專利名稱：從苦瓜中獲得的蛋白質(zhì)/多肽－k及其萃取方法
領(lǐng)域本發(fā)明涉及高效降血糖多肽-k，它提取自苦瓜(Momordica charantia)。本發(fā)明還提供一種從苦瓜中提取所述多肽-k的方法。此外，本發(fā)明還提供新的降血糖組合物，它含有所述的提取物，用于治療糖尿病。
背景目前，已經(jīng)由動物胰臟合成胰島素，或由大腸桿菌合成人胰島素(EliLily,USA)，并作為商品出售。至今，還沒有商品化地從植物中提取胰島素/多肽-k。
從動物的胰臟分離胰島素因以下原因而受到反對1．殺死10,000頭動物，只能獲得1磅純胰島素。
2．它不適合舌下給予。
3．如果胰臟被某些疾病傳染，常可能被胰島素所攜帶(如果是病毒)。
4．昂貴的人胰島素可由大腸桿菌來合成。
因此，為了避免傳統(tǒng)胰島素提取方法中的以上及其他缺陷，科學(xué)家轉(zhuǎn)而注意基于植物的產(chǎn)品。
苦瓜是廣泛生長于亞洲的一種葫蘆科多年生草本植物。這種草本植物多見于熱帶，例如印度、南非、菲律賓、中國和緬甸。西方國家的苦瓜在形態(tài)和感覺上與熱帶品種都不同。該植物的各部分，尤其是果實(shí)，已被廣泛用于制備降血糖的藥物組合物。
已知，其果實(shí)的提取物具有降血糖特性，常被推薦用于降低糖尿病患者的血糖水平。
該植物極易栽培，因此可由其合成任意量的多肽-k。
在印度專利No.136565中，申請人曾揭示一種從苦瓜中提取多肽-p的方法。用乙醇分別萃取干燥且粉碎的苦瓜的果實(shí)和組織培養(yǎng)物，然后與冷乙醇和二乙醚混合。然后，加入微量的鋅，18小時后形成針狀結(jié)晶。果實(shí)和培養(yǎng)物分別粉碎，在水、乙醇中均質(zhì)化，并加入濃硫酸將pH調(diào)至03以獲得絮凝狀沉淀。
該方法具有以下缺陷
1．因?yàn)椴豢赡艿玫酱罅康囊掖迹移渲杏须s質(zhì)，所以在提取過程中使用乙醇是不可行的。
2．使用果實(shí)和組織培養(yǎng)物作為原料會給處理帶來問題，不經(jīng)濟(jì)，而且得率低。
另一印度專利，No.17640克服了該專利的缺陷。后一專利揭示了一種用己烷和二乙醚提取高效多肽-p的方法。雖然該方法因?yàn)槿コ擞头莺驮磉芭浠绕渌s質(zhì)而獲得了良好的得率，提高了純度和藥效，但它有缺陷，其中包括1．因?yàn)榇嬖谥头莺驮磉芭浠?，純化多?p非常麻煩。
2．在提取中使用二乙醚不可行，因?yàn)樗兹级页杀靖摺?br> 3．農(nóng)藥/殺蟲劑/尿素等雜質(zhì)的存在影響了多肽-p的純度。
4．得率不理想。
美國專利No.5484889描述了一種用于治療腫瘤和HIV感染的植物蛋白質(zhì)。已從苦瓜種籽中獲得了該蛋白質(zhì)。需要指出的是，分離和純化得到的該蛋白質(zhì)是一種核糖體滅活蛋白質(zhì)，因此被用于腫瘤治療。所述該蛋白質(zhì)的提取過程包括溶劑的使用和繁瑣的層析和透析等過程。在該專利以及印度專利No.176040所述的過程中，得率和純度很低，而且有雜質(zhì)。所以，為了克服以上及其他缺陷，申請人從苦瓜中分離了具有降血糖活性的新的多肽-k，還設(shè)計了一種從該植物來源提取該蛋白質(zhì)的新的方法。
目的本發(fā)明的目的之一是提供一種新的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的目的還在于提供從苦瓜的種籽和果實(shí)中提取蛋白質(zhì)的方法。
本發(fā)明的目的還在于用所述蛋白質(zhì)制備新的降血糖組合物。
本發(fā)明的目的還在于提供用于治療人和動物的降血糖組合物。
發(fā)明概述根據(jù)以上及其他目的，本發(fā)明提供了自苦瓜中提取的新的多肽-k，提取所述多肽-k的方法，和采用本發(fā)明多肽的新的降血糖組合物。
詳細(xì)描述因此，本發(fā)明提供了一種從苦瓜種籽中提取蛋白質(zhì)的方法，包括的步驟有ⅰ)在合適的研磨機(jī)中將干種籽研磨成細(xì)粉，
ⅱ)用非極性溶劑混合物處理粉碎后的種籽，ⅲ)將殘留物溶解在約水約80％的丙酮中，ⅳ)用氫氧化銨之類合適的有機(jī)緩沖液將pH上調(diào)至9.5，ⅴ)用硫酸處理上清液，ⅵ)收集絮凝狀多肽-k沉淀，通過選擇性結(jié)晶分離蛋白質(zhì)。然后用層析法分析蛋白質(zhì)。
這種提取自苦瓜種籽的新蛋白質(zhì)(多肽-k)含有氨基酸
實(shí)施例之一中，將苦瓜的種籽剖開，用水徹底清洗2-3次，使它基本不含雜質(zhì)，經(jīng)真空干燥，然后萃取蛋白質(zhì)。
另一實(shí)施例中，所用的非極性溶劑可含丙酮與芳香或脂族烴的混合物，所述的烴選自苯、己烷、石油醚和乙醚。
另一實(shí)施例中，脂族或芳香烴在非極性溶劑混合物中的比例是2∶1。
實(shí)施例之一中，在100℃活化鋪有硅膠G(0.4-0.5mm厚)的玻璃板(20×20)，將胰島素溶液點(diǎn)樣，玻璃板在正丁醇、水、乙酸(12∶5∶2)中展開，干燥，噴涂茚三酮的丙酮溶液(0.25％)使對應(yīng)于胰島素標(biāo)準(zhǔn)品的點(diǎn)顯色，從未噴涂的板上分離對應(yīng)斑點(diǎn)連同硅膠G，以氫氧化銨緩沖的50％乙醇萃取，過濾，干燥濾液，形成純的白色針狀晶體。
另一實(shí)施例中，在分析中，分離得到的物質(zhì)與胰島素標(biāo)準(zhǔn)品一同水解，分別點(diǎn)樣到層析紙上并展開，結(jié)果得到相同的氨基酸，但多肽-p多了甲硫氨酸。
另一特征中，分離得到的物質(zhì)與胰島素標(biāo)準(zhǔn)品分別用6N HCl水解20小時，干燥，于50％乙醇中溶解，加到Whatman No.1濾紙條上，在正丁醇、乙酸、水(60∶320∶20)中展開，展開后的濾紙條噴涂以茚三酮的丙酮溶液(0.25％)，氨基酸與標(biāo)準(zhǔn)品水解產(chǎn)物相同，但多肽-p多了甲硫氨酸。在分析中，用己烷丙酮萃取種籽，所得產(chǎn)物的熔點(diǎn)(234℃)、凝膠凝膠電泳方式和氨基酸數(shù)都與胰島素標(biāo)準(zhǔn)品相同，但多肽R多了甲硫氨酸。
需要注意的是，苦瓜植株的多數(shù)部位都不同程度地含有本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)。因此，可用植株的任意部位來提取該蛋白質(zhì)，其中以果實(shí)為佳，種籽最好。
用己烷(食品級)和丙酮，而不是早先專利176040所用的乙醚，處理干種籽。這一過程去除了不需要的油份、黃酮類和皂甙配基，因此多肽的得率高，純度高，效力高。
在糖尿病中，葡萄糖不能作為能源被機(jī)體所用，于是高水平地滯留在血液中，最后隨尿液排除。有時，由胰β細(xì)胞分泌的胰島素不足，或未充分行使其功能。
糖尿病主要分為胰島素依賴性糖尿病(Ⅰ型糖尿病)和非胰島素依賴性糖尿病(Ⅱ型糖尿病)。Ⅰ型糖尿病所處的狀態(tài)是胰β細(xì)胞因遺傳、病毒感染等原因而機(jī)能下降，因此，基本上不分泌胰島素，主要突發(fā)于20-30多歲的人群。雖然尚不確定，但Ⅱ型糖尿病多發(fā)于具有糖尿病家族史、肥胖、承受高壓力等的40多歲的人群。在Ⅱ型糖尿病中，胰島的胰島素分泌是充足的，但其胰島素耐受性和葡萄糖的利用卻與正常人不同，因此，盡管血中胰島素過高，血糖仍不能恢復(fù)到正常水平。
糖尿病常伴有許多癥狀。典型的例如多尿，多飲和貪食。即，因高血糖的滲透壓作用，糖尿病患者隨尿液排出葡萄糖和過多的水分，于是表現(xiàn)為多尿，繼而因脫水而口渴，這包括過量飲水，并感到胃中空虛，于是過量進(jìn)食。糖尿病患者不能有效的利用葡萄糖作為能源，轉(zhuǎn)而利用機(jī)體所儲存的蛋白質(zhì)和脂肪，這一現(xiàn)象通過一惡性循環(huán)而導(dǎo)致體重下降。
然而，這一現(xiàn)象是只在糖尿病初期才看得到的急性癥狀。如果糖尿病因延誤治療而發(fā)展成了慢性的，則將導(dǎo)致慢性血管病之類的并發(fā)癥。因此，諸如糖尿病性視網(wǎng)膜病(視力障礙，視覺缺失，視網(wǎng)膜出血)，糖尿病性腎病，糖尿病性外周神經(jīng)病等糖尿病并發(fā)癥全面降低人體的代謝和感覺功能。
已開發(fā)并試驗(yàn)了許多藥物，它們能降低非胰島素依賴性糖尿病的血糖。然而，其中大多數(shù)存在著或多或少的缺點(diǎn)，有些對大多數(shù)人有嚴(yán)重的副作用，或者所需劑量過高。而且，有些將血糖降得過低，因此只能偶爾在發(fā)作時使用，否則會危害健康，其他則可能有毒性。目前，還沒有一種天然的抗糖尿病藥物能高效地降低血糖但不會降低到安全水平以下，而且沒有嚴(yán)重的副作用。
根據(jù)本發(fā)明，只用本發(fā)明的蛋白質(zhì)，即可以一種簡便的方法制得一種具有藥物活性的降血糖制劑。要獲得所需的功能，只需較少量的該治療藥物。
采用本發(fā)明蛋白質(zhì)的草本植物組合物從苦瓜中提取的蛋白質(zhì)具有降血糖特性，因此含該蛋白質(zhì)的組合物可用于治療哺乳動物的糖尿病。從苦瓜中獲得的該蛋白質(zhì)呈無定形粉末的形式。該蛋白質(zhì)激活無活性的胰島素，因此，根據(jù)各患者病程長短，它能夠恢復(fù)胰的活力。實(shí)際上，它可能最終治愈糖尿病。申請人進(jìn)行了500多次實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)每次約12mg的單獨(dú)劑量十分有效。因此，值得推薦的是，含所述蛋白質(zhì)的組合物的單次劑型應(yīng)含約12mg所述蛋白質(zhì)。
可將含本發(fā)明蛋白質(zhì)的降血糖組合物配制成各種形式，例如片劑、注射劑、食品。為了制備片劑，將約12mg蛋白質(zhì)與藥學(xué)上認(rèn)可的適用載體混合。所述藥學(xué)上認(rèn)可的載體須具有足夠高的純度和足夠低的毒性。可以制備成非立即吞咽的食品，例如餅干、口香糖等。在各種制劑中，所述蛋白質(zhì)的含量都是約12mg。已發(fā)現(xiàn)，用本發(fā)明蛋白質(zhì)做的咸餅干很受糖尿病患者的歡迎。
需要指出的是，本發(fā)明的降血糖組合物需在餐前10分鐘服用，每日至少4次。最重要的是，所述片劑或降血糖組合物只能咀嚼而不能立即吞咽。
作為本發(fā)明特征之一，所述的降血糖組合物沒有副作用。在使用時，對其他治療手段的運(yùn)用沒有限制。
以下將參照實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。許多修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，應(yīng)該包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1(蛋白質(zhì)制備實(shí)施例)從苦瓜中提取蛋白質(zhì)從苦瓜的成熟果實(shí)中得到100g干種籽。手工將這些種籽剖開。然后，剖開的種籽用水徹底清洗3-4次，使它們基本上不含任何雜質(zhì)。然后將剖開的種籽真空干燥，用研磨設(shè)備粉碎成細(xì)粉。也可使用任何其他常用設(shè)備。
然后用丙酮∶己烷1∶2的溶劑混合物處理細(xì)粉，將殘留物溶解于20％丙酮。加入氫氧化銨/有機(jī)緩沖液，將pH調(diào)至9.5，獲取上清液，用H2SO4調(diào)至pH3，以獲取絮凝狀沉淀，收集沉淀，用乙酸鋅結(jié)晶。
將硅膠G(Kieselgel G nach Stahl；E.Merck)鋪在(0.4-0.5mm厚)玻璃薄板(20×20cm)上，在100℃活化半小時。將含有分離到的物質(zhì)的溶液點(diǎn)樣在玻璃板邊緣以上1cm處，在正丁醇∶水∶乙酸(12∶5∶2)的有機(jī)溶劑混合物中展開。展開后的玻璃板在室溫下干燥，并噴涂以0.25％的茚三酮丙酮溶液。從200塊未噴涂的板上回收與胰島素對應(yīng)的分離物的茚三酮陽性斑點(diǎn)(R=0.19)連同硅膠G，用以氫氧化銨緩沖的50％乙醇萃取。將萃得物過濾并真空干燥。然后，稱量所得的純的無色晶體(3g/100g干重的種籽)。
測定了純化合物的熔點(diǎn)(232-235℃)和mmp(234℃)。胰島素標(biāo)準(zhǔn)品的熔點(diǎn)據(jù)記錄是233℃。
胰島素標(biāo)準(zhǔn)品樣品和分得的多肽-k分別用6N HCl回流水解20小時。將水解產(chǎn)物過濾，干燥，分別在50％乙醇中再溶解，點(diǎn)樣在Whatman No.1紙條上。紙條在正丁醇∶水∶乙酸(60∶20∶20)的有機(jī)溶劑混合物中展開。還分別將分離產(chǎn)物和胰島素標(biāo)準(zhǔn)品的水解產(chǎn)物與已知氨基酸(羥基賴氨酸，甲硫氨酸，羥基脯氨酸和色氨酸)一起點(diǎn)樣。在各展開后的層析圖上噴以0.25％的茚三酮丙酮溶液。標(biāo)準(zhǔn)品水解產(chǎn)物的氨基酸與分離所得化合物水解產(chǎn)物的完全相符，只是，分離所得的多肽-k多了甲硫氨酸。分離所得多肽-p和標(biāo)準(zhǔn)物水解產(chǎn)物中都沒有羥基賴氨酸，羥基脯氨酸和色氨酸，說明分離所得多肽-p幾乎與胰島素完全相同，只是多肽-k多一個甲硫氨酸。與17種氨基酸相比，多肽-k中的18種氨基酸多了谷氨酰胺。
進(jìn)行了圓盤電泳(10％SDS Biophore凝膠，在tris緩沖液中電泳，操作條件為pH6.1,3％乙酸，低槽(lower cell)；90V，每管2.5mA；溴酚藍(lán)示蹤染料)。注入分離物的結(jié)晶樣品和含二硫蘇糖醇(dithiotheltol)和EDTA的牛胰島素，電泳7小時。從管中收集凝膠，染色(考馬斯亮藍(lán)R250在7％乙酸水溶液中配成的0.05％溶液)，并用10％乙酸洗滌。如

圖1所示，分離產(chǎn)物和牛胰島素的電泳模式幾乎完全相同。多肽-p的免疫分析顯示，在以牛胰島素進(jìn)行測試時，沒有任何交叉反應(yīng)性。
舌下服用分離物顯示出明確的高降血糖活性。對500名糖尿病患者進(jìn)行治療(片劑1)時，沒有發(fā)現(xiàn)藥物副作用。即使用藥長達(dá)2-4年，這些患者中也沒有出現(xiàn)神經(jīng)病、嗜睡和低血糖。同時，在一個月內(nèi)，血糖水平就顯著下降。結(jié)果見表1。
實(shí)施例2(從苦瓜中提取蛋白質(zhì))從苦瓜的成熟果實(shí)中得到200g干種籽。手工將這些種籽剖開。然后，剖開的種籽用水徹底清洗3-4次，使它們基本上不含任何組織。然后將剖開的種籽真空干燥，用研磨設(shè)備粉碎成細(xì)粉。也可使用任何其他常用設(shè)備。
然后用丙酮∶己烷1∶2的溶劑混合物處理細(xì)粉。將硅膠G(Kieselgel G nach Stahl；E.Merck)鋪在(0.4-0.5mm厚)玻璃薄板(20×20cm)上，在100℃活化半小時。將含有分離物質(zhì)的溶液點(diǎn)樣在玻璃板邊緣以上1cm處，在正丁醇∶水∶乙酸(12∶5∶2)的有機(jī)溶劑混合物中展開。展開后的玻璃板在室溫下干燥，并噴涂以0.25％的茚三酮丙酮溶液。從200塊未噴涂的板上回收與胰島素對應(yīng)的分離物的茚三酮陽性斑點(diǎn)(R=0.19)連同硅膠G，用以氫氧化銨緩沖的50％乙醇萃取。將萃得物過濾并真空干燥。然后，稱量所得的純的無色晶體(3g/100g干重的種籽)。
測定了純化合物的熔點(diǎn)(232-235℃)和mmp(234℃)。胰島素標(biāo)準(zhǔn)品的熔點(diǎn)據(jù)記錄是233℃。
胰島素標(biāo)準(zhǔn)品樣品和分離得的多肽-p各自用6N HCl回流水解20小時。將水解產(chǎn)物過濾，干燥，各自在50％乙醇中再溶解，點(diǎn)樣在Whatman No.1紙條上。紙條在正丁醇∶水∶乙酸(60∶20∶20)的有機(jī)溶劑混合物中展開。還分別將產(chǎn)物和胰島素標(biāo)準(zhǔn)品各自與已知氨基酸(羥基賴氨酸，甲硫氨酸，羥基脯氨酸和色氨酸)一起點(diǎn)樣。在展開后的各層析圖上噴以0.25％的茚三酮丙酮溶液。標(biāo)準(zhǔn)品水解產(chǎn)物的氨基酸與分離所得化合物水解產(chǎn)物的完全相符，只是，分離所得的多肽-k多了甲硫氨酸和谷氨酰胺。分離所得多肽-k和標(biāo)準(zhǔn)物水解產(chǎn)物中都沒有羥基賴氨酸，羥基脯氨酸和色氨酸，說明分離所得的多肽-k幾乎與胰島素完全相同。多肽-k顯示有18種氨基酸。
進(jìn)行了圓盤電泳(10％SDS Biophore凝膠，在tris緩沖液中電泳，操作條件為pH6.1,3％乙酸，低槽(lower cell)；90V，每管2.5mA；溴酚藍(lán)示蹤染料)。注入分離物的結(jié)晶樣品和含二硫蘇糖醇(dithiotheltol)和EDTA的牛胰島素，電泳7小時。從管中收集凝膠，染色(考馬斯亮藍(lán)R250在7％乙酸水溶液中配成的0.05％溶液)，并用10％乙酸洗滌。如圖1所示，分離產(chǎn)物和牛胰島素的電泳模式幾乎完全相同。多肽-k的免疫分析顯示，在以牛胰島素進(jìn)行測試時，沒有任何交叉反應(yīng)性。
以下是病例研究的代表性實(shí)施例，其中的患者已服用了本發(fā)明的降血糖組合物。所有患者都患有糖尿病，但慢性程度各不相同?；颊弑唤ㄗh食用基本不含淀粉并包括至少一份水果的優(yōu)質(zhì)食物。還建議患者在服用本發(fā)明組合物的同時進(jìn)行鍛煉。在治療開始之前，大多數(shù)患者曾服用Diaonlic/Glyciphate/格列苯脲(Glynase)/苯乙福明(DBI)/格列苯脲(優(yōu)降糖Euglucon)/Dimicron或glyciphage與格列苯脲(Glynase)的組合物。
在一周至40天后，觀察到患者的血糖水平逐漸恢復(fù)正常。每餐前10-15分鐘舌下含服本發(fā)明組合物，每日4此，持續(xù)6個月至3年不等。血糖水平高于355的，在所述劑量的組合物之外還補(bǔ)充以2(1+1)或1(1/2+1/2)的格列苯脲(Diaonil)(早晨和傍晚)。15天后，完全停用格列苯脲(Diaonil)。病例研究1．Vivek Muklerjee先生，18歲，主訴腿疼，過分口渴，尿頻，視力模糊。檢查發(fā)現(xiàn)，他的餐后(pp)血糖水平為425mg/dl，空腹血糖為209mg/dl?？诜幬锒夹Ч患选；颊呓邮芙ㄗh服用本發(fā)明的降血糖組合物(每日4次，12mg/劑。每次都在餐前10分鐘服用，不用其他液體或固體送服)和Diaonil(1+1+1)。這使得血糖水平顯著下降。一個月后，Diaonil減量至半，再以后則完全停用，2個月后，餐后血糖水平出人意料地下降至114mg/dl。現(xiàn)在，患者只使用本發(fā)明組合物，血糖水平保持正常，沒有副作用。
2．K.P.Mishra教授，71歲，慢性糖尿病，血糖水平為305mg/dl。他依賴于胰島素(18單位/日)。該患者接受建議服用本發(fā)明的降血糖組合物4次。近兩年里，他的血糖保持正常。
3．D.P.Gaur先生，60歲，患慢性糖尿病10年。雖然服用60單位胰島素，仍發(fā)生了神經(jīng)病變和嗜睡。還有高血壓和高甘油三酯癥狀。該患者開始每日4次服用本發(fā)明制劑，同時，胰島素減至Yμ。血糖水平降低了。胰島素劑量逐漸減少，最后停用，現(xiàn)在，患者服用4劑次的本發(fā)明制劑，血糖水平保持正常，而且身體健康。
4．Rashmi Geha女士，46歲，有癥狀，經(jīng)血檢(血紅蛋白質(zhì)-苷化測試)證實(shí)為糖尿病(320mg/dl)。自開始服用本發(fā)明粉末后，其血糖水平保持正常。她從未使用過其他口服藥物。
5．Banerjee先生，70歲，慢性糖尿病患者(15-20年)，并患有高血壓，高甘油三酯和高膽固醇。他服用了3年本發(fā)明粉末，每日4劑次本發(fā)明制劑。這使得他的血糖水平保持正常，并使其血壓和膽固醇水平得到控制。
表1Gourdin(多肽-k)對糖尿病患者血糖水平的作用
以下是本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1．因?yàn)楦纳屏颂崛》椒?，先前用專?76040中的方法分離得到的多肽-p變得更有效。
2．多肽-p是高效的舌下服用降血糖藥。
3．用本發(fā)明藥物治療糖尿病時，膽固醇、包括總膽固醇、HDL、LDL、VLDL和甘油三酯等的水平降至正常。
4．在連續(xù)用此藥2-4年的500多名患者中，沒有出現(xiàn)腿疼、嗜睡等癥狀。
本發(fā)明所述的實(shí)施例只是用于說明本發(fā)明的特點(diǎn)，而不是對本發(fā)明范圍的限定。
降血糖組合物的來源和效果1．它是自“Karela”/苦瓠果/苦瓜中提取的蛋白質(zhì)。
2．Gourdin的燃點(diǎn)/mp為232±2℃。
3．以氨基酸分析儀進(jìn)行分析時，水解產(chǎn)物顯示有18種氨基酸(圖1)4．掃描時可觀察到單一電泳條帶，顯示單個純Gourdin峰(圖2)5．生物-免疫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多肽-k對胰島素呈陰性。
6．藥理學(xué)研究顯示明顯的降血糖作用。
7．多肽-k不溶于水，在pH9.5時，部分溶解。
8．可用茚三酮進(jìn)行物理測定，因?yàn)榭扇芙M分會在加熱后由黃色變成紫色。
9．對多肽組分測序時，發(fā)現(xiàn)第一末端是游離的。
10．本發(fā)明的降血糖組合物激活血液中無活性的胰島素，因而可治愈糖尿病，療程取決于疾病的慢性程度。
11．如果是遺傳性的，正常人可用單劑量作為預(yù)防劑量。
12．如果膽固醇水平高，可服用本發(fā)明組合物來降低膽固醇水平。
13．還可以降低高甘油三酯水平。
14．關(guān)節(jié)疼痛和炎癥消失或緩解。
15．服用該組合物，使糖尿病患者感覺正常。
16．沒有發(fā)現(xiàn)其他副作用。
權(quán)利要求書按照條約第19條的修改1．一種稱為多肽-k的蛋白質(zhì)，提取自苦瓜，純度為100％，所含18種氨基酸為
所述多肽-k不溶于水，但在pH9.5時部分溶解，所述多肽-k不適合注射，但可舌下給予。
2．一種自苦瓜中提取新蛋白質(zhì)(多肽-k)的方法，包括ⅰ．研磨干的苦瓜種籽；ⅱ．用非極性溶劑混合物處理粉碎后的種籽；ⅲ．將殘留物溶于含水80％的丙酮中；ⅳ．用氫氧化銨等合適的有機(jī)緩沖液將pH上調(diào)至9.5；
ⅴ．在將pH調(diào)節(jié)至3后，用硫酸處理上清液；和ⅵ．收集絮凝狀多肽-k沉淀，通過選擇性結(jié)晶分離蛋白質(zhì)。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中的蛋白質(zhì)是從苦瓜的果實(shí)和種籽中提取的。
4．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，將苦瓜的種籽剖開，用水徹底清洗2-3次使它基本不含雜質(zhì)，并真空干燥，然后提取蛋白質(zhì)。
5．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所用的非極性溶劑含丙酮與一種芳香或脂族烴的混合物，所述的烴選自苯、己烷、石油醚和乙醚。
6．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，脂族或芳香烴在非極性溶劑混合物中的比例是2∶1。
7．自苦瓜中提取的多肽-k的用途，通過舌下給予來治療糖尿病。
國際局于2000年6月13日收到；修改權(quán)利要求1,3和7；其余權(quán)利要求不變Khanna P.等“植物來源的多肽-p的降血糖活性”，天然產(chǎn)物雜志，xx xx卷44，第648-655頁。
以上文獻(xiàn)是發(fā)明人自己過去的研究和成果。不巧的是，在申請時，有關(guān)文獻(xiàn)中多肽-p的細(xì)節(jié)在權(quán)利要求中重復(fù)了。實(shí)際上，申請人已分離出一種新的稱為“多肽-k”的蛋白質(zhì)。該多肽-k與多肽-p的區(qū)別在于以下幾方面1．多肽-k有18種氨基酸，而多肽-p只有17種，多肽-k另含谷氨酰胺。
2．多肽-k的近似分子量為18,000單位，而多肽-p的為11,000。
3．多肽-k有游離的N末端，而多肽-p沒有。
4．多肽-k不溶于水，多肽-p則是水溶性的。
5．多肽-k不可給患者注射而只能通過舌下口服，但多肽-p可給患者注射。
多肽-k是一種與多肽-p不同的蛋白質(zhì)。多肽-k是發(fā)明人最近鑒定到的，具有不同的特性?？赡?，同一植物含有不同的蛋白質(zhì)，而申請人現(xiàn)在將它們分離開來，并得到一種新的稱為多肽-k的蛋白質(zhì)。
文獻(xiàn)中不曾提到過權(quán)利要求2所述的方法。該方法是為提取在pH9.5時部分溶解的多肽-k而特別設(shè)計的。本發(fā)明方法中各步驟的順序和所用的成分與文獻(xiàn)中的過程是不同的。
其他文獻(xiàn)定為A級，因?yàn)榕c本發(fā)明的技術(shù)背景相關(guān)。
權(quán)利要求
1．一種提取自苦瓜的新的蛋白質(zhì)(多肽-k)，它所含的氨基酸包括
2．一種自苦瓜中提取新蛋白質(zhì)(多肽-k)的方法，包括ⅰ．研磨干的苦瓜種籽；ⅱ．用非極性溶劑混合物處理粉碎后的種籽；ⅲ．將殘留物溶于含水80％的丙酮中；ⅳ．用氫氧化銨等合適的有機(jī)緩沖液將pH上調(diào)至9.5；ⅴ．在將pH調(diào)節(jié)至3后，用硫酸處理上清液；和ⅵ．收集絮凝狀多肽-k沉淀，通過選擇性結(jié)晶分離蛋白質(zhì)。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中的蛋白質(zhì)是從苦瓜的果實(shí)和/或種籽中提取的。
4．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，將苦瓜的種籽剖開，用水徹底清洗2-3次使它基本不含雜質(zhì)，并真空干燥，然后提取蛋白質(zhì)。
5．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所用的非極性溶劑含丙酮與一種芳香或脂族烴的混合物，所述的烴選自苯、己烷、石油醚和乙醚。
6．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，脂族或芳香烴在非極性溶劑混合物中的比例是2∶1。
7．自苦瓜中提取的蛋白質(zhì)用于制造治療糖尿病的降血糖組合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及高效降血糖多肽－k,它提取自苦瓜。本發(fā)明還提供一種從苦瓜中提取所述多肽－k的方法。此外,本發(fā)明還提供新的降血糖組合物,含有所述的提取物,用于治療糖尿病。
文檔編號A61P3/00GK1315964SQ99809134
公開日2001年10月3日 申請日期1999年9月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月13日
發(fā)明者普什帕康納 申請人:普什帕康納