專利名稱：Hox和含有同源域的蛋白質(zhì)結(jié)合的抑制及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控領(lǐng)域。更具體的，本發(fā)明涉及Hox與含有同源域的蛋白質(zhì)結(jié)合的抑制及其用途。
相關(guān)技術(shù)的描述骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)(一種TGFβ亞類)是調(diào)控胚胎發(fā)育、脊椎動(dòng)物圖式發(fā)育(patterning)和間充質(zhì)細(xì)胞分化的強(qiáng)大生長因子(10,11)。被鑒定為骨誘導(dǎo)生長因子的BMP-2/4，是脊椎動(dòng)物骨骼發(fā)育中重要的信號(hào)分子(12-14)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑的中心是Smad1蛋白，它轉(zhuǎn)位入核，通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體的直接磷酸化來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄(1,3,4)。
在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育的各過程中，都涉及TGFβ超家族的生長因子。已深入研究了TGFβ對(duì)中胚層和骨骼發(fā)育的誘導(dǎo)和圖式發(fā)育的作用。具體的說，TGFβ相關(guān)分子，BMP-2/4誘導(dǎo)骨骼圖式發(fā)育，肢芽生長和骨骼細(xì)胞分化。在同一過程中還涉及Hox和含轉(zhuǎn)錄因子的同源域(homeodomain)，而且已提出，它們作為BMP-4的下游調(diào)控來介導(dǎo)其作用。然而，對(duì)于理解hox蛋白在胚胎發(fā)育中如何起作用幾乎毫無進(jìn)展。雖然hox蛋白是DNA結(jié)合蛋白，但關(guān)于其天然DNA反應(yīng)元件和它們在轉(zhuǎn)錄中的作用幾乎毫無所知。
在脊椎動(dòng)物中，有39種含Hox同源框(homeobox)的轉(zhuǎn)錄因子基因，分成四個(gè)分開的染色體簇，它們在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育的過程和圖式發(fā)育中起著關(guān)鍵作用(15,16)。這39種基因根據(jù)進(jìn)化過程中祖先同源框簇的復(fù)制、序列相似性和簇中的位置再分成13個(gè)共生同源組(17)。已證明各共生同源組負(fù)責(zé)一具體胚胎功能域或結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生(16)。在Hox共生同源組Ⅷ中有三個(gè)成員Hoxb-8、Hoxc-8和H0xd-8(17)。在脊椎動(dòng)物肢芽發(fā)育中需要Hox基因，具體說，已提出Hoxb-8是與激活Sonic hedgehog基因(四肢發(fā)育中的關(guān)鍵中介體)有關(guān)的一種轉(zhuǎn)錄因子(18,19)。另外，RNA印跡分析顯示在人胚胎發(fā)育中脊髓、脊椎和四肢中高水平，心臟中低水平表達(dá)Hoxc-8(20)。BMP-2/4激活了Hox基因的表達(dá)，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，并控制發(fā)育中的四肢跨過前后(a-p)軸的圖式發(fā)育(21)。
現(xiàn)有技術(shù)在刺激成骨細(xì)胞分化和骨形成的方法上是不足的?，F(xiàn)有技術(shù)在通過Hox蛋白和/或含同源框的蛋白調(diào)控轉(zhuǎn)錄的方法上也是不足的。本發(fā)明填補(bǔ)了本領(lǐng)域中該長期的需要和要求。
發(fā)明簡述已將骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)鑒定為與誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化有關(guān)的一種骨誘導(dǎo)生長因子。骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑的中心是Smad1蛋白，它轉(zhuǎn)位入核，通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體的直接磷酸化而激活成骨細(xì)胞專一性基因轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明鑒定了Smad1與Hox和含同源域的蛋白(其常作為轉(zhuǎn)錄阻抑物)的專一性相互作用，其中Smad1和Hoxc-8的結(jié)合以劑量依賴方式抑制了Hoxc-8對(duì)其DNA結(jié)合位點(diǎn)的識(shí)別和結(jié)合。Smad1和Hoxc-8之間的專一性相互作用可用作抑制Hoxc-8和其DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的靶，從而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化并防止骨質(zhì)疏松。Smad1和其它Hox蛋白或含同源框的蛋白的相互作用也可用來調(diào)控其它疾病，如癌癥或心血管疾病。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了在個(gè)體中刺激骨形成的方法，包含的步驟為誘導(dǎo)Smad1和含同源框轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用。優(yōu)選的，該相互作用誘導(dǎo)了編碼骨基質(zhì)蛋白的BMP-反應(yīng)性基因。該誘導(dǎo)導(dǎo)致成骨細(xì)胞和/或成軟骨細(xì)胞分化，進(jìn)而刺激骨形成。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種誘導(dǎo)編碼骨基質(zhì)蛋白基因的方法，包含步驟誘導(dǎo)Smad1和含同源框的轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，其中該相互作用導(dǎo)致編碼骨基質(zhì)蛋白的基因的誘導(dǎo)。具體提供了一種誘導(dǎo)編碼骨橋蛋白的基因的方法，包含步驟誘導(dǎo)Smad1和Hoxc-8之間的相互作用。優(yōu)選的，該相互作用導(dǎo)致除去轉(zhuǎn)錄阻抑物并誘導(dǎo)編碼骨橋蛋白的基因。
在另一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施例中，提供了篩選能刺激骨形成的化合物的方法，包含步驟使細(xì)胞與一種化合物接觸；確定該化合物抑制Hoxc-8和基因結(jié)合的能力。該結(jié)合的抑制導(dǎo)致基因的誘導(dǎo)，這表明該化合物能刺激骨形成。
在另一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施例中，提供了一種在個(gè)體中調(diào)控疾病的方法，包含步驟抑制含同源框的轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控疾病有關(guān)的基因的結(jié)合，其中該抑制除去了含同源框的蛋白對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄性阻抑，并導(dǎo)致那些和調(diào)控疾病有關(guān)的基因的誘導(dǎo)。
下文對(duì)本發(fā)明優(yōu)選例的描述將使本發(fā)明的其它和進(jìn)一步的方面、特征和優(yōu)點(diǎn)變得明顯。這些實(shí)施例為了公開而給出。
附圖簡述因此獲得了上文陳述的本發(fā)明的特征、優(yōu)點(diǎn)和目的，以及其它將變清楚的事情，而且可得到更詳細(xì)的了解。通過參考某些在附圖中描述的實(shí)施例可獲得對(duì)上文簡要總結(jié)的本發(fā)明的更具體的描述。這些圖構(gòu)成了說明書的一部分。然而要注意的是，


了本發(fā)明的優(yōu)選例，因此不是用來限制其范圍。
圖1顯示了在一雙雜交系統(tǒng)中Smad1和Hoxc-8的專一性相互作用。圖1A顯示了Smad1和Hoxc-8之間相互作用的雙雜交生長試驗(yàn)。注意到在帶有pGBT9-Smad1和PAC-Hoxc-8質(zhì)粒的酵母(在缺少His、Leu和Trp的培養(yǎng)基上生長)中的專一性相互作用。圖1B顯示了雙雜交試驗(yàn)的β-gal液體試驗(yàn)。測定了帶有所示質(zhì)粒的酵母菌的β-半乳糖苷酶的活性。圖1C顯示了在折疊實(shí)驗(yàn)中Smad 1和Hoxc-8的專一性相互作用。用[35S]甲硫氨酸通過翻譯來標(biāo)記Hoxc-8蛋白，并和純化的GST-Smad1或GST-蛋白一起培養(yǎng)。然后將樣品和GST-Sepharose一起培養(yǎng)、洗滌、以SDS緩沖液洗脫并在10％SDS-PAGE凝膠上分離。
圖2顯示了Smad1和Hoxc-8相互作用抑制作為阻抑物的Hoxc-8功能。圖2A顯示Hoxc-8專一性結(jié)合Hox DNA結(jié)合元件。單用32P-標(biāo)記的Hox結(jié)合元件(泳道1)或用GST(泳道2)和GST-Hoxc-8(泳道3-10)進(jìn)行EMSA。泳道4-6和8-10含有5、25和100倍分子比過量的未標(biāo)記Hox元件(探針-S)和MSX-2DNA結(jié)合元件(探針-M)。圖2B顯示Smad1以劑量依賴性方式抑制Hoxc-8與其DNA結(jié)合元件的結(jié)合。單用32P-標(biāo)記的Hox結(jié)合元件(泳道1)或用GST(泳道2)、GST-Smad1(泳道3)或GST-Hoxc-8蛋白(泳道4-8)和不同量的GST-Smad1(泳道5-8)進(jìn)行EMSA。圖2C顯示了體內(nèi)Smad1和3與Hoxc-8的相互作用。用或不用ALK3(Q233D)共轉(zhuǎn)染FLAG-尾Smad1和-4和HA-尾Hoxc-8。用抗HA抗體免疫沉淀細(xì)胞裂解物，用抗-FLAG抗體蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)分析了得到的復(fù)合物。用抗-FLAG抗體蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)顯示了Smad1和-4(中)的表達(dá)水平，并用抗-HA抗體顯示了Hoxc-8(底部)的表達(dá)水平。
圖3顯示了骨橋蛋白啟動(dòng)子的Hoxc-8 DNA結(jié)合位點(diǎn)的性質(zhì)。圖3A顯示了在圖3B、3C、3D、3E、3F和3G中EMSA用的骨橋蛋白啟動(dòng)子的DNA探針。圖3B顯示OPN-2 DNA片段含有Hoxc-8結(jié)合位點(diǎn)。用不同的32P-標(biāo)記DNA片段進(jìn)行EMSA:OPN-1(泳道1-3),OPN-2(泳道4-6)和OPN-3(泳道7-9)，和單與探針(泳道1、4和7)，GST(泳道2、5和8)或GST-Hoxc-8(泳道3、6和9)培育。圖3C顯示OPN-5是Hoxc-8的結(jié)合位點(diǎn)。用較小的32P-標(biāo)記的DNA片段進(jìn)行EMSA:OPN-4(泳道1-5),OPN-5(泳道6-10)和OPN-6(泳道11-15)和單與探針(泳道1、6和11)，GST(泳道2、7和12)，GST-Smad1(泳道3、5、8、10、13和15)或GST-Hoxc-8(泳道4、5、9、10、14和15)培育。圖3D顯示Hoxc-8和OPN-5專一性結(jié)合。單用32P-標(biāo)記的OPN-5(泳道1)或用GST-Hoxc-8(泳道2-8)進(jìn)行EMSA。泳道3-5和6-8含有5、25和100倍分子比過量的未標(biāo)記OPN-5和MSX-2 DNA結(jié)合元件(探針-M)。圖3E顯示Smad1以濃度依賴性方式抑制Hosxc-8和OPN-5的結(jié)合。單用32P-標(biāo)記的OPN-5(泳道1)，用1.5微克GST(泳道2)，1.5微克GST-Smad1(泳道3)或0.2微克GST-Hoxc-8蛋白(泳道4-7)和不同量的GST-Smad1(泳道5-7分別是1.5、3和4.5微克)進(jìn)行了EMSA。圖3F顯示Hox蛋白和Smad1和-4但不和Smad2和-3相互作用。測試了Hoxa-9和Hoxc-8 GST融合蛋白(0.2μg)在凝膠移位試驗(yàn)中與Smad1、-2、-3和-4或GST(3微克)相互作用的能力。圖3G顯示Smad不抑制Msx-1和Msx-2含同源域的蛋白與其關(guān)聯(lián)DNA元件結(jié)合。將純化的GST-Msx-1或-Msx-2(0.5μg)和探針-M以及不同Smad(3微克)一起培育。
圖4顯示BMP-2誘導(dǎo)的骨橋蛋白基因轉(zhuǎn)錄是由Hoxc-8結(jié)合位點(diǎn)介導(dǎo)的。圖4A顯示在轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中所用的構(gòu)建物的示意性描述OPN-266是天然骨橋蛋白構(gòu)建物；Hox-pGL3含有和SV40啟動(dòng)子連接的骨橋蛋白Hox結(jié)合位點(diǎn)；mHox-pGL3含有突變的骨橋蛋白Hox結(jié)合位點(diǎn)。圖4B顯示BMP活化骨橋蛋白啟動(dòng)子。將OPN-266質(zhì)粒和Hoxc-8、Smad1或Smad4質(zhì)粒各單獨(dú)或在存在或缺乏ALK3質(zhì)粒的情況下聯(lián)合這三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入C3H10T1/2間充質(zhì)細(xì)胞。圖4C顯示骨橋蛋白Hox結(jié)合位點(diǎn)介導(dǎo)了BMP-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。將Hox-pGL3構(gòu)建物和ALK6或ALK3共轉(zhuǎn)染入C3H10T1/2間充質(zhì)細(xì)胞。圖4D顯示Hox結(jié)合位點(diǎn)的突變廢除了BMP刺激。將Hox-pGL3構(gòu)建物或mHox-pGL3-pGL3對(duì)照質(zhì)粒和ALK6、ALK3或Hoxc-8質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入C3H10T1/2間充質(zhì)細(xì)胞中。分析了表B、C和D中細(xì)胞裂解物的熒光素酶活性(標(biāo)準(zhǔn)化為轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的Renilla熒光素酶水平)。實(shí)驗(yàn)以一式三份重復(fù)兩次。
圖5顯示Smad1的N-末端區(qū)域和Hoxc-8相互作用。圖5A顯示了B組所示的凝膠移位試驗(yàn)中所用的純化GST-Smad1片段的SDS-PAGE全貌圖，和Smad1缺失構(gòu)建物的示意性表現(xiàn)。在谷胱甘肽-瓊脂糖上純化了以氨基酸數(shù)目標(biāo)出的細(xì)菌表達(dá)的GST重組Smad1蛋白。將谷胱甘肽洗脫物加到10％SDS-PAGE上，通過考馬斯藍(lán)染色(左)顯現(xiàn)。用凝膠頂部泳道的分子量標(biāo)記來確定各大小。圖5B顯示Smad1的兩個(gè)區(qū)域賦予Hoxc-8結(jié)合的抑制作用。用純化的GST融合蛋白和衍生自骨橋蛋白啟動(dòng)子～206到～180的[32P]-標(biāo)記探針進(jìn)行凝膠移位試驗(yàn)。泳道1，單為探針；泳道2-16,GST(泳道2)和探針，或僅有GST-Hoxc-8(泳道4)或存在各種大小的Smad1蛋白和GST-Hoxc-8(泳道5-16)。對(duì)兩個(gè)區(qū)域(MH1的aa101-145和MH1-接頭連接區(qū)的148-191)進(jìn)行作圖，(證明這兩個(gè)區(qū)域)對(duì)相互作用已足夠(泳道14和16)。圖5C顯示Hoxc-8和DNA結(jié)合受到Smad1片段抑制是劑量依賴性的。將Hoxc-8與相同探針在不存在(泳道1)和存在Smad1片段101-145(泳道2-4)或148-191(泳道5-7)時(shí)培育(在相連續(xù)泳道之間截短的Smad1濃度呈2-倍增加)。
圖6顯示Hoxc-8的同源域和Smad1相互作用。圖6A顯示用于相互作用研究的Hoxc-8的各種缺失突變的示意性說明。各突變物的大小用氨基酸殘基標(biāo)出。CR1，保守域1；HP，六肽；HDC，同源域及其C-末端延伸；和HD，同源域。圖6B顯示在酵母雙雜交系統(tǒng)中Smad1和Hoxc-8之間的相互作用。用pACT2(對(duì)照)或含有標(biāo)出的不同長短Hoxc-8cDNA的pACT2，轉(zhuǎn)化含有質(zhì)粒pGBT9/Smad1的酵母菌株Y190。分析了轉(zhuǎn)化子(克隆)的β-半乳糖苷酶活性，對(duì)細(xì)胞密度數(shù)值作了標(biāo)準(zhǔn)化。各條圖代表平均數(shù)(三次獨(dú)立測定的SD)。圖6C顯示Hoxc-8的同源域及其C-末端延伸涉及和Smad MH1區(qū)域的相互作用。將細(xì)菌表達(dá)的GST-HDC和圖5中所用的相同探針在不存在(泳道4)和存在(泳道5-16)如頂部標(biāo)出的不同Smad缺失一起培養(yǎng)。陰性對(duì)照包括單用探針(泳道1)，用GST(泳道2)，和用GST-Smad1(泳道3)。圖6D顯示Hoxc-8的同源域和各種Smad1衍生物相互作用。在與表C中相似的凝膠移位試驗(yàn)中分析了GST-HD的結(jié)合活力。
圖7顯示含有Hoxc-8相互作用區(qū)的Smad1功能域誘導(dǎo)骨細(xì)胞分化。圖7A顯示Smad1-NL,Smad1-L和Smad1-M的構(gòu)建物。用pTet-Splice載體來產(chǎn)生Smad1-NL(aa3-276),-L(aa145-276)和-M(aa104-191)的四環(huán)素(Tet)-調(diào)控哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒。將核定位信號(hào)(NLS)與各構(gòu)建物融合，使之表達(dá)截短的蛋白質(zhì)進(jìn)入核。圖7B顯示Smad1片段的表達(dá)是Tet調(diào)控的。將表A中顯示的構(gòu)建物永久轉(zhuǎn)染入2T3成骨前體細(xì)胞，而在不存在或存在Tet下培養(yǎng)細(xì)胞2天后抽提出總RNA。將5毫克來自所標(biāo)示克隆的RNA和[32P]-標(biāo)記的相應(yīng)cDNA探針用于狹線印跡雜交試驗(yàn)(Bio-Rad)。通過Tet撤除誘導(dǎo)各Smad1片段的表達(dá)。圖7C顯示Smad1的Hoxc-8相互作用域誘導(dǎo)了堿性磷酸酶的活性。將帶有pTet-Splice載體(載體)，pTet/Splice/Smad1-NL(Smad1-NL),-Smad1-L,或Smad1-M的2T3細(xì)胞在存在或不存在Tet下培養(yǎng)，在指定日裂解細(xì)胞(x-軸)。如本文所述測定堿性磷酸酶的活性，對(duì)于蛋白內(nèi)容物數(shù)值作了標(biāo)準(zhǔn)化。各直方條代表至少3個(gè)獨(dú)立的測量。圖7D顯示Smad1片段誘導(dǎo)了2T3克隆中礦物基質(zhì)形成。將指定的穩(wěn)定克隆在存在或不存在Tet或存在100ng/ml BMP-2(BMP-2)下培養(yǎng)12天。然后固定細(xì)胞，并用von Kossa法染色。在用BMP-2處理的細(xì)胞中，并在Smad1表達(dá)系的Hoxc-8相互作用域中形成了礦物晶體(黑點(diǎn))。
圖8顯示Hoxc-8的過度表達(dá)誘導(dǎo)了高水平的堿性磷酸酶活性。用Hoxc-8的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(pcDNA3/Hoxc-8)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染2T3細(xì)胞。用狹線印跡雜交選出陽性克隆并如圖7所述分析其堿性磷酸酶活性。顯示了一式三份的平均值和SD。
圖9顯示提出的Smad1的Hoxc-8相互作用域模擬了BMP信號(hào)傳導(dǎo)，并誘導(dǎo)骨細(xì)胞分化的機(jī)制的一種模式。Hoxc-8阻抑了處于基點(diǎn)的多能性和可自我更新的干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄。當(dāng)Smad1-Hoxc-8相互作用域表達(dá)時(shí)，它們進(jìn)入核并結(jié)合Hoxc-8。Smad1片段和Hoxc-8的相互作用抑制了Hoxc-8與骨標(biāo)記基因(如骨橋蛋白)中其相關(guān)DNA元件結(jié)合，然后阻抑了Hoxc-8并激活基因轉(zhuǎn)錄，并因此誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的形成。
發(fā)明詳述TGB-β超家族中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)需要兩類絲氨酸/蘇氨酸跨膜激酶受體的相互作用。信號(hào)通過Smad蛋白的直接磷酸化介導(dǎo)。Smad2和Smad3通過TGFβ和活化素而磷酸化(2,3)，而Smad1和Smad5具體是由骨形態(tài)發(fā)生蛋白(它是TGF-β超家族的成員(4,5))誘導(dǎo)的。磷酸化后，Smad蛋白和共同伙伴，Smad4，相互作用，并轉(zhuǎn)位入核，在核中該復(fù)合物征集DNA結(jié)合蛋白來激活專一性基因轉(zhuǎn)錄(4,6-9)。然而，還未鑒定出骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)傳導(dǎo)中涉及的DNA結(jié)合蛋白。
本發(fā)明證明Smad能專一性和Hoxc-8(同源域轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一)相互作用，以劑量依賴性方式抑制Hoxc-8與其DNA結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。Hoxc-8作為轉(zhuǎn)錄阻抑物起作用，并在骨組織中優(yōu)勢表達(dá)。另外，從骨橋蛋白基因的5′側(cè)翼區(qū)域確定了Hoxc-8結(jié)合位點(diǎn)，其表達(dá)由BMP-2/4迅速誘導(dǎo)。看來骨形態(tài)發(fā)生蛋白一誘導(dǎo)的骨橋蛋白基因轉(zhuǎn)錄是通過Hoxc-8結(jié)合位點(diǎn)介導(dǎo)的。
本發(fā)明針對(duì)一種在個(gè)體中刺激骨形成的方法，包含步驟誘導(dǎo)Smad1和含同源框的轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，其中該相互作用誘導(dǎo)了編碼骨基質(zhì)蛋白(導(dǎo)致成骨細(xì)胞和/或成軟骨細(xì)胞分化，因而刺激骨形成)的BMP-反應(yīng)性基因。誘導(dǎo)該相互作用的代表性方法包括Smad1的磷酸化，Smad1的過度表達(dá)，和含同源框的轉(zhuǎn)錄因子的突變。通常，含同源框的轉(zhuǎn)錄因子是Hoxc-8、Hoxa-9、Msx-1或Msx-2，而BMP-代表性基因可包括編碼骨橋蛋白、涎蛋白、骨粘連蛋白或骨鈣蛋白的基因。通常，該個(gè)體患骨質(zhì)疏松。
本發(fā)明還針對(duì)一種誘導(dǎo)編碼骨基質(zhì)蛋白的基因的方法，包含步驟誘導(dǎo)Smad1和含同源框轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，其中該相互作用導(dǎo)致誘導(dǎo)編碼骨基質(zhì)蛋白的基因。上文描述了這種誘導(dǎo)的代表性方法，如代表性的含同源框的轉(zhuǎn)錄因子和BMP-反應(yīng)性基因。具體的，本發(fā)明針對(duì)一種誘導(dǎo)編碼骨橋蛋白基因的方法，包含步驟誘導(dǎo)Smad1和Hoxc-8之間的相互作用，其中該相互作用導(dǎo)致除去編碼骨橋蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄阻抑，從而誘導(dǎo)編碼骨橋蛋白的基因。
本發(fā)明還針對(duì)一種篩選刺激骨形成的化合物的方法，包含步驟使細(xì)胞和一種化合物接觸，并測定該化合物抑制Hoxc-8和基因結(jié)合的能力。結(jié)合的抑制導(dǎo)致基因誘導(dǎo)，這表示化合物刺激了骨形成。代表性化合物包括抗體及其片段、合成藥物、合成蛋白或Smad1的磷酸化形式或其片段。結(jié)合的抑制可通過凝膠移位試驗(yàn)、轉(zhuǎn)錄、RNA印跡和蛋白質(zhì)印跡等方法測定。如上所述，代表性基因編碼骨橋蛋白、涎蛋白、骨粘連蛋白和骨鈣蛋白的基因。
本發(fā)明還針對(duì)一種調(diào)控個(gè)體內(nèi)疾病的方法，包含步驟抑制含同源框的轉(zhuǎn)錄因子和個(gè)體細(xì)胞中涉及調(diào)控疾病的基因的結(jié)合。結(jié)合的抑制消除了含同源框蛋白對(duì)該基因的轉(zhuǎn)錄阻抑，從而導(dǎo)致誘導(dǎo)了涉及調(diào)控疾病的基因。就此而言，抑制可能是由于存在能結(jié)合含同源框的轉(zhuǎn)錄因子的化合物，從而抑制了該含同源框的轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性。同上，代表性的化合物包括抗體及其片段、合成藥物、合成蛋白和Smad1的磷酸化形式或其片段。優(yōu)選的含同源框的轉(zhuǎn)錄因子是Hoxc-8,Hoxa-9,Msx1和Msx2。該方法可用于患骨質(zhì)疏松、癌癥、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的個(gè)人。本文所用的術(shù)語“BMP-誘導(dǎo)的基因活化”指任何能在BMP刺激后受誘導(dǎo)而表達(dá)的基因。本文所用的術(shù)語“Smad1”指任何與果蠅(Drosophila)母體蛋白同源的抗DPP或MAD的蛋白質(zhì)。本文所用詞組“Smad1和Hox之間的相互作用”或“Smad1和含同源域蛋白之間的相互作用”指任何在這兩種蛋白之間的，導(dǎo)致Hox或含同源域的蛋白的轉(zhuǎn)錄阻抑物活性破壞的相互作用。本文所用的術(shù)語“hox蛋白的轉(zhuǎn)錄阻抑”或“含同源域蛋白的轉(zhuǎn)錄阻抑”指任何在存在hox蛋白或含同源域蛋白時(shí)其轉(zhuǎn)錄活性被阻抑的基因。
根據(jù)本發(fā)明，可使用本領(lǐng)域技術(shù)中的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。在文獻(xiàn)中全面解釋了這些技術(shù)。見例如Maniatis,Fritsch & Sambrook.“分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊”(1982)；“DNA克隆實(shí)踐方法”卷Ⅰ和卷Ⅱ(D.N.Glover編，1985)；“寡核苷酸合成”(M.J.Gait編，1984)；“核酸雜交”[B.D.Hames & S.J.Higgins編(1985)]；“轉(zhuǎn)錄和翻譯”[B.D.Hames & S.J.Higgins編(1984)]；“動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)”[R.I.Freshney編(1986)]；“固定化細(xì)胞和酶”[IRL Press(1986)]；B.Perbal,“分子克隆實(shí)踐指南”(1984)。因此，如果在本文中出現(xiàn)，下列術(shù)語將具有下文列出的定義。
“DNA分子”指脫氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)以其單鏈形式或雙鏈螺旋的多聚體形式。該術(shù)語僅指該分子的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，并不將其限制在任何具體三級(jí)形式中。因此，該術(shù)語包括尤其是在線性DNA分子(如限制性片段)，病毒，質(zhì)粒和染色體中發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA。在討論本文的結(jié)構(gòu)時(shí)，根據(jù)常規(guī)，僅給出DNA沿非轉(zhuǎn)錄鏈的5′到3′方向(即，具有和mRNA同源的序列的鏈)。
“載體”是一種復(fù)制子，如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，在其上可結(jié)合其它DNA片段，從而致使結(jié)合片段復(fù)制。“復(fù)制子”是任何基因元件(如質(zhì)粒、染色體、病毒)，它們在體內(nèi)的作用是DNA復(fù)制的自主單位；即，能在自身控制下復(fù)制?！皬?fù)制起始點(diǎn)”指那些參與DNA合成的DNA序列?！氨磉_(dá)控制序列”是控制和調(diào)節(jié)另一條DNA序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列。當(dāng)RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后翻譯成該編碼序列編碼的蛋白時(shí)，編碼序列在細(xì)胞中與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列“可操縱性連接”，并“在其控制下”。
一般說，與宿主結(jié)合使用含有能促進(jìn)有效轉(zhuǎn)錄和翻譯插入的DNA片段的啟動(dòng)子序列的表達(dá)載體。通常表達(dá)載體含有復(fù)制起始點(diǎn)、啟動(dòng)子、終止子，以及能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的特殊基因。可根據(jù)本領(lǐng)域已知方法發(fā)酵并培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主，來得到最佳細(xì)胞生長。
DNA“編碼序列”是當(dāng)置于合適調(diào)控序列的控制下，能在體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽的雙鏈DNA序列。由5′(氨基)末端的起始密碼子和3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子確定編碼序列的邊界。編碼序列可包括，但不限于原核序列、真核mRNA的cDNA、來自真核生物(如哺乳動(dòng)物)DNA的基因組DNA序列、和合成的DNA序列。通常將聚腺苷酸信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列定位于編碼序列的3′。“cDNA”定義為拷貝-DNA或互補(bǔ)-DNA，是mRNA轉(zhuǎn)錄物的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物。“外顯子”是從基因座轉(zhuǎn)錄的表達(dá)序列，而“內(nèi)含子”是基因座的非表達(dá)序列。
轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列是DNA調(diào)控序列，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、阻抑子、聚腺苷酸化信號(hào)、終止子等，它們提供了在宿主細(xì)胞中編碼序列的表達(dá)。“順式-元件”或“DNA結(jié)合識(shí)別序列”是一種核苷酸序列，也稱為“共有序列”或“基序”，它和能上調(diào)或下調(diào)具體基因座表達(dá)的其它蛋白相互作用?！靶盘?hào)序列”也可以包括在編碼序列中。該序列編碼信號(hào)肽，多肽的N-末端，它和宿主細(xì)胞通訊并將多肽指引向合適的細(xì)胞位置?？砂l(fā)現(xiàn)信號(hào)肽和原核生物和真核生物的各種天然蛋白結(jié)合在一起。
“啟動(dòng)子序列”是能在細(xì)胞中結(jié)合RNA聚合酶，并引發(fā)下游(3’方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的一種DNA調(diào)控區(qū)域。為了明確本發(fā)明，啟動(dòng)子序列其3′末端以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為邊界，并向上游(5′方向)延伸包括引發(fā)高于背景的可檢測水平轉(zhuǎn)錄所必需的最少數(shù)量的堿基或元件。在啟動(dòng)子序列中，將發(fā)現(xiàn)一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，以及負(fù)責(zé)RNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域(共有序列)。真核啟動(dòng)子通常，但不總是含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核啟動(dòng)子除了-10和-35共有序列外，還含有Shine-Dalgarno序列。
術(shù)語“寡核苷酸”定義為包含兩個(gè)或更多，優(yōu)選三個(gè)以上脫氧核糖核苷酸的分子。它的確切大小將視許多因素而定，這些因素又由該寡核苷酸的最終功能和用途決定。本文所用的術(shù)語“引物”指當(dāng)置于誘導(dǎo)合成引物延伸產(chǎn)物(其與核酸鏈互補(bǔ))，即，存在核苷酸和DNA聚合酶等誘導(dǎo)劑，適合的溫度和pH的條件下，能作為合成起始點(diǎn)的寡核苷酸(不論在純化的限制性消化中天然存在的，或合成產(chǎn)生的)。引物可以是單鏈或雙鏈的，而且必須足夠長，從而在誘導(dǎo)劑存在下引發(fā)需要延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長度將視許多因素，包括溫度。引物來源和方法的使用而定。例如，為了診斷應(yīng)用，由靶序列的復(fù)雜程度而定，寡核苷酸引物通常含有15-25或更多個(gè)核苷酸，雖然它可含有較少的核苷酸。
挑選了與某具體靶DNA序列的兩條不同鏈“基本”互補(bǔ)的本文的引物。這意味著該引物一定是充分互補(bǔ)，而和其各自相應(yīng)的鏈雜交。因而，引物序列不需要反映模板的確切序列。例如，可將非互補(bǔ)核苷酸片段與引物的5′末端連接，而引物的剩余部分和該鏈互補(bǔ)。另外，如果引物序列和該序列充分互補(bǔ)，或與其雜交，并因而形成合成延伸產(chǎn)物的模板，可將非互補(bǔ)堿基或更長的序列散布在引物中。
本文所用的術(shù)語“限制性內(nèi)切酶”和“限制性酶”指在特異性核酸序列處或附近切開雙鏈DNA的酶。
“重組DNA技術(shù)”指用來聯(lián)合兩條異源DNA分子(通常是來自不同有機(jī)體的DNA體外連接的結(jié)果)的技術(shù)。重組DNA分子常用基因工程實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生。同義的術(shù)語包括“基因剪接”、“分子克隆”和“基因工程”。這些操作的產(chǎn)物是“重組體”或“重組分子”。
當(dāng)DNA被引入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，該細(xì)胞即為被外源或異源DNA“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)染”。轉(zhuǎn)化DNA可以整合(共價(jià)連接)或不整合到細(xì)胞的基因組中。在原核細(xì)胞、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，可使轉(zhuǎn)化DNA維持在游離型元件如載體或質(zhì)粒上。對(duì)于真核細(xì)胞，一個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是其中轉(zhuǎn)化DNA已被穩(wěn)定整合入染色體中，從而通過染色體復(fù)制被子細(xì)胞繼承的細(xì)胞。真核細(xì)胞能夠建立由一群含有轉(zhuǎn)化DNA的子細(xì)胞形成的細(xì)胞系或克隆的能力，證明了這種穩(wěn)定性?！翱寺　笔峭ㄟ^有絲分裂衍生自一個(gè)細(xì)胞或祖先的一群細(xì)胞?！凹?xì)胞系”是一個(gè)能在體外穩(wěn)定生長許多代的原代細(xì)胞的克隆。已經(jīng)過外源DNA轉(zhuǎn)化的植物或動(dòng)物等生物體稱為“轉(zhuǎn)基因生物”。
本文所用的術(shù)語“宿主”指不僅包括原核動(dòng)物，而且包括酵母、植物和動(dòng)物細(xì)胞等真核細(xì)胞。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的任何技術(shù)可用重組DNA分子或基因轉(zhuǎn)化宿主。一個(gè)優(yōu)選例是用含有某基因編碼序列的載體來作真核轉(zhuǎn)化。原核宿主可包括大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌(S.tymphimurium)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草桿菌(Bacillus subtilis)。真核宿主包括巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)等酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞，而更優(yōu)選的，擬南芥(Arabidopsisthaliana)和煙草(Tobaccum nicotiana)等植物細(xì)胞。
當(dāng)兩條DNA序列的核苷酸相對(duì)于其DNA序列的確定長度至少75％(優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選是至少90％或95％)互相匹配時(shí)，它們是“基本同源”的。可通過使用序列數(shù)據(jù)庫中可得的標(biāo)準(zhǔn)軟件，或在具體系統(tǒng)所確定的嚴(yán)緊條件下的DNA雜交實(shí)驗(yàn)中，比較諸序列，來鑒定基本同源的序列。確定合適的雜交條件在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。見Maniatis等，同上；DNA克隆，卷Ⅰ&Ⅱ，同上；核酸雜交，同上。
DNA構(gòu)建物的“異源”區(qū)域是一條較長的DNA分子中的可鑒定的DNA片段，沒有發(fā)現(xiàn)它天然和較大的分子相結(jié)合。因此，當(dāng)該異源區(qū)編碼一個(gè)哺乳動(dòng)物基因時(shí)，該基因側(cè)翼常常有在來源生物體基因組中不側(cè)接該哺乳動(dòng)物基因組DNA的DNA。在另一個(gè)例子中，編碼序列是其中的編碼序列本身天然不存在的構(gòu)建物(如其中基因組編碼序列含有內(nèi)含子，或具有和天然基因不同的密碼子的合成序列)。等位基因突變或天然存在的突變事件不會(huì)產(chǎn)生本文所確定的DNA異源區(qū)。
本文用于多肽或抗體的“片段”，一般將是長度至少10個(gè)殘基，更典型的是至少20個(gè)殘基，而優(yōu)選的是至少30(如50)個(gè)殘基，但比全部的完整序列短的多肽或抗體。可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，如天然存在或重組物的酶消化，使用編碼確定片段表達(dá)載體的重組DNA技術(shù)，或化學(xué)合成來產(chǎn)生這些片段。候選片段顯示Smad1的特性(如與Hoxc-8結(jié)合)的能力可用本文所述方法評(píng)估?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方案，使用Smad1的純化片段或Smad1的抗原性片段來產(chǎn)生抗體。
可用標(biāo)準(zhǔn)RNA印跡試驗(yàn)，根據(jù)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的常規(guī)RNA雜交技術(shù)來確定從植物或其它轉(zhuǎn)基因組織中獲得的細(xì)胞或組織中mRNA的相對(duì)量。另外，可用標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡試驗(yàn)，根據(jù)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的常規(guī)DNA雜交技術(shù)來確定轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)中某基因的存在及其拷貝數(shù)。RNA印跡和DNA印跡都使用雜交探針，如含全長、單鏈DNA或該DNA序列長度為至少20(優(yōu)選至少30，更優(yōu)選至少50，而最優(yōu)選至少100個(gè)連續(xù)核苷酸)的放射性標(biāo)記的cDNA?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多不同方法之一來標(biāo)記DNA雜交探針。
這些研究最常用的標(biāo)記是放射性元素，酶，當(dāng)暴露于紫外光時(shí)會(huì)放出熒光的化學(xué)物質(zhì)和其它物質(zhì)。許多熒光材料是已知的，而且可用作標(biāo)記。這些材料包括熒光素、羅丹明、金胺、Texas紅、AMCA藍(lán)和熒光黃。一種特殊檢測材料是在山羊中制備的抗-兔抗體，并通過異硫氰酸鍵和熒光素偶聯(lián)。還可用放射性元素或用酶標(biāo)記蛋白質(zhì)?？赏ㄟ^任何現(xiàn)在可行的計(jì)數(shù)程序檢測放射性標(biāo)記。優(yōu)選的同位素可選自3H、14C、32p、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
類似的，酶標(biāo)記也是有用的，而且能用任何目前所用的比色、分光光度、熒光分光光度、電流分析或氣體定量技術(shù)檢測。通過和橋連分子如碳二亞胺、二異氰酸、戊二醛和類似物反應(yīng)，將酶與所選顆粒偶聯(lián)。許多可用于這些過程的酶是已知的，而且可被利用。優(yōu)選的是過氧化物酶、β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡糖氧化酶加過氧化物酶和堿性磷酸酶。參考以舉例方式的美國專利No.3,654,090、3,850,752和4,016,043公開的其它標(biāo)記材料和方法。
給出下列實(shí)施例是為了說明本發(fā)明的不同實(shí)施例，而不意味以任何方式限制本發(fā)明實(shí)施例1雙雜交文庫篩選將Smad1 cDNA克隆入pBGT9載體的SalⅠ/PstⅠ位點(diǎn)來產(chǎn)生pGBT9/Smad1誘餌質(zhì)粒。用該誘餌質(zhì)粒，按照廠商(Clontech,CA)提供的程序篩選了人U2 OS成骨細(xì)胞樣pACT cDNA文庫。為了確定Hoxc-8和Smad1的相互作用，將一條全長小鼠Hoxc-8 cDNA亞克隆入pACT載體的XhoⅠ和RcoRⅠ位點(diǎn)。用pBGT9/Smad1將pACT/Hoxc-8共轉(zhuǎn)化入Y190，用菌落轉(zhuǎn)移過濾試驗(yàn)和液體試驗(yàn)分析菌落的β-半乳糖苷酶表達(dá)。
實(shí)施例2谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白的表達(dá)和純化通過限制性消化pGBT-Smad1(SalⅠ/HindⅢ)和pCMV5-Smad3(BamHⅠ/SalⅠ)，然后分別插入pGEX-KG載體的SalⅠ/HindⅢ和BamHⅠ/SalⅠ位點(diǎn)來產(chǎn)生GST-Smad1和-Smad4的GST融合構(gòu)建物。用EcoRⅠ/SalⅠ消化從pCMV-Smad2和pCMV5-Smad4得到的GST-Smad2和-Smad4，然后分別插入pGEX-5X-2和pGEX-5X-1載體(Amersham Pharmacia Biotech)的EcoRⅠ/SalⅠ位點(diǎn)。用高保真性Pfu-Turbo DNA聚合酶(Stratagene)PCR擴(kuò)增GST-Hoxc-8和GST-Hoxa-9，并分別克隆入pGEX-KG載體的BamHⅠ/EcoRⅠ和BamHⅠ/XbaⅠ位點(diǎn)。Dr.C.Abate-Shen(Center ofAdvanced Biotechnology and Medicine,Piscataway,NJ)提供了GST-Msx-1和-Msx-2表達(dá)質(zhì)粒。將上述的GST構(gòu)建物轉(zhuǎn)化入BL21，并進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)和純化。
實(shí)施例3GST折疊試驗(yàn)在[35S]甲硫氨酸存在下，使用TNT-偶聯(lián)網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解系統(tǒng)，根據(jù)廠商(Promega)的程序，分別用線性化的Smad1或Hoxc-8 pBluescript(SK)質(zhì)粒翻譯了Smad1或Hoxc-8。用SDS-PAGE確認(rèn)了標(biāo)記的Smad1蛋白。
將含Smad1的裂解物(5微升)和等價(jià)量(1微克)GST或GST-Hoxc-8混合。另外，將含Hoxc-8的裂解物和GST單獨(dú)或GST-Smad1混合。將樣品在冰上培育30分鐘，然后在各樣品中加入稀釋于NENT緩沖液(50微升)的GST-瓊脂糖，然后4℃培育30分鐘。在PBS/0.1％TritonX-100溶液中洗滌Sepharose珠四次，通過在2X SDS緩沖液中10℃培育5分鐘洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。作為進(jìn)樣液，將體外翻譯的標(biāo)記的Smad1蛋白質(zhì)裂解物(1微克)和洗脫樣品一起加到12.5％SDS-PAGE上。
實(shí)施例4免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡從pACT2/Hoxc-8將HA-尾的Hoxc-8亞克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen)的BglⅡ/BamHⅠ和XhoⅠ中。Dr.Rik Derynck(加利福尼亞大學(xué)，舊金山，CA)提供了FLAG-尾的Smad1和Smad4的表達(dá)載體。Dr.JeffreyL.Wrana(Hospital for Sick Children,Canada)提供了用于組成性活化BMP IA型(ALK3)和IB(ALK6)受體的表達(dá)質(zhì)粒。根據(jù)廠商指南(Promega)，使用Tfx-50用表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后裂解細(xì)胞，用抗-HA抗血清(Babco)免疫沉淀裂解物并用抗-FLAG M2(Eastman Kodak)免疫印跡。
實(shí)施例5電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)用從骨橋蛋白啟動(dòng)子序列(圖3A)設(shè)計(jì)的引物作PCR產(chǎn)生DNA片段OPN1、OPN2和OPN3。通過退火下列12對(duì)合成寡核苷酸來建立雙鏈寡聚體5′-AGGGTAATTGGAGGC(SEQ ID No.1)和5′-GCCTCCAATTACCCT-3′(SEQ ID no.2)(探針S)；5′-CATGACCCCAATTAGTCCTGGCAGCA-3′(SEQ ID No.3)和5′-CAGGGATCCATAAGGAAAGG-3′(SEQ ID No.4)(OPN-4)；5′-GACATCGTTCATCAGTAATGCTTG-3′(SEQ ID No.5)和5′-CAAGCATTACTGATGAACGATGTC-3′(SEQ ID No.6)(OPN-5)；5′-GACATCGTTCATCAGTAATGCTTTG-3′(SEQ ID No.7)和5′-CAAAGCATTACTGATGAACCATGTC-3′(SEQ ID No.8)(OPN-6)；通過與T4激酶和[γ-32P]ATP的反應(yīng)來放射性標(biāo)記這些DNA片段或寡聚物。將結(jié)合反應(yīng)物22℃和體積為19微升的75mM NaCl,1mm EDTA,1mm DTT,10mMTris-HCl(pH7.5),6％牛血清白蛋白和25ng dI/dC中的指定蛋白質(zhì)一起預(yù)培育20分鐘。加入1微升DNA探針(0.5ng,50,000-100,000cpm)。反應(yīng)物在4％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行非變性電泳。
實(shí)施例6轉(zhuǎn)染從CH10T1/2細(xì)胞基因組DNA PCR擴(kuò)增了相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)從區(qū)域-266到-1的骨橋蛋白啟動(dòng)子，并將其克隆入pGL-3基礎(chǔ)載體(Promega)的SmaⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)，產(chǎn)生熒光素酶報(bào)道構(gòu)建物(OPN-266)。用相同策略構(gòu)建了帶有Hoxc-8結(jié)合位點(diǎn)(-290到-166)的Hox-pGL3報(bào)道子，但將其置于pGL3-對(duì)照載體(Promega)中。在Hox-pGL3中，用GCGG通過PCR置換Hox識(shí)別核心TAAT，來產(chǎn)生突變體Hox-pGL3(mHox-pGL)。
每個(gè)60-mm盤中接種2×105個(gè)C3H10T1/2細(xì)胞，次日用Tfx-50(Promega)和0.5微克熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒(pGL3-OPN170)以及表明的不同表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。用pcDNA3-β-gal質(zhì)粒來平衡不同組中的DNA量。為了標(biāo)準(zhǔn)化效率，共轉(zhuǎn)染了pRL-SV40質(zhì)粒。使細(xì)胞接觸Tfx-50和質(zhì)粒的混合物1小時(shí)。然后使轉(zhuǎn)染細(xì)胞與10％DMEM接觸。48小時(shí)后，將細(xì)胞收集在1X被動(dòng)裂解緩沖液中，用Promega′sDual-LuciferaseTM報(bào)道試驗(yàn)系統(tǒng)分析裂解液的熒光素酶活性。用Renilla熒光素酶活性在SV40啟動(dòng)子的控制下對(duì)數(shù)值作了標(biāo)準(zhǔn)化。圖中顯示了對(duì)照的相對(duì)值。
通過以PCR為基礎(chǔ)的策略將編碼與核定位信號(hào)(NLS)融合的不同形式的Smad1的質(zhì)粒構(gòu)建入巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子為基礎(chǔ)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，pCMV5。各構(gòu)建物含有下列區(qū)域之一Smad1-NL(氨基酸3-276)、Smad1-L(aa145-267)和Smad1-M(101-191)。從pACT2/Hoxc-8將Hoxc-8亞克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen)。用0.5mg OPN266熒光素酶報(bào)道質(zhì)粒和不同的表達(dá)質(zhì)粒，如所述使用Tfx-50(Shi和Yang等，1999)轉(zhuǎn)染了C3H10T1/2細(xì)胞(12孔培養(yǎng)盤中5×104細(xì)胞/孔)。
實(shí)施例7永久細(xì)胞系的建立用Tet-調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)(Gibco)在2T3成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(Harris等，1996)中產(chǎn)生Smad1突變體表達(dá)細(xì)胞系。從pCMV5中將NLS-連接的Smad1-NL、Smad1-L或Smad1-M亞克隆入pTet-剪接載體(Gibco)。共轉(zhuǎn)染2毫克pTet-剪接/Smad1-NL,Smad1-L,Smad1-M,或pTet-剪接(對(duì)照),2mg的pTet-tTAk和40ng的pcDNA3(Clontech)，并通過在生長培養(yǎng)基中加入G418(400mg/ml)選出陽性克隆。使用5毫克總RNA和[α-32P]-dCTP標(biāo)記探針，用狹線-印跡(Bio-Rad)來測定Smad1的表達(dá)缺失形式。
實(shí)施例8骨標(biāo)記基因表達(dá)用STAT-60(Tel-試驗(yàn))或用MicroPoly(a)Pure(Ambion)根據(jù)廠商說明書分離了對(duì)照和Smad1表達(dá)細(xì)胞系的總RNA或mRNA。用Rapid-Hyb緩沖液(Amersham)根據(jù)廠商指示進(jìn)行了RNA印跡。用C3H10T1/2細(xì)胞的cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增了骨橋蛋白探針。Dr.Harris(Univ.of Texas)友好提供了I(a)類膠原和osf-2/cbfa1探針。
實(shí)施例9堿性磷酸酶和礦物化骨基質(zhì)形成試驗(yàn)用堿性磷酸酶試驗(yàn)(Begley等,1993)和von Kossa染色(Bharagava等,1986)測定了骨細(xì)胞分化。
實(shí)施例10酵母雙雜交文庫篩選為了調(diào)查BMP-2/4誘導(dǎo)的基因活化中的轉(zhuǎn)錄機(jī)制，用酵母雙雜交系統(tǒng)來鑒定BMP-2/4信號(hào)傳導(dǎo)途徑中與Smad1相互作用的轉(zhuǎn)錄因子。用與Gal4 DNA結(jié)合域融合的完整Smad1 cDNA作為誘餌質(zhì)粒來篩選構(gòu)建于pACT2質(zhì)粒載體中的人U-2OS成骨細(xì)胞樣細(xì)胞文庫。從25個(gè)陽性克隆中，DNA序列分析鑒定一個(gè)克隆為Hoxc-8，兩個(gè)克隆為Smad4。
圖1A說明兩個(gè)雜交系統(tǒng)的生長性質(zhì)，證明體內(nèi)Smad1和Hoxc-8的專一性相互作用，它由β-gal液體試驗(yàn)(圖1B)進(jìn)一步確認(rèn)。同時(shí)帶有Smad1和Hoxc-8質(zhì)粒的酵母菌能在缺乏Trp,Leu,和his的培養(yǎng)基上生長。當(dāng)在該雙雜交系統(tǒng)中測試與融合Gal4 DNA結(jié)合域融合的全長Hoxc-8時(shí)，顯示了和Smad1強(qiáng)得多的相互作用(圖1A和B)。
實(shí)施例11Smad與Hoxc-8在體外和在COS-1細(xì)胞中相互作用為了進(jìn)一步確定體外這兩種蛋白質(zhì)之間的直接相互作用，還用[35S]甲硫氨酸-標(biāo)記的Hoxc-8和GST-Smad1融合蛋白進(jìn)行了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)折疊(pull down)實(shí)驗(yàn)。如圖1C所示，Hoxc-8和純化的GST-Smad1融合蛋白成功的共沉淀，但和GST單獨(dú)不行，證明了這兩種蛋白質(zhì)之間的直接相互作用。
本發(fā)明證明Smad1和Hoxc-8之間的直接相互作用，并揭示了BMP-2/4-誘導(dǎo)的骨骼發(fā)育中Smad1-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄機(jī)制。為了測試該相互作用對(duì)Hoxc-8 DNA結(jié)合能力的影響，在凝膠移位實(shí)驗(yàn)中測試了Hoxc-8蛋白的DNA結(jié)合性能。圖2A顯示純化的GST-Hoxc-8融合蛋白與其DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。用競爭性試驗(yàn)證明了該結(jié)合的專一性。未標(biāo)記的Hoxc-8 DNA結(jié)合元件以劑量依賴的方式消除了Hoxc-8轉(zhuǎn)移條帶，而Msx-2 DNA結(jié)合元件(22)(另一種含同源域的蛋白質(zhì))的存在無作用(圖2A)。顯然，當(dāng)將純化的GST-Smad1蛋白加到結(jié)合反應(yīng)中時(shí)，以劑量依賴性方式抑制了Hoxc-8結(jié)合條帶(圖2B)。因此，這些結(jié)果表明Smad1和Hoxc-8的相互作用阻礙了Hoxc-8與其DNA反應(yīng)元件的結(jié)合。這看來反映了BMP-誘導(dǎo)的基因活化，因?yàn)橐烟岢鯤oxc-8是一種轉(zhuǎn)錄阻抑物。
BMP-2刺激Smad1的磷酸化，而磷酸化的Smad1接著與Smad4結(jié)合，并將復(fù)合物攝入核內(nèi)。令人感興趣的是，是否Smad1,Smad4,或Smad1和Smad4的復(fù)合物也在細(xì)胞中與Hoxc-8相互作用。用對(duì)于FLAG-Smad1、FLAG-Smad4、HA-Hoxc-8，和/或組成性活化BMPIA型受體，ALK3(Q233D)的表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。用抗-HA抗體免疫沉淀細(xì)胞裂解物，并用抗-FLAG抗體免疫印跡分析。圖2C證明Smad1(泳道3)、Smad4(泳道5)或兩者(泳道7)是在細(xì)胞中與HA-Hoxc-8共沉淀的。ALK3(Q233D)的共轉(zhuǎn)染增強(qiáng)了Smad1(泳道4)或Smad4(泳道6)與Hoxc-8的相互作用。然而，ALK3(Q233D)并不顯著增強(qiáng)Smad1和Smad4復(fù)合物與Hoxc-8的相互作用(泳道8)。
這些結(jié)果顯示，在COS-1細(xì)胞中，有或無BMP刺激的條件下Smad1和Smad4都與Hoxc-8相互作用，表明Smad1的磷酸化不是其與Hoxc-8相互作用所必需的。如果真是這種情況，那么該相互作用的BMP-依賴性調(diào)控是這些蛋白質(zhì)胞內(nèi)定位中固有的。Hox蛋白是定位在核內(nèi)的同源域轉(zhuǎn)錄因子，而Smad1和Smad4在細(xì)胞質(zhì)中?？赡苁莾H當(dāng)BMP受體誘導(dǎo)其磷酸化后，Smad1或復(fù)合物轉(zhuǎn)移到核中時(shí)，才發(fā)生相互作用。
實(shí)施例12骨橋蛋白啟動(dòng)子含有Hoxc-8結(jié)合元件為了調(diào)查是否Smad1和Hoxc-8之間的相互作用結(jié)合DNA并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性，測試了BMP-2可誘導(dǎo)的基因。通過對(duì)啟動(dòng)子序列之間的比較，在4個(gè)BMP-2反應(yīng)性骨基質(zhì)蛋白基因，骨涎蛋白、骨橋蛋白、骨粘連蛋白和骨鈣蛋白(它們作為成骨細(xì)胞分化的標(biāo)記基因)中發(fā)現(xiàn)了推測的Hox結(jié)合位點(diǎn)。由于骨橋蛋白啟動(dòng)子的mRNA表達(dá)在C3H10T1/2間充質(zhì)細(xì)胞對(duì)BMP-2的處理反應(yīng)中，被迅速活化，所以檢測了骨橋蛋白啟動(dòng)子。在骨橋蛋白基因5′側(cè)翼區(qū)域的前382bp中有5個(gè)具有Ta/tAT的核心序列的推測Hox結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)。當(dāng)凝膠移位試驗(yàn)中，在和純化GST-Hoxc-8蛋白培育中使用了含有所有5個(gè)推測的Hox位點(diǎn)的從-382到-170(OPN-1)的212堿基對(duì)DNA片段時(shí)，觀察到一條Hoxc-8結(jié)合條帶，表明在骨橋蛋白啟動(dòng)子中僅有一個(gè)Hoxc-8結(jié)合位點(diǎn)(圖3B)。隨后用更短的探針(OPN-2和OPN-3)作凝膠移位試驗(yàn)，將Hoxc-8結(jié)合元件定位在從-206到-180(包括在OPN-2中)區(qū)域中(圖3A和C)。當(dāng)用了3個(gè)單一推測的Hox結(jié)合探針(OPN-4、-5和-6)時(shí)，Hxc-8僅和位于-206到-280的OPN-5結(jié)合。GST單獨(dú)或GST-Smad1融合蛋白都不和該凝膠移位試驗(yàn)系列中使用的任何探針結(jié)合。當(dāng)OPN-5中Hoxc-8結(jié)合位點(diǎn)的TAAT核心序列突變成GCCG(mOPN-5)時(shí)，廢除了Hoxc-8結(jié)合。
用凝膠移位競爭試驗(yàn)測定了Hoxc-8與DNA結(jié)合的專一性(圖3D)。未標(biāo)記的Hoxc-8 DNA結(jié)合元件以濃度依賴性方式抑制了轉(zhuǎn)移條帶(圖3E)，其中多100倍的特異性冷探針消除了Hoxc-8結(jié)合，而多100倍的Msx-2 DNA結(jié)合元件無作用。Msx-2是含同源域的蛋白質(zhì)，但其不屬于Hox家族。從骨鈣蛋白啟動(dòng)子中鑒定到了Msx-2 DNA結(jié)合元件，其核心序列的側(cè)翼區(qū)域與Hoxc-8結(jié)合位點(diǎn)不同。
對(duì)于骨橋蛋白啟動(dòng)子，鑒定到3個(gè)TAAT和2個(gè)TTAT推測的Hox位點(diǎn)。Hoxc-8僅與TAAT核心序列(-206到-180)中的一個(gè)結(jié)合，提示該側(cè)翼區(qū)對(duì)于Hoxc-8結(jié)合也是重要的。Hoxc-8結(jié)合位點(diǎn)，包括其側(cè)翼區(qū)，在雞、小鼠、豬和人中是高度保守的。其它4個(gè)推測的Hox位點(diǎn)可能涉及其它同源域蛋白結(jié)合或不是真正的Hox結(jié)合位點(diǎn)。
實(shí)施例13Smad1抑制Hox蛋白和DNA的結(jié)合測試了純化GST-Smad1與Hoxc-8相互作用對(duì)Hoxc-8 DNA結(jié)合活性的影響。當(dāng)將GST-Hoxc-8蛋白及其DNA結(jié)合元件(OPN-5)與遞增量的GST-Smad1蛋白一起培育時(shí)，以濃度依賴性方式抑制了Hoxc-8與DNA探針的結(jié)合。等量的GST蛋白對(duì)Hoxc-8結(jié)合活力沒有影響。這些結(jié)果提示，Smad1與Hoxc-8的相互作用將Hoxc-8從其反應(yīng)元件中驅(qū)趕出來。
因?yàn)門GF-β超家族的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，重要的是了解Hox和Smad蛋白之間相互作用的專一性。選擇Hoxa-9作為具有明確特征的同源框DNA結(jié)合蛋白來測試其與不同Smad蛋白的相互作用。兩種其它的同源域蛋白，Msx-1和Msx-2也出于相同目的用于凝膠移位試驗(yàn)。在Hox基因簇以外的其它基因座發(fā)現(xiàn)的Msx-和Msx-2，和牙齒發(fā)育有關(guān)。這兩個(gè)基因的表達(dá)都受到BMP-2和BMP-4的協(xié)同調(diào)節(jié)。
為了估計(jì)Smad和同源域蛋白之間相互作用的相對(duì)強(qiáng)度，在各凝膠移位試驗(yàn)中使用了等量的Hoxc-8和Hoxa-9或Msx-1和Msx-2蛋白，與固定量的不同Smad蛋白。Smad1和Smad4均抑制Hoxc-8和Hoxa-9結(jié)合，而兩種Smad蛋白同時(shí)加入時(shí)，抑制增強(qiáng)。相反的，Smad2或Smad3都不和這兩種Hox蛋白相互作用。任何Msx蛋白都不和4種Smad蛋白中的任一相互作用。GST不影響Hox或Msx蛋白結(jié)合。同源域，一高度保守的DNA結(jié)合基元，是Hoxc-8和Hoxa-9之間高度保守的區(qū)域，提示Smad1能與其它涉及BMP信號(hào)傳遞的Hox蛋白相互作用。
實(shí)施例14Hox結(jié)合位點(diǎn)介導(dǎo)BMP-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄為了測試是否Hoxc-8結(jié)合位點(diǎn)起B(yǎng)MP-2/4反應(yīng)性元件的作用，將一條266bp的含Hoxc-8結(jié)合位點(diǎn)的骨橋蛋白啟動(dòng)子片段克隆入pGL3-基礎(chǔ)的熒光素酶報(bào)道載體中，產(chǎn)生OPN-266報(bào)道質(zhì)粒。C3H10T1/2間充質(zhì)細(xì)胞中OPN-266構(gòu)建物的轉(zhuǎn)染顯示當(dāng)Smad1或Smad4表達(dá)質(zhì)粒被共轉(zhuǎn)染時(shí)，中等程度刺激了該報(bào)道活性。當(dāng)將OPN-266報(bào)道構(gòu)建物用ALK3(Q233D)、Smad1和Smad4表達(dá)質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染時(shí)，顯著增強(qiáng)了熒光素酶活性。另外，當(dāng)過度表達(dá)Hoxc-8時(shí)，完全消除了ALK3(Q233D)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。
為了進(jìn)一步明確Hoxc-8結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄活性，將含有Hoxc-8結(jié)合位點(diǎn)的更短的骨橋蛋白啟動(dòng)子片段連接到在SV40啟動(dòng)子(Hox-pGL3)或tk最小啟動(dòng)子(Hox-tk)控制下的熒光素酶報(bào)道載體上。將Hox-pGL3構(gòu)建物和ALK3(Q233D)或ALK6(Q203D)共轉(zhuǎn)染入C3H10T1/2間充質(zhì)細(xì)胞中，分別誘導(dǎo)了13-和11倍以上的熒光素酶報(bào)道活性。最重要的是，Hoxc-8的過度表達(dá)抑制了ALK3(Q233D)-誘導(dǎo)的或ALK6(Q203D)-誘導(dǎo)的報(bào)道活性。這些結(jié)果證明Hox結(jié)合位點(diǎn)介導(dǎo)了BMP信號(hào)傳導(dǎo)，而Hoxc-8起了轉(zhuǎn)錄阻抑物的作用。最有趣的是，當(dāng)Hox-tk構(gòu)建物與Smad1、Smad4和組成性活化型IB BMP受體表達(dá)質(zhì)粒(ALK6)一起被共轉(zhuǎn)染入C3H10T1/2間充質(zhì)細(xì)胞時(shí)，誘導(dǎo)的熒光素酶報(bào)道活性水平為20倍，表明Hoxc8結(jié)合位點(diǎn)起了BMP-2/4反應(yīng)性元件的作用。Smad1或Smad4表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)或與ALK6一起共轉(zhuǎn)染，確實(shí)顯著誘導(dǎo)了報(bào)道活性(圖4B)。結(jié)果提示為了轉(zhuǎn)位于核內(nèi)，需要Smad4來與磷酸化的Smad1一起形成異源-寡聚物，而BMP-2/4通過Smad與Hoxc-8蛋白相互作用，除去阻抑物Hoxc-8而激活基因轉(zhuǎn)錄。可能BMP-2/4通過除去Hoxc-8的轉(zhuǎn)錄阻抑來刺激間充質(zhì)細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞(圖4C)。
為了證實(shí)是否Hoxc-8位點(diǎn)介導(dǎo)了BMP信號(hào)傳導(dǎo)，將Hoxc-8結(jié)合位點(diǎn)的核心核苷酸從TAAT突變成GCCG而產(chǎn)生mHox-pGL3。該突變構(gòu)建物的轉(zhuǎn)染完全消除了ALK3(Q233D)-誘導(dǎo)的或ALK6(Q203D)-誘導(dǎo)的報(bào)道活性，并消除了C3H10T1/2細(xì)胞中的Hoxc-8抑制。這些結(jié)果確認(rèn)了骨橋蛋白Hox結(jié)合位點(diǎn)是一種BMP反應(yīng)性元件。
實(shí)施例15MH1中的兩個(gè)區(qū)域和Smad1接頭對(duì)與Hoxc-8的相互作用的貢獻(xiàn)用雙雜交研究在酵母中，用共免疫沉淀在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，并在體外用折疊試驗(yàn)檢測了Smad1和Hoxc-8之間的直接相互作用。為了測定介導(dǎo)蛋白-蛋白相互作用的區(qū)域，構(gòu)建了一系列編碼保守N-末端區(qū)域MH1(有(3-276)或無(1-169接頭(145-276))或保守C-末端區(qū)域MH2(有(145-466)或無(244-466)接頭)的Smad1缺失。在酵母雙雜交試驗(yàn)中測試了這些蛋白的結(jié)合。將野生型Smad1及其缺失突變體，以及空誘餌(對(duì)照，圖5A)分別轉(zhuǎn)化入含Hoxc-8捕獲質(zhì)粒的酵母細(xì)胞中，并測定了β-gal活性。攜帶MH1和/或接頭域的野生型和突變體與Hoxc-8相互作用，并顯示(與陰性對(duì)照比較)顯著增加的β-gal活性，而單獨(dú)的MH2域(276-466)不和Hoxc-8相互作用(圖5A)。
先前，已顯示Hoxc-8與衍生自骨橋蛋白啟動(dòng)子的23bp元件結(jié)合。凝膠移位試驗(yàn)顯示，GST-Smad1融合蛋白以劑量依賴性方式抑制Hoxc-8與該元件的結(jié)合(Shi和Yang,1999)。如圖6B所示，在細(xì)菌中表達(dá)了與GST融合的一套Smad1片段。在凝膠移位試驗(yàn)中分析了等量的純化GST-Smad1野生型和截短的突變體(圖6B)，對(duì)抑制Hoxc-8 DNA結(jié)合活性的區(qū)域進(jìn)行作圖。如圖5C所示，由于加入了野生型Smad1(泳道5)和含有MH1(泳道5)或接頭(泳道7)的突變Smad1，減弱了Hoxc-8的結(jié)合(泳道4)。在保留MH1和接頭域的Smad1中觀察到強(qiáng)烈的抑制(泳道6)。相反，當(dāng)加入GST-MH2時(shí)，Hoxc-8的結(jié)合保持不變(泳道9)。注意，接頭區(qū)對(duì)Hoxc-8結(jié)合DNA探針的抑制作用被MH2的存在所掩蔽(泳道8)。使用更小缺失的凝膠移位試驗(yàn)分辨出Smad1 MH1域和MH1-接頭連接區(qū)中的兩個(gè)與Hoxc-8相互作用的區(qū)域(148-191和101-145，圖6B和C)(圖6C，泳道11-16)。這兩個(gè)片段都以劑量依賴性的方式抑制Hxc-8結(jié)合(圖6D)。這些結(jié)果表明Smad 1的N-末端中的這兩個(gè)區(qū)域可說明Hoxc-8與其相關(guān)DNA元件結(jié)合的抑制。
實(shí)施例16同源域負(fù)責(zé)Hoxc-8與Smad1結(jié)合Hox蛋白具有普遍相似的同源域(HD)，含有高度保守的60個(gè)氨基酸的DNA結(jié)合基序(Sharley,等，1995)。除了在氨基酸(aa)149到209中的同源異型域處，Hoxc-8含有兩個(gè)其它保守肽區(qū)域一個(gè)八肽(aa1-8)和一個(gè)六肽(aa137-142)(Le Mouellic等，1988)。Leu-Met-Phe-Pro-Trp-Met六肽位于同源域的上游并被假定涉及與Hoxc-8輔助性輔因子相互作用(Phelan等，1995和Sharley等，1997)。最近的研究揭示Hoxb-1的五肽與其DNA結(jié)合伙伴，Pbx1蛋白之間直接接觸(Piper等，1999)。
也用Hoxc-8捕獲進(jìn)行了缺失分析，以確定與Smad1結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。將空捕獲(對(duì)照，圖6A)，Hoxc-8的全長形式，及其缺失突變體分別轉(zhuǎn)化入含有Smad1誘餌質(zhì)粒的酵母細(xì)胞，并隨后分析了β-gal活性。圖6A顯示，當(dāng)與陰性對(duì)照比較時(shí)，全長Hoxc-8(1-242)及其含同源域的缺失(137-242,151-242,和68-237)與Smad1的相互作用具有更高的β-gal活性。與全長Hoxc-8和含有氨基酸殘基68-237的原始克隆(Shi和Yang,1999)的結(jié)合較強(qiáng)，表明HD以外的區(qū)域與相互作用有關(guān)。同源域的缺失消除了該相互作用，提示同源域可能直接涉及Hoxc-8-Smad1相互作用。aa1-8保守區(qū)(圖6B中的CR1)和六肽(圖6B中的HP)的缺失似乎不導(dǎo)致結(jié)合的顯著下降。實(shí)際上，同源域單獨(dú)(圖6B,149-209)足夠支持強(qiáng)相互作用。
為了確定同源域是與Smad1相互作用的區(qū)域，將編碼同源域(149-209)或同源域與其C-末端側(cè)翼序列(HDC,151-242,圖6)的缺失子克隆入細(xì)菌表達(dá)載體，產(chǎn)生Hoxc-8融合蛋白的突變體。測試了Hoxc-8的含HD缺失突變體(圖6B-D)在野生型或突變性Smad1存在下與DNA的結(jié)合。如圖6D中所示，純化的GST-HD和GST-HDC與DNA探針結(jié)合(分別是泳道4和9)。野生型Smad1(泳道5和10)和含有MH1和接頭區(qū)的突變體(泳道6和11)抑制了結(jié)合，顯示了對(duì)Hoxc-8結(jié)合的最強(qiáng)抑制(圖9C，泳道7)。與用野生型Hoxc-8的凝膠移位試驗(yàn)相似，編碼Smad 1的MH1或接頭部分(泳道7和8)的較小缺失也抑制了HDC的結(jié)合。令人感興趣的是，只有編碼氨基酸殘基101-145(泳道12)的突變體抑制同源域的結(jié)合，但148-191(泳道13)不抑制，提示在Smad1-Hoxc-8相互作用中可能涉及一種以上的蛋白-蛋白接觸。
實(shí)施例17與Hoxc-8相互作用的兩個(gè)Smad1功能域誘導(dǎo)了骨橋蛋白啟動(dòng)子活化先前，已報(bào)道了Hoxc-8與266bp的骨橋蛋白啟動(dòng)子結(jié)合，并阻抑了報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄(Shi和Yang等，1999)。在C3H10T1/2間充質(zhì)細(xì)胞中Smad1、Smad4和BMPI型受體ALK3(Q233D)的組成性活化形式的共轉(zhuǎn)染，誘導(dǎo)了報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄。為了研究Smad1的Hoxc-8相互作用域的轉(zhuǎn)錄活性，將三個(gè)含有1或2個(gè)與核定位信號(hào)(NLS)融合的Hoxc-8相互作用域的cDNA片段克隆入CMV5B哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(圖7A)。用含有氨基酸3-276(Smad1-NL)、145-276(Smad1-L)、或101-191(Smad1-M)和OPN-266(含有Hoxc-8結(jié)合位點(diǎn)的重組受體構(gòu)建物)的Smad1表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染(Shi和Yang等，1999)。全部三種含有1或兩個(gè)Hoxc-8相互作用域的Smad1片段刺激了3-5倍的骨橋蛋白啟動(dòng)子活性(圖7)。然而，Smad1M(aa101-191，缺失的Smad1)不能刺激啟動(dòng)子活性。因此，Smad1的Hoxc-8相互作用域模擬了BMP信號(hào)傳導(dǎo)，并足夠誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄。
實(shí)施例18Smad1的Hoxc-8相互作用功能域誘導(dǎo)了骨細(xì)胞形成為了測試是否Smad1與Hoxc-8之間的相互作用刺激成骨細(xì)胞分化，也將Smad1-NL、Smad1-L和Smad1-M克隆入四環(huán)素調(diào)控的表達(dá)系統(tǒng)。將這些質(zhì)粒和對(duì)照載體永久性轉(zhuǎn)染入2T3細(xì)胞(一種特性明確的成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系)(Ghosh-Choudhury等，1996和Chen等，1998)。使用相應(yīng)的cDNA探針，用狹線印跡和RNA雜交選出了5至10個(gè)四環(huán)素-調(diào)控的陽性克隆。圖8B顯示在三個(gè)克隆中，Smad1片段的表達(dá)受到四環(huán)素的調(diào)控。
堿性磷酸酶活性是骨形成的標(biāo)志，而在祖細(xì)胞系中其活性的誘導(dǎo)標(biāo)志著細(xì)胞進(jìn)入成骨細(xì)胞譜系。通過撤除四環(huán)素，穩(wěn)定表達(dá)Smad1-NL、Smad1-L或Smad1-M以時(shí)間依賴的方式有效刺激了堿性磷酸酶的活性，而在用pTet-Splice載體永久轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞中堿性磷酸酶的活性保持不變(圖9C)。最重要的是，在2T3細(xì)胞中，這些Smad1片段的穩(wěn)定表達(dá)誘導(dǎo)了骨礦物化(圖9D)。這些結(jié)構(gòu)表明Smad1與Hoxc-8之間的相互作用引發(fā)了成骨細(xì)胞分化的全過程。
Hoxa-9蛋白也與骨橋蛋白Hox結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，而Smad1抑制其結(jié)合。已用酵母雙雜交系統(tǒng)和凝膠移位試驗(yàn)對(duì)與Smad1相互作用的Hoxc-8該蛋白功能域進(jìn)行了作圖。Hoxc-8同源域，一個(gè)高度保守的DNA結(jié)合基序，與Smad1相互作用。這些結(jié)果提示Smad1可抑制大多數(shù)Hox和同源域蛋白與其DNA結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。由于Hox和同源域蛋白均起了活化物和阻抑物的作用，取決于這些Hox和同源域蛋白的空間和時(shí)間表達(dá)以及相關(guān)啟動(dòng)子，BMP-2/4可以打開或關(guān)閉基因轉(zhuǎn)錄(圖4D)。該精密的調(diào)控機(jī)制可解釋為什么尚未確定BMP-2/4 DNA反應(yīng)性元件的特征。因此，BMP-2/4可通過調(diào)節(jié)Hox或同源域蛋白與其DNA結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合來刺激間充質(zhì)細(xì)胞分化。本發(fā)明證明了BMP誘導(dǎo)Smad1與Hoxc-8蛋白之間的相互作用，在前體細(xì)胞中刺激成骨細(xì)胞的分化。這些觀察揭示了在胚胎骨骼發(fā)育中，BMP與Hox基因之間的作用和關(guān)系。
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在本說明書中提到的任何專利或出版物表示本領(lǐng)域所在的本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。另外，這些專利和出版物以相同程度納入本文，即各獨(dú)立的專利和出版物是特意并獨(dú)立的納入本文作參考。
本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，本發(fā)明非常適合實(shí)施目的并獲得所述的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)，而本文描述的代表性優(yōu)選例的目的和方法、過程、處理、分子和具體的化合物，是示范性的，不是要限制本發(fā)明的范圍。其改變和其它的用途對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是存在的，而且包含在權(quán)利要求范圍確定的、本發(fā)明的精神中。
序列表<110>Cao,XuShi,xingmingChang,Zhijie<120>Hox和含有同源域的蛋白質(zhì)結(jié)合的抑制及其用途<130>D6106PCT<140><141>1999-04-05<150>US 60/080,859<151>1998-04-06<160>10<210>1<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸探針S的正向鏈<400>1agggtaattg gaggc15<210>2<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸探針S的反向鏈<400>2gcctccaatt accct15<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡聚物OPN-4的正向鏈<400>3catgacccca attagtcctg gcagca26<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡聚物OPN-4的反向鏈<400>4cagggatcca taaggaaagg 20<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡聚物OPN-5的正向鏈<400>5gacatcgttc atcagtaatg cttg 24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡聚物OPN-5的反向鏈<400>6caagcattac tgatgaacga tgtc24<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡聚物OPN-6的正向鏈<400>7gacatcgttc atcagtaatg ctttg 25<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡聚物OPN-6的反向鏈<400>8<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>骨橋蛋白Hoxc-8結(jié)合位點(diǎn)<400>9ggtagttaat gacatcgttc atcag25<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>突變骨橋蛋白Hoxc-8結(jié)合位點(diǎn)<400>10ggtagtgccg gacatcgttc atcag 2權(quán)利要求
1．一種在個(gè)體中刺激骨形成的方法，其特征在于，該方法包含步驟誘導(dǎo)Smad1和含同源框的轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，其中所述相互作用誘導(dǎo)編碼骨基質(zhì)蛋白的BMP-反應(yīng)性基因，所述骨基質(zhì)蛋白產(chǎn)生成骨細(xì)胞和/或成軟骨細(xì)胞分化，從而刺激骨分化。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述相互作用是通過選自Smad1磷酸化、Smad1過度表達(dá)，和所述含同源框轉(zhuǎn)錄因子突變的方法而誘導(dǎo)的。
3．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述含同源框的轉(zhuǎn)錄因子選自Hoxc-8,Hoxa-9,Msx-1和Msx-2。
4．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述BMP-反應(yīng)性基因是選自骨橋蛋白，涎蛋白，骨粘連蛋白和骨鈣蛋白。
5．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述個(gè)體是患骨質(zhì)疏松的個(gè)體。
6．一種誘導(dǎo)編碼骨基質(zhì)蛋白的基因的方法，其特征在于，該方法包含步驟誘導(dǎo)Smad1和含同源框的轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，其中所述相互作用導(dǎo)致誘導(dǎo)編碼骨基質(zhì)蛋白的基因。
7．一種誘導(dǎo)編碼骨橋蛋白基因的方法，其特征在于，該方法包含步驟誘導(dǎo)Smad1和Hoxc-8之間的相互作用，其中所述相互作用導(dǎo)致除去編碼骨橋蛋白基因的轉(zhuǎn)錄阻抑，從而誘導(dǎo)所述編碼骨橋蛋白的基因。
8．如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述相互作用是通過選自Smad1磷酸化、Smad1過度表達(dá)，和所述含同源框轉(zhuǎn)錄因子突變的方法而誘導(dǎo)的。
9．一種篩選刺激骨形成的化合物的方法，其特征在于，該方法包含步驟使細(xì)胞和化合物接觸；和測定所述化合物抑制Hoxc-8與基因結(jié)合的能力，其中對(duì)結(jié)合的抑制導(dǎo)致誘導(dǎo)所述基因，從而表明該化合物能刺激骨形成。
10．如權(quán)利要求9的方法，其特征在于，所述化合物選自抗體或其片段，合成藥物，合成蛋白和Smad1的磷酸化形式或其片段。
11．如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，測定Hoxc-8與基因結(jié)合的抑制采用選自凝膠移位試驗(yàn)、轉(zhuǎn)錄、RNA印跡和蛋白質(zhì)印跡方法。
12．如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述基因選自骨橋蛋白，涎蛋白，骨粘連蛋白和骨鈣蛋白。
13．一種調(diào)控個(gè)體內(nèi)疾病的方法，其特征在于，該方法包含步驟抑制含同源框的轉(zhuǎn)錄因子與在所述個(gè)體細(xì)胞中涉及調(diào)控疾病基因的結(jié)合，其中對(duì)結(jié)合的抑制除去了含同源框的蛋白對(duì)所述基因的轉(zhuǎn)錄阻抑，從而導(dǎo)致對(duì)所述涉及調(diào)控疾病的所述基因的誘導(dǎo)。
14．如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述抑制是由于存在與含同源框轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的化合物，從而抑制了所述含同源框的轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性。
15．如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述化合物選自抗體或其片段、合成藥物、合成蛋白和Smad1的磷酸化形式或其片段。
16．如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述含同源框的轉(zhuǎn)錄因子選自Hoxc-8,Hoxa-9,Msx-1和Msx-2。
17．如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述個(gè)體患有選自骨質(zhì)疏松、癌癥、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的疾病。
全文摘要
本發(fā)明證明了BMP－2/4通過Smad 1與Hoxc－8DNA結(jié)合域相互作用來除去Hoxc－8結(jié)合,以活化骨橋蛋白基因轉(zhuǎn)錄。因?yàn)樵谒蠬ox和含有同源域的蛋白中DNA結(jié)合域是保守的,所以Smad 1可能和所有Hox或含有同源域的蛋白質(zhì)相互作用。另外,本發(fā)明揭示了BMP－2/4信號(hào)途徑中Smad 1一介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄機(jī)制,還提供了關(guān)于胚胎發(fā)育中Hox基因的轉(zhuǎn)錄作用的信息。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1310618SQ99807021
公開日2001年8月29日 申請(qǐng)日期1999年4月5日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月6日
發(fā)明者曹旭, 史杏明, 常志杰 申請(qǐng)人:亞拉巴馬大學(xué)伯明翰分校研究基金會(huì)