專利名稱：Fsh和fsh變體制劑,產(chǎn)品和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到該領(lǐng)域已知的促卵泡激素(FSH)或促卵泡激素變體(FSH變體)的新制劑，制成品和使用制劑的方法。本發(fā)明還提供了有益的、多用途和穩(wěn)定的溶液、制劑和醫(yī)藥產(chǎn)品，它們以前從未用于醫(yī)療。這些制劑和產(chǎn)品對(duì)于以在一段治療時(shí)期增加FSH或FSH變體的血清含量為目的的治療服法尤其有用。這樣，本發(fā)明尤其滿足了在不育治療中對(duì)于含有FSH或FSH變體的方便穩(wěn)定和防腐的溶液，制劑和產(chǎn)品以及對(duì)它們的使用的需求。
背景技術(shù)：
FSH可用于不育癥?；颊咄ㄟ^每天或兩天一次的肌肉(IM)或皮下(SC)注射給藥，注射量隨其反應(yīng)而調(diào)整，通常為75-300IU/天。FSH的半衰期很短，使得患者必須連續(xù)進(jìn)行幾天注射，視其卵巢和睪丸反應(yīng)每天或兩天一次。一種更穩(wěn)定的FSH或FSH變體的制劑可提高其在治療中的應(yīng)用。
盡管FSH從未通過除IM或SC以外的獲準(zhǔn)給藥方式進(jìn)行給藥，其他的藥用蛋白可在較長的一段時(shí)期內(nèi)給藥。包括常規(guī)IM或SC注射、透皮貼劑(transdermal patches)、植入物、滲透泵、微型泵、藥筒(cartridge)、肺送遞系統(tǒng)及其它方式在內(nèi)的送遞方法均可在諸如輔助患者適應(yīng)，降低不適或輔助給藥等方面具有作用。這些長期的治療服法通常需要穩(wěn)定的溶液或制劑中加入防腐劑。
防腐劑一方面防止或盡可能將的制劑中的有害微生物污染。對(duì)于傳統(tǒng)的非蛋白治療劑，抗微生物防腐劑如雙氯苯雙胍己烷、苯酚、苯乙醇、鄰甲苯酚、間甲苯酚、對(duì)甲苯酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞、苯甲酸、烷基對(duì)羥基苯甲酸酯(甲基、乙基、丙基、丁基及其他類似基團(tuán))、氯下烷銨、氯化芐乙氧銨、sodium dehydroacetate andthimerosal及其各種混合物通常加入制劑以確保其在銷售期間和/或多種服用時(shí)無菌(Akers,MJ,Pharmaceutical Sciences,17thedition.,Mack,Easton,PA.,1279-1280,1985)。這一大類防腐劑對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定有害。例如，十分有效的防腐劑間甲酚據(jù)報(bào)道可同蛋白質(zhì)結(jié)合并使之變性(Development of PharmaceuticalParenteral Dosage Forms,Bontempo,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,New York,pp.118-119,1977)。諸如人類生長激素這樣的激素溶液的穩(wěn)定性還面臨著特殊的困難(Maa YF and Hsu C,International Journal of Pharmaceutics,140,pp.155-168,1996)。
FSH是異二聚體糖蛋白激素家族中的一員，該家族包括促甲狀腺素(TSH)、絨毛膜促性腺激素(CG)和黃體生成素(LH)(Pierce JGand Parsons TF,Annu.Rev.Biochem.,50,465-495,1981；Baenziger and Green,Biochem.Biophys.Acta.,947,287-306,1988)。本家族的成員為異二聚體，通過非共價(jià)作用將兩個(gè)不同的亞基結(jié)合在一起。人FSH(hFSH)二聚體包括(ⅰ)一條成熟的92氨基酸的α亞基，它是人類家族其它成員(如，絨毛膜促性腺激素(“CG”)、黃體生成素(“LH”)和促甲狀腺素(“TSH”))所共有的；(ⅱ)一條成熟的111氨基酸的β亞基，它為FSH所特有(Shomeet al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.39:187-205(1974)；Shome,et al.,Prot.Chem.,7:325-339,1988)。α和β亞基非共價(jià)結(jié)合，這使得該結(jié)合被認(rèn)為對(duì)蛋白質(zhì)去穩(wěn)定劑更敏感。
人類或其它哺乳類的天然FSHα和β亞基氨基酸序列以及這些序列的一些變體在1982年以前便已了解得很清楚，人類或其它哺乳類活性FSH在哺乳細(xì)胞中的克隆和表達(dá)在1985年以前便已完成。從純化的蛋白中對(duì)光有的促性腺激素α亞基(FSHα)進(jìn)行測(cè)序(Bellisarioet al.,J.Biol.Chem.248:6796(1973)；Morgan et al.,J.Biol.Chem.250:5247(1973))隨后將其克隆并表達(dá)(Fiddes et al.,Nature 281:351(1979)；Nature 286:684(1981)；J.Molec.Appl.Genet.1:3-18(1981))。FSHβ亞基也從純化的蛋白中進(jìn)行測(cè)序(Shomeet al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.39:187(1974)；Saxena et al.,J.Biol.Chem.251:993(1976))；(Sairam et al.,Biochem.J.197:541(1981)；Fujiki et al.,Biochem.Biophs.Acta624:428(1980))。Integrated Genetics報(bào)道了人類CG的重組表達(dá)(Biotechology Newswatch(p.3,June 20,1983)；Chemical andEngineering News 61:47(Nov.21,1983)；Genetic Technology News3:9(Dec.12,1983))以及它的活性形式(biotechnology Newswatch,Jan.16,1984),也報(bào)道了FSH的成功克隆(Genetic EngineeringNewsletter 4:4(August 10,1984))和重組FSH在哺乳類細(xì)胞中的活性形式(DNA 4:76(Jan.16,1985))。Amgen還報(bào)道了活性牛LH在CHO細(xì)胞中的表達(dá)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:7280(Nov.1985))。
有相當(dāng)多的文獻(xiàn)證據(jù)表明異源二聚體蛋白激素可在生理或酸環(huán)境中解聚(Ryan,R.J.,et al.,Recent Progr.Hormone Res.26:105-137；1970,Strickland,TW and Puett,D,J.Biol.Chem.,257:2954-2960；1982,Reichert LE and Ramsey Rb,J.Biol.Chem.,250:3034-3040；1975)。完整的二聚體對(duì)于FSH的生物活性和分泌是十分重要的(Baenziger JU and Green ED,Biochem.Biophys.Acta,947:287-306,1988；Corless,et al.,J.CellBiol.,104:1173-1181,1987)。降低FSH的不穩(wěn)定性的嘗試包括將兩亞基合并到一個(gè)穩(wěn)定分子中以產(chǎn)生一個(gè)單鏈分子，以及產(chǎn)生額外的二硫鍵以穩(wěn)定兩亞基間的相互作用(Sughara T.,et al.,J.Biol.Chem.,271:10445-10448,1996；Heikoop J.C.,et al.,NatureBiotech,15:658-62,1997)。
Donaldson，美國專利號(hào)No.5,162,306，直接相關(guān)于包括FSH和LH的獸用組合物。這些組合物在麝香草酚(5-甲基-2(1-甲基乙基)苯酚)中表現(xiàn)得很穩(wěn)定。據(jù)Danaldson報(bào)道，麝香草酚是U.S.P.XXI中的在已公布的SUPER-OV制劑中對(duì)糖蛋白無害的防腐劑之一(美國專利號(hào)No.5,162,306)。
來自絕經(jīng)后婦女的尿源FSH(hMG，其商品如Organon的Menotropin或HumagonTM以及Serono的urofollitropin或MetrodinTM)30多年來在生殖輔助技術(shù)(ART)計(jì)劃中用于排卵病人的多卵泡發(fā)育以及誘導(dǎo)無卵泡型不孕癥患者的排卵(Fauser BCJM andVan Heusden AM,Endocrine Rev.,18,7l-106,1997)。最近，來自CHO細(xì)胞的重組人FSH(rhFSH)已經(jīng)可以得到(Keene J.L.,et al.,J.Biol.Chem.,264:4769-4752,1989；Loumaye E.,et al.,HumanReprod.Update,1:188-199,1995；Olijve W.,et al.,Mol.Hum.Reprod.,2:361-369,1996)。
當(dāng)前的藥用FSH(hMG或rhFSH)以凍干形式提供在75 IU/瓶或150 IU/瓶的安瓿瓶中可在2-25℃下保存一年半到兩年。建議進(jìn)行十天以內(nèi)的起始藥量為75IU或150IU的每日注射以使hFSH的濃度達(dá)到穩(wěn)定，此濃度約為一次單獨(dú)給藥后濃度的1.5-2.5倍。這一給藥法產(chǎn)生的藥物濃度對(duì)于治療效果十分必要，因?yàn)镕SH通過閾機(jī)制發(fā)揮作用(Schoemaker J.,et al.,ANN.NY.Acad.Sci.687:296-299,1993)。根據(jù)患者的反應(yīng)，可進(jìn)行多至3個(gè)療程的不斷增加藥量的治療。患者或其伴侶必須每天將凍干的藥物以溶劑再配并立即給藥(Package insert N1700101A,published in February 1996,for FertinexTM(urofollitropin for injection,purified)forSubcutaneous injection,by Serono Laboratories,Inc.,Randolph,MA)。不用的物質(zhì)應(yīng)予以拋棄。
因此，該領(lǐng)域需要開發(fā)FSH或FSH變體蛋白的穩(wěn)定和防腐制劑及相關(guān)制成品以提高病人的順應(yīng)性。當(dāng)長期治療是必須或有益的時(shí)尤其需要這些穩(wěn)定制劑例如用FSH治療不育癥時(shí)。提供可獲準(zhǔn)用于在24小時(shí)或更長的時(shí)期內(nèi)的多用途給藥的FSH或FSH變體產(chǎn)品也是需要的。本發(fā)明還提供了FSH或FSH變體及相關(guān)制成品的新的穩(wěn)定溶液和制劑和防腐溶液和制劑，它們也可獲準(zhǔn)在24小時(shí)或更長的時(shí)期使用。
發(fā)明概要該發(fā)明提供了新的FSH或FSH變體的制劑，它們的制備，它們?cè)卺t(yī)療和獸醫(yī)學(xué)上的生育力紊亂的治療中的應(yīng)用及相關(guān)制成品。
在一方面，本發(fā)明提供了防腐的溶液和制劑，它包括FSH或FSH變體和一種防腐劑，該防腐劑選自酚、間甲苯酚、對(duì)甲苯酚、鄰甲苯酚、氯甲酚、芐醇、烷基對(duì)羥基苯甲酸(甲，乙，丙，丁酯及其類似物)、潔爾滅、氯化芐乙銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞及其各種衍生物的至少一種或混合物，的水性稀釋液。此防腐溶液和制劑還可以根據(jù)情況而含有一種選定的緩沖液或鹽。
另一方面，本發(fā)明提供了包含F(xiàn)SH或FSH變體和一種選定的緩沖液的穩(wěn)定的溶劑或制劑，緩沖液優(yōu)選為含有鹽水或選定的鹽類的磷酸緩沖液。
在另一方面，本發(fā)明提供了向包括對(duì)有需求的患者給藥的用于不育癥治療的FSH或FSH變體的防腐制劑，它溶于含至少一種防腐劑的溶液中，該防腐劑選自酚、間甲苯酚、對(duì)甲苯酚、鄰甲苯酚、氯甲酚、芐醇、烷基對(duì)羥基苯甲酸(甲，乙，丙，丁酯及其類似物)、潔爾滅、氯化芐乙銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞及其各種衍生物的至少一種或混合物，另一方面，本發(fā)明提供了不育癥治療方法，包括對(duì)有需求的患者給藥FSH或FSH變體的穩(wěn)定制劑，它溶于一穩(wěn)定溶液中，該溶液優(yōu)選為含有鹽水或選定鹽類的磷酸緩沖液。
本發(fā)明另一方面提供了制備至少一種FSH或FSH變體的多劑量制劑的方法，包括將FSH和至少一種防腐劑相混合，該防腐劑選自酚、間甲苯酚、對(duì)甲苯酚、鄰甲苯酚、氯甲酚、芐醇烷基對(duì)羥基苯甲酸(甲，乙，丙，丁酯及其類似物)、潔爾滅、氯化芐乙銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞及其各種衍生物的至少一種或混合物，的水性溶液。
本發(fā)明另一方面提供了制備至少一種FSH或FSH變體的穩(wěn)定制劑的過程，該制劑包括同穩(wěn)定溶液或制劑相混合FSH或FSH變體，該溶液或制劑優(yōu)選為含有鹽水或選定鹽類的磷酸緩沖液。
本發(fā)明還提供了用于人類醫(yī)療的制成品，包括包裝材料和藥瓶，瓶中含有FSH或FSH變體和一種防腐劑的溶液，此處所述的包裝材料包括一個(gè)表明該溶液可使用超過24小時(shí)或更長時(shí)間的標(biāo)簽。本發(fā)明還提供了用于人類醫(yī)療的制成品，包括包裝材料和藥瓶，第一個(gè)藥瓶含有凍干的FSH或FSH變體，第二個(gè)瓶中含有防腐劑，此處所述的包裝材料包括一個(gè)標(biāo)簽用以指導(dǎo)患者用防腐溶液再配FSH或FSH變體以形成可在所述條件下使用超過24小時(shí)或更長時(shí)間的溶液。
發(fā)明還提供了用于人類醫(yī)療的制成品，包括包裝材料和藥瓶，含有凍干的FSH或FSH變體和第二種穩(wěn)定溶液或制劑，該溶液或制劑優(yōu)選為含有鹽水或選定鹽類的磷酸緩沖液，此處所述的包裝材料包括一個(gè)表明該溶液可使用超過24小時(shí)或更長時(shí)間的標(biāo)簽。
本發(fā)明還提供了用于人類醫(yī)療的制成品，包括包裝材料和藥瓶，第一個(gè)藥瓶含有凍干的FSH或FSH變體，第二個(gè)瓶中含有防腐劑，此處所述的包裝材料包括一個(gè)標(biāo)簽用以指導(dǎo)患者用防腐溶液再配FSH或FSH變體以形成可在所述條件下使用超過24小時(shí)或更長時(shí)間的溶液。
本發(fā)明還提供了用于人類醫(yī)療的制成品，包括包裝材料和藥瓶，含有凍干的FSH或FSH變體和第二種穩(wěn)定溶液或制劑，該溶液或制劑優(yōu)選為含有鹽水或選定鹽類的磷酸緩沖液，此處所述的包裝材料包括一個(gè)標(biāo)簽用以指導(dǎo)患者用穩(wěn)定溶液再配FSH或FSH變體以形成可在所述條件下使用超過24小時(shí)或更長時(shí)間的溶液。
詳述一方面，本發(fā)明提供了重組或/純化或分離而得的FSH或FSH變體溶液和制劑，制成品，使用或治療方法以及藥用產(chǎn)品，它們的穩(wěn)定超出預(yù)期且/或適于長期或多方面用途。效用這些具備改進(jìn)的性質(zhì)或穩(wěn)定性的FSH或FSH變體的溶液和制劑，制成品，使用或治療方法對(duì)于婦女和男子不育的治療十分有效。這些制劑和制成品還適用于可注射的和可供選擇的遞送系統(tǒng)，例如，但不限于鼻腔、肺、透粘膜、透皮膚、口腔、皮下、肌間或非腸胃的持續(xù)釋放，液體或干制劑。通過防止或降低活性或穩(wěn)定性的喪失，或通過提高給藥的效率或期望值，如在以下任一方面的提高，模式、頻率、藥量、舒適度、使用方便性、體內(nèi)或體外的生物活性等等，所提供的TSH和TSH變體在單獨(dú)或與至少一種額外的促性腺激素組合給藥時(shí)，同已知的商品比較還具有增強(qiáng)的體內(nèi)效力。引用本文引用的出版物或?qū)＠诖肆袨閰⒖迹鼈儽砻髁嗽擃I(lǐng)域與本發(fā)明同期以及引用的相關(guān)發(fā)明申請(qǐng)的歸檔日期的狀況。歸為參考的引用如下:Ausubel,et al.,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,NY(1987-1999)；Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ndEditon,Cold SpringHarbor,NY(1989)；Harlow and Lane,Antibodies,a LaboratoryManual,Cold Spring Harbor,NY(1989)；Collogan,et al.,eds.,Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons,N.Y.(1994-1999)；Colligan et al.,eds.,Current Protocols inProtein,John Wiley and Sons,N.Y.(1994-1999).定義本文定義的促卵泡激素“FSH”或促卵泡激素變體“FSH變體”，無論是重組產(chǎn)生還是分離獲得的，在本領(lǐng)域中已被熟知。這里使用的FSH指的是全長的成熟蛋白，它包括無論是重組產(chǎn)生還是人源分離獲得的人類FSH或“hFSH”(見Shome B.,et al.,J.Prot.Chem.,7:325-339,1988；Saxena B.B.and Rathnam P.,J.Biol.Chem.,251:993-1005,1976；Watkins,et al.,DNA,6:205-212,1987；Shome B.and Parlow A.F.,J.Clin.Endocrinol.Metab.39(1):203-205,1974；Beck,et al.,DNA,4:76,1985；美國專利號(hào)5,405,945和美國專利號(hào)5,639,640-每一引用均合并與參考文獻(xiàn)中)，但不限于此。序列標(biāo)識(shí)號(hào)No.5提供了人類FSHα亞基的蛋白序列，序列標(biāo)識(shí)號(hào)No.6提供了人類FSHβ亞基的蛋白序列。各種FSH變體也為本領(lǐng)域所熟知(見Shome et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.39:187(1974)；Saxena et al.,J.Biol.Chem.251(4):993-1005(1976)；Sairam et al.,Biochem.J.197:541(1981)；另見Closset Eur.J.Biochem J 197:541(1981)；Fujiki,J.Biol.Chem.253:5363-5368(1978)；Sairam,Biochem.J.541-552(1981)-每一引用均獨(dú)立包含于參考文獻(xiàn)中)。***先前工藝的FSHβ亞基還包括Saxena序列及Sairm在關(guān)于(a)進(jìn)化上保守的氨基酸和(b)已詳知的且被表征的序列錯(cuò)誤的討論中提及的一類序列。本領(lǐng)域人員應(yīng)當(dāng)知道先前工藝確認(rèn)的氨基酸用(ⅰ)化學(xué)上近似的氨基酸或(ⅱ)進(jìn)化上保守的氨基酸的替換對(duì)含有這樣修飾過的hFSHβ亞基的FSH異二聚體的生物學(xué)活性無影響。
特別是在關(guān)于Saxena hFSH序列的說明以及關(guān)于功能FSH分子間的已確認(rèn)的氨基酸替換的討論中，Sairam定義了先前工藝中的一類FSHβ鏈序列。更具體地，1981年，根據(jù)Saxena et al.,Shome et al.,Closset et al.和Fujiki et al.,Sairam在Sairam,Biochem J197:541,551(1981)中發(fā)表確認(rèn)了保守氨基酸序列。先前工藝(1)為Saxena的FSHβ亞基序列優(yōu)于Shome的FSHβ亞基提供了證據(jù)；(2)提出了羧基端的異質(zhì)性address；(3)提出受分子中種間差異影響的部分對(duì)激素的活性影響并不重要；(4)強(qiáng)調(diào)了種間以及三種糖蛋白FSH,LH,TSH的β鏈間的同源性。
C端異質(zhì)性在除豬FSH外的所有已發(fā)表序列中均有報(bào)道，豬FSH的C端殘基只能是甘氨酸。對(duì)于27位，Saxena認(rèn)為這個(gè)位置上是一個(gè)色氨酸殘基，對(duì)于FSH-B的24位。進(jìn)化上的保守亦支持它為一個(gè)色氨酸。對(duì)于44位和46位，Saxena顯示44位上的殘基應(yīng)是精氨酸而非賴氨酸，46位上應(yīng)為賴氨酸而非精氨酸。豬、碼、綿羊的序列也反映了進(jìn)化對(duì)于44位上精氨酸的壓力。21、22和44位上的變化涉及到結(jié)構(gòu)上的保守替換或進(jìn)化上的保守(同源)替換，它們均有生物活性。
Sairam,Shome和Closset的參考文獻(xiàn)在21-22的殘基均公布為異亮氨酸和絲氨酸，而在這些位置Saxena公布為亮氨酸和蘇氨酸，F(xiàn)ujiki公布為異亮氨酸和蘇氨酸。公布的這些不僅是進(jìn)化上的保守替換而且是結(jié)構(gòu)上的保守替換。41位上天冬氨酸和天冬酰胺之間的變化涉及到兩個(gè)進(jìn)化上保守的殘基，它們均提供生物活性，天冬氨酸為Sairam,Shome,Closset和Fujiki公布，天冬酰胺為Saxnea,Closset和Sairam公布。這些保守替換和進(jìn)化上保守的替換的公布指導(dǎo)有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員在hFSH-B鏈類群中分辨FSHβ亞基變體。
此處的FSH的變體是羧端經(jīng)刪除的β亞基，它短于序列標(biāo)識(shí)號(hào)N0:6的全長成熟蛋白。序列標(biāo)識(shí)號(hào)NOS:11、12和13給出了人類β亞基的羧端刪除。β亞基的羧端變體被認(rèn)為同已知的α亞基形成二聚體而成為FSH變體異二聚體。另外已知了許多種FSH，包括豬FSH(序列標(biāo)識(shí)號(hào)NOS:7和8)，馬FSH(序列標(biāo)識(shí)號(hào)NOS:3和4)，牛FSH(序列標(biāo)識(shí)號(hào)NOS:1和2)，綿羊FSH(序列標(biāo)識(shí)號(hào)NOS:9和10)及在Combarnous Y.,Endocrine Reviews,13(4),670-691,1992-包含于參考文獻(xiàn)-中所引用的。如本文進(jìn)一步給出，其他的羧基變體被認(rèn)為可由該領(lǐng)域的技術(shù)人員從給定的物種中制造和制備出。
FSH異二聚體或FSH變體異二聚體可由適當(dāng)?shù)姆椒ㄉa(chǎn)，如，重組生產(chǎn)、由天然來源分離或純化、化學(xué)合成、或綜合使用各方法。FSH異二聚體或FSH變體異二聚體的非限制實(shí)施例包括一α亞基和一β亞基，它包括以下序列，但不限于這些序列(a):α-亞基(SEQ ID NO:1)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:2)RSCELTNITITVEKEECGFCISINTTWCAGYCYTRDLVYRDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCSKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFREIKE(b):α-亞基(SEQ ID NO:3)FPDGEFTTQDCPECKLRENKYFFKLGVPIYQCKGCCFSRAYPTPARSRKTMLVPKNITSESTCCVAKAFIRVTVMGNIKLENHTQCYCSTCYHHKIβ-亞基(SEQ ID NO:4)NSCELTNITIAVEKEGCGFCITINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATACHCGKCNSDSTDCTVRGLGPSYCSFGDMKE(c):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:6)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE(d):α-亞基(SEQ ID NO:7)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:8)NSCELTNITITVEKEECNFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFSEMKE(e):α-亞基(SEQ ID NO:9)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:10)RSCELTNITITVEKEECSFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKACTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDRDSTDCTVRGLGPSYCSFSDIRE(f):α-亞基(SEQ ID NO:5)
APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:11)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGE(g):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:12)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEM(h):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:13)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMK術(shù)語“重組”的使用指的是通過重組DNA技術(shù)進(jìn)行FSH或FSH變體的重組生產(chǎn)(如Boine et al.,Seminars in ReproductiveEndocrinology 10,45-50,1992，另如本文進(jìn)一步提供或示例)。已知了幾個(gè)物種的α和β亞基的基因組或cDNA序列(Fiddes,J.C.,etal.,J.Molec.Appl.Genet.1:3-18(1981)；Esch F.S.,et al.DNA 5:363-369(1986)；Watkins P.C.,et al.,DNA 6:205-212(1987)；Hirai T.,et al.,J.Mol.Endocrinol.5:147-158(1990)；Maurer,R.A.,et al.,Mol.Endocrinol.1:717-723(1987)；Guzman K.,et al.,DNA Cell Biol.10:593-601(1991)；Kumar TR,et al.,Gene.1995 Dec 12；166(2):335-6；Kumar TR,et al.,Gene.1995 Dec 12；166(2):333-4-在此引入作為參考)。序列標(biāo)識(shí)號(hào)14-20提供了α和β亞基的幾個(gè)DNA序列。用編碼α和β亞基的DNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，無論各有一個(gè)啟動(dòng)子的每一亞基在一個(gè)載體上還是在兩個(gè)載體上，均可產(chǎn)生完整的二聚體，用其他本領(lǐng)域已知的方法亦可。
根據(jù)本發(fā)明所使用的FSH或FSH變體不僅可通過包括由哺乳細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因制備在內(nèi)的重組方法產(chǎn)生，還可從其它生物來源純化，如尿源純化。可接受的方法包括在Hakola,K.Molecular and CellularEndocrinology,127:59-69,1997；Keene,et al.,J.Biol.Chem.,J.Biol.Chem.,264:4769-4775,1989；Cerpa Poljak,et al.,Endocrinology,132:351-356,1993；Dias,et al.,J.Biol.Chem.,269:25289-25294,1994；Flack,et al.,J.Biol.Chem.269:14015-14020,1994；Valove,et al.,Endocrinology,135:2657-2661,1994和美國專利號(hào)3,119,740中所描述的方法。
“基本純”用于蛋白或多肽時(shí)指的是它們從其它細(xì)胞或非細(xì)胞分子中分離而得并含有其它蛋白分子?；炯兊闹苽湮锛兌戎辽?5％，至少95％更優(yōu)。基本純的蛋白可通過為熟練技術(shù)人員所掌握的多種技術(shù)來制備，例如高壓液相色譜(HPLC)和本領(lǐng)域中已知的或本文闡述的方法。
術(shù)語“給藥”指的是向有需要的患者體內(nèi)引入本發(fā)明的制劑以治療疾病或癥狀。
術(shù)語“患者”指的是接受疾病或癥狀治療的哺乳類動(dòng)物?；颊呖梢允且韵律铮祟?、綿羊、豬、馬、牛、兔及其他類似生物，但并不限于此。
術(shù)語“烷基對(duì)羥基苯甲酸酯(alkylparaben)”指的是可用作抗微生物試劑的生理可耐受的C1-C6烷基對(duì)羥基苯甲酸酯。非限制性的例子至少包括對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯。
術(shù)語“水性稀釋劑”指的是含水的液體溶劑。水溶劑系統(tǒng)可以只包括水或水加上一種或多種可混合溶劑，還可以含溶于其中的溶質(zhì)如糖或其它賦形劑。較常用的可混合溶劑是短鏈的有機(jī)醇，如甲醇、乙醇、丙醇，短鏈的酮，如丙酮，以及多羥基醇，如甘油。
“等滲試劑”是一種生理可耐受的化合物，它使制劑的透性適當(dāng)以防止與制劑接觸的細(xì)胞膜的水的凈流入(net flow)。諸如甘油這樣的化合物常在已知濃度下用于該目的。其他合適的等滲試劑包括氨基酸和蛋白質(zhì)(例如甲硫氨酸和白蛋白)、鹽(例如氯化鈉)、和糖(例如葡萄糖、蔗糖和乳糖)以及其他本領(lǐng)域已知的化合物，在此引為參考。
術(shù)語“防腐劑”指的是加入至制劑中作為抗微生物、抗真菌、抗支原體、抗病毒、抗朊病毒和/或抗細(xì)菌試劑的化合物或組合物。含有本發(fā)明的制劑的防腐FSH或FSH變體更好地符合了商品化多用途產(chǎn)品的防腐效果的法令法規(guī)。合適的防腐劑包括但不限于氯化芐乙銨、潔爾滅、雙氯苯雙胍己烷、苯酚、間甲苯酚、芐醇烷基對(duì)羥基苯甲酸酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯及其他類似基團(tuán))、脫氫乙酸鈉、鄰甲苯酚、對(duì)甲苯酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞苯甲酸和它們中的至少一種的混合物。例見Wallhauser,K.,Develop.Biol.Standard.24,pp.6-28(Basel,S.Krager,1974)。
術(shù)語“磷酸緩沖液”指的是含磷酸根離子的賦形劑。磷酸緩沖液一般由磷酸或磷酸鹽制備，如鈉鹽或鉀鹽。本領(lǐng)域已知幾種磷酸鹽，如鈉和鉀的單價(jià)、二價(jià)和三價(jià)鹽。已知磷酸鹽還以水合的形式存在。磷酸緩沖液的pH范圍很關(guān)，如從4到10,5到9則更優(yōu)，最好是在6.0和8.0之間。本發(fā)明的制劑pH值最好在約6.8到7.8之間，包括pH7.0、7.2、7.4。鈉離子或鉀離子為較優(yōu)選的離子，它們單獨(dú)或共同存在于溶液中，如磷酸氯化鈉緩沖液(PBS)。磷酸氯化鈉緩沖液在本領(lǐng)域中為人們熟知，如Dulbecco的磷酸氯化鈉緩沖液。溶液中鹽的濃度在5mM、9.5mM、10mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM到500mM之間變化。離子含量最好在10mM、50mM或100mM以上。
術(shù)語“藥瓶”寬泛地指適于在無菌狀態(tài)下盛放FSH和稀釋液的容器。本文使用的藥品的例子包括安瓿瓶、藥筒(cartridge)、包裝泡(blister package)或其它適用于泵(包括滲透泵)，導(dǎo)液管，透皮貼劑(transdermal patches)，藥筒，肺、跨粘膜或非腸胃送遞系統(tǒng)的容器。適合包裝用于肺、跨粘膜或透皮給藥的產(chǎn)品的藥瓶在本領(lǐng)域已為人們所熟知。
術(shù)語“穩(wěn)定性”指的是本發(fā)明的制劑的物理、化學(xué)和結(jié)構(gòu)構(gòu)象的穩(wěn)定。蛋白質(zhì)制劑的不穩(wěn)定可能導(dǎo)致化學(xué)降解或蛋白分子聚集成高度多聚體，這是由于異二聚體解聚成單體、去糖基化、糖基修飾及其它結(jié)構(gòu)修飾造成的，它們至少可以減低包含于本發(fā)明中的FSH多肽一種生物活性。
“穩(wěn)定”溶液和制劑是指其中的一種蛋白的降解、修飾、聚集、生物活性的喪失等程度及處于可接受的控制之內(nèi)且該程度隨時(shí)間的增加亦非不可接受，優(yōu)選的“穩(wěn)定”溶液或制劑為含有鹽水或選定鹽類的磷酸緩沖液。穩(wěn)定性可通過本領(lǐng)域所熟知的方法評(píng)測(cè)，包括測(cè)量樣品的光散射、光表觀衰減(吸收或光密度)、大小(例如分子量排阻層析)、體內(nèi)或體外生物活性和/或通過差示量熱掃描法(DSC)。其他本領(lǐng)域所熟知的方法也可根據(jù)本發(fā)明而使用。
術(shù)語“治療”指的是對(duì)適于FSH給藥的患者進(jìn)行給藥、跟蹤監(jiān)控、處理和/或看護(hù)，其目的在于獲得卵泡或睪丸刺激或其它受FSH調(diào)控的生理反應(yīng)。治療可以包括用于誘導(dǎo)或提高卵泡或精子發(fā)育或誘導(dǎo)排卵的FSH給藥，但不限于此。另外，預(yù)期治療可用于恢復(fù)雄性的正常精子發(fā)生。
“鹽”指的是生理可耐受的FSH的鹽。該鹽由蛋白質(zhì)的任一或多個(gè)帶電基團(tuán)和任一或多個(gè)生理可耐受的無毒陰離子或陽離子之間形成。有機(jī)和無機(jī)鹽包括由諸如鹽酸、硫酸、磺酸、酒石酸、富馬酸、氫溴酸、羥基乙酸、檸檬酸、馬來酸、磷酸、琥珀酸、乙酸、硝酸、安息香酸、抗壞血酸、對(duì)甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸(naphthalenesulfonic)、丙酸、碳酸等這樣的酸或諸如銨、鈉、鉀、鈣或鎂等這樣的離子制備而的得。本領(lǐng)域的其它適合的鹽也包括在內(nèi)。
術(shù)語“緩沖液”或“生理可耐受的緩沖液”指的是在制劑中可安全用于藥用或獸用的化合物且其在制劑所需的pH范圍內(nèi)可維持制劑效能或控制pH?？稍跍睾偷乃醦H和堿pH間控制pH的可行緩沖液包括諸如磷酸、乙酸、檸檬酸、精氨酸、TRIS和組氨酸這樣的化合物，但不限于此?！癟RIS”指的是2-氨基-2-羥甲基-1,3-丙二醇和它的任何藥學(xué)上可接受的鹽。優(yōu)選為含有鹽水或選定鹽類的磷酸緩沖液。其他生理可耐受的或適于在所需條件下控制pH的緩沖液包括于本發(fā)明內(nèi)，它們已為具備本領(lǐng)域普通技術(shù)的人員所知。編碼FSH或FSH變體的核酸利用依據(jù)于一寡核苷酸或已知核酸序列的探針可檢測(cè)cDNA或基因組文庫以得到編碼已知FSH序列的克隆?？梢杂锰结樛蚪M或cDNA序列進(jìn)行雜交以從相同或不同的有機(jī)體中分離同源DNA序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)為不同嚴(yán)緊程度的雜交可用于分析且雜交或介質(zhì)洗滌均可以是嚴(yán)緊的。隨著雜交條件變得更加嚴(yán)緊，探針和目標(biāo)之間的互補(bǔ)程度會(huì)提高。嚴(yán)緊程度可通過溫度、離子強(qiáng)度、pH和部分變性劑如甲酰胺的存在而加以控制。例如，通過控制甲酰胺的含量于0-100％之間而改變反應(yīng)溶液的極性可以便捷地改變雜交的嚴(yán)緊程度?？蓹z測(cè)結(jié)合所需的互補(bǔ)度(序列識(shí)別)將隨介質(zhì)雜交和/或介質(zhì)洗脫的嚴(yán)緊度而變化。最佳互補(bǔ)度為100％；然而，必須認(rèn)識(shí)到降低雜交和/或介質(zhì)洗脫的嚴(yán)緊度可補(bǔ)償探針和引物序列上的微小變化。
本領(lǐng)域中的RNA或DNA的擴(kuò)增方法已為人所熟知，它們可根據(jù)本發(fā)明所提供的指導(dǎo)無需過度的試驗(yàn)，而在合適的實(shí)驗(yàn)中使用。通過PCR的選擇性擴(kuò)增方法可對(duì)核酸序列小片段，如編碼已定義的FSH變體β鏈的核酸，進(jìn)行操作。這樣的擴(kuò)增技術(shù)可向擴(kuò)增序列加入便捷的終止信號(hào)、限制性切點(diǎn)等類此序列。
已知的DNA或RNA擴(kuò)增方法包括，多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)和相關(guān)擴(kuò)增過程(例見Mullis,et al.的美國專利號(hào)4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；Innis的美國專利號(hào)5,142,033；Wilson et al.的美國專利號(hào)5,122,464；Innis的美國專利號(hào)5,091,310；Gyllensten,et al.的美國專利號(hào)5,066,584；Gelfand,et al.的美國專利號(hào)4,889,818；Silver,et al.的美國專利號(hào)4,994,370；Biswas的美國專利號(hào)4,766,067；Ringold的美國專利號(hào)4,656,13)，以及RNA依賴的擴(kuò)增，其使用目標(biāo)序列的反義RNA作為雙鏈DNA合成的模板(Malek,et al.的美國專利號(hào)5,130,238；商品名NASBA,Ausubel，見上文；Colligan，見上文；Sambrook，見上文；全文引入作為參考)，但擴(kuò)增方法并不限于這些。
例如，多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)可用于從基因組或cDNA文庫直接擴(kuò)增聚核苷序列或相關(guān)DNA序列。在諸如克隆編碼表達(dá)蛋白的核酸序列，獲取FSH或FSH變體，產(chǎn)生用作從樣品中檢測(cè)所需mRNA的探針、用于核酸測(cè)序或其他目的的核酸這樣的實(shí)驗(yàn)中PCR和其他體外擴(kuò)增法方法都是有用的。充足的指導(dǎo)技術(shù)人員的體外擴(kuò)增方法實(shí)例可見于上文中Berger,Sambrook，和Ausubel的文獻(xiàn)，以及Mullis,etal.的美國專利號(hào)4,683,202(1987)；Innis,et al.,PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications,Eds.,Academic Press Inc.,San Diego,CA(1990)。用于基因組PCR擴(kuò)增的商品化試劑盒在本領(lǐng)域已為人所知。例見Advantage-GC Genomic PCR Kit(Clontech)。T4基因32蛋白(Boehringer Mannheim)可提高長PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。用于構(gòu)建核酸的合成方法表達(dá)上述FSH或FSH變體所需的核酸還可通過直接化學(xué)合成法制備，如Narang,et al.,Meth.Enzymol.68:90-99(1979)中的磷酸三酯法；Brown,et al.,Meth.Enzymol.68:109-151(1979)中的磷酸二酯法；Beaucage,et al.,Tetra.Letts.22(20):1859-1862(1981)中的diethylphosphoramidite法；Beaucage andCaruthers,Tetra.Letts.22(20):1859-1862(1981)中描述的固相phosphoramidite三酯法；利用自動(dòng)合成儀；Needham-VanDevanter,et al.,Nucleic Acids Res.12:6159-6168(1984)中所述方法；以及美國專利號(hào)4,458,066中的固相支持物法?；瘜W(xué)合成通常產(chǎn)生單鏈寡聚核苷酸，其可通過同互補(bǔ)序列雜交或以單鏈為模板用DNA聚合酶進(jìn)行多聚化來轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA。本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)為盡管化學(xué)合成的DNA限于100個(gè)堿基以內(nèi)的序列，可以通過連接較短序列以得到較長的序列。重組表達(dá)盒如本領(lǐng)域所知，利用重組表達(dá)盒可以表達(dá)已知FSH或FSH變體的編碼核酸。核酸序列，如編碼全長亞基的cDNA或基因組序列，可用于構(gòu)建重組表達(dá)盒，該盒可引入所需的宿主細(xì)胞。但在本領(lǐng)域中，據(jù)認(rèn)為為獲得有功能的異二聚體必須同時(shí)表達(dá)兩個(gè)亞基，無論在它們?cè)谝粋€(gè)質(zhì)?；騼蓚€(gè)不同質(zhì)粒中引入。一個(gè)典型的重組表達(dá)盒包括同可作用于其上的的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控序列相連的一段多聚核酸，該調(diào)控序列在宿主細(xì)胞中可控制各亞基的多聚核酸的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域熟知用以表達(dá)FSH的這些方法(例如CHO細(xì)胞產(chǎn)生的重組人類FSH(hFSH)；(KeeneJ,L.,et al.,J.Biol.Chem.,264:4769-4752,1989；Loumaye E.,et al.,Human Reprod.Update,1:188-1999；Oliyve W.,et al.,Mo.Hum.Reprod.,2:361-369,1996)。
異源和非異源的啟動(dòng)子(如內(nèi)生啟動(dòng)子)均可用于編碼FSH或FSH變體亞基的核酸的直接表達(dá)。通過重組技術(shù)的普通生產(chǎn)方法已為本領(lǐng)域所熟知.例見Sambrook,et al.,1989；Ausubel,et al.,1987-1987，均全文引入作為參考。載體和宿主細(xì)胞編碼FSH和FS或變體α和β亞基的多聚核酸可同含用以在宿主中擴(kuò)增的選擇標(biāo)記的載體相連。一質(zhì)粒載體(或多個(gè)質(zhì)粒載體，當(dāng)α和β亞基在不同載體上時(shí))通常在沉淀物中，如磷酸鈣沉淀，或同帶電的脂成復(fù)合物而被引入。如果載體是病毒，可利用適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系對(duì)其進(jìn)行體外包裝然后轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
每一亞基的DNA插入組件均須同可對(duì)其作用的適當(dāng)啟動(dòng)子連接，如SV40的早期或晚期啟動(dòng)子或反轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)序列啟動(dòng)子。其它的合適啟動(dòng)子為有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員所熟悉。表達(dá)結(jié)構(gòu)還進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)錄起始和終止位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)的翻譯所必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。該結(jié)構(gòu)表達(dá)而得的成熟轉(zhuǎn)錄本的編碼部分最好包括一起始處的翻譯起始密碼子和mRNA末端適當(dāng)位置處的終止密碼子(例如UAA、UGA或UAG)。
較優(yōu)選的表達(dá)載體包括至少一個(gè)選擇標(biāo)記。這樣的標(biāo)記包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新生霉素抗性基因以及用于大腸桿菌和其它細(xì)菌培養(yǎng)的四環(huán)素或氨芐青霉素的抗性基因。合適的宿主細(xì)胞的代表性例子包括真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞，如果蠅S2和草地夜蛾SF9細(xì)胞；動(dòng)物或哺乳類細(xì)胞，如CHO、COS、AV-12、HEPG2、NIH3T3和Bowes黑素瘤細(xì)胞；以及植物細(xì)胞，其中CHO為較優(yōu)選的細(xì)胞。適合于上述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和環(huán)境已為本領(lǐng)域所知。優(yōu)選的真核載體包括可從Stratagene購得的pWLNEO,pSV2CAT,pOG44,pXT1,pSG；及可從Pharmacia購得的pSVK3,pBPV和pMSG。其它的合適載體為有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員所熟悉。
向宿主細(xì)胞引入一個(gè)或多個(gè)載體可通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂類介導(dǎo)的陽離子轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其它方法來完成。這些方法在許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中均有描述，如Sambrook的上述文獻(xiàn)第一至四章和十六至十八章；Ausubel的上述文獻(xiàn)第一、九、十三、十五、十六章。
預(yù)計(jì)FSH或FSH變體可以以修飾過的形式表達(dá)，如成融合蛋白，而且不僅可以包括分泌信號(hào)還可以包括附加的異源功能區(qū)。例如可以將一段附加的氨基酸，特別是帶電氨基酸加至多肽的N末端，以增強(qiáng)其在宿主細(xì)胞、純化或其后的操作和儲(chǔ)存過程中的穩(wěn)定性和耐久性。小肽段也可加入多肽以輔助純化。這些區(qū)域可在所需FSH或FSH變體最終制成前去除。這些方法在許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中均有一般性描述，如Sambrook的上述文獻(xiàn)第17.29至17.42章和18.1至18.74章；Ausubel的上述文獻(xiàn)第16、17和18章。蛋白在宿主細(xì)胞中的表達(dá)利用本發(fā)明的核酸序列或本領(lǐng)域已知的序列可以在經(jīng)重組工程處理的真核細(xì)胞，如哺乳細(xì)胞中表達(dá)FSH或FSH變體的α和β亞基。本領(lǐng)域的技術(shù)人員預(yù)計(jì)對(duì)于用以表達(dá)編碼含兩個(gè)亞基的蛋白的核酸的眾多表達(dá)系統(tǒng)知之甚稔。對(duì)已知的用于蛋白質(zhì)真核表達(dá)的不同方法不再贅述。
簡而言之，典型的編碼FSH或FSH變體的核酸通過將α和β亞基的DNA或cDNA分別同啟動(dòng)子(結(jié)構(gòu)或誘導(dǎo)啟動(dòng)子)可行地相連，然后組成表達(dá)載體而進(jìn)行表達(dá)?；蛘咻d體還可以插入DNA而提供一合適啟動(dòng)子。載體可適用于真核細(xì)胞中的復(fù)制或整合。典型的表達(dá)載體包括用于調(diào)控編碼本發(fā)明蛋白的DNA轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、起始序列和啟動(dòng)子。為獲得克隆入基因的高水平表達(dá)，構(gòu)建至少包括有一個(gè)控制轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子、一個(gè)用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、以及一個(gè)轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)為可在不降低生物活性的情況下進(jìn)行修飾。某些修飾可用于輔助克隆、表達(dá)或?qū)⒛繕?biāo)分子并入基因組。這些修飾為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，它們包括提供定位方便的限制性切點(diǎn)、終止密碼子或純化序列。
另外，還可通過對(duì)含編碼所需α和β亞基的內(nèi)源DNA的宿主細(xì)胞進(jìn)行處理以表達(dá)該核酸。這些方法在本領(lǐng)域?yàn)槿藗兯熘?，如美國專利?hào)5,580,734、5,641,670、5,733,746和5,733,761所述，全文引入作為參考。真核表達(dá)各種真核表達(dá)系統(tǒng)，如哺乳細(xì)胞，為本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所熟知。正如下文的簡要解釋，編碼已知的FSH或FSH變體α和β亞基的一段核酸序列可在這些真核系統(tǒng)中表達(dá)。
在酵母中合成異源蛋白為人們所熟知。F.Sherman,et al.,Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory(1982)是一篇被廣泛接受的文獻(xiàn)，它描述用于在酵母中生產(chǎn)蛋白的多種方法。釀酒酵母和Pichia pastoris是兩種廣泛用于真核蛋白生產(chǎn)的酵母。用于在釀酒酵母和Pichia中進(jìn)行表達(dá)的載體、菌株和方案在本領(lǐng)域?yàn)槿藗兯熘⒖少徸怨?yīng)商(如，Invitrogen)。合適的載體通常具有表達(dá)控制序列，例如，啟動(dòng)子，包括3-磷酸甘油酸激酶和乙醇脫氫酶啟動(dòng)子，復(fù)制原點(diǎn)和終止序列等類似序列。
編碼FSH和FSH變體α和β亞基的序列連于多種表達(dá)載體用一轉(zhuǎn)染諸如哺乳細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞這樣的細(xì)胞群落。哺乳細(xì)胞是用于產(chǎn)生肽鏈的細(xì)胞群落的說明性的例子。盡管哺乳細(xì)胞懸浮物也可使用，哺乳細(xì)胞系統(tǒng)通常為單細(xì)胞層。本領(lǐng)域已經(jīng)開發(fā)出多種可表達(dá)完整蛋白的合適的細(xì)胞系，它們包括HEK93、BHK21、和CHO細(xì)胞系，其中CHO細(xì)胞系為優(yōu)選細(xì)胞系，例如來自Lonza的CHO K1。用于這些細(xì)胞的載體可包括表達(dá)控制序列，如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子(例如較優(yōu)選的CMV啟動(dòng)子、HSV tk啟動(dòng)子、EF1α啟動(dòng)子、SV40的早期或晚期啟動(dòng)子、pgk(磷酸甘油酸激酶)啟動(dòng)子)、增強(qiáng)子(Queen,et al.,Immunol.Rev.89:49(1986))，以及加工信息位點(diǎn)，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪切位點(diǎn)、多聚腺苷酸化位點(diǎn)(例如SV40的large T Ag多聚加A位點(diǎn))和轉(zhuǎn)錄終止序列。還有一些其它的可用于生產(chǎn)本發(fā)明蛋白的動(dòng)物細(xì)胞，例見American Type Culture Collection Catalogueof Cell Lines and Hybridomas(7th,1992)。優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括CHO細(xì)胞，如CHO-K1，優(yōu)選的載體包括GS載體，它們均可得自LonzaBiologics PLC(Slough,Bershire,England,UK)。
用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)FSH和FSH變體α和β亞基的合適載體通常來自SF9桿狀病毒。合適的細(xì)胞系包括蚊幼蟲、蠶、粘蟲、蛾和果蠅細(xì)胞系，例如Schneider細(xì)胞系(見Schneider,J.Embryol.Exp.Morphol.27:353-365(1987))。
同酵母一樣，使用高等動(dòng)物或植物宿主細(xì)胞時(shí)載體也應(yīng)加入多聚腺苷酸化或轉(zhuǎn)錄終止序列。終止序列的一個(gè)例子是來自牛生長激素的多聚腺苷酸化序列。用于轉(zhuǎn)錄本的精確剪切的序列也應(yīng)包含在內(nèi)。剪切序列的一個(gè)例子是來自SV40的VP1內(nèi)含子(Sprague,et al.,J.Virol.45:773-781(1983))。另外，控制其在宿主中的復(fù)制的基因序列也可融入載體，如牛乳突淋瘤病毒type-載體那樣。M.Saveria-Campo,Bovine Papilloma Virus DNA,a Eucaryotic Cloning Vectorin DNA Cloning Vol.II,a Practical Approach,D.M.Glover,Ed.,IRL Press,Arlington,VA,pp.213-238(1985)。蛋白純化經(jīng)表達(dá)而得的FSH或FSH變體可通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白分離技術(shù)從細(xì)胞中分離成溶解物。純化過程的監(jiān)測(cè)可利用Western印跡技術(shù)或其它標(biāo)準(zhǔn)免疫分析技術(shù)的放免分析。
含一個(gè)α和β亞基的FSH或FSH變體的獲得和純化可通過廣為人知的方法來完成，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析、分子量排阻層析、凝集素層析。較優(yōu)選的純化方法有高壓液相色譜(“HPLC”)、陽離子交換層析、親和層析、分子量排阻層析或以上方法的綜合使用。含一個(gè)α和β亞基的FSH或FSH變體包括天然純化產(chǎn)品、化學(xué)合成產(chǎn)品以及通過重組技術(shù)從真核細(xì)胞產(chǎn)生的產(chǎn)品，這些真核細(xì)胞包括酵母、高等植物、昆蟲和哺乳細(xì)胞。本發(fā)明的多肽可以是糖基化和非糖基化的蛋白，這取決于重組生產(chǎn)過程中使用的宿主細(xì)胞。另外，本發(fā)明的多肽還可含一個(gè)修飾過的起始甲硫氨酸殘基，這在在某些情況下是由宿主控制的加工造成的。這些方法在許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中均有描述，如Sambrook的上述文獻(xiàn)第17.37-17.42章；Ausubel的上述文獻(xiàn)第10,12,13,16,18和20章。全文引入作為參考。FSH或FSH變體和多肽本領(lǐng)已知的FSH或FSH變體包括以下標(biāo)識(shí)號(hào)的說明中序列標(biāo)識(shí)部分所列的蛋白序列，但不限于這些SEQ ID NO:1；牛α亞基-96氨基酸SEQ ID NO:2；牛β亞基-111氨基酸SEQ ID NO:3；馬α亞基-96氨基酸SEQ ID NO:4；馬β亞基-111氨基酸SEQ ID NO:5；人α亞基-96氨基酸SEQ ID NO:6；人β亞基-111氨基酸SEQ ID NO:7；豬α亞基-96氨基酸SEQ ID NO:8；豬β亞基-111氨基酸
SEQ ID NO:9；綿羊α亞基-96氨基酸SEQ ID NO:10；綿羊β亞基-111氨基酸SEQ ID NO:11；人β亞基-108氨基酸SEQ ID NO:12；人β亞基-109氨基酸SEQ ID NO:13；人β亞基-110氨基酸FSH或FSH變體核酸序列FSH或FSH變體核酸序列包括以下標(biāo)識(shí)號(hào)的說明中序列標(biāo)識(shí)部分所列的編碼一α或一β亞基的核酸序列，但不限于這些SEQ ID NO:14；人類α亞基cDNA-276核苷酸(編碼92個(gè)氨基酸)SEQ ID NO:15；h.β亞基變體cDNA -324核苷酸(編碼108個(gè)氨基酸)SEQ ID NO:16；h.β亞基變體cDNA -327核苷酸(編碼109個(gè)氨基酸)SEQ ID NO:17；h.β亞基cDNA -330核苷酸(編碼110個(gè)氨基酸)SEQ ID NO:18；h.β亞基cDNA -333核苷酸(編碼111個(gè)氨基酸)SEQ ID NO:19；人類α亞基cDNA-276核苷酸(編碼92個(gè)氨基酸)SEQ ID NO:20；h.β亞基變體cDNA -324核苷酸(編碼108個(gè)氨基酸)SEQ ID NO:19和20是設(shè)計(jì)而出并由寡聚核苷酸連接而構(gòu)建的。SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:19之間的差異不會(huì)改變其所編碼的α亞基蛋白的氨基酸序列。與此類似，SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:15之間的差異不會(huì)改變其所編碼的β變體亞基蛋白的氨基酸序列。氨基酸編碼本發(fā)明中組成蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸通常以縮寫表示。氨基酸通常以它的單字母編碼、三字母編碼、名稱、或三核苷密碼子表示，這在本領(lǐng)域是眾所周知的(見Alberts,B.,et al.,Molecular Biologyof the Cell,Third Ed.,Garland Publishing,Inc.,New York,1994)
制劑如上所述，本發(fā)明提供含藥學(xué)上可接受的FSH或FSH變體的穩(wěn)定制劑以及含防腐劑的防腐制劑和溶液和適于醫(yī)療和獸醫(yī)使用的多用途防腐制劑，其中穩(wěn)定制劑優(yōu)選為含有鹽水或選定鹽類的磷酸緩沖液。防腐制劑至少含有一防腐劑，該防腐劑選自酚、間甲苯酚、對(duì)甲苯酚、鄰甲苯酚、氯甲酚、芐醇、烷基對(duì)羥基苯甲酸酯(甲，乙，丙，丁酯及其類似物)、潔爾滅、氯化芐乙銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞的至少一種或其混合物，的水性稀釋液。
如上所述，本發(fā)明提供了包括包裝材料和藥瓶在內(nèi)的制成品，瓶中含有FSH或FSH變體的溶液，該溶液含所限定的緩沖液和/或防腐劑，可視情況溶于水稀釋液中，此處所述的包裝材料包括一個(gè)表明該溶液可使用超過24小時(shí)或更長時(shí)間的標(biāo)簽。本發(fā)明還提供包括包裝材料和藥瓶的制成品，第一個(gè)藥瓶含有凍干的FSH或FSH變體，第二個(gè)瓶中含有溶于水稀釋液中的規(guī)定的緩沖液或防腐劑，此處所述的包裝材料包括一個(gè)標(biāo)簽用以指導(dǎo)患者用水性稀釋劑再配FSH或FSH變體以形成可在所述條件下使用超過24小時(shí)或更長時(shí)間的溶液。
本發(fā)明所使用的FSH或FSH變體可通過重組手段產(chǎn)自哺乳細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因制取或從其它生物來源，如尿源純化產(chǎn)生?？山邮艿姆椒òㄔ贖akola,K.Molecular and Cellular Endocrinology,127:59-69,1997；Keene,et al.,J.Biol.Chem.,J.Biol.Chem.,264:4769-4775,1989；Cerpa Poljak,et al.,Endocrinology,132:351-356,1993；Dias,et al.,J.Biol.Chem.,269:25289-25294,1994；Flack,et al.,J.Biol.Chem.269:14015-14020,1994；Valove,et al.,Endocrinology,135:2657-2661,1994和美國專利號(hào)3,119,740中所描述的方法，在此列為參考。
用于向本發(fā)明的制劑提供蛋白質(zhì)的方法無關(guān)緊要，較優(yōu)選的FSH為包括一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基的異二聚體，SEQ ID NOS 5和6分別給出了二者的序列，還可以是包括一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基的FSH變體異二聚體，SEQ ID NOS:5和11；5和12；5和13分別給出了二者的序列。本發(fā)明內(nèi)的合適的FSH或FSH變體α包括至少一個(gè)已知的α亞基和至少一個(gè)已知的β亞基(見列出的已知α和β亞基序列以及其他本領(lǐng)域的已知序列)。
FSH或FSH變體的非限制性例子包括以下內(nèi)容，但并不限于這些(a):α-亞基(SEQ ID NO:1)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:2)RSCELTNITITVEKEECGFCISINTTWCAGYCYTRDLVYRDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCSKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFREIKE(b):α-亞基(SEQ ID NO:3)FPDGEFTTQDCPECKLRENKYFFKLGVPIYQCKGCCFSRAYPTPARSRKTMLVPKNITSESTCCVAKAFIRVTVMGNIKLENHTQCYCSTCYHHKIβ-亞基(SEQ ID NO:4)NSCELTNITIAVEKEGCGFCITINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATACHCGKCNSDSTDCTVRGLGPSYCSFGDMKE(c):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:6)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE(d):α-亞基(SEQ ID NO:7)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKS
β-亞基(SEQ ID NO:8)NSCELTNITITVEKEECNFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFSEMKE(e):α-亞基(SEQ ID NO:9)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:10)RSCELTNITITVEKEECSFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKACTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDRDSTDCTVRGLGPSYCSFSDIRE(f):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:11)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGE(g):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:12)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQLTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEM(h):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:13)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMK本發(fā)明的蛋白質(zhì)激素產(chǎn)品的含量范圍，包括再配時(shí)形成的量，如果在一干/濕系統(tǒng)中，濃度從約1.0μg/ml到約50mg/ml不等，此范圍以外的含量也是可行的，這取決于所需的送遞方式，溶液制劑不同于透皮貼劑、肺、跨粘膜或滲透泵、微型泵這樣不同的方式而變化。較優(yōu)選的激素含量為5.0μg/ml到2mg/ml，最佳含量為5.0或10或50μg/ml到約200μg/ml。
水性稀釋劑最好還包括一藥學(xué)上可接受的防腐劑。優(yōu)選的該防腐劑選自酚、間甲苯酚、對(duì)甲苯酚、鄰甲苯酚、氯甲酚、芐醇烷基對(duì)羥基苯甲酸酯(甲，乙，丙，丁酯及其類似物)、潔爾滅、氯化芐乙銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞的至少一種或其混合物。其中較好的防腐劑為間甲苯酚、苯酚、氯甲酚或它們的混合物，間甲苯酚為最佳。用于本制劑的防腐劑的含量應(yīng)足以產(chǎn)生抗微生物效果。該含量取決于所選用的防腐劑，熟練的技術(shù)人員可較容易地決定該含量。例如，間甲苯酚或苯酚(單獨(dú)或混用)的含量一般在約23mM到約35mM。令人吃驚的是，用于本發(fā)明權(quán)利要求制劑的防腐劑對(duì)FSH或FSH變體的生物活性無負(fù)面影響并可以多用途給藥。
其它賦形劑，例如等滲試劑、緩沖液、抗氧化劑、防腐增強(qiáng)劑，它們可視需要或在優(yōu)選方案中加入稀釋劑。等滲試劑，如甘油，通常在已知含量下使用。甘油含量一般約16mg/ml。可加入生理耐受的緩沖液以更好地控制pH。制劑的pH值范圍可以很廣，如從約pH4到約pH10，從約pH5到約pH9則更好，最好為從約pH6.0到約pH8.0。本發(fā)明中制劑較優(yōu)選的pH在約pH6.8到約pH7.8。較好的緩沖液包括磷酸緩沖液，最好是磷酸鈉，尤其是磷酸緩沖液鹽水(PBS)。
其它添加劑，如藥學(xué)上可接受的增溶劑吐溫20(聚環(huán)氧乙烷(20)山梨聚糖單月桂酸)，吐溫40(聚環(huán)氧乙烷(20)山梨聚糖單棕櫚酸)，吐溫80(聚環(huán)氧乙烷(20)山梨聚糖單油酸)，多聚醇F68(聚環(huán)氧乙烷聚環(huán)氧丙烷嵌段共聚物)和PEG(聚乙烯乙二醇)，非離子表面活性劑如聚山梨酸酯20或80、poloxamer 184或188、Pluronic_polyls、或其它嵌段共聚物，以及諸如EDTA和EGTA這樣的螯合劑均可視需要加入至制劑或組合物中以減少聚集。當(dāng)使用泵或塑料容器進(jìn)行給藥時(shí)這些添加劑尤為有用。本發(fā)明權(quán)利要求的制劑令人驚奇地穩(wěn)定。在本發(fā)明之前，不穩(wěn)定性使得FSH的防腐制劑和多用途制劑被認(rèn)為不可能實(shí)現(xiàn)。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)權(quán)利要求的制劑可在從2到40℃的溫度下安全保存并在長時(shí)期內(nèi)保持蛋白的活力超過2個(gè)月。
本發(fā)明制劑通過包括將FSH或FSH變體同防腐劑相混合的制備過程制得，該防腐劑選自酚、間甲苯酚、對(duì)甲苯酚、鄰甲苯酚、氯甲酚、芐醇烷基對(duì)羥基苯甲酸酯(甲，乙，丙，丁酯及其類似物)、潔爾滅、氯化芐乙銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞的至少一種或其混合物，的水稀釋劑。FSH或FSH變體同溶于水稀釋劑的防腐劑的混合通過傳統(tǒng)的溶解和混合過程來完成。為制備合適的制劑，將緩沖溶液中的標(biāo)準(zhǔn)量的FSH或FSH變體同緩沖溶液中所需防腐劑相混合，溶液的量應(yīng)足以使蛋白質(zhì)和防腐劑的含量適合需要。該過程的一些變化為具備本領(lǐng)域的一般技術(shù)的人員所公認(rèn)。例如，各組分的加入次序、是否使用額外的添加劑、制劑制備的溫度和pH值，這些因素均可以進(jìn)行優(yōu)化以適應(yīng)含量和所用給藥方式。
提供給患者的權(quán)利要求的制劑可以是澄清的溶液或盛于雙藥瓶中的藥劑，一瓶盛有凍干的FSH或FSH變體，它可以用第二瓶中防腐劑或賦形劑再配，優(yōu)選的賦形劑優(yōu)選為含有鹽水或選定鹽類的磷酸緩沖液。單溶液藥瓶和需再配的雙藥瓶均可多次重復(fù)使用并可滿足患者的單療程或多療程需要，這樣便提供了一種比現(xiàn)行方法更方便的治療服法。
本權(quán)利要求的制成品對(duì)于24小時(shí)以上或更長時(shí)間的給藥非常有用。本發(fā)明之前這樣的產(chǎn)品只適于迅速使用?；颊弑灰髵仐壩从玫乃幤?，這造成浪費(fèi)和費(fèi)用的昂貴。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)權(quán)利要求的制劑可在從2到40℃的溫度下安全保存并在長時(shí)期內(nèi)保持蛋白的活力超過2個(gè)月；這樣便可以使用一個(gè)表明該溶液可保存和/或使用超過24、36、48、72或96小時(shí)或更長時(shí)間的標(biāo)簽。如果使用了防腐稀釋劑，標(biāo)簽可以包括最高至1年、一年半到兩年。
本發(fā)明FSH或FSH變體溶液的制備過程包括將FSH或FSH變體混溶于水稀釋劑?；旌贤ㄟ^傳統(tǒng)的溶解和混合過程來完成。為制備合適的稀釋劑，將水或緩沖液中的標(biāo)準(zhǔn)量的FSH或FSH變體混合，溶液的量應(yīng)足以使蛋白質(zhì)和視情況加入的防腐劑或緩沖液的含量適合需要。該過程的一些變化為具備本領(lǐng)域的一般技術(shù)的人員所公認(rèn)。例如，各組分的加入次序、是否使用額外的添加劑、制劑制備的溫度和pH值，這些因素均可以進(jìn)行優(yōu)化以適應(yīng)含量和所用給藥方式。
權(quán)利要求的制劑可以以澄清的溶液或盛于雙藥瓶中的藥劑提供給患者，雙藥瓶中一瓶盛有凍干的FSH或FSH變體，它可以用第二瓶中的水稀釋劑再配。單溶液藥瓶和需再配的雙藥瓶均可多次重復(fù)使用并可滿足患者的單療程或多療程需要，這樣便提供了一種比現(xiàn)行方法更方便的治療服法。
通過將權(quán)利要求的制劑提供給藥房、診所或其它類似機(jī)構(gòu)設(shè)施，可以將其直接供給患者，制劑以澄清的溶液或盛于雙藥瓶中的藥劑提供，雙藥瓶中一瓶盛有凍干的FSH或FSH變體，它可以用第二瓶中的水性稀釋劑再配。這種情況下，澄清溶液可以1升或更大體積提供，它儲(chǔ)存于大的容器中，藥房或診所可從中一次或多次取出少量的FSH或FSH變體以轉(zhuǎn)入較小的藥瓶中提供給它們的消費(fèi)者和/或患者。這種情況下的雙藥瓶藥劑可以1升或更大體積提供，它儲(chǔ)存于大的容器中，藥房或診所可從中一次或多次取出少量的稀釋劑以再配凍干的FSH或FSH變體。藥房或診所提供給消費(fèi)者和患者的澄清溶液或再配的FSH或FSH變體可滿足患者的單療程或多療程需要，這樣便提供了一種比現(xiàn)行方法更方便的治療服法。
包括單藥瓶在內(nèi)的公認(rèn)的設(shè)備包括用于溶劑遞送的pen-注射器，如Humaject_、Novopen_、B-D_Pen、AutoPen_和OptiPen_。包括雙藥瓶在內(nèi)的公認(rèn)的設(shè)備包括pen-注射器系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于在藥筒中再配藥劑，而該藥筒用于遞送再配的藥劑，該系統(tǒng)的例子是HumatroPen_。
本權(quán)利要求中的產(chǎn)品包括包裝材料。除管理機(jī)構(gòu)所要求的信息之外，包裝材料還說明了使用產(chǎn)品所需的條件。對(duì)于雙藥瓶干/濕產(chǎn)品，本發(fā)明的包裝材料提供說明用以指導(dǎo)患者用水稀釋劑再配FSH或FSH變體以形成一溶液并進(jìn)行超過24小時(shí)或更長時(shí)間的使用。對(duì)于單藥瓶溶液產(chǎn)品，標(biāo)簽表明該溶液可使用超過24小時(shí)或更長時(shí)間。本權(quán)利要求的產(chǎn)品可用于人類醫(yī)療。
本發(fā)明FSH或FSH變體制劑的制備過程包括將FSH或FSH變體混溶于一選定緩沖液，優(yōu)選為含有鹽水或選定鹽類的磷酸緩沖液。FSH或FSH變體同緩沖液在水稀釋劑中的混合通過傳統(tǒng)的溶解和混合過程來完成。為制備合適的制劑，將水或緩沖液中的測(cè)定量的FSH或FSH變體同所需的緩沖試劑混合，溶液的量應(yīng)足以使蛋白質(zhì)和緩沖液的含量適合需要。該過程的一些變化為具備本領(lǐng)域的一般技術(shù)的人員所公認(rèn)。例如，各組分的加入次序、是否使用額外的添加劑、制劑制備的溫度和pH值，這些因素均可以進(jìn)行優(yōu)化以適應(yīng)含量和所用給藥方式權(quán)利要求的穩(wěn)定或防腐制劑可以以澄清的溶液或盛于雙藥瓶中的藥劑提供給患者，雙藥瓶中一瓶盛有凍干的FSH或FSH變體，它可以用第二瓶水稀釋劑中的防腐劑或緩沖液和賦形劑再配。單藥瓶溶液和需再配的雙藥瓶藥劑均可多次重復(fù)使用并可滿足患者的單療程或多療程需要，這樣便提供了一種比現(xiàn)行方法更方便的治療服法。
本文所述的穩(wěn)定或防腐制劑中的FSH或FSH或變體可根據(jù)本發(fā)明通過多種遞送方法向患者給藥，這些方法在本領(lǐng)域眾所周知，包括SC或IM注射；透皮、植入、滲透泵、微型泵、藥筒、肺、口腔送遞系統(tǒng)及其它為熟練的技術(shù)人員所認(rèn)可的方法。
以下的實(shí)施例僅供進(jìn)一步闡明本發(fā)明的制劑和組合物的制備。本發(fā)明絕不僅只由下列實(shí)施例組成核酸/多肽實(shí)施例實(shí)施例1FSH或FSH變體在哺乳細(xì)胞中的克隆和表達(dá)典型的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體含至少一個(gè)調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始啟動(dòng)子元件、多肽編碼序列、轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄本多聚腺苷酸化所需的信號(hào)。但是，由于有功能的FSH或FSH變體必須同時(shí)含有α亞基和β亞基，因此需要同時(shí)表達(dá)兩個(gè)亞基的方法，可以在一個(gè)單載體上表達(dá)兩個(gè)亞基，每個(gè)亞基在該載體上均有一個(gè)啟動(dòng)子，或使用兩個(gè)載體第一個(gè)載體含一個(gè)啟動(dòng)子以表達(dá)第一個(gè)亞基，第二個(gè)載體含一個(gè)啟動(dòng)子以表達(dá)第二個(gè)亞基。
另外，每一哺乳動(dòng)物表達(dá)載體還具備包括增強(qiáng)子、Kozak序列、以及用于RNA剪切的供體和受體位點(diǎn)兩側(cè)的間隔序列在內(nèi)的元件，這些元件可在一個(gè)或多個(gè)載體中存在。
使用SV40的早期和晚期啟動(dòng)子、來自反轉(zhuǎn)錄病毒，如RSV,HTLVI,HIVI的長末端重復(fù)序列和巨細(xì)胞病毒(CMV)的早期啟動(dòng)子。然而也可以使用細(xì)胞元件(如人類肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。用于生產(chǎn)FSH或FSH變體亞基的合適載體包括pIRES1neo、pRetro-off、pRetro-on、PLXSN或pLNCX(Clonetech Labs,Palo Alto,CA),pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL和PMSG(Pharmacia,Uppsala,Sweden),pRSVcat(ATCC37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC67109)?？墒褂玫牟溉閯?dòng)物細(xì)胞包括人類Hela 293、H9和Jurkat細(xì)胞，鼠NIH3T3和C127細(xì)胞，Cos1、Cos7和CV1，鵪鶉QC1-3細(xì)胞，鼠L細(xì)胞和中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
另外，α和β亞基的DNA序列一旦整合入細(xì)胞染色體便可在這些含用以表達(dá)各亞基的DNA序列的穩(wěn)定細(xì)胞系中表達(dá)。正如本領(lǐng)域已知的那樣，同選擇標(biāo)記進(jìn)行共轉(zhuǎn)染可識(shí)別被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并將其分離，選擇標(biāo)記的例子有dhfr,gpt，新霉素或潮霉素。
轉(zhuǎn)染用的亞基DNA序列可進(jìn)行擴(kuò)增以大量表達(dá)編碼的多肽。DHFR(二氫葉酸還原酶)標(biāo)記有助于于獲得攜帶數(shù)百或甚至數(shù)千個(gè)目標(biāo)DNA拷貝的細(xì)胞系。另一由該作用的選擇標(biāo)記是谷氨酸合成酶(GS)(Murphy,et al.,Biochem.J.227:277-279(1991)；Bebbington,et al.,Bio/Technology 10:169-175(1992))。利用這些標(biāo)記，令哺乳細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上生長可選出最高抗性的細(xì)胞。這些細(xì)胞系含整合入染色體的擴(kuò)增基因。中國倉鼠細(xì)胞(CHO)和NSO細(xì)胞通常用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽。
表達(dá)載體pC1和pC4含有來自勞氏肉瘤病毒的強(qiáng)啟動(dòng)子(LTR)(Cullen,et al.,Molec.Cell.Biol.5:438-447(1985))及一個(gè)CMV-增強(qiáng)子片段(Boshart,et al.,Cell 41:521-530(1985))。多克隆位點(diǎn)，例如限制酶切點(diǎn)BamHⅠ,XbaⅠ和Asp718，它們可輔助所需的α亞基和β亞基的DNA序列的克隆。載體還具備大鼠前胰島素原的3’內(nèi)含子、多聚腺苷酸化和終止信號(hào)。
實(shí)施例2在COS或CHO細(xì)胞中的克隆和表達(dá)將編碼FSH或FSH變體的cDNA克隆入表達(dá)載體pcDNAⅠ/Amp或pcDNAⅢ(可從Invitrogen,Inc.獲得)可構(gòu)成一FSH或FSH變體的表達(dá)質(zhì)粒。如上文提及，為產(chǎn)生有功能的異二聚體需要表達(dá)每一個(gè)亞基，通過向細(xì)胞獨(dú)立地引入分開的載體或構(gòu)建一個(gè)單獨(dú)的載體使之表達(dá)α和β亞基均可。
表達(dá)載體pcDNAⅠ/Amp包括；(1)一大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)，用于在大腸桿菌或其它原核細(xì)胞中復(fù)制；(2)一氨芐青霉素抗性基因，用于選擇含質(zhì)粒的細(xì)胞；(3)一個(gè)SV40復(fù)制起點(diǎn)，用于在真核細(xì)胞中的復(fù)制；(4)一個(gè)CMV啟動(dòng)子、一多連接頭、一SV40內(nèi)含子；(5)幾個(gè)編碼紅血球凝集素片段(例如，輔助純化的“HA”標(biāo)簽)或HIS標(biāo)簽(例見上文中Ausubel的文獻(xiàn))的密碼子，其后是一個(gè)終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)，如此排列可經(jīng)多連接頭的限制性切點(diǎn)將cDNA方便地置于CMV啟動(dòng)子的表達(dá)控制之下，并使之與可對(duì)其作用的SV40內(nèi)含子和多聚腺苷酸化信號(hào)相連。HA標(biāo)簽相關(guān)于來自流感紅血球凝集素多肽的一個(gè)抗原決定基，其在Wilson,et a1.,Cell 37:767-778(1984)中有所描述。無論是α或β亞基，將HA標(biāo)記與之融合便可利用一識(shí)別HA抗原決定基的抗體很容易地對(duì)重組多肽進(jìn)行檢測(cè)和回收。pcDNAⅢ還含有新霉素選擇標(biāo)記。
將一個(gè)編碼FSH或FSH變體的α亞基和β亞基的DNA片段克隆入載體的多連接頭區(qū)域，使CMV啟動(dòng)子控制重組多肽的表達(dá)?？梢暻闆r決定是否插入HA抗原決定基。質(zhì)粒的構(gòu)建策略如下面所述。使用含方便的限制性切點(diǎn)的引物對(duì)用于FSH或FSH變體各亞基克隆的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。
用適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶疨CR擴(kuò)增出的各亞基DNA片段和載體pcDNA/Amp，然后將各亞基與酶解的載體連接。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE(Stratagene Cloning Systems,11099 North TorreyPines Road,La Jolla,CA 92037)，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物涂于氨芐青霉素平板上培養(yǎng)以令氨芐青霉素抗性菌落生長。從抗性菌落中分離各亞基的質(zhì)粒DNA并通過酶切分析或其他手段以檢驗(yàn)編碼FSH或FSH變體的片段。
如上所述，為表達(dá)重組的FSH或FSH變體，用分別含各亞基的載體對(duì)COS細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染可使用DEAE-葡聚糖，可參考Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ndEditon,Cold Spring Harbor,NY(1989)。在可使各載體表達(dá)FSH或FSH變體的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
預(yù)計(jì)FSH或FSH變體HA融合多肽可通過放射標(biāo)記和免疫沉淀而檢測(cè)，所用方法在Harlow and Lane,Antibodies,a LaboratoryManual,Cold Spring Harbor,NY(1989)中有所描述。為此目的，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后兩天在含35S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)8小時(shí)。收集細(xì)胞和培養(yǎng)基，用含去污劑的RIPA緩沖液洗滌和裂解細(xì)胞，RIPA緩沖液；150mM NaCl,1％NP-40,0.1％SDS,0.5％DOC,50mMTRIS,pH7.5,該緩沖液在上文引用的Wilson et a1.文獻(xiàn)中有所描述。用HA特異性單克隆抗體將蛋白從裂解物和培養(yǎng)基中分離出來。然后通過SDS-PAGE電泳和放射自顯影技術(shù)分析沉淀的蛋白。細(xì)胞裂解物可見到預(yù)計(jì)大小的的表達(dá)產(chǎn)物而陰性對(duì)照中則無。
載體pC4被用于FSH或FSH變體各亞基的分別表達(dá)。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員還可加工pC4以使α和β亞基同時(shí)表達(dá)由一個(gè)載體表達(dá)。pC4是質(zhì)粒pSV2-dhfr(ATCC登記號(hào)No.37146)的衍生質(zhì)粒該質(zhì)粒含鼠DHFR基因，其在SV40的早期啟動(dòng)子的控制之下。缺乏二氫葉酸活性的中國倉鼠卵巢或其它細(xì)胞經(jīng)α和β亞基質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后可用選擇培養(yǎng)基(αminus MEM,Life Technologies)對(duì)其進(jìn)行選擇，該培養(yǎng)基含化療藥物氨甲喋呤，已經(jīng)證明DFHR基因的擴(kuò)增導(dǎo)致了藥物靶酶DHFR的過量產(chǎn)生從而產(chǎn)生抗性(例見F.W.Alt,et al.,J.Biol.Chem.253:1357-1370(1978)；J.L.Hamlin and C.Ma,Biochem.etBiophys.Acta 1097:107-143(1990)；M.J.Page and M.A.Sydenham,Biotechnology 9:64-68(1991))。如果DNA序列與DHFR相連，它通常會(huì)共擴(kuò)增和過表達(dá)。本領(lǐng)域中已知該方法可產(chǎn)生攜帶超過1000個(gè)擴(kuò)增基因拷貝的細(xì)胞系。隨后，當(dāng)停止使用氨甲喋呤時(shí)，可獲得在一個(gè)或多個(gè)染色體上整合入擴(kuò)增DNA序列的細(xì)胞系。
pC4質(zhì)粒在勞氏肉瘤病毒的長末端重復(fù)序列(LTR)強(qiáng)啟動(dòng)子(Cullen,et al.,Molec.Cell.Biol.5:438-447(1985))之后連有用于表達(dá)α和β亞基的DNA序列，LTR該啟動(dòng)子還具有分離自人類巨細(xì)胞病毒(CMV)瞬時(shí)早期基因增強(qiáng)子的片段(Boshart,et al.,Cell41:521-530(1985))。啟動(dòng)子的下游具有BamHⅠ、XbaⅠ和Asp718限制性酶切位點(diǎn)用于DNA序列的整合。這些克隆位點(diǎn)之后是大鼠前胰島素原的3’內(nèi)含子和多聚腺苷酸化位點(diǎn)。其它高效啟動(dòng)子也可用于表達(dá)，例如，人類b-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、SV40早期或晚期啟動(dòng)子或來自其它反轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)序列，如HIV和HTLVI。Clontech的Tet-off和Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)及類似系統(tǒng)可以合乎法規(guī)的方式在哺乳細(xì)胞中表達(dá)FSH或FSH變體(M.Gossen,and H.Bujard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551(1992))。其它信號(hào)也可用于mRNA的多聚腺苷酸化，例如來自人類生長激素或球蛋白基因的信號(hào)。染色體整合入了α和β亞基DNA序列穩(wěn)定細(xì)胞系可通過用選擇標(biāo)記進(jìn)行共轉(zhuǎn)染來選出，例如gpt、G418或潮霉素。使用一個(gè)以上的選擇標(biāo)記有利于實(shí)驗(yàn)，如G418加氨甲喋呤抗性。
通過本領(lǐng)域已知的程序?qū)|(zhì)粒進(jìn)行酶解并用牛小腸磷酸酶進(jìn)行去磷酸化。然后通過1％的瓊脂糖凝膠分離載體。
利用與基因3’和5’端相關(guān)的PCR多聚核苷酸引物對(duì)編碼完整的FSH或FSH變體各亞基的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)本領(lǐng)域的專業(yè)常識(shí)非限制性的例子包括與FSH或FSH變體部分編碼序列互補(bǔ)或相應(yīng)的3’和5’引物。
用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶解，然后再通過1％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行純化。然后用T4DNA連接酶分別將分離而得的編碼各亞基的片段同去磷酸化的載體進(jìn)行連接。分別用它們轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101或XL-1 Blue細(xì)胞，利用諸如限制性酶切這樣的方法確認(rèn)出含有插入pC4質(zhì)粒的DNA片段(對(duì)于同時(shí)表達(dá)兩亞基的載體則是兩個(gè)片段)的細(xì)菌。
通常使用缺乏DHFR活性基因的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞來進(jìn)行轉(zhuǎn)染。5μg表達(dá)載體可利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑同0.5μg pSV-neo質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。pSV-neo質(zhì)粒具有來自Tn5的顯性選擇標(biāo)記neo基因，該基因編碼的酶可產(chǎn)生對(duì)一類的抗生素抗性，包括G418在內(nèi)。用補(bǔ)充G418至1μg/ml的αplus MEM培養(yǎng)細(xì)胞。兩天之后，用胰蛋白酶處理細(xì)胞并在雜交瘤克隆板(Greiner,Germany)上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基使用補(bǔ)充氨甲喋呤至10、25或50ng/ml及G418至1μg/ml的αplus MEM。10-14天后用胰蛋白酶處理單克隆然后在6孔培養(yǎng)皿或10ml瓶中在不同氨甲喋呤濃度下(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)進(jìn)行培養(yǎng)。將可在最高濃度的氨甲喋呤中生長的克隆轉(zhuǎn)至新的6孔培養(yǎng)皿，皿中含更高濃度的的氨甲喋呤(1mM、2mM、5mM、10mM、20mM)。重復(fù)該過程直至獲得可在濃度為100-200mM下生長的克隆。利用諸如SDS-PAGE和Western印跡或反相HPLC分析這樣的方法分析所需產(chǎn)物的表達(dá)。
除以上的實(shí)施例和說明中所描述的之外，本發(fā)明將表明還可通過其它方法來實(shí)施。
本領(lǐng)域中已知許多本蛋白表達(dá)方法的修改和變化，包括KeeneJ.L.,et al.,J.Biol.Chem.,264:4769-4752,1989；Loumaye E.,et al.,Human Reprod.Update,1:188-199,1995；Olijve W.,etal.,Mol.Hum.Reprod.,2:361-369,1996，以及其它已知并用于其它促性腺激素的重組技術(shù)。
實(shí)施例3AV12細(xì)胞中的表達(dá)表達(dá)盒載體pGTH被用于α亞基在AV12細(xì)胞的表達(dá)。有相當(dāng)數(shù)量的發(fā)表文獻(xiàn)描述了AV12-664和/或AV12-RGT細(xì)胞的使用(見Grinnell,B.W.et al.,Blood 76(12):2546-54,1990；Burck,P.J.et al.,J.Biol.Chem.265(9):5170-7,1990；Parkinson,J.F.et al.,J.of Biol.Chem.265(21):12602-10,1990；Grinnell,B.W.et al.,J.Biol.Chem.266(15):9778-85,1991；Wery,J.P.et al.,Nature 352(6330):79-82,1991；Berg,D.T.et al.,Biotechniques 14:972-9,1993；Gerlitz,B.et al.BiochemicalJournal 295(1):131-40,1993；Kursar,J.D.et al.MolecularPharmacology 46(2):227-34,1994；Desai,M.A.et al.,Molecular Pharmacology 48(4):648-57,1995；Obesity Research3 Suppl 4:4441S-4447S,1995；Desai,M.A.et al.,BritishJournal of Pharmacology 118(6):1558-64,1996；Kumar,A.et al.,Cancer Research 56(23):5397-402,1996；Boggs,L.N.et al.,J.of Neurochemistry 57(3):1324-7,1996；Schoepp,D.D.et al.,Neuropharmacology 35(12):1661-72,1996；Kumar,A.et al.,Cancer Research 57(15):3111-4,1997；Urology 49(3):497-93,1997；Wainscott,D.B.et al.Naunyn-Schmiedebergs Archivesof Pharmacology 357(1):17-24,1998；Wu,S.et al.BrainResearch-Molecular Brain Research 53(1-2):88-97,1998。同樣有發(fā)表的文獻(xiàn)描述了質(zhì)粒pGTH(見Grinnell,B.W.et al.,J.Biol.Chem.266(15):9778-85,1991)和pGTD(見Biochemical Journal295(Pt1):131-40,1993)。
簡言之，pGTH含有幾個(gè)連續(xù)的元件SV40早期啟動(dòng)子.ori、大腸桿菌潮霉素抗性、SV40小“t”抗原剪切位點(diǎn)/poly-A位最、pBR322克隆殘跡、BK病毒(P2株)克隆殘跡、polyCA20/GT20元件(合成的寡聚核苷)、BK病毒(P2株)增強(qiáng)子、AD2主要晚期啟動(dòng)子/剪切過的三聯(lián)前導(dǎo)序列、用于FSHα亞基編碼序列(含終止密碼子)的Bcll插入位點(diǎn)、SV40小“t”抗原剪切位點(diǎn)/poly-A位點(diǎn)；以及pBR322的氨芐青霉素抗性基因/ori。
通過將一個(gè)362bp的FSH cDNA BclⅠ片段(見序列-SEQ ID:19或14)克隆入載體的單一BclⅠ位點(diǎn)產(chǎn)生了用于表達(dá)人類α亞基編碼序列(SEQ ID:5)的質(zhì)粒pGTH-α。FSH片段利用穿梭質(zhì)粒pLGD637作為模板的PCR擴(kuò)增而產(chǎn)生(pLGD637含有合成/寡聚核苷組裝的FSHαcDNA序列)。通過測(cè)序并同GenPept數(shù)據(jù)庫(登記號(hào)31869)進(jìn)行比較對(duì)BclⅠ插入組件的完整性進(jìn)行確認(rèn)。
表達(dá)盒載體pGTD被用于FSH變體β亞基(SEQ ID:11)在AV12細(xì)胞中的表達(dá)。pGTD含有幾個(gè)用于在AV12細(xì)胞中表達(dá)的元件。pGTD具備連續(xù)的BK病毒(P2株)克隆殘跡、polyCA20/GT20元件(合成的寡聚核苷)、BK病毒(P2株)增強(qiáng)子、AD2主要晚期啟動(dòng)子/剪切過的三聯(lián)前導(dǎo)序列、用于FSH變體β亞基編碼序列(含終止密碼子)的Bcll插入位點(diǎn)、SV40小“t”抗原剪切位點(diǎn)/poly-A位點(diǎn)；SV40早期啟動(dòng)子。ori、鼠類二氫葉酸還原酶cDNA、SV40小“t”抗原剪切位點(diǎn)/poly-A位點(diǎn)以及pBR322的氨芐青霉素抗性基因/ori。
通過將一個(gè)393bp的FSHβbCD-3 cDNA BclⅠ片段(見序列-SEQID:20或15)克隆入載體的單一BclⅠ位點(diǎn)產(chǎn)生了質(zhì)粒pGTD-bCD3。FSHβ-CD3片段利用穿梭質(zhì)粒pLGD638作為模板的PCR擴(kuò)增而產(chǎn)生(pLGD638含有合成/寡聚核苷組裝的FSHβcDNA序列)。通過測(cè)序并同GenPept數(shù)據(jù)庫(登記號(hào)476441)進(jìn)行比較對(duì)BclⅠ插入元件的完整性進(jìn)行確認(rèn)。
簡言之，pGTD-α和pGTD-bCD3質(zhì)粒被線性化、重新純化，然后共轉(zhuǎn)染貼壁的AV23-RGT18細(xì)胞。用含0.25μM的氨甲喋呤和100μg/ml的潮霉素，以及用于維持V23-RGT18細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表型的200μg/ml G418的培養(yǎng)基進(jìn)行選擇，然后手工或用流式細(xì)胞篩選分離出單個(gè)穩(wěn)定克隆。用商業(yè)化的FSH ELISA試劑盒進(jìn)行條件培養(yǎng)基分析以確認(rèn)產(chǎn)量最高的克隆。將幾個(gè)克隆轉(zhuǎn)入無血清懸浮培養(yǎng)進(jìn)一步擴(kuò)增以獲得可分離量的的FSH變體異二聚體。
實(shí)施例4CHO-K1細(xì)胞中的表達(dá)已開發(fā)出一個(gè)CHO-K1細(xì)胞系(LONZA Biologics plc.)以生產(chǎn)一種含SEQ ID NO:5的α亞基和SEQ ID NO:11的β亞基的FSH變體異二聚體。
表達(dá)載體框包括編碼α亞基，SEQ ID NO:5的DNA和編碼β亞基，SEQ ID NO:11的DNA，它們由兩個(gè)不同的啟動(dòng)子控制CMV控制β亞基，EF1α控制α亞基。α和β亞基均使用牛生長激素多聚腺苷酸尾。該質(zhì)粒還含有谷氨酸合成酶基因，它由SV40晚期啟動(dòng)子控制并含有SV40多聚腺苷酸尾，該基因用作選擇標(biāo)記。這一質(zhì)粒被用來轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞。
本細(xì)胞系在GibcoBRL的CD CHO培養(yǎng)基上生長，處于L-甲硫氨酸磺基肟的選擇壓力之下。用ELISA來確認(rèn)表達(dá)FSH變體的主要培養(yǎng)孔。對(duì)幾個(gè)主要培養(yǎng)孔進(jìn)行克隆和擴(kuò)增。這些實(shí)驗(yàn)可形成滴度適合的克隆細(xì)胞系2B6.1B3.25。在小搖瓶中進(jìn)行的表達(dá)研究表明這一細(xì)胞系可在7至8天后表達(dá)30mg/L的FSH變體。
實(shí)施例5從CHO或AV-12細(xì)胞中純化FSH變體含一個(gè)SEQ ID NO:5的α亞基和一個(gè)SEQ ID N0:11的β亞基的FSH變體可通過許多在本領(lǐng)域中已知并有描述的方法從CHO或AV-12細(xì)胞或其他合適的細(xì)胞系的單層或懸浮培養(yǎng)物中純化。從含培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物分離已公布的FSH變體的方法之一是對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行陽離子交換層析、染料親和層析和凝膠過濾層析以純化蛋白。對(duì)于可能含有去污劑的懸浮培養(yǎng)物，可能需要一些額外的純化步驟，如Q-Sepharose?？蛇M(jìn)一步加入層析步驟或?qū)ζ鋚H、導(dǎo)電性、緩沖液組成以及層析條件(柱的大小、流過速度等等)。純度和產(chǎn)量可通過SDS-PAGE凝膠(考馬斯染色和Western印跡)、ELISA分析、排阻層析進(jìn)行分析，蛋白含量可通過277nm下的紫外吸光或其它已知技術(shù)進(jìn)行分析。
以下給出了各分離步驟的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，可通過它們進(jìn)行純化和層析分離。對(duì)于單細(xì)胞層培養(yǎng)物，在使用陽離子交換柱之前須對(duì)條件培養(yǎng)基進(jìn)行濃縮和滲濾。Q-Sepharose批量提純步驟可用于懸浮培養(yǎng)物以除去可能存在的去污劑。
1．濃縮一般如果對(duì)AV12懸浮培養(yǎng)物使用0.02-0.04％的Pluronic F68,那么對(duì)CHO懸浮培養(yǎng)物則使用0.1-0.18％。利用離心和紗布過濾使條件培養(yǎng)基澄清，再使用S3YM10轉(zhuǎn)頭(Amicon#540633)通過切向流過濾系統(tǒng)ProFlux(來自Millipore的ProFlux M12)將其濃縮。根據(jù)使用的Pluronic F68的量將培養(yǎng)基濃縮4-10倍以使?jié)饪s后的Pluronic F68濃度為0.2-0.4％。8升的CHO-K1或24升AV12的培養(yǎng)物濃縮后的終體積通常為2-3升。
2．Q-Sepharose批量處理往濃縮后的初始條件培養(yǎng)基中加入Fast Flow Q-Sepharose樹脂(Pharmacia 17-0510-01，用20mM Tris,pH7.4進(jìn)行預(yù)平衡)，加入的量為每升濃縮前的培養(yǎng)基加入50ml，并加入足量的NaCl以使其終電導(dǎo)率為200mM(~20mS/cm)，在4℃下溫和攪拌過夜。
3．滲濾濃縮培養(yǎng)基和Q-sepharose樹脂過夜批量處理后使樹脂沉淀，倒去上清并用Zeta Plus 30-SP濾膜(#B0406-30SP，購自Sun SourceFauver)和Masterflex泵以170ml/min的流速通過CUNO系統(tǒng)過濾。然后進(jìn)一步將培養(yǎng)基濃縮至800ml并在Proflux系統(tǒng)中用5-6倍體積的20mM Tris,pH7.4進(jìn)行滲濾。此時(shí)的電導(dǎo)為～2mS/cm。用1N HCl將pH調(diào)到5.0，用CUNO系統(tǒng)和新的Zeta Plus 30-SP濾膜重新過濾并立即上樣到陽離子交換柱上。
4．陽離子交換層析層析柱每～100-200mg FSH(~500-600mg總蛋白)用PharmaciaSP-Sepharaose Fast Flow(17-0729-01)裝50ml的層析柱。緩沖液為A:20mM磷酸鈉，pH5.0；B20mM磷酸鈉，pH5.0,1M NaCl。
將樣品的pH調(diào)到5.0，過濾使之澄清并立即上樣到層析柱上，并在15個(gè)柱體積的0％到50％的梯度開始之前先以5ml/min的流速跑4個(gè)柱體積。搜集3min的級(jí)分(15ml)。級(jí)分被收集到400ml 1M Tris,pH8.0。
用考馬斯亮藍(lán)染色的SDS PAGE凝膠選擇含F(xiàn)SH的級(jí)分(通常50ml層析柱收集的級(jí)分體積為200到250ml)。將收集物對(duì)20mM Tris,pH7.4在4℃透析過夜以使電導(dǎo)下降到＜3mS/cm.
5．染料親和層析(DAC)層析柱每～40mg FSH用購自Prometic Bioscience Inc.的Mimetic Blue Dye 1 A6XL,0090-0500,0090-0500裝50ml的層析柱。緩沖液為A:25mM磷酸鈉，pH6.5(電導(dǎo)為4.5-5mS/cm)；B:25mM磷酸鈉，150mM KCl,pH6.5；C:25mM磷酸鈉，1MKCl,pH8.0。
CEX收集產(chǎn)物透析后將pH值跳到6.5并以3ml/min的流速上樣到DAC層析柱。進(jìn)行4個(gè)體積100％A到50％A:50％B的梯度，然后用5個(gè)體積的緩沖液C洗脫，收集3min的級(jí)分(9ml)。
用考馬斯亮藍(lán)染色的SDS PAGE凝膠選擇含F(xiàn)SH的級(jí)分。通常50ml層析柱收集的級(jí)分體積為90到100ml。用Millipore Ultrafree離心裝置將收集物濃縮到4ml(UFV2BCC40,5000MWCO,2000rpm離心)并上樣到凝膠過濾層析柱上。
6．凝膠過濾層析柱50到100mg的FSH用BioPilot Superdex 75 Prep Grade35/600層析柱。緩沖液為1×PBS(從GIBCO 10×PBS,#70011制備得到)加上100mM NaCl。緩沖液的最終組分為1mM單堿磷酸鉀，3mM雙堿磷酸鈉，253mM氯化鈉，pH7.4。
將來自DAC步驟的溶于以上所描述的1×PBS的4ml FSH上樣于上述層析柱，流速為3ml/min，收集1min(3ml)的級(jí)分。
根據(jù)考馬斯和銀染色的凝膠，此步的FSH的純度為＞95％。
制劑/制成品實(shí)施例實(shí)施例6防腐劑對(duì)FSH物理穩(wěn)定性的影響由于防腐劑傾向于使蛋白變性、破壞其穩(wěn)定或使其聚集(Brange,J.and Lankjar,L.,Acta Phram.Nord,4,149-158,1992；MaaYF and Hsu C,International Journal of Pharmaceutics,140,155-168,1996)，因此使用動(dòng)態(tài)光散色技術(shù)對(duì)uFSH(uFSH-體外診斷學(xué)-人類尿源促卵泡素)在不同防腐劑存在的情況下的物理穩(wěn)定性進(jìn)行檢驗(yàn)。通過包括一臺(tái)Lexel 95 Argon激光儀(488nm)，一臺(tái)Brookhaven Instruments model BI-200SM的測(cè)向器和一臺(tái)BI9000AT自動(dòng)校正器在內(nèi)的系統(tǒng)以獲得測(cè)量數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)參數(shù)包括初始光子計(jì)數(shù)調(diào)至100,000計(jì)數(shù)/秒，持續(xù)時(shí)間30秒，dust截?cái)嘀?1，以及散射角90°。
向1.5ml含1mg/ml尿源卵泡刺激激素(uFSH-體外診斷學(xué)-人類尿源促卵泡素)的溶液加入防腐劑，在此之前尿源卵泡刺激激素以1×PBS在pH7.4下透析過夜。選擇防腐劑的濃度達(dá)到通常已知的可提供充分抗微生物活性的濃度。在層流罩中將樣品通過一0.1μmAnotop-Plus濾紙(10mm)過濾入一12mmDLS測(cè)試管。將樣品置于37℃下平衡過的DLS固定器中。在24小時(shí)內(nèi)每15分鐘確定自動(dòng)校正器函數(shù)并對(duì)其分析以產(chǎn)生流體動(dòng)力學(xué)參數(shù)。測(cè)量數(shù)據(jù)表明99％以上的蛋白分子的平均直徑約為5.7nm。少部分的直徑約為200nm。在37℃下經(jīng)過24小時(shí)，防腐劑的存在并不明顯地改變?cè)摲肿哟笮〉姆植?。然后使用NNLS(非負(fù)線性平方)程序分析24小時(shí)的代表性數(shù)據(jù)，程序見表Ⅰ.。99％以上的蛋白成平均直徑約5.7nm的顆粒。使用一晶體學(xué)上相關(guān)的經(jīng)驗(yàn)方程可據(jù)其分子量確定疏水半徑(Squire,P.G.andHimmel,M.E.,in Arch.BioI.Biophys.,196,pp.165-177,1979)，該DLS顆粒平均大小相對(duì)的分子量約36,000，這與uFSH異二聚體的分子量相一致。剩余的少量顆粒(＜1％)平均直徑約200nm。表Ⅵ中的數(shù)據(jù)表明所測(cè)試的防腐劑在本測(cè)試條件下不會(huì)明顯地造成uFSH的聚集。
表Ⅵ．uFSH在含不同防腐劑的制劑中的大小分布。
實(shí)施例7uFSH制劑的熱變性研究在溶劑條件影響下的uFSH的熱解折疊過渡通過差示量熱掃描法(DSC)來檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)通過一個(gè)VP-DCS微量熱計(jì)(MicroCal inc.,Northampton,MA；Plotnilk,V.V.et al.,Anal.Biochem.,250:237-244,1997)來進(jìn)行，使用VPViewer軟件來收集數(shù)據(jù)，使用Origin DSC軟件來分析數(shù)據(jù)。適配的樣品槽和參照槽由鉭進(jìn)行棒形化(lollipop-shaped)而制得，其工作體積為0.5ml。用適當(dāng)?shù)木彌_液透析約1mg/ml的uFSH樣品，以紫外光譜法測(cè)定蛋白濃度。然后將蛋白稀釋至0.4-0.5mg/ml以用于DSC實(shí)驗(yàn)。透析溶液被用作參照溶液。樣品和參照溶液在加樣之前需脫氣5分鐘，上樣使用2.5ml的針頭通過填充道完成。以壓力帽保持壓力在30psi。為本實(shí)驗(yàn)的測(cè)量，在處理樣品之前向樣品槽和參照槽內(nèi)加入緩沖液并開動(dòng)儀器過夜以建立熱力學(xué)歷程。以O(shè)rigin DSC軟件使用雙態(tài)模型分析數(shù)據(jù)(Sturtevant,J.M.,Annu.Rev.Phys.Chem.,38:463-488,1987)。蛋白質(zhì)在不同溶液條件中的過渡溫度的中點(diǎn)(Tm)總結(jié)于表Ⅶ。蛋白質(zhì)在pH7.4的PBS緩沖液中進(jìn)行非常協(xié)同地過渡，其Tm為77.3℃。緊接著第一次掃描后的第二次掃描缺少過渡，這顯示在該測(cè)量的時(shí)間范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的熱變性不可恢復(fù)。但是，解聚的亞基在溶液中保持為單體，這些單體可在幾天后重新聚合成具生物活性的二聚體(數(shù)據(jù)未顯示)。如表Ⅶ所示，添加所示濃度的防腐劑間甲苯酚、苯酚、苯乙醇、甲基對(duì)羥基苯甲酸酯和氯甲酚對(duì)Tm的影響表現(xiàn)為空白。
表Ⅶ．DSC所檢測(cè)到的pH、鹽和防腐劑對(duì)uFSH Tm值的影響
實(shí)施例8uFSH在pH影響下的的穩(wěn)定性u(píng)FSH(uFSH-體外診斷學(xué)-人類尿源促卵泡素)在PBS中的穩(wěn)定性受不同pH值的影響。在pH影響下的異二聚體百分比通過分子量排阻層析來檢測(cè)，見表Ⅷ
表Ⅷ．通過分子量排阻層析檢測(cè)的在pH影響下的異二聚體百分比
實(shí)施例9uFSH防腐和非防腐制劑的穩(wěn)定性在PBS(Dulbecco’s,GIBCO)中制備uFSH(uFSH-體外診斷學(xué)-人類尿源促卵泡素)的溶液并用PBS進(jìn)一步稀釋至濃度為50μg/ml。用一臺(tái)Hewlett Packard Model 8452A二極管分析分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
向盛有預(yù)稱量過的間甲苯酚樣品的燒杯中加入部分uFSH溶液，使間甲苯酚最終濃度約為3.16mg/ml。將每份1ml的防腐和非防腐溶液置于塑料離心管中在約22℃、37℃和45℃下溫育至238天。在不同的時(shí)間段，將小份樣品注入平衡過的Superdex-75HR 10/30柱(Pharmacia)室溫下以0.5ml/min PBS過柱。在214nm下檢測(cè)洗脫液。以二聚體峰的面積除以二聚體峰和單體峰的總面積計(jì)算二聚體的百分比，如表Ⅲ所示。64天后，37℃下的含間甲苯酚的溶液中約79％的uFSH分子為完整的異二聚體，45℃下則有多于52％的完整異二聚體。令人驚奇的是，室溫下63天以后uFSH在防腐和非防腐溶液中均有最小量的解聚。很明顯在22℃、37℃和45℃下4、8、16、21、28、29、43、63、64、126、127、237和238天uFSH在防腐和非防腐溶液中的解聚一般均相對(duì)較低。
表Ⅸ．防腐或非防腐溶液中的二聚體百分比
實(shí)施例10uFSH樣品的生物活性測(cè)量用編碼一潮霉素選擇標(biāo)記的人類FSH受體表達(dá)載體轉(zhuǎn)染已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了cAMP敏感的b-乳糖酶(BLAM)報(bào)告載體(Zlokarnik,et al.,1998,Science 279:84-88)的HEK 293細(xì)胞，在潮霉素中培養(yǎng)三周。用10μg/ml的FSH(Sigma)處理存活的細(xì)胞5小時(shí)，檢測(cè)出受FSH激活而顯出最高強(qiáng)度的藍(lán)色熒光的細(xì)胞群落并通過FACS將其分離。擴(kuò)展多克隆群落，用10μg/ml的FSH(Sigma)處理5小時(shí)，以FACS檢測(cè)出單細(xì)胞克隆。以微量滴定板法分析兩個(gè)克隆細(xì)胞系，結(jié)果表明其藍(lán)/綠比例提高了6至8倍。將BLAM表達(dá)增加倍數(shù)最大的FSH-R細(xì)胞系選出用于隨后的FSH分析。
在100μl生長培養(yǎng)基(DMEM目錄號(hào)11965-092,10％PBS,500μg/ml慶大霉素)中培養(yǎng)攜帶cAMP敏感的b-乳糖酶(BLAM)報(bào)告載體的FSH受體細(xì)胞，培養(yǎng)使用聚D-賴氨酸表面處理過的96孔黑壁組織培養(yǎng)板，每孔20,000個(gè)細(xì)胞，在37℃,5％CO2下培養(yǎng)過夜。用100μl分析培養(yǎng)基(DMEM目錄號(hào)11965-092,0.5％PBS,500μg/ml慶大霉素)替換生長培養(yǎng)基，平板在37℃,5％CO2下培養(yǎng)過夜。除去分析培養(yǎng)基，向每個(gè)孔加入100μl含指示濃度FSH的分析培養(yǎng)基，平板在37℃,5％CO2下培養(yǎng)5個(gè)小時(shí)。向每個(gè)孔加入20μl BLAM上樣底物，它的組成包括6μl含1mM CCF2-AM的DMS0,6μl Pluronic Acid(100μg/ml,溶于0.1％的乙酸DMSO)，將它們?nèi)苡?ml 2％PEG-400和10％ESS(Aurora Biosciences)。在室溫下溫育1小時(shí)后，使用細(xì)胞熒光計(jì)(Perseptives Biosystem,Series 4000多孔酶標(biāo)儀)測(cè)定藍(lán)色(激發(fā)波長395nm/發(fā)射波長460nm)和綠色(激發(fā)波長395nm/發(fā)射波長530nm)熒光強(qiáng)度的比值。用所測(cè)得的各比值除以參照組的藍(lán)/綠比值即可算出由于FSH的存在所造成的藍(lán)/綠比值的增加倍數(shù)。
含50μg/ml的尿源FSH(uFSH-體外診斷學(xué)-人類尿源促卵泡素)的PBS溶液(樣品A)可依照實(shí)施例9來制備。在90℃下加熱部分溶液10分鐘，將二聚體解聚成兩單體(如SEC分析所示)，以作為本分析的陰性對(duì)照(樣品B)。調(diào)整另取的部分FSH溶液使之含3.15mg/ml間甲苯酚(樣品C)。用FSH-R 293-Cre-BLAM assay在兩個(gè)分開的平板上測(cè)算這三個(gè)測(cè)試樣品的生物活性。表Ⅹ所示的是各平板上三組分析的平均值。數(shù)據(jù)表明該分析的進(jìn)行是可重復(fù)的。數(shù)據(jù)還表明解離的異二聚體失去了生物活性(樣品B)而在含間甲苯酚的制劑中的FSH(樣品C)保持了全部活性。
表Ⅹ．FSH受體生物活性分析中藍(lán)/綠比例增加的倍數(shù)。
實(shí)施例11防腐和非防腐的uFSH樣品的生物活性測(cè)量尿源FSH(uFSH-體外診斷學(xué)-人類尿源促卵泡素)樣品的生物活性在實(shí)施例10所述的體外生物活性分析中測(cè)定。在表Ⅺ中，對(duì)兩樣品體外生物活性分析的結(jié)果同一個(gè)參照組作了比較，樣品于23℃下的PBS中存放11個(gè)月后進(jìn)行分析，其PBS分別含有和不含間甲苯酚。數(shù)據(jù)表明本分析中防腐和非防腐的uFSH樣品在11個(gè)月后均保持了全部的生物活性。
表Ⅺ．在23℃下11個(gè)月后uFSH的防腐和非防腐溶液的體外生物活性
實(shí)施例12防腐和非防腐的rFSH變體樣品的藥筒相容性為測(cè)試制劑化的rFSH變體(α亞基SEQ ID NO:5；β亞基SEQ IDNO:11)溶液同藥筒的相容性，由下所列的儲(chǔ)存液制備4ml表12中的樣品溶液含1.85mg/ml rFSH變體的PBS含1.73mg/ml rFSH變體的PB含20mg/ml間甲苯酚的PBS含20mg/ml間甲苯酚的PB含20％甘油的PB1×PBS混合后，將各溶液各取1.7ml加入獨(dú)立的藥筒，留下最小的上部空間。每樣品裝兩個(gè)藥筒。封好藥筒帽。將藥筒在30℃下溫育20天。各樣品裝完藥筒所剩下的部分在40℃下溫育以作參照。在30℃下溫育20天后，使用實(shí)施例11所述的方法測(cè)量這些樣品的體外活力。在零時(shí)間點(diǎn)將這些樣品的活性同相關(guān)參照組進(jìn)行比較。如表Ⅻ所示，在PBS中濃度為50μg/ml的rFSH樣品和在含3.15mg/ml的間甲苯酚的PBS中濃度為200μg/ml的rFSH樣品在藥筒中(藥筒1和藥筒4)穩(wěn)定。這些樣品在30℃下溫育20天后保持了全部活力。但是，在這些條件下不含NaCl的磷酸緩沖液中的樣品活力較低。在含1.6％的甘油的磷酸緩沖液中的rFSH樣品活力與其參照組相比較有所降低(藥筒2和藥筒3)。
表Ⅻ．在藥筒中30℃下溫育20天后的防腐和非防腐樣品的體外活力
如這些例子所表明，遵循所述的方法和技術(shù)可產(chǎn)生FSH或FSH變體的高度穩(wěn)定的組合物和制劑。這些組合物和制劑導(dǎo)致了本權(quán)利要求中的制成品的開發(fā)。從大約1970年以來，法律一直認(rèn)為一個(gè)制成品中的印刷信息不能消除該產(chǎn)品被申請(qǐng)專利的可能性，只要條款和發(fā)明作為一個(gè)整體滿足法律的其他要求，如新穎性和非顯而易見性。由于先前工藝所認(rèn)識(shí)到的FSH或FSH變體明顯地認(rèn)為該溶液僅適于立即使用且開始使用后其產(chǎn)品必須拋棄，而不是本權(quán)利要求中的產(chǎn)品那樣適于24小時(shí)或更長時(shí)間的使用，亦有別于本權(quán)利要求中的制成品，它包括有新的非顯而易見的發(fā)明，該發(fā)明是獨(dú)特的且不同于先前工藝的發(fā)明。
本發(fā)明中主要的，優(yōu)選的具體內(nèi)容和操作模式已在先前說明中描述。但是，本發(fā)明所期望的保護(hù)不僅限于只針對(duì)已公開的具體形式，因?yàn)樗鼈兪顷U明性的而非限制性的說明。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員可不偏離本發(fā)明精神而進(jìn)行改動(dòng)和變化。
實(shí)施例9uFSH防腐和非防腐制劑的穩(wěn)定性將約含1mg/ml重組FSH變體(α亞基SEQ ID N0:5；β亞基SEQID NO:11)的磷酸氯化鈉緩沖液(PBS,Dulbecco’s,GIBCO)儲(chǔ)存溶液以PBS和含間甲苯酚的PBS分別稀釋至50μg/ml或20μg/ml，使間甲苯酚在后者中的終濃度為3.15mg/ml。按類似方法制備另一套以10mg/ml的苯乙醇為防腐劑的溶液。在塑料eppendorf管中于4、22、37℃下溫育1ml每份的防腐和非防腐溶液至3個(gè)月。在不同的時(shí)間段，將小份樣品注入以PBS平衡過的Superdex-75凝膠過濾柱(Pharmacia)室溫下以0.07ml/min速率過柱，過柱時(shí)間為35分鐘。以214nm的紫外吸收下進(jìn)行全時(shí)檢測(cè)。積分計(jì)算出峰面積，以二聚體峰的面積除以二聚體峰和單體峰的總面積計(jì)算二聚體的百分比。如表Ⅲ所示，室溫或更低溫度下溫育3個(gè)月后，不同溶液條件下的異二聚體有最小的解聚。多于50％的異二聚體在37℃下溫育3個(gè)月后保持完整。異二聚體在較高濃度的溶液中的穩(wěn)定性較高。
表ⅨSE-HPLC檢測(cè)出的rFSH變體的異二聚體穩(wěn)定性
序列表<110>Eli Lilly and Company<120>FSH和FSH變體制劑，產(chǎn)品和方法<130>X12383M Sequence Listing<140><141><150>60/093906<151>1998-07-23<150>60/094611<151>1998-07-30<150>60/094767<151>1990-07-31<150>60/098711<151>1998-09-01<150>60/100696<151>1998-09-17<160>20<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>96<212>PRT<213>哺乳動(dòng)物<400>1Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Met Gln Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu15 10 15Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys Pro Asp Ala Pro Ile Tyr Gln Cys20 25 30Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys35 40 45Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys50 55 60Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Met Gly Asn Val Arg Val65 70 75 80Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser85 90 95<210>2<211>111<212>PRT<213>哺乳動(dòng)物<400>2Arg Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Thr Val Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Gly Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Arg Asp Pro Ala Arg Pro Asn Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Glu Cys His Cys Ser Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Arg Glu Ile Lys Glu100 105 110<210>3<211>96<212>PRT<213>哺乳動(dòng)物<400>3Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Thr Gln Asp Cys Pro Glu Cys Lys Leu1 5 10 15Arg Glu Asn Lys Tyr Phe Phe Lys Leu Gly Val Pro Ile Tyr Gln Cys
20 25 30Lys Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg ser Arg35 40 45Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys50 55 60Val Ala Lys Ala Phe Ile Arg Val Thr Val Met Gly Asn Ile Lys Leu65 70 75 80Glu Asn His Thr Gln Cys Tyr Cys Ser Thr Cys Tyr His His Lys Ile85 90 95<210>4<211>111<212>PRT<213>哺乳動(dòng)物<400>4Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Val Glu Lys Glu Gly1 5 10 15Cys Gly Phe Cys Ile Thr Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ger Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Ala Cys His Cys Gly Lys Cys Asn Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Asp Met Lys Glu100 105 110<210>5<211>92<212>PRT<213>人類<400>5Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro1 5 10 15Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys20 25 30Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu35 40 45Val Gln Lys Ash Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser50 55 60Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr65 70 75 80Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser85 90<210>6<211>111<212>PRT<213>人類<400>6Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu100105 110<210>7<211>96<212>PRT<213>哺乳動(dòng)物<400>7Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Met Gln Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu1 5 10 15Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys Leu Gly Ala Pro Ile Tyr Gln Cys20 25 30Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys35 40 45Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys50 55 60Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Met Gly Asn Ala Arg Val65 70 75 80Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser85 90 95<210>8<211>111<212>PRT<213>哺乳動(dòng)物<400>8Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Thr Val Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Asn Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Glu Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Ser Glu Met Lys Glu100 105 110<210>9<211>96<212>PRT<213>哺乳動(dòng)物<400>9Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Met Gln Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu1 5 10 15Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys Pro Asp Ala Pro Ile Tyr Gln Cys20 25 30Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys35 40 45Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys50 55 60Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Met Gly Asn Val Arg Val65 70 75 80Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser85 90 95<210>10<211>111<212>PRT<213>哺乳動(dòng)物<400>10Arg Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Thr Val Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Ser Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn Ile Gln35 40 45Lys Ala Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Glu Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Arg Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Ser Asp Ile Arg Glu100 105 110<210>11<211>108<212>PRT<213>人類<400>11Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu100 105<210>12<211>l09<212>PRT<213>人類<400>12Asn ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met100 105<210>13<211>110<212>PRT<213>人類<400>13Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys100 105 110<210>14<211>276<212>DNA<213>人類<400>14gctcctgatg tgcaggattg cccagaatgc acgctacagg aaaacccatt cttctcccag 60ccgggtgccc caatacttca gtgcatgggc tgctgcttct ctagagcata tcccactcca 120ctaaggtcca agaagacgat gttggtccaa aagaacgtca cctcagagtc cacttgctgt 280gtagctaaat catataacag ggtcacagta atggggggtt tcaaagtgga gaaccacacg 240gcgtgccact gcagtacttg ttattatcac aaatct 276<210>15<211>324<212>DNA<213>人類<400>15aatagctgtg agctgaccaa catcaccatt gcaatagaga aagaagaatg tcgtttctgc 60ataagcatca acaccacttg gtgtgctggc tactgctaca ccagggatct ggtgtataag 120gacccagcca ggcccaaaat ccagaaaaca tgtaccttca aggaactggt atatgaaaca 180gtgagagtgc ccggctgtgc tcaccatgca gattccttgt atacataccc agtggccacc 240cagtgtcact gtggcaagtg tgacagcgac agcactgatt gtactgtgcg aggcctgggg 300cccagctact gctcctttgg tgaa324<210>16<211>327<212>DNA<213>人類<400>16aatagctgtg agctgaccaa catcaccatt gcaatagaga aagaagaatg tcgtttctgc 60ataagcatca acaccacttg gtgtgctggc tactgctaca ccagggatct ggtgtataag 120gacccagcca ggcccaaaat ccagaaaaca tgtaccttca aggaactggt atatgaaaca 180gtgagagtgc ccggctgtgc tcaccatgca gattccttgt atacataccc agtggccacc 240cagtgtcact gtggcaagtg tgacagcgac agcactgatt gtactgtgcg aggcctgggg 300cccagctact gctcctttgg tgaaatg 327<210>17<211>330<212>DNA<213>人類<400>17aatagctgtg agctgaccaa catcaccatt gcaatagaga aagaagaatg tcgtttctgc 60ataagcatca acaccacttg gtgtgctggc tactgctaca ccagggatct ggtgtataag 120gacccagcca ggcccaaaat ccagaaaaca tgtaccttca aggaactggt atatgaaaca 180gtgagagtgc ccggctgtgc tcaccatgca gattccttgt atacataccc agtggccacc 240cagtgtcact gtggcaagtg tgacagcgac agcactgatt gtactgtgcg aggcctgggg 300cccagctact gctcctttgg tgaaatgaaa 330<210>18<211>333<212>DNA<213>人類<400>18aatagctgtg agctgaccaa catcaccatt gcaatagaga aagaagaatg tcgtttctgc 60ataagcatca acaccacttg gtgtgctggc tactgctaca ccagggatct ggtgtataag 120gacccagcca ggcccaaaat ccagaaaaca tgtaccttca aggaactggt atatgaaaca 180gtgagagtgc ccggctgtgc tcaccatgca gattccttgt atacataccc agtggccacc 240cagtgtcact gtggcaagtg tgacagcgac agcactgatt gtactgtgcg aggcctgggg 300cccagctact gctcctttgg tgaaatgaaa gaa 333<210>19<211>276<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述經(jīng)修飾以便于克隆<400>19gctcctgatg tgcaggattg cccagaatgc acgctacagg aaaacccatt cttctcccag 60ccgggtgccc caatacttca gtgcatgggc tgctgcttct caagagcata tcccactcca 120ctaaggtcca agaagacgat gttggtccaa aagaacgtca cctcagagtc cacttgctgt 180gtagctaaat catataacag ggtcacagta atggggggtt tcaaagtgga gaaccacacg 240gcgtgccact gcagtacttg ttattatcac aaatct 276<210>20<211>324<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述經(jīng)修飾以便于克隆<400>20aacagctgtg agctcaccaa catcaccatt gcaatagaga aagaagaatg tcgtttctgc 60atatcgatca acaccacttg gtgtgctggc tactgctaca ccagggatct ggtgtataag 120gacccggccc gtcccaaaat ccagaaaaca tgtaccttca aggaactggt atatgaaaca 180gtacgcgtgc ccggctgtgc tcaccatgca gattccttgt atacataccc agtggccacc 240cagtgtcact gtggcaagtg tgacagcgac agcactgatt gtactgtgcg aggcctgggg 300cccagctact gctcctttgg tgaa32權(quán)利要求
1．含有包括一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基的FSH或FSH變體以及防腐劑的制劑，該防腐劑選自酚、鄰甲苯酚、間甲苯酚、對(duì)甲苯酚、氯甲酚、芐醇、烷基對(duì)羥基苯甲酸甲，乙，丙，丁酯及其類似物、潔爾滅、氯化芐乙銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞及其各種衍生物的至少一種或混合物，的水性稀釋劑中。
2．權(quán)利要求1的制劑，其防腐劑為苯酚、間甲苯酚、氯甲酚或其混合物。
3．權(quán)利要求2的制劑，其FSH或FSH變體濃度約為1.0μg/ml至50mg/ml。
4．權(quán)利要求3的制劑，它進(jìn)一步含有一種等滲試劑。
5．權(quán)利要求4的制劑，它進(jìn)一步含有一種生理可耐受的緩沖液。
6．包括兩個(gè)藥瓶的制劑，第一個(gè)藥瓶含有凍干的FSH或FSH變體，第二個(gè)藥瓶含一種防腐劑，該防腐劑選自酚、鄰甲苯酚、間甲苯酚、對(duì)甲苯酚、氯甲酚、芐醇、烷基對(duì)羥基苯甲酸甲，乙，丙，丁酯及其類似物、潔爾滅、氯化芐乙銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞及其各種衍生物的至少一種或混合物，的水性稀釋劑中。
7．權(quán)利要求1的制劑，其所述的FSH或FSH變體和防腐劑存在于溶液中。
8．權(quán)利要求1的制劑，其所述的FSH或FSH變體是選自如下所列群體的至少一種化合物(a)α-亞基(SEQ ID NO:1)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:2)RSCELTNITITVEKEECGFCISINTTWCAGYCYTRDLVYRDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCSKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFREIKE(b):α-亞基(SEQ ID NO:3)FPDGEFTTQDCPECKLRENKYFFKLGVPIYQCKGCCFSRAYPTPARSRKTMLVPKNITSESTCCVAKAFIRVTVMGNIKLENHTQCYCSTCYHHKIβ-亞基(SEQ ID NO:4)NSCELTNITIAVEKEGCGFCITINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATACHCGKCNSDSTDCTVRGLGPSYCSFGDMKE(c):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:6)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE(d):α-亞基(SEQ ID NO:7)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:8)NSCELTNITITVEKEECNFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFSEMKE(e):α-亞基(SEQ ID NO:9)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:10)RSCELTNITITVEKEECSFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKACTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDRDSTDCTVRGLGPSYCSFSDIRE(f):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:11)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGE(g):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:12)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEM(h):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNNTSESTCCVAKSYNKVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:13)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMK
9．一種用于治療不育癥的方法，它包括以權(quán)利要求1的制劑向有需要的患者進(jìn)行給藥。
10．權(quán)利要求9的方法，其所述的患者選自人類、綿羊、牛、馬或兔。
11．用于制備含一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基的FSH或FSH變體的防腐溶液制劑的方法，它包括將所述的FSH或FSH變體同一種防腐劑混合，該防腐劑選自酚、鄰甲苯酚、間甲苯酚、對(duì)甲苯酚、氯甲酚、芐醇、烷基對(duì)羥基苯甲酸甲，乙，丙，丁酯及其類似物、潔爾滅、氯化芐乙銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞及其各種衍生物的至少一種或混合物，的水性稀釋劑。
12．一種用于人類醫(yī)療的制成品，它包括包裝材料和一個(gè)包含含有一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基的FSH或FSH變體溶液以及一種防腐劑溶液的藥瓶，所述的包裝材料包括一個(gè)表明所述溶液可保存超過24小時(shí)或更長時(shí)間的標(biāo)簽。
13．權(quán)利要求12的制成品，其所述的藥品為玻璃容器，它具有一個(gè)用于多用途給藥的塞子。
14．權(quán)利要求12的制成品，其所述的藥瓶為一包裝泡，它可以被穿刺并用于肺部給藥。
15．權(quán)利要求12的制成品，其所述的藥瓶為一pen-注射器設(shè)備。
16．一種制成品，它包括包裝材料、盛有凍干的含一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基的FSH或FSH變體的第一個(gè)藥瓶和含一種防腐溶液的第二個(gè)藥瓶，此處所述的包裝材料包括一個(gè)標(biāo)簽用以指導(dǎo)患者用防腐溶液再配所述的FSH或FSH變體以使用超過24小時(shí)或更長時(shí)間。
17．權(quán)利要求16的制成品，其所述的第一個(gè)和第二個(gè)藥瓶包含于一pen-注射器設(shè)備。
18．一種用于治療患者的不育癥的方法，它包括以溶于防腐溶液的包含一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基的FSH或FSH變體的防腐溶液向有需要的患者進(jìn)行給藥，所述的溶液適于超過24小時(shí)或更長時(shí)間的給藥。
19．一種使用含一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基并用于治療患者的不育癥的FSH或FSH變體的穩(wěn)定溶液的方法，它包括以FSH或FSH變體的穩(wěn)定溶液向有需要的患者進(jìn)行給藥，所述的溶液適于超過24小時(shí)或更長時(shí)間的給藥。
20．FSH或FSH變體的至少一個(gè)α多肽或β多肽在制備防腐溶液中的使用，該防腐溶液適于超過24小時(shí)或更長時(shí)間的給藥。
21．一種包括至少一種含有一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基FSH或FSH變體以及含鹽水或一種鹽的磷酸緩沖液的穩(wěn)定制劑，此處所述的FSH或FSH變體在23℃下60天后至少含90％的FSH或FSH變體二聚體。
22．權(quán)利要求21的制劑，其所述的FSH或FSH變體濃度約為1.0μg/ml至50mg/ml。
23．權(quán)利要求21的制劑，進(jìn)一步包括一種等滲試劑。
24．權(quán)利要求21的制劑，其所述的緩沖液為磷酸鹽水緩沖液。
25．一種制劑，它包括盛有含一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基的凍干的FSH或FSH變體的第一個(gè)藥瓶和盛有含鹽水或一種鹽的磷酸緩沖液的第二個(gè)藥瓶。
26．權(quán)利要求21的制劑，其所述的FSH或FSH變體和所述的磷酸緩沖液處于溶液中。
27．權(quán)利要求21的制劑，其所述的FSH或FSH變體是選自如下所列群體的至少一種化合物(a):α-亞基(SEQ ID NO:1)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:2)RSCELTNITITVEKEECGFCISINTTWCAGYCYTRDLVYRDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCSKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFREIKE(b):α-亞基(SEQ ID NO:3)FPDGEFTTQDCPECKLRENKYFFKLGVPIYQCKGCCFSRAYPTPARSRKTMLVPKNITSESTCCVAKAFIRVTVMGNIKLENHTQCYCSTCYHHKIβ-亞基(SEQ ID NO:4)NSCELTNITIAVEKEGCGFCITINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATACHCGKCNSDSTDCTVRGLGPSYCSFGDMKE(c):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:6)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE(d):α-亞基(SEQ ID NO:7)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:8)NSCELTNITITVEKEECNFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFSEMKE(e):α-亞基(SEQ ID NO:9)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:10)RSCELTNITITVEKEECSFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKACTFKELVYETVEVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDRDSTDCTVRGLGPSYCSFSDIRE(f):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:11)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGE(g):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:12)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEM(h):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:13)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMK
28．一種用于治療不育癥的方法，它包括以權(quán)利要求21的制劑向有需要的患者進(jìn)行給藥。
29．權(quán)利要求28的方法，其所述的患者選自人類、綿羊、牛、馬或兔。
30．用于制備含一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基的FSH或FSH變體的穩(wěn)定溶液制劑的過程，它包括FSH或FSH變體混溶于含鹽水或一種鹽的磷酸緩沖液。
31．一種用于醫(yī)療的制成品，它包括包裝材料和一個(gè)含溶于水性稀釋劑的一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基的FSH或FSH變體穩(wěn)定溶液的藥瓶，所述的包裝材料包括一個(gè)表明該溶液適于超過24小時(shí)或更長時(shí)間使用的標(biāo)簽。
32．權(quán)利要求31的制成品，其所述的藥品為玻璃容器，它具有一個(gè)用于多用途給藥的塞子。
33．權(quán)利要求31的制成品，其所述的藥瓶為一包裝泡，它可以被穿刺并用于肺部給藥。
34．權(quán)利要求31的制成品，其所述的藥瓶為一pen-注射器設(shè)備。
35．一種制成品，它包括包裝材料、盛有凍干的含一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基的FSH或FSH變體的第一個(gè)藥瓶和含一種穩(wěn)定的水性稀釋劑的第二個(gè)藥瓶，此處所述的包裝材料包括一個(gè)標(biāo)簽用以指導(dǎo)患者在水稀釋劑中再配所述的FSH或FSH變體以形成可使用超過24小時(shí)或更長時(shí)間的溶液。
36．權(quán)利要求35的制成品，其所述的第一個(gè)和第二個(gè)藥瓶包含于一pen-注射器設(shè)備。
37．一種用于治療患者的不育癥的方法，它包括以溶于磷酸緩沖水性稀釋劑的含一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基FSH或FSH變體的穩(wěn)定溶液向有需要的患者進(jìn)行給藥，所述的溶液適于超過24小時(shí)或更長時(shí)間的給藥。
38．一種使用含一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基的FSH或FSH變體溶液治療患者的不育癥的方法，它包括以溶于水性稀釋劑中的FSH或FSH變體的穩(wěn)定溶液向有需要的患者進(jìn)行給藥，該溶液適于超過24小時(shí)或更長時(shí)間的給藥。
39．FSH或FSH變體的至少一個(gè)多肽在制備穩(wěn)定溶液中的使用，該穩(wěn)定溶液適于超過24小時(shí)或更長時(shí)間的給藥。
40．一種如此處所描述的制劑。
41．一種如此處所描述的制成品。
42．一種如此處所描述的制備方法。
43．一種如此處所描述的用途。
44．一種如此處所描述的方法。
45．權(quán)利要求1的制劑在治療有需要的患者的不育癥中的使用。
46．權(quán)利要求1的制劑的使用，此處所述的患者選自人類、綿羊、牛、馬或兔。
47．含一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基的FSH或FSH變體的防腐溶液在治療有需要的患者的不育癥中的使用，所述的溶液適于超過24小時(shí)或更長時(shí)間的給藥。
48．含一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基的FSH或FSH變體的穩(wěn)定溶液在治療有需要的患者的不育癥中的使用，它包括以在含鹽水或一種鹽的磷酸緩沖液中的所述的FSH或FSH變體的溶液向有需要的患者進(jìn)行超過24小時(shí)或更長時(shí)間的給藥。
49．權(quán)利要求21的制劑在治療有需要的患者的不育癥中的應(yīng)用。
50．權(quán)利要求49的制劑的使用，此處所述的患者選自人類、綿羊、牛、馬或兔。
51．純化的FSH或FSH變體的穩(wěn)定溶液在治療有需要的患者的不育癥中的使用，F(xiàn)SH或FSH變體含一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基，它們?nèi)苡诤}水或一種鹽的磷酸緩沖液中，用于超過24小時(shí)或更長時(shí)間的給藥。
52．含一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基的FSH或FSH變體的穩(wěn)定溶液在治療有需要的患者的不育癥中的使用，其所述的溶于含鹽水或一種鹽的磷酸緩沖液中的FSH或FSH變體適于超過24小時(shí)或更長時(shí)間的使用。
53．一種生產(chǎn)制劑的制備方法，它包括將含一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基的FSH或FSH變體同一種防腐劑混合，該防腐劑選自酚、鄰甲苯酚、間甲苯酚、對(duì)甲苯酚、氯甲酚、芐醇、烷基對(duì)羥基苯甲酸甲，乙，丙，丁酯及其類似物、潔爾滅、氯化芐乙銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞及其各種衍生物的至少一種或混合物，的水性稀釋劑中。
54．一種生產(chǎn)穩(wěn)定制劑的過程，它包括將含一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基的至少一種FSH或FSH變體同含鹽水或一種鹽的磷酸緩沖液混合，此處所述的FSH或FSH變體在23℃下60天后至少含90％的FSH或FSH變體二聚體。
55．權(quán)利要求53的過程，其防腐劑為苯酚、間甲苯酚、氯甲酚或其混合物。
56．權(quán)利要求53-54的任一過程，其FSH或FSH變體濃度約為1.0μg/ml至50mg/ml。
57．權(quán)利要求53-54的任一過程，它進(jìn)一步含有一種等滲試劑。
58．權(quán)利要求53-54的過程，它進(jìn)一步含有一種生理可耐受的緩沖液。
59．包括制備兩個(gè)藥瓶的制備方法，第一個(gè)藥瓶含有凍干的FSH或FSH變體，第二個(gè)藥瓶含一種防腐劑，該防腐劑選自酚、鄰甲苯酚、間甲苯酚、對(duì)甲苯酚、氯甲酚、芐醇、烷基對(duì)羥基苯甲酸甲，乙，丙，丁酯及其類似物、潔爾滅、氯化芐乙銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞及其各種衍生物的至少一種或混合物，的水性稀釋劑中。
60．權(quán)利要求59的制備方法，其所述的FSH或FSH變體和防腐劑進(jìn)一步被置于溶液中。
61．權(quán)利要求53-54的任一制備方法，其所述的FSH或FSH變體是選自如下所列群體的至少一種化合物(a):α-亞基(SEQ ID NO:1)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:2)RSCELTNITITVEKEECGFCISINTTWCAGYCYTRDLVYRDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCSKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFREIKE(b):α-亞基(SEQ ID NO:3)FPDGEFTTQDCPECKLRENKYFFKLGVPIYQCKGCCFSRAYPTPARSRKTMLVPKNITSESTCCVAKAFIRVTVMGNIKLENHTQCYCSTCYHHKIβ-亞基(SEQ ID NO:4)NSCELTNITIAVEKEGCGFCITINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATACHCGKCNSDSTDCTVRGLGPSYCSFGDMKE(c):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:6)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE(d):α-亞基(SEQ ID NO:7)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:8)NSCELTNITITVEKEECNFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFSEMKE(e):α-亞基(SEQ ID NO:9)FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:10)RSCELTNITITVEKEECSFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKACTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDRDSTDCTVRGLGPSYCSFSDIRE(f):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:11)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGE(g):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:12)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEM(h):α-亞基(SEQ ID NO:5)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSβ-亞基(SEQ ID NO:13)NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMK
全文摘要
本發(fā)明涉及包含于制劑和制成品中的含有α亞基和β亞基的FSH和FSH變體。本發(fā)明提供了優(yōu)越的新的蛋白和核酸,蛋白和核酸的多用途的藥用溶劑,制劑,現(xiàn)有的商售制品沒有被證明有如此長期的用途的性能。該產(chǎn)品特別適用于一段時(shí)間的治療后,提高FSH和FSH變體的血液濃度。因此本發(fā)明滿足了FSH和FSH變體的便利產(chǎn)品的需求。
文檔編號(hào)A61P15/00GK1309567SQ99808813
公開日2001年8月22日 申請(qǐng)日期1999年7月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月23日
發(fā)明者J·A·霍夫曼, 呂繼蓉 申請(qǐng)人:伊萊利利公司