專利名稱：糖尿病的治療的制作方法
介紹背景糖尿病是發(fā)生于所有年齡階層和群體的最普通的內(nèi)分泌疾病之一。糖尿病不僅臨床發(fā)病率和死亡率高，其經(jīng)濟(jì)費(fèi)用也很高，僅在美國(guó)每年就超過(guò)900億美元，糖尿病的廣泛發(fā)病率預(yù)期到2010年將增加2倍以上。
糖尿病有兩種主要的形式胰島素依賴型(1型)糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus,IDDM)，占所有病例的5-10％；以及非胰島素依賴型(2型)糖尿病(non-insulin-dependentdiabetes mellitus,NIDDM)，占所有病例的大約90％。2型糖尿病與年齡的增加有關(guān)，然而，被診斷患有NIDDM，即所謂的年輕人成熟期發(fā)病的糖尿病(maturity onset diabetes of the young,MODY)，的年輕人的數(shù)目呈增加趨勢(shì)。在1型和2型病例中，胰島素的分泌都減少，要么是因?yàn)橐认僦械摩?細(xì)胞的破壞，要么是因?yàn)橐葝u素的分泌或產(chǎn)生存在缺陷。在NIDDM中，患者典型地通過(guò)實(shí)行最優(yōu)膳食療法、減肥以及運(yùn)動(dòng)來(lái)開(kāi)始治療。當(dāng)這些措施無(wú)法再提供足夠的代謝控制時(shí)，開(kāi)始藥物療法。初始的藥物療法包括磺脲類，它們刺激β-細(xì)胞的胰島素分泌，但也可以包括縮二胍、α-葡萄糖苷酶抑制劑、(thiazolidenediones)以及組合療法。然而，值得一提的是，2型糖尿病的疾病運(yùn)作機(jī)制的漸進(jìn)性本質(zhì)是難以控制的。在所有的通過(guò)藥物治療的糖尿病患者中，50％以上的患者在6年內(nèi)對(duì)血糖的控制都很差，不管施用的是什么藥物。許多人認(rèn)為胰島素治療是2型糖尿病治療的最后一個(gè)手段，并且有病人拒絕使用胰島素。
胰島是從位于胎兒管狀胰臟內(nèi)皮的內(nèi)胚層干細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的，上述內(nèi)皮還含有發(fā)育為外分泌胰腺的多能性干細(xì)胞。Teitelman和Lee,發(fā)育生物學(xué)(Developmental Biology),121:454-466(1987)；Pictet和Rutter,胚胎內(nèi)分泌胰臟的發(fā)育(Development of theembryonic encocrine pancreas)，于內(nèi)分泌學(xué)(Endocrinology)中，生理學(xué)手冊(cè)(Handbook of Physiology),R.O.Greep和E.B.Astwood編輯(1972)，美國(guó)生理學(xué)會(huì)(American PhysiologicalSociety):Washington,D.C.,第25-66頁(yè)。胰島的發(fā)育在胚胎妊娠期的不連續(xù)發(fā)育階段繼續(xù)進(jìn)行，上述階段被戲劇性的過(guò)渡屢次打斷。初始的階段是一個(gè)分化早期狀態(tài)，其特征在于多能性干細(xì)胞被提交給胰島細(xì)胞譜系，這通過(guò)分化初期(protodifferentiated)細(xì)胞對(duì)胰島素和高血糖素的表達(dá)表現(xiàn)出來(lái)。這些分化初期細(xì)胞含有一群被提交的胰島前體細(xì)胞，它們僅表達(dá)低水平的胰島特異性基因產(chǎn)物并缺乏成熟胰島細(xì)胞的細(xì)胞分化。Pictet和Rutter，見(jiàn)上。在小鼠妊娠的第16天左右，分化初期的胰臟開(kāi)始一個(gè)快速生長(zhǎng)和分化的階段，其特征在于胰島細(xì)胞的細(xì)胞分化和胰島特異性基因表達(dá)的幾百倍的增加。在組織學(xué)上，胰島的形成(再生)隨著增殖的胰島從胰腺管中萌芽出來(lái)(胰島細(xì)胞增殖癥)變得明顯。在即將出生之前胰島的生長(zhǎng)減緩，胰島的再生和胰島細(xì)胞增殖癥很大程度上變得較不明顯。與此同時(shí)，胰島達(dá)到最完全分化的狀態(tài)，其胰島素基因的表達(dá)達(dá)到最高水平。因此，與許多器官類似，細(xì)胞分化的完成伴隨著再生能力的降低；分化后的成熟胰臟不具有發(fā)育中的胰臟所具有的同樣的再生潛能或者增殖能力。
由于分化初期前體細(xì)胞的分化發(fā)生于胰臟胚胎發(fā)育的晚期，調(diào)控胰島分化的因子可能在這一階段在胰臟中得以表達(dá)。在胰島發(fā)育期間被表達(dá)的基因的其中之一編碼胃腸肽一胃泌激素。雖然胃泌激素在成年人中充當(dāng)胃激素，調(diào)控酸的分泌，但是在胚胎中胃泌激素表達(dá)的主要位點(diǎn)是胰島。Brand和Fuller,J.Biol.Chem.,263:5341-5347(1988)。胃泌激素在胰島中的表達(dá)是短暫的。它被限制在分化初期胰島前體細(xì)胞形成分化的胰島的這一階段。雖然胰臟胃泌激素在胰島發(fā)育中的重要性仍是未知的，一些臨床觀察提示了胃泌激素在胰島發(fā)育中的一個(gè)如下的規(guī)則。例如，由胃泌激素表達(dá)胰島細(xì)胞腫瘤引起的高胃泌激素血癥以及萎縮型胃炎是與胰島細(xì)胞增殖癥相關(guān)聯(lián)的，后者與在正在分化的胚胎胰島中看到的類似。Sacchi等，Virchows ArchivB,48:261 276(1985)；以及Heitz等，糖尿病(Diabetes),26:632-642(1977)。另外，胰臟胃泌激素的不正常持續(xù)在一個(gè)小兒胰島細(xì)胞增殖癥病例的文件中已有記載。Hollande等，腸胃病學(xué)(Gastroenterology)，71:251-262(1976)。然而，在上述的觀察中均沒(méi)有建立一個(gè)胰島細(xì)胞增殖癥和胃泌激素刺激之間的因果關(guān)系。
因此，鑒定刺激胰島細(xì)胞再生的因子是有意義的，這些因子在早期IDDM的治療和NIDDM中β-細(xì)胞缺乏的預(yù)防中是有價(jià)值的。
引用本文中所述的參考文獻(xiàn)不應(yīng)該被解釋成是承認(rèn)此類參考文獻(xiàn)是本發(fā)明的優(yōu)先工藝。
相關(guān)文獻(xiàn)胎兒胰臟的發(fā)育牽涉到三種生長(zhǎng)因子，即胃泌激素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)以及表皮生長(zhǎng)因子(EGF)(Brand和Fuller,J.Biol.Chem.263:5341-5347)。過(guò)量表達(dá)單一的TGF-α或者胃泌激素的轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島細(xì)胞的生長(zhǎng)并不活躍，然而，表達(dá)上述兩個(gè)轉(zhuǎn)基因的小鼠的胰島細(xì)胞質(zhì)量顯著增加(Wang等，(1993)J.Clin.Invest.92:1349-1356)。Bouwens和Pipeleers(1998)在Diabetoligia41:629-633中報(bào)道在正常的成年人的胰臟中萌芽的β-細(xì)胞的比例很高，而且發(fā)現(xiàn)所有的β-細(xì)胞中15％是單個(gè)的單元。單個(gè)的β-細(xì)胞焦點(diǎn)(foci)在成年的(未經(jīng)刺激的)小鼠的胰臟中通常并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)；Wang等(1995)在Diabetologia 38:1405-1411中報(bào)道的頻率是大約占β-細(xì)胞總數(shù)的1％。
1型糖尿病患者在實(shí)施被囊胰島移植(encapsulated islettransplantation)之后對(duì)胰島素的非依賴性描述于Soon-Shiong等(1994)Lancet 343:950-51中。同時(shí)還參考Sasaki等(1998年6月15日)移植(Transplantation)65(11):1510-1512；Zhou等(1998年5月)美國(guó)生理學(xué)雜志(Am.J.Physiol.)274(5 Pt1):C1356-1362；Soon-Shiong等(1990年6月)Postgrad Med 87(8):133-134；Kendall等(1996年6月)糖尿病代謝(Diabetes Metab)22(3):157-163；Sandler等(1997年6月)移植(Transplantation)63(12):1712-1718；Suzuki等(1998年1月)細(xì)胞移植(Cell Transplant)7(1):47-52；Soon-Shiong等(1993年6月)美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90(12):5843-5847；Soon-Shiong等(1992年11月)移植(Transplantation)54(5):769-774；Soon-Shiong等(1992年10月)ASAIO J 38(4):851-854；Benhamou等(1998年6月)糖尿病代謝(Diabetes Metab)24(3):215-224；Christiansen等(1994年12月)臨床內(nèi)分泌代謝雜志(J Clin Endocrinol Metab)79(6):1561-1569；Fraga等(1998年4月)移植(Transplantation)65(8):10601066；Korsgren等(1993)Ups J Med Sci 98(1):39-52，Newgard等(1997年7月)Diabetologiz 40 Suppl 2:S42-S47.
發(fā)明概要本發(fā)明涉及一種通過(guò)給需要治療糖尿病的個(gè)體施用一種組合物以進(jìn)行糖尿病治療的方法，其中上述的組合物含有一種胃泌激素/膽囊收縮素受體配體，一種EGF受體配體，或者兩者的組合，其數(shù)量足以使患者的胰島前體細(xì)胞分化為成熟的胰島素分泌細(xì)胞。該組合物可以全身施用或者通過(guò)宿主細(xì)胞在原位進(jìn)行表達(dá)，上述的宿主細(xì)胞含有位于一個(gè)表達(dá)載體中的核酸構(gòu)造物，其中的核酸構(gòu)造物含有一個(gè)胃泌激素縮膽囊素受體配體的編碼序列或者一個(gè)EGF受體配體的編碼序列，以及一個(gè)在胰島前體細(xì)胞中發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控區(qū)域。本發(fā)明同時(shí)還提供了用于對(duì)需要治療糖尿病的患者進(jìn)行糖尿病治療的方法和組合物，通過(guò)給糖尿病患者移植胰島細(xì)胞以便增加胰島中胰臟β-細(xì)胞的數(shù)量，其中上述的胰島細(xì)胞已經(jīng)在培養(yǎng)基中被暴露于足量的一種胃泌激素/縮膽囊素受體配體和一種EGF受體配體；可選地，胰臟β-細(xì)胞的種群可以在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一段足以在移植之前擴(kuò)增β-細(xì)胞種群的時(shí)間。這些方法和組合物在糖尿病患者的治療中發(fā)揮作用。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A顯示了數(shù)目眾多的來(lái)源于TGF-α轉(zhuǎn)基因胰臟的位于化生管中的胰島素染色細(xì)胞，用免疫過(guò)氧化酶染色。圖lB顯示了大多數(shù)的小導(dǎo)管細(xì)胞胰島素染色的程度較低，但是偶然地小導(dǎo)管細(xì)胞的胰島素染色的程度也會(huì)與毗鄰的胰島的程度一樣高。
圖2A圖解了嵌合的胰島素啟動(dòng)子-胃泌激素(insulinpromoter-gastrin,INSGAS)轉(zhuǎn)基因的結(jié)構(gòu)。圖2B圖解了INSGAS轉(zhuǎn)基因小鼠胰臟提取物的放射免疫化驗(yàn)，顯示了高水平的胃泌激素免疫反應(yīng)性，這超出了胃竇中由內(nèi)源性小鼠基因表達(dá)的胃泌激素的含量。INSGAS轉(zhuǎn)基因小鼠在出生后胃泌激素在胰臟中有高水平的表達(dá)。
圖3A是一只被用于實(shí)施例3中所報(bào)告的研究中的INSGAS/TGF-α小鼠的胰臟的組織學(xué)圖象。INSGAS/TGF-α胰臟有-些小管復(fù)合物增加而且細(xì)胞間質(zhì)(interstitial cellularity)稍有增加的區(qū)域。此處所示的視野是所用的五只動(dòng)物中組織學(xué)最為異常的。圖3B是一只實(shí)施例3中的對(duì)照小鼠的胰臟組織學(xué)圖象。圖3C是一只被用于實(shí)施例3中所報(bào)告的研究中的TGF-α小鼠的胰臟組織學(xué)圖象。這一顯示了被用于實(shí)施例3中所報(bào)告的研究中的TGF-α小鼠胰臟的視野是典型的，它顯示了細(xì)胞間質(zhì)和纖維癥，同時(shí)結(jié)合有旺盛小導(dǎo)管化生，這已被Jhappan等，見(jiàn)上，所描述。
圖4A是一個(gè)圖解點(diǎn)=記數(shù)(point=counting)形態(tài)測(cè)定數(shù)據(jù)的直方圖，它確證了在第17周，INSGAS/TGF-α小鼠的胰臟的導(dǎo)管質(zhì)量比TGF-α小鼠的胰臟的小，這是以實(shí)施例3中所報(bào)道的研究為基礎(chǔ)的。圖4B是一個(gè)圖解點(diǎn)=記數(shù)形態(tài)測(cè)定數(shù)據(jù)的直方圖，它顯示了胃泌激素和TGF-α在INSGAS/TGF-α胰臟中的共表達(dá)顯著地增加了胰島的質(zhì)量(與相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈蟮囊葝u質(zhì)量作比較)。另外，僅表達(dá)TGF-α并不增加胰島的質(zhì)量。這些數(shù)據(jù)是以實(shí)施例3中所述的研究為基礎(chǔ)的。
圖5顯示了TGF-α和胃泌激素在由鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠(用PBS(空心圓)或者TGF-α和胃泌激素結(jié)合(空心正方形)進(jìn)行處理，每日腹膜內(nèi)施用一次，為期10天)中對(duì)葡萄糖容許量的影響。
圖6顯示了在如實(shí)施例7中所述的三組經(jīng)過(guò)治療的Zucker小鼠以及相應(yīng)的PBS對(duì)照(6只/組)中TGF-α和胃泌激素治療對(duì)β-細(xì)胞再生的影響。條1代表瘦的經(jīng)TGF+胃泌激素處理的，條4代表肥胖的經(jīng)TGF+胃泌激素處理的，條5代表肥胖的PBS對(duì)照，條3代表經(jīng)TGF+胃泌激素預(yù)處理的，條2代表瘦的PBS對(duì)照。在被研究的所有的組中，TGF-α和胃泌激素顯著地增加了單個(gè)β-細(xì)胞焦點(diǎn)的相對(duì)比例(與經(jīng)PBS處理的動(dòng)物相比較)。組4和組5有顯著的差別(p＜0.0015)，組1和組2也有顯著的差別(p＜0.0041)。
圖7顯示了TGF-α和胃泌激素處理對(duì)瘦的和肥胖的Zucker大鼠的β-細(xì)胞再生的影響。β-細(xì)胞的再生是通過(guò)β-細(xì)胞總數(shù)和新生的單個(gè)β-細(xì)胞焦點(diǎn)的差值記數(shù)來(lái)定量的，以所記數(shù)的β-細(xì)胞總數(shù)的百分比來(lái)表示。在經(jīng)生長(zhǎng)因子組合治療的瘦的Zucker大鼠中單個(gè)β-細(xì)胞焦點(diǎn)的百分率為10.5±0.9，而相應(yīng)的PBS對(duì)照組的為3.9±1.1(p=0.004)(圖7A和圖B)。在肥胖的Zucker大鼠中，在預(yù)先經(jīng)過(guò)治療的組中單個(gè)β-細(xì)胞焦點(diǎn)的百分率為8.7±1.3，而相應(yīng)的對(duì)照組的為4.2±1.1(p=0.0015)(圖7C和圖D)。圖7E是圖7C中所示的導(dǎo)管區(qū)域(如箭頭所示)的400×的一個(gè)放大圖，它提供了含有胰島素的細(xì)胞從導(dǎo)管表皮細(xì)胞中萌芽出來(lái)(這是β-細(xì)胞再生的特征)的清楚的證據(jù)。
優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明提供了一種通過(guò)給需要治療糖尿病的個(gè)體施用一種組合物以進(jìn)行糖尿病治療的方法，其中上述的組合物含有一種胃泌激素/膽囊收縮素受體配體，如胃泌激素，一種EGF受體配體，如TGF-α，或者兩者的組合，其數(shù)量足以使患者的胰島前體細(xì)胞分化為成熟的胰島素分泌細(xì)胞。當(dāng)全身性施用該組合物時(shí)，通常是將其制備于生理學(xué)可接受的載體中進(jìn)行注射，優(yōu)選的靜脈注射。當(dāng)在原位表達(dá)該組合物時(shí)，胰島前體細(xì)胞在體外或者在體內(nèi)被一種表達(dá)載體中的一種或多種核酸表達(dá)構(gòu)造物所轉(zhuǎn)化，上述的表達(dá)載體在胰島前體細(xì)胞中表達(dá)了所需的一種或多種受體配體。例如，表達(dá)構(gòu)造物包括一個(gè)縮膽囊素受體配體的編碼序列，如一個(gè)前胃泌激素原肽前體編碼序列，它在表達(dá)之后被加工成胃泌激素，或者一個(gè)EGF受體配體如EGF-α的編碼序列，以及轉(zhuǎn)錄或者翻譯調(diào)控區(qū)域，它們?yōu)樵谝葝u前體細(xì)胞中表達(dá)作準(zhǔn)備。轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可以是構(gòu)成性或者誘導(dǎo)性的(例如通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的濃度)，例如可以是一個(gè)來(lái)源于胰島素基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域。用任何一種適合的表達(dá)載體，例如腺病毒表達(dá)載體，來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。當(dāng)轉(zhuǎn)化是在體外進(jìn)行時(shí)，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞被移植到糖尿病患者中，例如使用一種腎膠囊?？蛇x的，在體外用足量的胃泌激素/縮膽囊素受體配體和/或者EGF受體配體對(duì)胰島細(xì)胞進(jìn)行處理以便在移植到糖尿病患者中之前增加胰腺中胰臟β-細(xì)胞的數(shù)量。如所要求的，在移植之前，在培養(yǎng)基中通過(guò)讓胰臟β-細(xì)胞接觸如上的一種或多種受體配體來(lái)擴(kuò)增它們的種群。
本發(fā)明比起現(xiàn)有的糖尿病治療方法具有一些優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)提供一種方法來(lái)刺激成熟的胰臟再生，不僅使對(duì)傳統(tǒng)藥物治療(2型)或者胰島素治療(1型和2型)的需要較少或者甚至消除，而且正常血糖水平的保持也可能減少糖尿病的一些引起衰老的綜合癥。糖尿病綜合癥包括那些影響視網(wǎng)膜、腎、以及神經(jīng)的小血管的癥狀(微血管綜合癥)，以及那些影響那些為心臟、大腦、以及下肢供血的大血管的癥狀(大血管綜合癥)。糖尿病微血管綜合癥是20-74歲年齡段的人新盲的主要病因，而且也是35％的晚期腎病新病例的病因。60％以上的糖尿病受到神經(jīng)病的影響。糖尿病是美國(guó)50％的非外傷切斷手術(shù)的病因，這主要是由糖尿病大血管疾病造成的，而且糖尿病患者死于冠狀動(dòng)脈疾病的幾率是非糖尿病患者的2.5倍。高血糖癥被認(rèn)為發(fā)起并加速了糖尿病微血管綜合癥的發(fā)展。使用目前的各種各樣的治療方法無(wú)法足夠地控制高血糖癥，因此就無(wú)法預(yù)防或者減弱糖尿病綜合癥的發(fā)展。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“胃泌激素/縮膽囊素受體配體”包括那些刺激胃泌激素/縮膽囊素受體的化合物。這種胃泌激素/縮膽囊素受體配體的例子包括各種不同形式的胃泌激素，如胃泌激素34(大胃泌激素)、胃泌激素17(小胃泌激素)、以及胃泌激素8(迷你型胃泌激素)；各種不同形式的縮膽囊素，如縮膽囊素58、縮膽囊素33、縮膽囊素22、縮膽囊素12以及縮膽囊素8；以及以單個(gè)的形式或者是與EGF受體配體相組合、可以誘導(dǎo)成熟胰臟中細(xì)胞分化形成胰島素分泌胰島細(xì)胞的其他的胃泌激素/縮膽囊素受體配體。本發(fā)明同時(shí)還設(shè)想了上述配體的活性類似物、片段以及其他的修飾物。此類配體還包括可以增加內(nèi)源性胃泌激素、縮膽囊素或者類似的活性肽從組織貯存體分泌的化合物。它們的例子有奧美拉唑(omeprazole)，它抑制胃酸的分泌，以及大豆胰蛋白酶抑制劑，它增加縮膽囊素的刺激。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“EGF受體配體”包括那些化合物，當(dāng)它刺激EGF受體時(shí)位于同一或者毗鄰組織或者位于同一個(gè)體中的胃泌激素/縮膽囊素受體也被刺激，胰島素生成胰島細(xì)胞的再生被誘導(dǎo)。此類EGF受體配體的例子包括EGF1-53及其片段及活性類似物，包括EGF1-48、EGF1-52、EGF1-49。見(jiàn)，例如美國(guó)專利編號(hào)5,434,135。其他的例子包括TGF-α受體配體(1-50)及其片段和活性類似物，包括1-48、1-47以及其他的EGF受體配體，如雙邊條曲菌素(amphiregulin)和痘病毒生長(zhǎng)因子以及具有與胃泌激素/縮膽囊素受體配體相同的協(xié)同性的其他的EGF受體配體。這包括上述配體的活性類似物、片段以及修飾物。更進(jìn)一步的背景請(qǐng)參考Carpenter和Wahl，肽生長(zhǎng)因子(Peptide Growth Factors)的第四章(由Sporn和Roberts編輯)，Springer Verlag,(1990)。
本發(fā)明的一個(gè)主要方面是一種通過(guò)給需要治療糖尿病的個(gè)體施用一種組合物以進(jìn)行糖尿病治療的方法，其中上述的組合物包括一種胃泌激素/膽囊收縮素受體配體以及/或者一種EGF受體配體，其數(shù)量足以使患者的胰島前體細(xì)胞分化為成熟的胰島素分泌細(xì)胞。如此分化的細(xì)胞是胰臟導(dǎo)管中的殘余的潛伏性胰島前體細(xì)胞。一個(gè)實(shí)施例包括給個(gè)體施用，優(yōu)選的全身性施用，一分化再生數(shù)量的胃泌激素/縮膽囊素受體配體和EGF受體配體，優(yōu)選的是TGF-α，可以單個(gè)施用或者結(jié)合施用。
另一個(gè)實(shí)施例包括給哺乳動(dòng)物的外植的胰臟組織的胰島前體細(xì)胞提供一種胃泌激素/縮膽囊素受體配體以及/或者一種EGF受體配體并將經(jīng)過(guò)如此刺激的胰臟組織重新導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物中。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明包括給哺乳動(dòng)物的外植的胰臟組織的胰島前體細(xì)胞提供一種胃泌激素/縮膽囊素受體配體以及/或者一種EGF受體配體以擴(kuò)增β-細(xì)胞的種群。
在另一個(gè)實(shí)施例中，胃泌激素/縮膽囊素受體配體刺激是通過(guò)表達(dá)一個(gè)通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法導(dǎo)入此類前體細(xì)胞中的嵌合的胰島素啟動(dòng)子-胃泌激素融合基因構(gòu)造物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在另一個(gè)實(shí)施例中，EGF受體配體刺激是通過(guò)表達(dá)一個(gè)通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法導(dǎo)入哺乳動(dòng)物中的EGF受體配體基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的。EGF基因的序列被提供于美國(guó)專利編號(hào)5,434,135中。
在另一個(gè)實(shí)施例中，來(lái)源于一個(gè)胃泌激素/縮膽囊素受體配體以及一個(gè)EGF受體配體的刺激是通過(guò)已經(jīng)被穩(wěn)定地導(dǎo)入哺乳動(dòng)物中的(ⅰ)一個(gè)前胃泌激素原(preprogastrin)肽前體基因和(ⅱ)一個(gè)EGF受體配體基因的共表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種使哺乳動(dòng)物胰島前體細(xì)胞分化的方法，通過(guò)結(jié)合使用一種胃泌激素/縮膽囊素受體配體和一種EGF受體配體來(lái)刺激此類細(xì)胞。在一個(gè)這一方面的優(yōu)選實(shí)施例中，胃泌激素的刺激是通過(guò)表達(dá)一個(gè)被穩(wěn)定地導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物中的前胃泌激素原肽前體基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這一表達(dá)受胰島素啟動(dòng)子的控制。EGF受體配體，例如TGF-α，的刺激是通過(guò)表達(dá)一個(gè)被穩(wěn)定的導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物中的EGF受體配體基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的。作為上述的更進(jìn)一步，用一種胃泌激素和一種TGF-α來(lái)進(jìn)行刺激，優(yōu)選的是通過(guò)被導(dǎo)入哺乳動(dòng)物中的(ⅰ)一個(gè)前胃泌激素原肽前體基因和(ⅱ)一個(gè)EGF受體配體基因的共表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。能夠指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的合適的啟動(dòng)子包括病毒啟動(dòng)子和細(xì)胞啟動(dòng)子。病毒啟動(dòng)子包括近早期(immediate early)巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(Boshart等(1985)細(xì)胞(Cell)41:521-530),SV40啟動(dòng)子(Subramani等(1981)分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)1:854-864)，以及來(lái)源于腺病毒2的主要的晚期啟動(dòng)子(Kaufman和Sharp(1982)分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)2:1304-1319)。優(yōu)選的，胃泌激素/縮膽囊素受體配體基因和EGF受體配體基因的其中之一或兩者的表達(dá)是受胰島素啟動(dòng)子控制的。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面是一個(gè)核酸構(gòu)造物。這一構(gòu)造物包括一個(gè)編碼一個(gè)前胃泌激素原肽前體的序列以及一個(gè)胰島素轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，它是一個(gè)編碼前胃泌激素原肽前體的序列的5’端并能夠支持這一序列的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選的，胰島素轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列包括至少一個(gè)胰島素啟動(dòng)子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，編碼前胃泌激素原肽前體的核酸序列包括一個(gè)多聚核苷酸序列，該序列含有人胃泌激素基因的外顯子2和3，可選的還含有內(nèi)顯子1和2。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是一個(gè)表達(dá)盒，包括(ⅰ)一個(gè)編碼哺乳動(dòng)物EGF受體配體的核酸序列，例如TGF-α，以及一個(gè)它的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；以及(ⅱ)一個(gè)編碼前胃泌激素原肽前體的核酸序列以及一個(gè)它的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。優(yōu)選的，EGF受體配體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列是一個(gè)強(qiáng)的非組織特異性啟動(dòng)子，如金屬硫蛋白啟動(dòng)子。優(yōu)選的，前胃泌激素原肽前體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列是一個(gè)胰島素啟動(dòng)子。在這一實(shí)施例的一個(gè)優(yōu)選形式中，編碼前胃泌激素原肽前體的核酸序列包括一個(gè)多聚核苷酸序列，該序列含有人胃泌激素基因的內(nèi)顯子1和2以及外顯子2和3。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一個(gè)載體，這一載體包括包含有前胃泌激素原肽前體編碼序列的表達(dá)盒。這一載體可以是一個(gè)質(zhì)粒，如pGeml，或者是一個(gè)含有一個(gè)包括一個(gè)胰島素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的噬菌體。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一個(gè)載體的組合物，包括(1)具有編碼哺乳動(dòng)物EGF受體配體的核酸序列，例如TGF-α，該序列受一個(gè)強(qiáng)的非組織特異性啟動(dòng)子，如金屬硫蛋白啟動(dòng)子，的控制，以及一個(gè)受一個(gè)胰島素啟動(dòng)子控制的前胃泌激素原肽前體編碼序列。就這一點(diǎn)而言，每一個(gè)載體都可以是一個(gè)質(zhì)粒，如質(zhì)粒pGeml或者是一個(gè)噬菌體?？蛇x的，表達(dá)盒或者載體也可以根據(jù)適合的組織營(yíng)養(yǎng)性(tissuetrophism)插入到病毒載體中。病毒載體的例子包括腺病毒、皰疹單純病毒、腺關(guān)聯(lián)病毒、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒、慢病毒，等等。見(jiàn)Blomer等(1996)人類分子遺傳學(xué)(Human Molecular Genetics)5 Spec.No:1397-404，以及Robbins等(1998)生物工程學(xué)趨勢(shì)(Trends inBiotechnology)16:35-40。腺病毒介導(dǎo)的基因治療已經(jīng)被成功地用于短暫地改正囊腫性纖維化患者的鼻上皮氯轉(zhuǎn)運(yùn)缺點(diǎn)。見(jiàn)Zabner等(1993)細(xì)胞(Cell)75:207-216。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種非人類哺乳動(dòng)物或者哺乳動(dòng)物組織，包括細(xì)胞，它能夠表達(dá)一個(gè)被穩(wěn)定整合的編碼前胃泌激素原的基因。這一方面的另一個(gè)實(shí)施例是一非人類哺乳動(dòng)物，它能夠共表達(dá)(ⅰ)一個(gè)前胃泌激素原肽前體基因；以及/或者(ⅱ)一個(gè)已經(jīng)被穩(wěn)定的整合到非人類哺乳動(dòng)物、哺乳動(dòng)物組織或者細(xì)胞中的EGF受體配體，例如一個(gè)TGF-α基因。哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞可以是人的組織或細(xì)胞。治療施用及組合物施用的模式包括但不局限于穿過(guò)真皮、肌肉、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、以及口服途徑?；衔锟梢杂萌魏畏奖愕耐緩絹?lái)施用，例如通過(guò)灌輸或者快速濃注(通過(guò)上皮或者皮膚粘膜內(nèi)層，如口腔粘膜層、直腸和腸粘膜層等，來(lái)吸收)，而且可以與其他的生物活性劑一起施用。優(yōu)選的進(jìn)行全身性施用。
本發(fā)明同時(shí)還提供了制藥組合物。此類組合物包括一治療有效量的一種治療上和制藥上可接受的載體或賦形劑。此類載體包括但不局限于鹽水、緩沖的鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇、以及它們的組合。制劑應(yīng)該適合施用的模式。用于本發(fā)明中的制藥可接受的載體和制劑見(jiàn)于Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack PublishingCompany,Philadelphia,PA，第17版，(1985)，該文獻(xiàn)作為參照被結(jié)合于本發(fā)明中。關(guān)于藥物遞送方法的一個(gè)簡(jiǎn)要的綜述請(qǐng)見(jiàn)Langer(1990)科學(xué)(Science)249:1527-1533，該文獻(xiàn)作為參照被結(jié)合于本發(fā)明中。
在制備本發(fā)明的制藥組合物的過(guò)程中，可能需要對(duì)本發(fā)明的組合物進(jìn)行修飾以改變它們的藥物動(dòng)力學(xué)和體內(nèi)分布特性(biodistribution)。關(guān)于藥物動(dòng)力學(xué)的一個(gè)總體的討論請(qǐng)參照Remingtons’s Pharmaceutical Sciences(如上)的第37-39章。用于改變藥物動(dòng)力學(xué)和體內(nèi)分布的許多方法是本工藝的一般技術(shù)人員所已知的(見(jiàn)，例如，Langer的如上的文獻(xiàn))。此類方法的例子包括將藥劑保護(hù)在由諸如蛋白、脂質(zhì)(例如脂質(zhì)體)、碳水化合物、或者合成聚合體等物質(zhì)組成的小囊泡中。例如，本發(fā)明的藥劑可以被結(jié)合到脂質(zhì)體中以便增強(qiáng)它們的藥物動(dòng)力學(xué)和體內(nèi)分布的特性。已有多種用于制備脂質(zhì)體的方法，如在Szoka等(1980)Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467、美國(guó)專利編號(hào)4,235,871、4,501,728、以及4,837,028中所描述的方法，上述文獻(xiàn)作為參照結(jié)合于本發(fā)明中。各種各樣的其他的輸送系統(tǒng)也是已知的，可以被用于施用本發(fā)明的治療藥劑，例如微粒、微膠囊等等。
如果需要，組合物還可以含有少量的濕潤(rùn)劑、乳化劑，或者pH緩沖劑。組合物可以是液體溶液、懸浮液、乳劑、藥片、藥丸、膠囊、緩釋制劑、或者粉末。組合物可以被配制為栓劑，帶有傳統(tǒng)的綁縛物和載體，如三甘油三酯?？诜苿┛梢园?biāo)準(zhǔn)的載體，如制藥等級(jí)的D-甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂，等等。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，組合物是根據(jù)常規(guī)的程序進(jìn)行配制的，配制成例如一種適合人類靜脈內(nèi)施用的制藥組合物。典型的，用于靜脈內(nèi)施用的組合物是用無(wú)菌等滲的水緩沖液制備的溶液。需要時(shí)，組合物還可以包括一種增溶劑以及一種局部麻醉劑以改善注射位點(diǎn)的疼痛。成分通常是以單位劑量的形式分別或者混合提供的，例如，以凍干粉末或者無(wú)水濃縮液的形式放置于一個(gè)密封的、有刻度的、標(biāo)示有活性劑質(zhì)量的容器，例如安培瓶或者小袋(sachette)中。當(dāng)組合物是用于灌輸施用時(shí)，可以用一個(gè)含有無(wú)菌的配藥等級(jí)的水或者鹽水的灌輸瓶進(jìn)行分配。當(dāng)組合物是用于注射施用時(shí)，可以提供一安培瓶的注射用無(wú)菌水或者鹽水以便在施用之前與成分混合。
本發(fā)明的治療劑可以被配制成中性的或者鹽的形式。制藥可接受的鹽包括那些與自由氨基形成的鹽，例如那些來(lái)源于鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等等的鹽，以及那些與自由羧基形成的鹽，例如那些來(lái)源于鈉、鉀銨、鈣以及其他二價(jià)陽(yáng)離子、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等等的鹽。
本發(fā)明的治療劑能夠有效治療特定的紊亂或疾病的量取決于紊亂或疾病的本質(zhì)，而且可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的臨床技術(shù)來(lái)確定。在制劑中所用的精確的劑量同時(shí)也取決于施用的途徑、以及疾病或紊亂的嚴(yán)重程度，并且應(yīng)該根據(jù)從業(yè)者的判斷和每一個(gè)患者的狀況來(lái)決定。然而，靜脈內(nèi)施用的合適的劑量范圍通常是每公斤體重大約20-500毫克活性化合物。鼻內(nèi)施用的合適的劑量范圍通常為每公斤體重大約0.01皮克至1毫克之間。有效的劑量可以從來(lái)源于體外或者動(dòng)物模型試驗(yàn)系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線向外延伸。栓劑所含有的活性成分通常在體重的0.5％至10％之間；口服制劑優(yōu)選的含有10％至95％的活性成分。
在本發(fā)明的基因治療方法中，體內(nèi)的轉(zhuǎn)染是通過(guò)在哺乳動(dòng)物宿主中引入一種治療性的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)載體來(lái)實(shí)現(xiàn)的，或者是以裸露DNA的形式(與脂質(zhì)載體，特別是陽(yáng)離子脂質(zhì)載體形成復(fù)合物)，或者是被插入到一個(gè)病毒載體，例如一個(gè)重組腺病毒，中?？梢杂煤脦追N方法來(lái)導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物宿主中，包括以靜脈內(nèi)或者腹腔內(nèi)注射、氣管內(nèi)、鞘內(nèi)、腸道外、關(guān)節(jié)內(nèi)、鼻內(nèi)、肌肉、局部、穿越真皮的形式施用于任何粘膜表面、角膜裝置等等。特別感興趣的是將治療性的表達(dá)載體引入到循環(huán)的體液中或者引入到身體的孔或者體腔中。因此，靜脈內(nèi)施用和膜內(nèi)施用是特別感興趣的，因?yàn)檩d體通過(guò)這種施用途徑可以被廣泛的傳播，在引入體孔或體腔時(shí)可以使用氣溶劑施用方法?？梢詫?duì)準(zhǔn)特定的細(xì)胞和組織，這取決于施用的途徑和施用的位置。例如，沿著血流方向最靠近注射位置的組織不需任何特定的尋靶即可被轉(zhuǎn)染。如果使用脂質(zhì)載體，可以對(duì)它們進(jìn)行修飾以用位置引導(dǎo)分子引導(dǎo)該復(fù)合物到達(dá)特定類型的細(xì)胞。這樣，可以使用針對(duì)特定受體或者其他的細(xì)胞表面蛋白的抗體或配體，由一個(gè)目標(biāo)細(xì)胞與一個(gè)特定的表面蛋白相關(guān)聯(lián)。
在施用DNA、重組病毒載體或者脂質(zhì)載體時(shí)可以使用任何生理學(xué)可接受的介質(zhì)，如去離子水、鹽、磷酸鹽緩沖液、5％右旋糖水溶液等等，如上面針對(duì)制藥組合物所描述的，這取決于施用的途徑。在制劑中也可以包括其他的成分，如緩沖液、穩(wěn)定劑、殺生物劑等等。這些成分在文獻(xiàn)中已經(jīng)有廣泛的范例，在此不作具體描述。應(yīng)該避免任何可能導(dǎo)致復(fù)合物聚集的稀釋液或者稀釋液的成分，包括高鹽、螯合劑，等等。
所用的治療性載體的量應(yīng)該是足以在目標(biāo)組織中進(jìn)行治療水平表達(dá)的量。治療水平的表達(dá)是足以使血糖降低到正常水平的表達(dá)量。另外，所使用的核酸載體的劑量必須足以使轉(zhuǎn)基因在所感染的組織產(chǎn)生所需水平的體內(nèi)表達(dá)。其他的DNA序列，如腺病毒VA基因，可以被包括在施用介質(zhì)中并被感興趣的基因共轉(zhuǎn)染。編碼腺病毒VA基因產(chǎn)物的基因的存在，如果需要，可以顯著增強(qiáng)從這一表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄的mRNA的翻譯。
有許多因子可以影響在受轉(zhuǎn)染組織的表達(dá)量，從而可以被用于對(duì)表達(dá)的水平進(jìn)行修飾以達(dá)到特別的目的。當(dāng)需要高水平表達(dá)時(shí)，可以對(duì)所有的因素進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)需要較少的表達(dá)時(shí)，可以改變一個(gè)或多個(gè)參數(shù)以獲得所需水平的表達(dá)。例如，如果高水平的表達(dá)將超出治療的窗口(therapeutic window)，那么可以使用比最優(yōu)條件差的條件進(jìn)行表達(dá)。
重組基因表達(dá)的水平和組織可以如上所述在mRNA水平進(jìn)行確定，以及/或者在多肽或者蛋白的水平進(jìn)行確定?；虍a(chǎn)物可以通過(guò)對(duì)其在組織中的生物學(xué)活性的測(cè)量來(lái)定量。例如，蛋白活性可以通過(guò)如下方法進(jìn)行確定如上所述的免疫測(cè)定方法、生物學(xué)測(cè)定方法(如血糖測(cè)定方法)、或者通過(guò)使用免疫染色技術(shù)來(lái)鑒定被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的基因產(chǎn)物，如用抗體進(jìn)行針探，其中上述的抗體特異地識(shí)別該基因產(chǎn)物或者存在于表達(dá)盒中的一個(gè)報(bào)告基因的產(chǎn)物。
典型的，治療盒并沒(méi)有被整合到患者的基因組中。如果需要，治療可以特別地進(jìn)行重復(fù)，這取決于所獲得的結(jié)果。如果進(jìn)行重復(fù)，可以對(duì)患者進(jìn)行監(jiān)控以確保對(duì)治療沒(méi)有產(chǎn)生有害的免疫或其他的反應(yīng)。
本發(fā)明還提供了用于在體外擴(kuò)增胰臟細(xì)胞種群的方法。在從合適的捐贈(zèng)者分離出胰臟之后，細(xì)胞被分離出來(lái)并在體外生長(zhǎng)。所用的細(xì)胞是從哺乳動(dòng)物捐獻(xiàn)者的組織樣品，包括人尸、豬的胎兒或者另外一種胰臟細(xì)胞的合適來(lái)源，獲得的。如果使用的是人的細(xì)胞，可能的話這些細(xì)胞與接受者在主要的組織相容性上是匹配的。細(xì)胞可以在對(duì)分離后的胰臟進(jìn)行酶解(如用膠原酶)之后用梯度分離來(lái)進(jìn)行純化。讓經(jīng)過(guò)純化的細(xì)胞在含有充足營(yíng)養(yǎng)物(以讓細(xì)胞存活)以及足量的含有胃泌激素/縮膽囊素受體配體和EGF受體配體的β-細(xì)胞增殖誘導(dǎo)組合物(以便形成胰島素分泌胰臟細(xì)胞)的介質(zhì)中生長(zhǎng)。根據(jù)本發(fā)明，在刺激之后，胰島素分泌胰臟細(xì)胞可以先在培養(yǎng)基中被直接擴(kuò)增，然后再被移植到有需要的患者中，或者也可以在經(jīng)過(guò)β-細(xì)胞增殖誘導(dǎo)組合物處理之后被直接移植。
移植的方法包括將所獲得的胰島素分泌胰臟β-細(xì)胞結(jié)合免疫抑制劑，如環(huán)孢菌素，移植到有需要的患者中。胰島素生產(chǎn)細(xì)胞也可以在移植之前被囊封于一種半透膜中。這種膜允許胰島素從囊封的細(xì)胞分泌出來(lái)，同時(shí)也保護(hù)這些細(xì)胞免受免疫攻擊。所要移植的細(xì)胞的數(shù)目估計(jì)為每公斤患者體重10,000至20,000個(gè)胰島素生產(chǎn)β-細(xì)胞。如果需要，可能需要重復(fù)的移植以保持有效治療數(shù)量的胰島素分泌細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，也可以給移植的接受者提供足量的胃泌激素/縮膽囊素受體配體盒EGF受體配體以誘導(dǎo)移植之后的胰島素分泌細(xì)胞的增殖。
糖尿病的治療效果可以如下進(jìn)行評(píng)估。如果可能的話，對(duì)治療形式的生物學(xué)效力和臨床效力都進(jìn)行評(píng)估。例如，疾病通過(guò)增加的血糖表現(xiàn)出來(lái)，因此，治療的生物學(xué)活性可以通過(guò)觀察到被評(píng)估的血糖返回到正常水平來(lái)評(píng)估。臨床效力，即所進(jìn)行的治療是否有效地改變了疾病的病程，測(cè)量起來(lái)更為困難。生物學(xué)效力的評(píng)估作為臨床效力的一個(gè)替代終點(diǎn)，涵蓋了很長(zhǎng)的時(shí)間，而臨床效力則不是最后的。因此，在，例如，六個(gè)月之后測(cè)量一個(gè)能夠指征β-細(xì)胞再生的臨床終點(diǎn)，可以對(duì)這一治療方法的臨床效力給出一個(gè)指征。
這些組合物可以被制備成試劑盒供一個(gè)或多個(gè)步驟使用。用于遺傳治療的試劑盒通常包括治療性DNA構(gòu)造物，可以是含有或不含有線粒體尋靶序列肽的裸露DNA、重組病毒載體、或者是與脂質(zhì)載體形成的復(fù)合物。另外，可以將脂質(zhì)載體制備于單獨(dú)的容器中，用以與所提供的DNA形成復(fù)合物。試劑盒包括一個(gè)含有一種有效藥劑的組合物，其中的藥劑可以是濃縮物(包括凍干組合物)，可以在使用前將它們稀釋，或者它們可以被制備成它們使用時(shí)的濃度，此時(shí)藥水瓶中可以包括一個(gè)或多個(gè)劑量。方便地，在試劑盒中可以將單個(gè)劑量制備于無(wú)菌的藥水瓶中以便內(nèi)科醫(yī)生可以直接使用藥水瓶，其中藥水瓶將含有所需數(shù)量和濃度的藥劑。當(dāng)藥水瓶含有直接使用的制劑時(shí)，通常就不再含有用于該方法的其他藥劑了。這種試劑盒可以附帶有一個(gè)告示，其格式為管理藥品和生物學(xué)制品生產(chǎn)、使用或者銷售的政府部門所規(guī)定的，這一告示反映了管理供人施用的(藥物)的生產(chǎn)、使用或者銷售的部門的批準(zhǔn)。
下面的實(shí)施例是說(shuō)明性的，并不具有局限性。
實(shí)施例材料及方法除了另外注明的以外，下面的材料和方法被用于下面所述的實(shí)施例所報(bào)告的研究中。動(dòng)物小鼠，F(xiàn)VB和CD株系，得自Taconic Farms,Inc.,Germantown,NY。所用的TGF-α轉(zhuǎn)基因系MT-42從一個(gè)金屬硫蛋白啟動(dòng)子表達(dá)高水平的TGF-α，它被描述于Jhappan等，細(xì)胞(Cell),61:1137-1146(1990)。正常的Wistar和Zucker大鼠被允許正常地隨意進(jìn)食和飲水并在每一研究開(kāi)始前一周讓其適應(yīng)新的環(huán)境。在誘導(dǎo)糖尿病的5至7天后靜脈內(nèi)施用新配制的鏈脲霉素，劑量為80毫克/公斤體重，將大鼠隨機(jī)分組供隨后的處理。將激素、TGF-α和大鼠胃泌激素配制于無(wú)菌的含有0.1％BSA的正常的鹽水中。根據(jù)針對(duì)不同研究的預(yù)定的處理方案，每一只動(dòng)物每日接受一次腹膜內(nèi)注射，注射單一的TGF-α或者胃泌激素(4.0微克/公斤體重)或者是1∶1(質(zhì)量比)的組合物(總共8.0微克/公斤)、或者是PBS，為期10天。INSGAS轉(zhuǎn)基因構(gòu)造物將一個(gè)含有大鼠胰島素I基因的-370至+38位核苷的Pvull-Rsal片段(Cordell,B.G.等，細(xì)胞(Cell),18:533-543(1979))連接到pGeml(Promega Corp.,Madison,WI)中。將一個(gè)含有人胃泌激素基因(編碼前胃泌激素原肽前體)的1.5kb內(nèi)含子1和2和外顯子2和3的4.4 kb的BamH1-EcoR1片段分離并亞克隆在pGem1(Promega)中的大鼠胰島素I片段的下游。這一片段被描述于Wiborg,O.，美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，81:1067-1069(1984)，以及Ito,R.等美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),81:4662-4666(1984)。將胰島素啟動(dòng)子-前胃泌激素原INSGAS轉(zhuǎn)基因構(gòu)造物剪切為一個(gè)4.8 kb的Xba1-EcoR1片段。轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生和性質(zhì)確定如上所制作的片段被如下制備以供微注射。將它用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離、用氯化銫梯度進(jìn)行純化、用注射緩沖液(5mM NaCl；01.MMEDTA；5mM Tris-HCI pH 7.4)進(jìn)行徹底的透析。來(lái)源于FVB近親繁殖的小鼠(Taconic Farms,Inc.，如上)的處于單細(xì)胞階段的受精卵母細(xì)胞被用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)進(jìn)行微注射。見(jiàn)Hogan.B.等，小鼠胚胎的操作實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Manipulating themouse embryo:A laboratory manual),Cold Spring Harbor,NY(1986)。然后根據(jù)Hogan等人的步驟將存活的胚胎移植到CD1(Charles River Laboratories,Inc.,Wilmington.MA)養(yǎng)母的輸卵管中。轉(zhuǎn)基因的創(chuàng)始鼠(founder mice)通過(guò)DNA印跡技術(shù)用從鼠個(gè)體的尾巴上分離的DNA，以及通過(guò)隨機(jī)引物擴(kuò)增用32 dCTP標(biāo)記的人胃泌激素外顯子2探針進(jìn)行鑒定。用類似的方法對(duì)F1代和它們的同胞進(jìn)行鑒定。
將含有來(lái)源于CD-1小鼠株系(Jhappan，如上)的MT-TGF-α轉(zhuǎn)基因的純合的MT-42小鼠與雜合的INSGAS小鼠雜交。在斷奶之后，如先前所述的將后代放置在酸化的50mM ZnCl2上以便誘導(dǎo)金屬硫蛋白啟動(dòng)子(Jhappan，如上)。RNA印跡雜交化驗(yàn)在進(jìn)行RNA印跡時(shí)，用Cathala等，DNA 2:329-335(1983)所描述的方法從組織中提取總RNA。將20微克的總RNA樣品用1％瓊脂糖變性凝膠分辨并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維上。將RNA印跡與用32P標(biāo)記的人胃泌激素的TGF-αRNA探針或外顯子2雜交，后兩者是不與小鼠內(nèi)源性胃泌激素mRNA雜交的。胃泌激素的肽放射免疫測(cè)定將組織提取出來(lái)并進(jìn)行胃泌激素免疫反應(yīng)性測(cè)定，這根據(jù)前述的方法來(lái)進(jìn)行，使用抗體2604，它在如Rehfeld，J.F.,Scand.J.Clin.Lab.Invest.30:36l-368(1972)中所述的一個(gè)胃泌激素放射免疫測(cè)定中對(duì)具生物學(xué)活性的C末端酰胺化的胃泌激素具有特異性。在所有的測(cè)定中均使用酪氨酸單碘化的人胃泌激素17示蹤物，用合成的人胃泌激素充當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)。TGF-α的肽放射免疫測(cè)定將組織在液氮中冰凍，用研缽和研杵將其研磨成粉末，然后根據(jù)Todaro,G.J.等，美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),77:5258-5262(1980)中所述的方法用酸-乙醇進(jìn)行提取。將提取物用水再生，用考馬氏藍(lán)燃料結(jié)合測(cè)定法(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)來(lái)確定蛋白質(zhì)的濃度。在一個(gè)TGF-α放射免疫測(cè)定中對(duì)來(lái)源于胰臟的等分試樣進(jìn)行二重測(cè)定，測(cè)定其與1251 TGF-α對(duì)固相兔抗體的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)，上述的兔抗體是針對(duì)大鼠TGF-α的C末端生成的，試劑盒來(lái)源于BioTope,Seattle,WA。血糖血糖是在過(guò)夜禁食之后或者在用葡萄糖氧化酶方法進(jìn)行的IPGTT之后確定的。組織胰島素分析在每一研究之后將動(dòng)物處死并取出胰臟。在整個(gè)胰臟的分開(kāi)的具有代表性的位置取出小的活組織并立即用液氮進(jìn)行快速冷凍以供免疫組織化學(xué)、蛋白、以及胰島素的測(cè)定之用。將快速冷凍后的胰臟樣品(n=5)快速解凍，在去離子水中進(jìn)行超聲斷裂，取等分試樣進(jìn)行蛋白測(cè)定，用酸/乙醇對(duì)勻漿液進(jìn)行提取，然后用RIA來(lái)確定胰島素。組織學(xué)分析將胰臟取出、稱重、在盒子中以類似的取向放置，在Bouin氏溶液中固定并用常規(guī)的步驟包埋于石蠟中。組織的制備和免疫組織化學(xué)將新鮮剪切的胰臟切開(kāi)，除去脂肪和淋巴結(jié)，在Bouin氏固定液中固定，然后用石蠟進(jìn)行包埋以供切片之用。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法將常規(guī)的切片用蘇木精和曙紅染色。將來(lái)源于17周齡的MT-TGF-α(MT-42)轉(zhuǎn)基因小鼠的胰臟組織進(jìn)行進(jìn)行確定胰島素的免疫染色以檢查TGF-α過(guò)度表達(dá)對(duì)胰島發(fā)育的影響。用免疫過(guò)氧化物酶可染色的幾內(nèi)亞豬抗人胰島素血清(Linco,Eureka,M0)來(lái)鑒定在經(jīng)TGF-α誘導(dǎo)的化生小管中的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞，用一只預(yù)先經(jīng)過(guò)免疫的幾內(nèi)亞豬的血清作為對(duì)照。在5μ的石蠟切片上，使用一個(gè)單克隆的兔抗胃泌激素抗體，用Sternberger的過(guò)氧化物酶/抗過(guò)氧化物酶方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。見(jiàn)Sternberger,L.A.,免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry)，第二版(1979)NY:Wiley.104-170。計(jì)點(diǎn)(Point-Counting)形態(tài)測(cè)定胰島、管道、或者間質(zhì)細(xì)胞的相對(duì)體積使用在Weibel,E.R.,Lab Investig.,12:131-155(1963)中所述的計(jì)點(diǎn)方法進(jìn)行量化。在400×的放大倍數(shù)下，從切片一個(gè)角落的一個(gè)隨機(jī)的點(diǎn)開(kāi)始，用一個(gè)25點(diǎn)的目鏡格子對(duì)每個(gè)新的視野進(jìn)行記分。通過(guò)使用載物臺(tái)微米計(jì)的記號(hào)來(lái)沒(méi)有偏見(jiàn)但卻全面地選擇視野。將被血管、脂肪、管道、淋巴結(jié)、或者小葉間空間中途截取的空間減去以得出胰臟的總面積。在每一區(qū)域(block)計(jì)數(shù)了用載物臺(tái)微米計(jì)系統(tǒng)地進(jìn)行選擇的108個(gè)視野的至少5000個(gè)點(diǎn)，相對(duì)的胰島體積被計(jì)算為在胰島組織中被截取的數(shù)目除以在胰臟組織中被截取的數(shù)目。絕對(duì)的胰島質(zhì)量或者胰島被計(jì)算為相對(duì)的胰島體積乘以胰臟的重量。見(jiàn)Lee,H.C.等，內(nèi)分泌學(xué)(Endoerinology)，124:1571-1575(1989)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用Student氏針對(duì)不成對(duì)數(shù)據(jù)的t檢測(cè)法對(duì)不同方法之間的差異進(jìn)行顯著差異的比較。
實(shí)施例1TGF轉(zhuǎn)基因胰臟中胰島素生產(chǎn)的測(cè)定免疫過(guò)氧化物酶染色顯示在TGF-α轉(zhuǎn)基因胰臟的化生管中存在數(shù)目眾多的胰島素染色細(xì)胞(圖1A)，而在非轉(zhuǎn)基因的管中胰島素染色細(xì)胞則實(shí)質(zhì)上不存在(少于6.1％)。在400×的最終放大倍數(shù)下可記錄到每只動(dòng)物有至少600個(gè)小導(dǎo)管細(xì)胞，而觀察到的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞在TGF-α轉(zhuǎn)基因小鼠的化生管中的幾率則為6.0±0.9％(n=5)。偶然有導(dǎo)管細(xì)胞胰島素染色的強(qiáng)度與毗鄰的胰島的染色強(qiáng)度一樣，但是大多數(shù)的染色強(qiáng)度均較弱(圖1B)。導(dǎo)管細(xì)胞胰島素染色水平的低下與在發(fā)育中胰臟的導(dǎo)管中被報(bào)道的分化初期細(xì)胞的類似。Pictet,R.和W.J.Rutter，胚胎內(nèi)分泌胰腺的發(fā)育(Development of the embryonicendocrine pancreas)，內(nèi)分泌學(xué)(Endocrinology)，生理學(xué)手冊(cè)(Handbook of Physiology)，R.O.Greep和E.B.Astwood編輯(1972)，美國(guó)生理學(xué)協(xié)會(huì)(American Physiological Society):Washington，D.C.25-66；以及Alpert，S.等，細(xì)胞(Cell)，53:295-308(1988)。
然而，盡管在化生管中的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞增多，TGF-α轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島質(zhì)量并沒(méi)有增加。用計(jì)點(diǎn)形態(tài)測(cè)定量化的胰島質(zhì)量在TGF-α轉(zhuǎn)基因胰臟中為2.14mg±0.84(平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=5)，而在非轉(zhuǎn)基因的同窩出生仔畜中為1.93mg±0.46(n=6)。
因此，單純的TGF-α的過(guò)度表達(dá)并不影響這些分化初期的導(dǎo)管細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆只囊葝u。這意味著胰島的分化需要其他的在TGF-α轉(zhuǎn)基因小鼠的成熟胰臟中所缺少的因子。由于分化初期胰島前體細(xì)胞的分化是在胚胎發(fā)育的晚期發(fā)生的，調(diào)控這一轉(zhuǎn)化的因子很可能在這一階段在胰島中被表達(dá)。在發(fā)育中胰島中被表達(dá)的因子中有胃腸肽-胃泌激素。
實(shí)施例2胰臟胃泌激素從INSGAS轉(zhuǎn)基因的表達(dá)為了檢查胃泌激素在調(diào)控胰島分化中的可能作用，創(chuàng)造了一種表達(dá)嵌合的胰島素啟動(dòng)子-胃泌激素(INSGAS)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，在上述的轉(zhuǎn)基因中，胰島素啟動(dòng)子指導(dǎo)胃泌激素轉(zhuǎn)基因(圖2A)的胰臟特異性的表達(dá)。與胃泌激素基因不同的是，胰島素基因的表達(dá)在出生后并沒(méi)有被關(guān)掉。這樣，INSGAS轉(zhuǎn)基因?qū)е挛该诩に卦诔墒斓囊扰K中持續(xù)地進(jìn)行表達(dá)。
INSGAS轉(zhuǎn)基因包括大鼠胰島素I基因位于5’端的370 bp的DNA以及第一個(gè)非編碼的外顯子。Cordell，B.等，細(xì)胞(Cell)18:533-543(1979)。它被連接到含有人胃泌激素基因(它編碼前胃泌激素原肽前體)1.5kb的內(nèi)含子1和外顯子2和3的BamH1-EcoR1片段。Wiborg，O.等，美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，81:1067-1069(1984)y；以及Ito等，美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),81:4662-4666(1984)。分離一段4.8kb的INSGAS片段并將其微注射到近親繁殖的FVB，即單細(xì)胞小鼠胚胎中。Hogan,B.等，小鼠胚胎的操作實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Manipulating themouse embryo:A laboratory manual),(1986)NY:Cold SpringHarbor。
轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小鼠的胰臟和胃提取物中的胃泌激素的免疫反應(yīng)性是通過(guò)放射免疫測(cè)定方法用抗血清2604進(jìn)行測(cè)定的(Rehfeld,J.等，Scand.J.Clin.Lab.Invest.,30:361-368(1972))，上述的抗血清2604對(duì)胃泌激素的具有生物學(xué)活性的酰胺化C末端具有特異性。
根據(jù)用一種胃泌激素單克隆抗體對(duì)胰臟組織進(jìn)行的免疫染色，可觀察到INSGAS轉(zhuǎn)基因發(fā)生β細(xì)胞特異性的胃泌激素表達(dá)。
將從八周齡的INSGAS轉(zhuǎn)基因小鼠的不同組織分離的RNA的RNA印跡與人胃泌激素外顯子2探針進(jìn)行雜交。在胰臟中觀察到高水平的胃泌激素轉(zhuǎn)基因mRNA，但在任何其他的組織中則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。這一探針對(duì)人胃泌激素基因具有特異性；在INSGAS的竇RNA沒(méi)有發(fā)現(xiàn)雜交，而非轉(zhuǎn)基因的FVB小鼠則表達(dá)高水平的鼠胃泌激素mRNA。來(lái)源于INSGAS轉(zhuǎn)基因小鼠的胰臟提取物的放射免疫測(cè)定顯示了高水平的胃泌激素免疫反應(yīng)性，該水平超出了從內(nèi)源性鼠基因(圖2B)表達(dá)的胃中庭(gastric atrium)中胃泌激素的含量。在非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈?圖2B)的胰臟提取物中沒(méi)有檢測(cè)到胃泌激素的免疫反應(yīng)性。胃泌激素的放射免疫測(cè)定對(duì)羧基端酰胺化的前體具特異性，顯示胃泌激素肽前體在翻譯后被有效地加工為具生物學(xué)活性的肽。對(duì)一種胃泌激素單克隆抗體的免疫組織化學(xué)測(cè)定顯示了胃泌激素的胰臟β胰島細(xì)胞特異性表達(dá)。
雖然INSGAS轉(zhuǎn)基因小鼠在出生后的胰臟中有高水平的表達(dá)(圖2B)，但是INSGAS轉(zhuǎn)基因小鼠的胰臟組織學(xué)與對(duì)照是相同的。由計(jì)點(diǎn)形態(tài)測(cè)定法(Weibel,E.R.,Lab Investig.12:131-155(1963))量化的胰島質(zhì)量與5-6周齡的INSGAS小鼠(1.78±0.21mg,n=11)以及相同年齡的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?1.74±0.18mg,n=11)是相同的。因此，單純的胃泌激素在出生后胰臟中的連續(xù)表達(dá)并不刺激胰島細(xì)胞的生長(zhǎng)。
實(shí)施例3TGF-α和TGF-α/INSGAS胰臟的組織學(xué)檢查胃泌激素對(duì)胰島生長(zhǎng)的刺激可能需要其他生長(zhǎng)因子的刺激來(lái)創(chuàng)造一個(gè)細(xì)胞的應(yīng)答性的種群。因此，對(duì)在TGF-α轉(zhuǎn)基因小鼠中胃泌激素刺激的影響進(jìn)行了研究，上述的小鼠具有化生管，這些化生管含有與分化初期的胰島前體類似的胰島素表達(dá)細(xì)胞。為了評(píng)估胃泌激素和TGF-α的相互作用，飼養(yǎng)了三組具有相同F(xiàn)VB/CDI株系遺傳背景的小鼠非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?、TGF-α單轉(zhuǎn)基因以及INSGAS/TGF-α雙轉(zhuǎn)基因。所有的三組小鼠在三周齡時(shí)都被放置于50mM的ZnCl2上。在17周齡時(shí)，將動(dòng)物處死并將胰臟取出以供組織學(xué)評(píng)估之用。取自TGF-α以及INSGAS/TGF-α小鼠的胰臟總體的形態(tài)學(xué)外觀是類似的具有彈性、堅(jiān)固并且緊密，不同于柔軟彌散的對(duì)照胰臟。當(dāng)用RNA印跡分析(數(shù)據(jù)沒(méi)有給出)和放射免疫測(cè)定進(jìn)行測(cè)量時(shí)，TGF-α在TGF-α和TGF-α/INSGAS兩組中的表達(dá)是等同的。胰臟TGF-α免疫反應(yīng)活性肽的水平在TGF-α和INSGAS/TGF-α小鼠中分別為12.2±1以及18.9±8納克/毫克蛋白(平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差)。
制作了來(lái)源于所研究的三組小鼠(A:INSGAS/TGF-α；B:FVB/CD1對(duì)照；以及C:TGF-α)胰臟的經(jīng)蘇木精染色的石蠟切片的光學(xué)顯微照相。INSGAS/TGF-α胰臟的一些區(qū)域管道復(fù)合物增加，間隙細(xì)胞質(zhì)也稍有增加；圖3A所示的視野具有在五只動(dòng)物中觀察到的最為異常的形態(tài)學(xué)；胰臟的大部分與對(duì)照是不能區(qū)別的(圖3B)。在對(duì)照中，TGF-α胰臟的視野(圖3C)是典型的，它顯示了間隙細(xì)胞質(zhì)和纖維癥，并結(jié)合有如Jhappan等人(見(jiàn)上)所述的紅潤(rùn)管化生(florid ductularmetaplasia)。
胰臟胃泌激素與TGF-α協(xié)同地相互作用以增加胰島的質(zhì)量并抑制由TGF-α過(guò)度表達(dá)所誘導(dǎo)的管化生。讓純合的MT-TGF-α(MT-42)小鼠與雜合的INSGAS小鼠交配得到的后代或者是TGF-α單轉(zhuǎn)基因，或者是含有INSGAS和TGF-α兩個(gè)轉(zhuǎn)基因(INSGAS/TGF-α)的雙轉(zhuǎn)基因。由于INSGAS是FVB株系而TGF-α是CD1株系，所以讓TGF-α純合子和CD1對(duì)照(CON)都與FVB交配以使所有的三組小鼠都具有FVB/CD1株系背景。從第三周開(kāi)始用50mM ZnCl2對(duì)小鼠進(jìn)行處理直到在17周齡將其處死。取出胰臟，稱重，以類似的取向放置于盒子內(nèi)，用Bouin氏溶液固定后包埋于石蠟中。取用每只動(dòng)物的一個(gè)隨機(jī)的切片，用計(jì)點(diǎn)形態(tài)測(cè)定法(Weibel,E.R.,Lab Investig.,12:131-155(1963))來(lái)量化導(dǎo)管和胰島的相對(duì)體積。在170×的放大倍數(shù)下，組織上的至少2000個(gè)點(diǎn)被計(jì)數(shù)為一個(gè)50點(diǎn)格子的截?cái)?；?jì)數(shù)覆蓋整個(gè)切片，但不重復(fù)。導(dǎo)管或者胰島的質(zhì)量是通過(guò)將相對(duì)體積與動(dòng)物胰臟的重量相乘來(lái)計(jì)算的。為了使不同的平均體重標(biāo)準(zhǔn)化，將質(zhì)量表達(dá)為微克/克體重。所示的結(jié)果是每組5-6只動(dòng)物的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，如Student氏t檢驗(yàn)(p＜0.05)所確定的。
胃泌激素從INSGAS轉(zhuǎn)基因的表達(dá)減少了由TGF-α過(guò)度表達(dá)所引起的管化生。在第17周，INSGAS/TGF-α小鼠的胰臟組織學(xué)(圖3A)與對(duì)照胰臟(圖3B)的相似程度比TGF-α小鼠的(圖3C)要高。
這通過(guò)對(duì)TGF-α和INSGAS/TGF-α轉(zhuǎn)基因小鼠以及FVB/CDl對(duì)照中的胰臟導(dǎo)管質(zhì)量用計(jì)點(diǎn)形態(tài)測(cè)定法(圖4A)進(jìn)行量化而得到證實(shí)。在INSGAS胰臟中胃泌激素和TGF-α的共表達(dá)同時(shí)也顯著地增加了胰島相對(duì)于對(duì)照(圖4D)的質(zhì)量，然而胰島的質(zhì)量在僅有單一的TGF-α或者胃泌激素表達(dá)時(shí)并沒(méi)有增加。三組小鼠的血糖濃度并沒(méi)有顯著的差別。
實(shí)施例4TGF-α和胃泌激素對(duì)正常小鼠的胰臟胰島素含量的影響這一實(shí)驗(yàn)被設(shè)計(jì)用于研究對(duì)經(jīng)TGF-α、胃泌激素、或者TGF-α與胃泌激素相結(jié)合處理的非糖尿病動(dòng)物，相比于對(duì)照動(dòng)物(未經(jīng)處理)，的胰臟胰島素含量的影響。將正常的Wistar大鼠分組(n=5)用于以下四組處理。
組1TGF-α將重組人TGF-α再生于無(wú)菌的含有0.1％BSA的鹽水，用0.8微克/天的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)施用，為期10天。
組2胃泌激素將合成的大鼠胃泌激素I溶解在非常稀的氫氧化銨中并再生于無(wú)菌的含有0.1％BSA的鹽水中，用0.8微克/天的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)施用，為期10天。
組3 TGF-α+胃泌激素將上述制劑的組合以上述的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)施用，為期10天。
組4僅用賦形劑對(duì)對(duì)照動(dòng)物進(jìn)行腹膜內(nèi)施用，為期10天。
在研究階段(10天)的終了，將所有的動(dòng)物處死并如下取出胰臟樣品在每只大鼠胰臟的分開(kāi)的具有代表性的位置上取出五個(gè)胰臟的活組織切片檢查標(biāo)本(1-2毫克)并立即速凍于液氮中以供胰島素含量分析之用。為了胰臟胰島素含量分析，將速凍的胰臟樣品迅速解凍，在蒸餾水中超聲斷裂并在進(jìn)行胰島素放射免疫測(cè)定(Green等，(1983)糖尿病(Diabetes)32:685-690)之前取出等分樣品用于蛋白質(zhì)確定和酸/乙醇提取。根據(jù)蛋白含量校正胰臟胰島素的含量并將其表達(dá)為微克胰島素/毫克胰臟蛋白。所有的值都被計(jì)算為平均值±SEM，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性是用Student氏2-樣t-檢驗(yàn)評(píng)估的。
表1用TGF-α和胃泌激素對(duì)正常的大鼠進(jìn)行處理處理胰臟胰島素含量(微克胰島素/毫克蛋白)對(duì)照 20.6±6.0TGF-α 30.4±7.4*胃泌激素 51.4±14.0**TGF-α+胃泌激素 60.6±8.7****TGF-α與對(duì)照相比，p=0.34；**胃泌激素與對(duì)照相比，p=0.11；***TGF-α和胃泌激素的組合物與對(duì)照相比，p=0.007.
如上面的表1所示，在經(jīng)過(guò)TGF-α+胃泌激素處理的動(dòng)物中胰臟胰島素的含量相比對(duì)照動(dòng)物顯著增加(p=0.007)；比起對(duì)照動(dòng)物，其胰臟胰島素含量增加大約三倍。這些數(shù)據(jù)支持了這樣一個(gè)假說(shuō)，即TGF-α和胃泌激素的結(jié)合確實(shí)增加了功能性胰島β-細(xì)胞的體積。這一增加反映了β-細(xì)胞增生(數(shù)目增加)，而并非β-細(xì)胞肥大(個(gè)體β-細(xì)胞尺寸的增加)，的總體狀況。
實(shí)施例5TGF-α和胃泌激素的結(jié)合對(duì)糖尿病動(dòng)物胰臟胰島素含量的影響第二個(gè)實(shí)驗(yàn)被設(shè)計(jì)用于確定TGF-α和胃泌激素的組合是否可以增加糖尿病動(dòng)物(經(jīng)鏈脲霉素(STZ)處理)中胰臟胰島素的含量，使其達(dá)到可以與正常(未經(jīng)STZ處理的)動(dòng)物相比較的水平。
給正常的Wistar大鼠單次靜脈內(nèi)注射劑量為80毫克/公斤體重的STZ。這一劑量的STZ是用以確保讓研究動(dòng)物患上糖尿病但又保留有功能性的、但是減小的β-細(xì)胞團(tuán)塊。在施用前將STZ迅速溶解于冰冷的10mM檸檬酸緩沖液中。每日對(duì)動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)控；持續(xù)性的糖尿病通過(guò)糖尿來(lái)表征，并通過(guò)非禁食血糖測(cè)定來(lái)證實(shí)。在糖尿病誘導(dǎo)一周后，將大鼠隨機(jī)分為如下兩組(n=6)。
組1TGF-α+胃泌激素給STZ糖尿病大鼠單次腹膜內(nèi)注射重組人TGF-α和合成的大鼠胃泌激素1的組合物；兩種制劑的施用劑量均為0.8微克/天，為期10天。
組2對(duì)照組僅給STZ糖尿病大鼠腹膜內(nèi)注射單純的賦形物，為期10天。
在研究階段的終了，將所有的動(dòng)物處死并將胰臟樣品取出，如實(shí)施例4中所述進(jìn)行分析，其結(jié)果示于表2。
表2用TGF-α和胃泌激素對(duì)鏈脲霉素大鼠進(jìn)行處理處理 胰臟胰島素含量(微克胰島素/毫克蛋白)對(duì)照(僅用STZ) 6.06±2.1STZ加TGF-α+胃泌激素 26.7±8.9STZ對(duì)糖尿病的誘導(dǎo)是成功的并產(chǎn)生了適度的但卻持續(xù)的高血糖癥。并沒(méi)有追求完全的(insulinopenic胰島素分泌減少的)胰島素缺失(insulinopaenia)，以便確保研究動(dòng)物保持有一個(gè)功能性的、但減小的β-細(xì)胞團(tuán)塊。
如上面的表2中所示，對(duì)照的經(jīng)鏈脲霉素處理的動(dòng)物的胰臟胰島素含量還不到正常大鼠含量(20.6±6.0微克胰島素/毫克蛋白，見(jiàn)上面的表1)的三分之一，這是由STZ對(duì)β-細(xì)胞的破壞造成的。在經(jīng)TGF-α和胃泌激素結(jié)合處理的STZ動(dòng)物中，胰臟胰島素的含量是僅接受STZ的動(dòng)物的四倍以上，而且在統(tǒng)計(jì)上與正常大鼠的相同。
糖尿病這種疾病的根本性生理學(xué)缺陷是β-細(xì)胞的不足，其原因在于自身免疫進(jìn)程導(dǎo)致β-細(xì)胞損壞或者是循環(huán)中高水平的葡萄糖所造成的慢性刺激導(dǎo)致β-細(xì)胞分裂潛能竭盡。后者最終導(dǎo)致β-細(xì)胞更新和/或更換的進(jìn)程在某種程度即告妥協(xié)，造成β-細(xì)胞總體上的損失并伴隨著胰臟中胰島素含量的減少。上述的結(jié)果顯示了TGF-α和胃泌激素相結(jié)合可以被用于治療糖尿病，通過(guò)刺激成熟β-細(xì)胞的產(chǎn)生來(lái)使胰臟中胰島素的含量恢復(fù)到非糖尿病的水平。
實(shí)施例6TGF-α和胃泌激素對(duì)經(jīng)STZ誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物中IPGTT的影響給兩組經(jīng)STZ誘導(dǎo)的糖尿病Wistar大鼠(平均體重103克，每組6只)每天分別腹膜內(nèi)注射TGF-α和胃泌激素的組合或者PBS，為期l0天。在第0、6、10天測(cè)定所有大鼠的禁食血糖水平。為了確定胰島素已經(jīng)分泌并且是功能性的，進(jìn)行了IPGTT試驗(yàn)。在第10天，在經(jīng)過(guò)過(guò)夜禁食之后，進(jìn)行了腹膜內(nèi)葡萄糖耐量試驗(yàn)(intraperitonealglucose tolerance test,IPGTT)。從尾靜脈獲取血樣，分別在腹膜內(nèi)注射葡萄糖(劑量為2克/公斤體重)之前、以及注射的30、60、和120分鐘之后進(jìn)行。如上進(jìn)行血糖確定。兩個(gè)研究組在時(shí)間0的血糖水平是類似的，但是在腹膜內(nèi)注射葡萄糖的30、60、以及120分鐘之后經(jīng)TGF-α和胃泌激素處理的大鼠的血糖值比對(duì)照大鼠的減少了50％(見(jiàn)圖5)。
實(shí)施例7TGF-α和胃泌激素對(duì)糖尿病潛伏動(dòng)物體重增加和胰島素含量的影響所獲得的Zucker大鼠有30天齡，大約離肥胖發(fā)育還有10-15天。在如下的研究中，除了糖尿病潛伏Zucker大鼠(遺傳型fa/fa，肥胖和糖尿病常染色體隱性突變)以外，同時(shí)也包括了瘦的非糖尿病同窩出生子畜(遺傳型+/+)。每天通過(guò)確定體重和血糖來(lái)監(jiān)控大鼠的肥胖和糖尿病的發(fā)展情況。糖尿病在Zucker大鼠中的發(fā)作通常開(kāi)始于第45-50天并可以通過(guò)血糖水平的顯著提高(與年齡相當(dāng)?shù)氖菔髮?duì)照的水平相比較)來(lái)確證。
研究包括了如表3中所述的五組(每組5只)大鼠。在第0-10天，用TGF-α和胃泌激素相結(jié)合，或者PBS分別對(duì)組1和組2(瘦的，非糖尿病的)進(jìn)行處理。組3、4、和5包括肥胖的、早期糖尿病的Zucker大鼠，其遺傳型為fa/fa。組3在糖尿病發(fā)作前進(jìn)行15天(第-15至第0天)的組合預(yù)處理并在發(fā)作之后再處理10天(第0-10天)。組4在糖尿病發(fā)作后用TGF-α和胃泌激素組合處理10天，而組5則在同一時(shí)間段用PBS進(jìn)行處理。在研究的終了處死大鼠并取出胰臟。在整個(gè)胰臟的分開(kāi)的具有代表性的位置取出小的活組織用于上述的蛋白和胰島素確定。
在研究的各個(gè)組中，經(jīng)過(guò)預(yù)處理、僅經(jīng)過(guò)處理或者經(jīng)鹽水處理(表3中的組3、4、和5)的肥胖的糖尿病Zucker大鼠的體重并沒(méi)有顯著的區(qū)別。有趣的是，即使延長(zhǎng)TGF-α和胃泌激素的處理的時(shí)間(25天，組3)，體重的增加并不受影響。在誤差范圍內(nèi)，所有組別的體重增加是相同的。
將TGF-α+胃泌激素處理對(duì)肥胖Zucker大鼠禁食血糖水平的影響與相應(yīng)的PBS對(duì)照進(jìn)行了比較。首先禁食血糖水平在第15天時(shí)顯著提高(4.0±0.6相比5.0±0.2)，將這一時(shí)間點(diǎn)選定為為期10天的TGF-α+胃泌激素處理或者PBS對(duì)照的起始點(diǎn)。TGF-α+胃泌激素處里或者PBS處理并沒(méi)有顯著改變禁食血糖的水平。瘦鼠的禁食血糖值比肥胖大鼠(不管是經(jīng)生長(zhǎng)因子還是經(jīng)PBS處理)的要低。
表3
用TGF-α和胃泌激素對(duì)2型糖尿病Zucker大鼠模型進(jìn)行處理的結(jié)果顯示，處理組和對(duì)照組的血糖水平并沒(méi)有顯著的區(qū)別，這可能反映了在延長(zhǎng)禁食(18小時(shí))之后出現(xiàn)短暫的低血糖癥效應(yīng)。免疫組織化學(xué)研究揭示了在經(jīng)TGF-α和胃泌激素處理的動(dòng)物中，胰島素包含細(xì)胞的單個(gè)焦點(diǎn)的數(shù)目比起對(duì)照動(dòng)物有顯著的增加。這些發(fā)現(xiàn)證明在經(jīng)過(guò)TGF-α和胃泌激素處理之后，在成熟大鼠的胰臟中單個(gè)的β-細(xì)胞增加了。有趣的是，這種單個(gè)的β-細(xì)胞焦點(diǎn)在成年的(未經(jīng)刺激的)大鼠胰臟中通常并沒(méi)有被觀察到。這些發(fā)現(xiàn)支持了TGF-α和胃泌激素在1型和2型糖尿病中的治療作用，因?yàn)橹委熓峭瑫r(shí)針對(duì)β-細(xì)胞的再生和復(fù)制的。
本發(fā)明部分基于一些證明在TGF-α誘導(dǎo)的化生管中存在大量胰島素染色細(xì)胞的研究。外分泌腺和內(nèi)分泌腺基因在化生管細(xì)胞中的低水平表達(dá)與在胎兒胰臟發(fā)育早期所見(jiàn)到的分化初期導(dǎo)管細(xì)胞的情形是類似的，這些分化初期胰島素表達(dá)細(xì)胞的增殖和分化導(dǎo)致胰島的形成(再生)。從組織學(xué)的角度，這是在胰島從胰管中萌發(fā)出來(lái)(胰島細(xì)胞增殖癥)的時(shí)候出現(xiàn)的。在MT-42 TGF-α轉(zhuǎn)基因小鼠中，管化生在剛出生后的階段并沒(méi)有觀察到，它只是在四周齡才發(fā)生。這顯示TGF-α的過(guò)度表達(dá)誘導(dǎo)了胰島素在管上皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，而不是延長(zhǎng)了在胎兒胰管中發(fā)現(xiàn)的胰島前體的持續(xù)。雖然化生管含有大量的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞，但是在TGF-α轉(zhuǎn)基因小鼠中胰島質(zhì)量相比對(duì)照并沒(méi)有增加。上面所報(bào)告的研究證明了在哺乳動(dòng)物成熟胰臟的管上皮細(xì)胞中，完整的胰島細(xì)胞再生在體內(nèi)被胃泌激素/縮膽囊素受體配體(如胃泌激素)以及/或者EGF受體配體(如TGF-α)的刺激所重新激活。對(duì)TGF-α和胃泌激素在胰臟中的轉(zhuǎn)基因過(guò)度表達(dá)進(jìn)行了研究報(bào)道，這些研究闡明了胰臟胃泌激素表達(dá)在胰島發(fā)育中的作用并顯示TGF-α和胃泌激素在調(diào)控胰島發(fā)育的過(guò)程中都各自發(fā)揮著作用。因此，殘余的多能性胰管細(xì)胞再生性地分化為成熟的胰島素分泌細(xì)胞是一種治療糖尿病的可行的方法，通過(guò)治療性地結(jié)合施用這些因子或者組合物以便給它們?cè)谝扰K中的原位表達(dá)提供條件。
本發(fā)明并不受此處所述的具體實(shí)施例的限制。通過(guò)參考上述的說(shuō)明和附圖而顯而易見(jiàn)的各種修改都?xì)w屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在本文中引用了各種不同的文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)中所揭露的全部?jī)?nèi)容都作為參照結(jié)合于本發(fā)明之中。
權(quán)利要求
1．一種用于對(duì)需要治療糖尿病的個(gè)體進(jìn)行治療的方法，上述的方法包括給上述的個(gè)體施用一種組合物，該組合物提供了至少一種選自胃泌激素/縮膽囊素受體配體和EGF受體配體的受體配體，其數(shù)量足以使胰島前體細(xì)胞分化為成熟的胰島素分泌細(xì)胞。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中上述的至少一種受體配體是一種選自EGF1-53、EGF1-48、或其EGFI-47或EGF1-49同類物的EGF受體配體。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中上述的EGF1-53、EGF1-48、或其EGFI-47或EGF1-49同類物是人的EGF1-53、EGF1-48、或其EGFI-47或EGF1-49或其同類物。
4．一種給需要治療糖尿病的患者提供一個(gè)成熟的胰島素分泌β-細(xì)胞種群的方法，上述的方法包括給上述的患者移植經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的胰島，上述的胰島在移植之前已經(jīng)被提供了足量的至少一種選自胃泌激素/縮膽囊素受體配體和EGF受體配體的受體配體以誘導(dǎo)上述胰島的成熟胰島素分泌β-細(xì)胞的增殖。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中上述的糖尿病是2型糖尿病。
6．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中上述的胃泌激素/縮膽囊素受體配體是一種胃泌激素。
7．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中上述的表皮生長(zhǎng)因子受體配體是TGF-α或者是一種選自EGF1-53、EGF1-48、或其EGF1-47或EGF1-49同類物的EGF。
8．一種用于擴(kuò)增胰臟β-細(xì)胞種群的方法，上述的方法包括給上述的胰臟β-細(xì)胞提供足量的胃泌激素/縮膽囊素受體配體以及表皮生長(zhǎng)因子受體配體以誘導(dǎo)上述胰臟β-細(xì)胞的增殖，由此來(lái)擴(kuò)增胰臟β-細(xì)胞的種群。
9．一種組合物，包括胰臟β-細(xì)胞，其中上述的培養(yǎng)物是通過(guò)給胰島提供足量的胃泌激素受體興奮劑和表皮生長(zhǎng)因子受體激動(dòng)劑以誘導(dǎo)上述胰臟β-細(xì)胞的增殖來(lái)獲得的。
10．一種對(duì)需要治療糖尿病的個(gè)體進(jìn)行治療的方法，該方法包括給上述的個(gè)體施用一種組合物，該組合物包括至少一種選自蛋白樣的胃泌激素/縮膽囊素受體配體和蛋白樣的EGF受體配體的受體配體，其數(shù)量足以使胰島前體細(xì)胞分化為成熟的胰島素分泌細(xì)胞，其中上述的組合物是全身性施用的。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中上述的蛋白質(zhì)的胃泌激素/縮膽囊素受體配體是胃泌激素。
12．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中上述的蛋白質(zhì)的EGF受體配體是TGF-α。
13．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中上述的糖尿病是2型糖尿病。
14．一種用于在需要的個(gè)體中刺激胰島細(xì)胞再生的方法，上述的方法包括給上述的個(gè)體施用一種組合物，該組合物包括至少一種選自胃泌激素/縮膽囊素受體配體以及EGF受體配體的受體配體，其數(shù)量足以使胰島前體細(xì)胞分化為成熟的胰島素分泌細(xì)胞，其中上述的組合物是全身性施用的。
15．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中上述的個(gè)體。
16．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中上述的胃泌激素/縮膽囊素受體配體和上述的EGF受體配體都被施用。
17．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中上述的胃泌激素/縮膽囊素受體配體和上述的EGF受體配體當(dāng)中至少一個(gè)是蛋白樣的受體配體。
18．一種用于對(duì)需要的個(gè)體進(jìn)行糖尿病治療的方法，包括給個(gè)體施用一種組合物，該組合物提供了一種胃泌激素/縮膽囊素受體配體和一種EGF受體配體，其數(shù)量足以使胰島前體細(xì)胞分化為成熟的胰島素分泌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了用以對(duì)需要治療糖尿病的個(gè)體進(jìn)行治療的方法和組合物。該方法包括給患者施用一種可以提供一種胃泌激素/縮膽囊素受體配體(如胃泌激素),以及/或者一種表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體配體(如EGF－α)的組合物,其劑量足以有效地促進(jìn)胰島前體細(xì)胞分化為成熟的胰島素分泌細(xì)胞。該組合物可以全身性施用,或者也可以通過(guò)被通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)補(bǔ)充有胃泌激素/縮膽囊素受體配體基因(如前胃泌激素原肽前體基因)以及/或者EGF受體配體基因(如TGF－α基因)的細(xì)胞進(jìn)行原位表達(dá)。該方法還包括給患者移植經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的胰島,在上述的胰島中,成熟的胰島素分泌β細(xì)胞通過(guò)暴露于胃泌激素/縮膽囊素受體配體以及EGF受體配體而得以增殖。
文檔編號(hào)A61K45/00GK1308544SQ99806777
公開(kāi)日2001年8月15日 申請(qǐng)日期1999年10月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月29日
發(fā)明者I·帕里克, A·拉尼, R·V·納迪, S·J·布蘭德 申請(qǐng)人:瓦拉塔藥品公司, 綜合醫(yī)院公司