專利名稱：用于神經(jīng)細(xì)胞的負(fù)鏈rna病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用病毒載體，更具體地說，是用一種負(fù)鏈RNA病毒載體轉(zhuǎn)移基因的方法，此方法可用于神經(jīng)細(xì)胞的基因治療。
目前基因治療中普遍應(yīng)用的病毒載體包括反轉(zhuǎn)錄病毒載體，單純皰疹病毒載體(HSV)，腺病毒載體，腺病毒相關(guān)病毒(AAV)載體，等等。特別是，隨著應(yīng)用核磁共振成像(MRI)和正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)(PET)分析腦功能的新進(jìn)展，對(duì)既能有效感染非分離神經(jīng)細(xì)胞又能調(diào)節(jié)被感染細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)基因高水平表達(dá)的載體的需要不斷增加。因此，腺病毒載體，單純皰疹病毒載體，AAV,HIV等相當(dāng)受重視。
盡管曾報(bào)導(dǎo)HSV能夠?qū)⒁欢位蜣D(zhuǎn)移至外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)節(jié)，但仍存在其表達(dá)量的問題(基因治療，1995,2:209-217)。HIV感染神經(jīng)細(xì)胞也已得到證實(shí)(自然生物技術(shù)，1997,15:871-875)。因?yàn)镠IV基因組插入染色體的位置難以預(yù)測(cè)，所以有可能破壞正?；颍せ畎┗?，以及使目的基因過度表達(dá)或表達(dá)抑制。
AAV已經(jīng)用于帕金森氏病的腦部治療(實(shí)驗(yàn)神經(jīng)病學(xué)，1997,144:147-156)和粘多糖?、餍偷哪X部治療(ASGT meenting,1998，摘要號(hào)692)。然而，有報(bào)導(dǎo)帕金森氏病中導(dǎo)入塞酶林神經(jīng)節(jié)的基因轉(zhuǎn)移不完全，其粘多糖病Ⅶ型的腦內(nèi)表達(dá)不足。
目前腺病毒的應(yīng)用最為普遍，有報(bào)導(dǎo)它能向海馬錐體細(xì)胞層轉(zhuǎn)移基因(自然醫(yī)藥(Nature Medicine),1997,3:997-1004)。但腺病毒有其缺陷，如細(xì)胞毒性和強(qiáng)免疫原性。
另一方面，由于負(fù)鏈RNA病毒，如仙臺(tái)病毒(此后簡(jiǎn)寫作SeV)，不與染色體整合，因此不會(huì)激活癌基因。而且，因SeV是一種RNA病毒，所以它有許多優(yōu)點(diǎn)，例如感染后短時(shí)間內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)以及與腺病毒相比轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物能更高水平地表達(dá)。
本發(fā)明者首先用SeV制備了攜帶多種外源基因的重組體病毒，SeV是一種典型的負(fù)鏈RNA病毒，由于其安全、方便而適用于做基因治療的載體。隨后，將這些重組體用于向神經(jīng)細(xì)胞、腦組織等轉(zhuǎn)移外源基因。結(jié)果，發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)這些重組體的應(yīng)用使外源基因有效地向神經(jīng)細(xì)胞和腦組織中轉(zhuǎn)移，而且，他們發(fā)現(xiàn)本項(xiàng)發(fā)明中的病毒載體的應(yīng)用致使導(dǎo)入的外源基因高效表達(dá)。
此外，轉(zhuǎn)移入腦的本項(xiàng)發(fā)明的病毒載體呈現(xiàn)有限的增殖。換言之，在外源基因表達(dá)一定時(shí)期后載體的表達(dá)降低了。而且，應(yīng)用本發(fā)明中病毒載體的基因治療被用于β-葡萄糖醛酸酶缺陷型小鼠腦組織，并改善了該小鼠的癥狀。因此，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，所制備的病毒載體在那些治療時(shí)需要對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的神經(jīng)病的基因治療中能有效發(fā)揮功能。
在沙土鼠或小鼠腦室內(nèi)給予攜帶FGF基因的本發(fā)明病毒載體導(dǎo)致載體感染室管膜細(xì)胞，降低了動(dòng)物的食物攝入和體重。室管膜細(xì)胞形成細(xì)胞層，把腦組織與腦室分隔開，但在第三腦室腦脊液與下丘腦核緊密相互作用。既然本發(fā)明中的載體能有效感染室管膜細(xì)胞，可利用這些載體在腦室內(nèi)表達(dá)分泌蛋白，使這些蛋白作用于下丘腦核(攝食中樞、飽中樞等等)。此外，在沙土鼠的缺血模型上，已發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入一種在海馬實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)生長(zhǎng)因子的病毒載體使細(xì)胞損傷明顯減少，這說明了本發(fā)明中的病毒載體在防止腦缺血中細(xì)胞脫落引起細(xì)胞死亡方面的用途。這些事實(shí)已經(jīng)說明本發(fā)明中的載體在多種臨床治療中用作向腦內(nèi)轉(zhuǎn)移基因的載體是實(shí)用的。
本項(xiàng)發(fā)明涉及(1)一種向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移核酸的方法，包括使神經(jīng)細(xì)胞與負(fù)鏈RNA病毒載體或包含該載體的細(xì)胞相接觸的步驟；(2)(1)中的方法，其中所述神經(jīng)細(xì)胞為中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞；(3)(2)中的方法，其中所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞為腦室的室管膜細(xì)胞；(4)(2)中的方法，其中所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞為海馬細(xì)胞；(5)(1)至(4)中的任一種方法，其中負(fù)鏈RNA病毒載體所含的核酸包含外源基因；(6)(5)中的方法，還可使所述外源基因短暫表達(dá)；(7)(5)中的方法，其中所述的外源基因編碼一種分泌蛋白；(8)(7)中的方法，其中所述蛋白質(zhì)作用于下丘腦神經(jīng)核；(9)(7)中的方法，其中所述蛋白質(zhì)能夠保護(hù)腦組織不被缺血損傷；(10)(5)中的方法，其中所述外源基因選自FGF-1,FGF-5,NGF,CNTF,BDNF,GDNF,p35,CrmA,ILP,bcl-2和ORF 150；(11)一種控制動(dòng)物攝食行為的方法，此方法包括施予動(dòng)物負(fù)鏈RNA病毒載體，此載體包含F(xiàn)GF-1或FGF-5作為外源基因；(12)一種控制動(dòng)物血糖水平的方法，此方法包括施予動(dòng)物負(fù)鏈RNA病毒載體，此載體包含F(xiàn)GF-1或FGF-5作為外源基因；(13)(1)至(12)中的任一種方法，其中所述負(fù)鏈RNA病毒屬于副粘液病毒科；(14)(13)中的方法，其中所述屬于副粘液病毒科的病毒是仙臺(tái)病毒；和(15)一種負(fù)鏈RNA病毒載體，其通過應(yīng)用(1)至(14)中的任一種方法用于向神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移核酸。
在此項(xiàng)發(fā)明中，“負(fù)鏈RNA病毒載體”包括一個(gè)復(fù)合體，此復(fù)合體由負(fù)鏈RNA病毒衍生并具有傳染力。這里，“傳染力”意思是“復(fù)合體將其核酸或其所包含的其他物質(zhì)通過它與細(xì)胞膜粘附和融合的能力而轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的能力”。
在此項(xiàng)發(fā)明中，負(fù)鏈RNA病毒載體可通過，例如，以負(fù)鏈RNA病毒作為起始物質(zhì)而制備。用作起始物質(zhì)的病毒如，屬于副粘液病毒科的如SeV，新城疫病毒，流行性腮腺炎病毒，麻疹病毒，RS病毒(呼吸道合胞病毒)，牛瘟病毒和犬瘟病毒；屬于正粘液病毒科的如流感病毒，屬于彈狀病毒的如水皰性口炎病毒和狂犬病病毒；等等。
當(dāng)應(yīng)用SeV時(shí)，由NP,P/C和L三種基因編碼的一組蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是病毒自主復(fù)制必要的，它們不必依靠本發(fā)明中的病毒載體對(duì)其編碼。例如，本發(fā)明中的載體能夠在攜帶這組蛋白質(zhì)基因的宿主細(xì)胞中增殖，因此這些蛋白質(zhì)可由宿主細(xì)胞提供。此外，這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列與病毒的天然氨基酸序列不必完全相同。任何突變均可被導(dǎo)入，或者用其他病毒的同源基因置換，只要它們的核酸轉(zhuǎn)移活性相同于或強(qiáng)于那些天然蛋白質(zhì)的。
而且，當(dāng)應(yīng)用SeV時(shí)，由M、F和HN基因編碼的一組蛋白質(zhì)，被認(rèn)為對(duì)病毒的傳播能力是必要的，它們不必依靠本發(fā)明中的病毒載體對(duì)其進(jìn)行編碼。例如，本發(fā)明中的載體能夠在攜帶這組蛋白質(zhì)基因的宿主細(xì)胞中生成，因此這些蛋白質(zhì)可由宿主細(xì)胞提供。此外，這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列與病毒的天然氨基酸序列不必完全相同。任何突變均可被導(dǎo)入，或者用其他病毒的同源基因置換，只要它們的核酸轉(zhuǎn)移活性等同于或強(qiáng)于那些天然蛋白質(zhì)的。
為向神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移外源基因，要制備和應(yīng)用一種復(fù)合體，它包含插入了外源基因的重組病毒基因組。此包含重組病毒基因組的復(fù)合體可在體外或體內(nèi)通過轉(zhuǎn)錄修飾過的cDNA而獲得，此cDNA源于前面提到的任意一種病毒或其重組病毒，然后重構(gòu)該病毒。重構(gòu)病毒的方法已經(jīng)被開發(fā)(見WO97/16539)。
此外，除了完整的SeV基因組，不完整的病毒如缺損干擾顆粒(DI顆粒)(病毒學(xué)雜志68,8413-8417,1994)，合成的寡核苷酸等等也可以用做組建復(fù)合體的成分。
當(dāng)用SeV做原料時(shí)，復(fù)合體可能包含全部三種基因，M、F和HN，它們與病毒的傳播能力關(guān)系密切。但是，一般來說，即使包含全部M、F和HN基因的復(fù)合體轉(zhuǎn)移入腦，在病毒顆粒形成后復(fù)合體可能仍不會(huì)顯示傳播能力，因?yàn)槿狈Φ鞍酌杆鈱?duì)SeV傳播能力必需的F蛋白。這里，“傳播能力”意思是“核酸通過感染或用人工技術(shù)轉(zhuǎn)移入細(xì)胞后可以復(fù)制并指導(dǎo)形成傳染性顆粒或它們的能把核酸播散給其他細(xì)胞的等價(jià)復(fù)合體”。然而，為增加安全性，最好消除涉及病毒傳播能力的基因或使之在復(fù)合體病毒基因組內(nèi)功能失活。就SeV來說，涉及病毒傳播能力的基因是M,F和/或HN基因。這類復(fù)合體的重構(gòu)系統(tǒng)已被開發(fā)(WO 97/16538)。例如，對(duì)于SeV，包含刪除了F和/或HN基因的基因組的病毒載體可由包含于重構(gòu)復(fù)合體中的病毒基因組制備。這類載體也包括在本發(fā)明中向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移核酸的載體之中。
復(fù)合體可能在其包膜外表面包含能粘附某特殊細(xì)胞的因子，如粘附因子，配體，受體等等。例如，負(fù)鏈RNA病毒重組體的部分基因可被修飾使有關(guān)免疫原性的基因失活或增強(qiáng)RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制效率。
復(fù)合體中包含的RNA可在其適當(dāng)位置摻入外源基因。為表達(dá)目的蛋白質(zhì)，將編碼此蛋白質(zhì)的外源基因摻入RNA中。對(duì)于SeV的RNA，由六的倍數(shù)個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列被如愿地插入R1和R2序列中間(病毒學(xué)雜志，1993,67卷，第8期，4822-4830頁(yè))。插入RNA中的外源基因的表達(dá)可由基因插入位置來調(diào)節(jié)或由插入基因附近的RNA序列調(diào)節(jié)。例如，就SeV的RNA來說，眾所周知，基因插入RNA的位置越靠近NP基因，則插入基因的表達(dá)水平越高。
復(fù)合體中RNA編碼的外源基因可通過隨復(fù)合體感染細(xì)胞而表達(dá)。如后面實(shí)施例中所示，本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中用SeV重構(gòu)系統(tǒng)制備的復(fù)合體已被證明能夠?qū)⑼庠椿蛴行У剞D(zhuǎn)移入各種神經(jīng)細(xì)胞株。如實(shí)施例5中所示，現(xiàn)已揭示，與反轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，用β-葡萄糖醛酸酶基因作為外源基因的本發(fā)明中復(fù)合體在另一實(shí)施方案中顯示出更高的表達(dá)水平。由于這些特點(diǎn)，本發(fā)明中的復(fù)合體可用于向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移基因。如實(shí)施例6中本發(fā)明中復(fù)合體的一個(gè)實(shí)施方案所示，在腦室內(nèi)給藥后一周左右復(fù)合體表達(dá)下降，所以這在僅需要有限時(shí)間內(nèi)基因表達(dá)的基因治療中很有用。
復(fù)合體包含的核酸或其他混合物可通過復(fù)合體與神經(jīng)細(xì)胞直接接觸而導(dǎo)入神經(jīng)細(xì)胞，或通過使產(chǎn)生病毒載體的細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞接觸而導(dǎo)入。復(fù)合體腦中給藥時(shí)，可通過，例如，麻醉狀態(tài)下顱骨切開術(shù)后在顱骨上鉆一個(gè)洞，隨后用玻璃針或其他類似物注入復(fù)合體而給藥。復(fù)合體可以包含外源基因。外源基因可以包括任何類型的基因，諸如神經(jīng)細(xì)胞特有的基因，凋亡抑制基因，治療各種疾病的其他基因，等等，這些基因可采用反義DNA和核酶形式以抑制某特殊基因的功能。
例如，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)缺血組織的腦細(xì)胞死亡不是在缺血后馬上發(fā)生，而是在缺血后的幾天里發(fā)生(神經(jīng)科學(xué)通訊，1998,240:69-72)。為防止這種情況下的腦細(xì)胞死亡，可應(yīng)用本發(fā)明中包含抑制細(xì)胞死亡的基因，如bcl-2等的復(fù)合體。實(shí)際上，在研究給予本發(fā)明中的載體是否能延緩缺血引起營(yíng)養(yǎng)耗竭導(dǎo)致脆弱的神經(jīng)細(xì)胞脫落過程中，發(fā)現(xiàn)給予FGF-1表達(dá)載體能夠明顯阻止細(xì)胞脫落(實(shí)施例10)。此外，如實(shí)施例6和8所示，本發(fā)明的復(fù)合體能經(jīng)腦室內(nèi)給藥將外源基因轉(zhuǎn)移入室管膜細(xì)胞和腦室旁的細(xì)胞。用表達(dá)分泌蛋白的基因作外源基因可以通過腦脊液把蛋白質(zhì)擴(kuò)散至腦組織包括海馬區(qū)域。如實(shí)施例7所示，通過把本發(fā)明中的載體施給海馬錐體細(xì)胞，也有可能在這些細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源基因。如實(shí)施例6和7所示，本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中復(fù)合體在給入腦內(nèi)甚至13天后還在海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，復(fù)合體的轉(zhuǎn)移沒引起嚴(yán)重的細(xì)胞脫落。這些結(jié)果顯示了本發(fā)明中的復(fù)合體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因治療中的有用之處。例如，在實(shí)施例9中，證明腦室內(nèi)給予FGF表達(dá)載體能成功控制攝入食物的量和降低體重。體重的下降歸因于FGF-2(Denton.D.A.等(1995)行為生理學(xué)，57(4):747-752)，伴隨體重下降的血糖水平降低也有報(bào)導(dǎo)(Stephens,T.W.等(1995)自然377(6549):430-532)，這和本發(fā)明中獲得的血糖水平降低伴有體重下降的結(jié)果相一致。
因此，本發(fā)明中的載體提供了以室管膜細(xì)胞為靶目標(biāo)施給載體的一種新穎方式。除室管膜細(xì)胞外，靶細(xì)胞包括，但不局限于，腦室側(cè)的細(xì)胞，海馬區(qū)域的細(xì)胞，尤其是海馬錐體細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞，從哺乳動(dòng)物胚胎中衍生的神經(jīng)嵴細(xì)胞。能被導(dǎo)入的基因包括，但不局限于，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、凋亡抑制因子、熱休克蛋白、過氧化物酶的基因，等等。這些基因詳細(xì)的實(shí)例包括編碼以下因子的基因，F(xiàn)GF-1(生物學(xué)和化學(xué)雜志(J.Biol.Chem) 271(47):30263-30271,1996),FGF-5(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，87(20):8022-8026,1990),NGF(自然，302(2):538-540,1983),CNTF(自然，357(6):502-504,1992),BDNF(歐洲分子生物學(xué)組織雜志，9(8):2459-2464,1990；Genomics,10(3):558-568,1991),GDNF(神經(jīng)科學(xué)研究雜志，41(2):279-290,1995),p35(病毒學(xué)雜志，61(7):2264-2272,1987),CrmA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，83:7698-7702,1986),ILP(歐洲分子生物學(xué)組織雜志，15(11):2685-2694,1996),bcl-2(癌基因，4(11):1331-6,1989),ORP 150(生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊，230(1):94-99,1997)，等等。本發(fā)明中的載體不僅適用于用DNA芯片和DNA陣列尋找基因，而且適用于方便地制備小鼠模型和開發(fā)藥物。
可導(dǎo)入本發(fā)明中載體的動(dòng)物包括所有哺乳動(dòng)物，例如人類，沙土鼠、小鼠、大鼠，家兔、牛、猴等等。


圖1以圖解方式表示建立包含外源基因如GFP或β-葡萄糖醛酸酶基因并有復(fù)制能力的SeV的方法。用含有NotⅠ位點(diǎn)的引物1和包括轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(R2)，間插序列(IG)，轉(zhuǎn)錄起始因子序列(R1)和NotⅠ位點(diǎn)的引物2，經(jīng)PCR擴(kuò)增外源基因的開放讀碼框架，并插入pUC18/T7HVJRz.DNA(+18)的NotⅠ位點(diǎn)。
圖2是小鼠腦額面剖視圖，顯示感染了包含GFP基因的SeV載體(GFP/SeV)的小鼠中GFP的表達(dá)。
圖3是側(cè)腦室剖視圖，顯示攜帶β-葡萄糖醛酸酶基因的SeV載體感染3天后β-葡萄糖醛酸酶缺陷型小鼠體內(nèi)β-葡萄糖醛酸酶的表達(dá)。
圖4A是側(cè)腦室剖視圖，顯示攜帶β-葡萄糖醛酸酶基因的SeV載體感染12天后，β-葡萄糖醛酸酶缺陷型小鼠體內(nèi)β-葡萄糖醛酸酶的表達(dá)(框內(nèi)區(qū)域)。圖4B顯示了Lorbacher法染色的圖4A鄰近區(qū)域。
圖5是一幅曲線圖，顯示腦室內(nèi)給予表達(dá)FGF-1,FGF-5和GFP的SeV后沙土鼠體重變化。
圖6是一幅曲線圖，顯示腦室內(nèi)給予表達(dá)FGF-1,FGF-5和GFP的SeV后小鼠體重變化。
圖7是一幅曲線圖，顯示腦室內(nèi)給予表達(dá)FGF-1,FGF-5和GFP的SeV后小鼠食物攝入量的變化。
圖8是顯微照片，顯示缺血5天后沙土鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的遲發(fā)型脫落。
圖9是顯微照片，顯示給予表達(dá)FGF-1的SeV載體后海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的遲發(fā)型脫落被阻止。
在確立細(xì)胞系時(shí)應(yīng)用了大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤(phenochromocytoma)(PC12)，人成神經(jīng)細(xì)胞瘤(IMR-32)和人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(A172)。PC12細(xì)胞用加了終濃度均為5％的馬血清和小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。為促進(jìn)軸突長(zhǎng)出，向培養(yǎng)基中加入終濃度50ng/ml的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF 7S)。向含10％小牛血清的MEM培養(yǎng)基中加入MEM丙酮酸鈉溶液和MEM非必需氨基酸溶液至終濃度分別為1mM和0.1mM，將其用于培養(yǎng)人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞(IMR-32)。人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(A172)用含10％小牛血清的MEM培養(yǎng)基(高葡萄糖培養(yǎng)基)培養(yǎng)。
將105細(xì)胞平鋪于6厘米的平皿中含有NGF的培養(yǎng)基中，孵育3天以誘導(dǎo)軸突長(zhǎng)出，然后用于PC12細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)。棄去培養(yǎng)基，細(xì)胞用PBS沖洗一次。將導(dǎo)入了GFP基因的SeV(此后稱作GFP/SeV載體)用添加了1％牛血清白蛋白的500μlPBS稀釋至噬斑形成單位(p.f.u)為106，將其加入細(xì)胞中使感染GFP/SeV載體，在防止細(xì)胞干燥的條件下感染20分鐘。感染后，向平皿中加入培養(yǎng)基(5ml)，將細(xì)胞培養(yǎng)2天。之后，在熒光立體顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞的GFP熒光，結(jié)果是，PC12細(xì)胞內(nèi)有GFP熒光的被確認(rèn)是感染了GFP/SeV載體。被不含GFP基因的SeV感染的對(duì)照組細(xì)胞或未感染的細(xì)胞觀察不到熒光發(fā)散。
將IMR-32細(xì)胞(3×105細(xì)胞)平鋪于含有預(yù)定培養(yǎng)基的10cm平皿中培養(yǎng)過夜。當(dāng)培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)約6×105后，GFP/SeV載體用1000μl含1％牛血清白蛋白的PBS稀釋至m.o.i(感染復(fù)數(shù))為10。細(xì)胞被病毒感染20分鐘后，培養(yǎng)于預(yù)先決定的培養(yǎng)基上12或36小時(shí)，然后于熒光立體顯微鏡下檢測(cè)GFP熒光。培養(yǎng)12小時(shí)后，可于GFP/SeV感染的細(xì)胞體中觀察到熒光。培養(yǎng)36小時(shí)后，除細(xì)胞體外于軸突部分也可觀察到熒光。在感染未攜帶GFP基因的SeV的對(duì)照組細(xì)胞及未感染的細(xì)胞中均未見熒光。
將A172細(xì)胞用同于IMR-32細(xì)胞的方式感染了病毒，可于GFP/SeV感染的細(xì)胞胞體觀察到熒光，但感染未攜帶GFP基因的SeV的對(duì)照組細(xì)胞及未感染細(xì)胞未見熒光。
GFP/SeV感染了在本研究中用到的所有已確立的神經(jīng)細(xì)胞株，并在這些細(xì)胞內(nèi)由GFP基因成功地表達(dá)了GFP。這些結(jié)果意味著SeV可感染原代培養(yǎng)的腦細(xì)胞和體內(nèi)病毒感染的腦細(xì)胞。實(shí)施例3原代大鼠腦細(xì)胞的培養(yǎng)懷孕18天的SD大鼠用二乙醚深麻醉并從腋窩動(dòng)脈放血致死。腹部用95％乙醇消毒后，行剖腹術(shù)取出胎鼠連同子宮。如無另外說明，以下步驟均在冰上或冰凍溶液中無菌條件下進(jìn)行。用剪刀和圓頭鑷從子宮中取出胎鼠，轉(zhuǎn)移到裝有20ml手術(shù)溶液(50％DMEM和50％PBS)的平盤中。將胎鼠放于無菌紗布?jí)|上，用兩把INOX4號(hào)鑷沿中線切開頭皮及頭蓋骨。隨之，沿腦組織內(nèi)側(cè)插入一把INOX7號(hào)鑷，以便切斷延髓將腦組織整個(gè)用杓取出，把腦組織切下放于手術(shù)液中。在立體顯微鏡下，用兩把手術(shù)刀分離腦干，將腦組織切成三部分，包括海馬和紋狀體的兩片大腦半球用圓頭鑷轉(zhuǎn)移入另一手術(shù)液中。在立體顯微鏡下，用兩把INOX5號(hào)鑷將腦膜從腦組織表面完全剝?nèi)ィ⒂脠A頭鑷轉(zhuǎn)移到另一手術(shù)液中中洗。六片大腦半球切片用圓頭鑷放入防腐液中(90％DMEM(包含5％馬血清和5％小牛血清)和10％DMSO)，然后用手術(shù)刀將其在載玻片上切成小于1mm的小塊。切好的組織碎片放入裝有約1.5ml于冷凍容器內(nèi)預(yù)冷的防腐液試管中，緩慢冷凍3小時(shí)以上，然后貯存于液氮中。六片大腦半球的組織碎片從液氮中取出，于32℃解凍，用8ml手術(shù)液中洗2次，靜置30秒，棄去上清。向組織碎片中加入5ml冰凍的木瓜蛋白酶溶液(木瓜蛋白酶1.5單位，半胱氨酸0.2mg，牛血清白蛋白0.2mg，葡萄糖5mg，和DNA酶0.1mg/ml)，此溶液已經(jīng)過濾和除菌。將此混合物于32℃溫育15分鐘且每5分鐘倒轉(zhuǎn)試管一次使之混合。分離出上清液，加入5ml含20％小牛血清的溶液。將預(yù)熱至32℃的木瓜蛋白酶溶液(5ml)加入沉淀級(jí)分中，并將此混合物繼續(xù)溫育15分鐘。每5分鐘倒轉(zhuǎn)試管將此混合物混合一次。當(dāng)確認(rèn)上清液濁度較好且組織碎片半透明后，用移液管移液將組織碎片分離。第一上清級(jí)分預(yù)熱至32℃，加入同樣溶液，所得混合物在預(yù)熱至32℃的離心機(jī)上離心(1200rpm/分，5分鐘)。棄去上清，加入5mlDMEM(包含5％馬血清和5％小牛血清)與沉淀混合以破碎細(xì)胞，隨后用上述條件離心。棄去上清，向沉淀中加入2ml DEME(包含5％馬血清和5％小牛血清)，并將所得混合物攪拌。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)為5×106個(gè)/ml。將如此獲得的原代培養(yǎng)的腦細(xì)胞種植于聚乙烯亞胺包被的平皿中培養(yǎng)。實(shí)施例4用GFP/SeV載體確認(rèn)SeV對(duì)原代培養(yǎng)腦細(xì)胞的感染力實(shí)施例3中獲得的原代培養(yǎng)腦細(xì)胞在10厘米平皿中培養(yǎng)3天。棄去上清液，用1000μl含1％牛血清白蛋白的PBS稀釋GFP/SeV載體以制備樣品溶液，并將之加入培養(yǎng)物中使培養(yǎng)物被病毒感染20分鐘。隨后，加入10mlDMEM培養(yǎng)基(包含5％馬血清和5％小牛血清)，再把細(xì)胞培養(yǎng)2天。然后在熒光立體顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞的GFP熒光。幾乎所有細(xì)胞都顯示熒光，這就是說，可以確定SeV感染了原代培養(yǎng)的腦細(xì)胞。實(shí)施例5攜帶β-葡萄糖醛酸酶基因的SeV載體(此后簡(jiǎn)寫作β-glu/SeV)感染β-葡萄糖醛酸酶基因缺陷型人類成纖維細(xì)胞，并在此細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該酶為完成本項(xiàng)發(fā)明，應(yīng)用了缺乏β-葡萄糖醛酸酶基因的人類成纖維細(xì)胞(此后簡(jiǎn)寫作β-glu缺陷型細(xì)胞)和正常人類成纖維細(xì)胞。
粘多糖?、餍?，是粘多糖病的一種類型，由β-葡萄糖醛酸酶缺乏引起，表現(xiàn)出從輕癥病例到有致命的積水(hydrops)的嚴(yán)重病例的各種臨床癥狀。許多嚴(yán)重病例在嬰兒期表現(xiàn)出各種發(fā)展癥狀，包括特殊面容，肝脾腫大，精神運(yùn)動(dòng)性阻滯，骨畸形，等等。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，酶分子添加糖鏈和酶的甘露糖部分的6-位磷酸化對(duì)于胞內(nèi)β-葡萄糖醛酸酶向溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)是必需的，到達(dá)溶酶體后，酶的c-末端發(fā)生蛋白水解反應(yīng)。
實(shí)施本發(fā)明之前，檢測(cè)β-glu/SeV載體以下幾個(gè)方面，1)對(duì)人成纖維細(xì)胞的感染力，2)它的表達(dá)量，和3)轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體的分子類型。
1)制備β-glu缺陷型成纖維細(xì)胞，使六孔板每孔105細(xì)胞。β-glu/SeV載體用含1％牛血清白蛋白的PBS 100μl稀釋，以使感染復(fù)數(shù)(m.o.i)成為5，并對(duì)已過夜培養(yǎng)的β-glu缺陷型細(xì)胞感染1小時(shí)。細(xì)胞在無血清MEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)。將此培養(yǎng)細(xì)胞用福爾馬林和丙酮的混合液(1∶7,v/v)固定。以萘酚AS-BI葡糖苷酸作為底物，反應(yīng)在丙酮緩沖液pH5.0,37℃中進(jìn)行，底物分解用著紅色來監(jiān)視。結(jié)果，與“β-glu/SeV”一起孵育的β-glu缺陷型細(xì)胞的胞質(zhì)被染成紅色，說明這些β-glu缺陷型細(xì)胞被表達(dá)轉(zhuǎn)移基因的“β-glu/SeV”所感染。2)制備β-glu缺陷型成纖維細(xì)胞，使六孔板每孔105細(xì)胞。β-glu/SeV載體用含1％牛血清白蛋白的PBS 100μl稀釋，以使感染復(fù)數(shù)(m.o.i)成為0.1和1.0，并與已過夜培養(yǎng)的β-glu缺陷型細(xì)胞孵育1小時(shí)，細(xì)胞在無血清MEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞孵育預(yù)定的一段時(shí)間，重新收集并經(jīng)超聲處理以制備胞內(nèi)成分。以4-甲基傘形基(methylumbelliferyl)-β-D-葡糖苷酸為底物，酶促反應(yīng)產(chǎn)物4-甲基傘形酮(MU)的量通過熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光強(qiáng)度來判斷。結(jié)果見表1。在此表中，表達(dá)量用胞內(nèi)組分中1mg蛋白質(zhì)1小時(shí)產(chǎn)生的4-甲基傘形酮(MU)的量代表。
表1

如表1所示，表達(dá)量在15,900-32,300(nmol MU/mg總蛋白/h)之間變化，正常成纖維細(xì)胞為276，用反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)β-葡萄糖醛酸酶(β-glu/retro)的細(xì)胞為911，說明SeV在其感染的細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)烈地表達(dá)轉(zhuǎn)基因。
3)2)中所得成分用作“β-glu/SeV”感染的β-葡糖醛酸酶缺陷型成纖維細(xì)胞的胞內(nèi)成分。分離培養(yǎng)上清，其中的蛋白質(zhì)用冷丙酮離心收集。把如此獲得的實(shí)驗(yàn)樣品用抗人β-葡萄糖醛酸酶抗體進(jìn)行Western雜交分析。結(jié)果，在“β-glu/SeV”-感染的β葡萄糖醛酸酶缺乏的成纖維細(xì)胞胞內(nèi)成分中，鑒定出兩類蛋白質(zhì)，一類為高分子量，另一類為低分子量，兩者均與抗人β-葡萄糖醛酸酶抗體反應(yīng)。低分子量蛋白質(zhì)的雜交帶與正常成纖維細(xì)胞內(nèi)與抗人β-葡萄糖醛酸酶抗體反應(yīng)的蛋白質(zhì)的雜交帶相一致，說明這類β-葡萄糖醛酸酶分子的C-末端在轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體后經(jīng)歷了蛋白水解。高分子量蛋白質(zhì)未見于正常成纖維細(xì)胞，但存在于β-glu/SeV-感染的β-葡萄糖醛酸酶缺陷型成纖維細(xì)胞的胞內(nèi)成分及上清成分內(nèi)。上清液部分只包含高分子量蛋白質(zhì)，這可能是由于β-glu/SeV載體感染所致β-葡萄糖醛酸酶的過高表達(dá)，使高分子量蛋白質(zhì)向溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)跟不上酶的如此高表達(dá)，導(dǎo)致這種蛋白質(zhì)向微粒體或細(xì)胞外空間的分泌。另一種可能，從其分子量判斷，該高分子量蛋白質(zhì)可能是一種有糖鏈附著，但無甘露糖部分的6-位磷酸化的分子類型，所以無法向溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)。
因此，推測(cè)被轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體的人類β-葡萄糖醛酸酶能夠在β-glu/SeV-感染的β-葡萄糖醛酸酶缺陷型成纖維細(xì)胞的胞內(nèi)部分表達(dá)。實(shí)施例6通過GFP/SeV的腦室內(nèi)給藥使GFP在室管膜細(xì)胞內(nèi)表達(dá)將8-10周齡的小鼠用稀釋10倍的戊巴比妥200μl麻醉。行顱骨切開術(shù)后，在頭顱骨上距前囟1.0mm且距中線向右1.5mm的位置用牙科鉆鉆一直徑1mm的洞。剝?nèi)ビ材X膜，用27G注射器針頭在該位置1.3mm深處注入GFP/SeV載體。GFP/SeV載體的劑量為20-30μl，樣品溶液中病毒數(shù)目大約1×107p.f.u-1.5×107p.f.u。對(duì)照小鼠給予PBS或不攜帶GFP基因的SeV。給藥后3、5、7和10天進(jìn)行尸體解剖。取出整個(gè)腦，做額狀切面。在熒光立體顯微鏡下觀察GFP熒光。給予GFP/SeV載體3天后尸檢時(shí)解剖的腦中，觀察到明顯的GFP熒光。在額狀切面上腦室側(cè)的部位觀察到明顯不同的GFP熒光(圖2)。如后面實(shí)施例8所述，發(fā)散GFP熒光的SeV感染細(xì)胞被認(rèn)為是室管膜細(xì)胞。感染5和7天的沿側(cè)腦室的細(xì)胞也成為熒光性的。然而，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度在感染7天后明顯降低，感染10天后未觀察到有熒光的腦細(xì)胞。作為對(duì)照給予PBS或未攜帶GFP基因的SeV的對(duì)照組小鼠腦內(nèi)未觀察到熒光。實(shí)施例7在立體定位手術(shù)下向腦實(shí)質(zhì)給入GFP/SeV載體為檢測(cè)SeV對(duì)神經(jīng)細(xì)胞，尤其是海馬錐體細(xì)胞的感染(這也是本發(fā)明的主要目的)需要向海馬附近精確地定位給予SeV。因此，立體定位手術(shù)被用于向腦實(shí)質(zhì)導(dǎo)入SeV，并檢測(cè)腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞感染。應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有1)小鼠和2)大鼠。
1)用牙科鉆在距前囟向后3mm，距中線2mm的左右側(cè)分別鉆直徑1mm的兩個(gè)洞。用玻璃毛細(xì)管將GFP/SeV載體(各1.5μl)給入腦實(shí)質(zhì)部分，右側(cè)3.5mm深，左側(cè)2.5mm深，封閉頭顱骨，于3天后行外科術(shù)打開以檢測(cè)腦實(shí)質(zhì)部分觀察到的GFP表達(dá)。用乙醇固定后，制備冰凍組織切片。盡管乙醇固定后由于生色團(tuán)流出而使冰凍切片上GFP熒光明顯減弱，但發(fā)熒光的部位仍可觀察到。在靠近內(nèi)囊的白質(zhì)中，髓鞘蛋白被乙醇洗脫后軸索上觀察到GFP熒光，而且，在推測(cè)為紋狀體區(qū)域的軸索中也觀察到GFP熒光。
這些結(jié)果證明GFP/SeV載體能夠感染小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞。
2)既然已經(jīng)有為大鼠制作的精確立體照片，故GFP/SeV載體能準(zhǔn)確地給入海馬CA1區(qū)域錐體細(xì)胞附近。將重約170g的大鼠麻醉，顱骨切開術(shù)后，用牙科鉆在頭顱骨上internal(σ)后4.5mm，距中線2mm的左右各鉆一直徑1mm的洞。用玻璃毛細(xì)管向腦實(shí)質(zhì)給入GFP/SeV載體(各1.5μl)，右側(cè)給藥深度3.5mm，左側(cè)2.5mm深。封閉頭顱骨，3天后行外科術(shù)打開以檢測(cè)GFP表達(dá)。結(jié)果，在海馬CA1錐體細(xì)胞區(qū)域觀察到GFP表達(dá)，此處GFP/SeV載體給藥深度2.5mm，用熒光顯微鏡放大海馬鄰近區(qū)域，發(fā)現(xiàn)在海馬CA1區(qū)域錐體細(xì)胞胞體和軸突內(nèi)有標(biāo)記的熒光。甚至，給藥后13天錐體細(xì)胞內(nèi)仍可觀察到GFP表達(dá)。甚至給予GFP/SeV后13天，在錐體細(xì)胞的胞體和樹突內(nèi)仍可觀察到GFP表達(dá)。這些結(jié)果證明，SeV感染甚至在感染后13天也不會(huì)引起神經(jīng)細(xì)胞死亡，有力說明SeV作為載體用在基因治療時(shí)直接阻止腦缺血后脫落細(xì)胞死亡。實(shí)施例8用β-glu/SeV載體在β-葡萄糖醛酸酶缺陷型小鼠上的基因治療試驗(yàn)實(shí)施例6的結(jié)果表明經(jīng)腦室內(nèi)給藥使室管膜細(xì)胞感染了SeV。因此，發(fā)明者們做了一個(gè)實(shí)驗(yàn)，將β-glu/SeV載體施給β-葡萄糖醛酸酶缺陷型小鼠(J.Clin.Invest.1989,83:1258-1266)以誘導(dǎo)β-葡萄糖醛酸酶自感染的細(xì)胞向腦脊液中分泌，然后被靶細(xì)胞攝取因而癥狀將得到改善。
根據(jù)小鼠尾靜脈中β-葡萄糖醛酸酶的活性和小鼠染色體上β-葡萄糖醛酸酶基因缺陷型位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增片段中NlaⅣ酶切位點(diǎn)的存在，從繁殖雜合子小鼠所得的鼠中挑選純合子小鼠用于本實(shí)驗(yàn)。給予β-glu/SeV載體按照實(shí)例6中方法完成。給藥后3或12天切下鼠腦，制備冰凍組織切片。組織中β-葡萄糖醛酸酶活性用實(shí)施例5中的方法略作修改來評(píng)價(jià)。如圖3所示，腦室側(cè)β-葡萄糖醛酸酶表達(dá)的部分被染上強(qiáng)烈的紅色。經(jīng)顯微鏡放大，證實(shí)側(cè)腦室室管膜細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)β-葡萄糖醛酸酶，此酶隨之被細(xì)胞分泌。在給藥后12天制備的組織切片上(圖4)，顯示已在側(cè)腦室室管膜細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并隨后被分泌的β-葡萄糖醛酸酶擴(kuò)散入腦室，隨腦脊液流動(dòng)到達(dá)海馬附近。純合子小鼠的體質(zhì)通過此種給藥方式得到明顯改善，盡管改善的較輕微。實(shí)施例9給予攜帶FGF-1或-5的SeV載體引起進(jìn)食減少的實(shí)驗(yàn)(沙土鼠或小鼠進(jìn)食減少的實(shí)驗(yàn))將沙土鼠(體重60-80g)用戊巴比妥麻醉，固定于立體定位儀上，去毛，然后在頭皮上沿中線切開。在顱骨上距前囟1.0mm，中線右側(cè)1.5mm處用牙科鉆鉆一洞，并小心避免損傷顱骨下血管。于鉆洞后，將硬腦膜等用鑷子剝?nèi)?。將小鼠FGF-1/SeV載體(5×106pfu)、人類FGF-5/SeV載體(1×107pfu)和GFP/SeV載體(5×106pfu)用一30G注射器針頭于1.0mm深處注入右側(cè)腦室(n=2)。重組體病毒按照實(shí)施例1制備。通過測(cè)量體重來監(jiān)測(cè)體重變化，于給藥后第2天開始觀察到體重的下降(圖5)。在FGF-1給予組，體重從給藥后第2天開始下降，繼之每天降低約5％直到5天后，6天后降低29.5％，于7天后觀察到降低最大幅度29.8％。然后體重轉(zhuǎn)而上升，給藥20天后恢復(fù)至3.5％的降幅。在FGF-5給予組，體重從第2天開始下降，在給藥5天后，達(dá)最大幅值21.7％，然后轉(zhuǎn)為上升，第20天后恢復(fù)至8.0％的降幅。在FGF-9給予組，同樣自第2天開始觀察到體重下降，給藥5天后出現(xiàn)最大降幅22.9％，然后轉(zhuǎn)為上升，第20天恢復(fù)為6.40％的降幅。在給GFP/SeV的對(duì)照組，觀察到體重最大降幅5.8％，推測(cè)由給藥本身所引起，然而，體重下降速度與FGF給予組比較是相當(dāng)小，明確說明FGF可影響體重降低。
由于在沙土鼠上觀察到的體重降低歸因于給予FGF-1/SeV載體和FGF-5/SeV載體，因而用B-6小鼠(體重約20-22g)作更詳細(xì)研究。右側(cè)側(cè)腦室被選為給藥部位，用牙科鉆于頭顱骨上距前囟1.0mm距中線向右1.5mm處鉆一直徑1.0mm洞。剝?nèi)ビ材X膜后，用27G注射器針頭將樣品注入該洞內(nèi)深1.3mm。樣品溶液通過將9μl,8μl和9μl PBS分別加入到1μl FGF-1/SeV載體(1×106pfu)、2μl FGF-5/SeV(2×106pfu)和1μl GFP/SeV對(duì)照載體(1×106pfu)溶液中而制備。體重和食物攝入于給予病毒后監(jiān)測(cè)2周。
給予GFP/SeV的對(duì)照小鼠未表現(xiàn)出體重下降，但與給藥前相比體重升高7.5％(圖6)。食物攝入量也未見明顯改變(圖7)，在FGF/SeV給藥組，于給藥后6天觀察到體重平均下降30.5％(圖6)。然后體重轉(zhuǎn)而回升，結(jié)果于第2周后為降低13.5％，因FGF-1給藥引起的食物攝入量的變化極富戲劇性，給藥后第2天至第6天，尤其第3到6天幾乎沒有食物攝入(圖7)。在FGF-5/SeV載體給藥組，盡管也觀察到體重下降，但與給予FGF-1/SeV組相比，體重降低百分率較小，最大降幅為17.9％(圖6)。對(duì)體重降低的影響與用沙土鼠實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)所獲結(jié)果有相似趨勢(shì)。盡管給予FGF-5/SeV載體對(duì)體重下降的影響小于給予FGF-1/SeV載體的影響，但明確觀察到食物攝入減少(圖7)。
如本實(shí)施例的結(jié)果所示，SeV載體誘導(dǎo)的FGF腦室內(nèi)表達(dá)對(duì)體重降低的影響最大降幅達(dá)30％?？紤]到腦室內(nèi)注射提純的FGF蛋白質(zhì)對(duì)體重降低的影響至多7～8％，本發(fā)明中得到的30％的百分率顯得非常高。這些作用的不同可能歸因于不同給藥方式所致FGF腦室內(nèi)積累的不同，但還有另一種可能，即該不同是由于SeV載體感染室管膜細(xì)胞而使FGF對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的直接作用所致。至于腦內(nèi)攝食中樞，僅報(bào)導(dǎo)了下丘腦神經(jīng)核的控制。鑒于此點(diǎn)，推斷SeV載體有效感染室管膜細(xì)胞使之向腦室內(nèi)腦脊液中分泌功能蛋白，該分泌蛋白有效作用于下丘腦神經(jīng)核使之發(fā)揮攝食控制功能。這種推理得到以下事實(shí)支持部分的下丘腦神經(jīng)組織有一種失去了與血腦屏障之緊密聯(lián)系的神經(jīng)結(jié)構(gòu)并包含接受外周循環(huán)和腦脊液中液體因子的神經(jīng)元。
在下丘腦的核中，化學(xué)敏感性神經(jīng)元存在于下丘腦腹內(nèi)側(cè)區(qū)(VMH)和下丘腦外側(cè)區(qū)(LHA)(這些區(qū)域被認(rèn)為是攝食中樞和飽中樞)，神經(jīng)元針對(duì)血中和腦脊液中代謝產(chǎn)物和激素作出應(yīng)答而改變活性。這些對(duì)血糖作出應(yīng)答的VMH和LHA神經(jīng)元，以及某些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子也被認(rèn)為有食欲調(diào)節(jié)者功能。此外，損毀實(shí)驗(yàn)已證明，室旁核(PVN)也抑制食物的攝入。此核具有產(chǎn)生促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)，并顯示進(jìn)食減少作用和交感神經(jīng)活性之激活作用的神經(jīng)元。而且，弓狀核(ARC)是產(chǎn)生NPY的部位，NPY為攝食刺激物，認(rèn)為其靶向PVN。本文所述控制攝食行為的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FGF作用于該神經(jīng)核。還應(yīng)注意與leptin的關(guān)系，leptin在有脂滴的成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，象NPY等一樣，其與進(jìn)食行為的關(guān)系已被廣泛研究。實(shí)施例10用沙土鼠進(jìn)行的抑制缺血細(xì)胞脫落實(shí)驗(yàn)遭受腦缺血的區(qū)域經(jīng)歷細(xì)胞受損，并隨缺血逐步嚴(yán)重而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞死亡的程度依賴于缺血的程度和持續(xù)時(shí)間。在嚴(yán)重缺血情況下，不僅神經(jīng)細(xì)胞而且缺血區(qū)的所有組成細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)遭受不可逆損傷，導(dǎo)致壞死引起的腦梗塞形成。然而，在持續(xù)時(shí)間很短的嚴(yán)重缺血應(yīng)激反應(yīng)情況下或長(zhǎng)時(shí)間輕微缺血時(shí)，缺血區(qū)細(xì)胞依缺血嚴(yán)重程度而變得脆弱，最脆弱的細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞，其次是少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。已知星形神經(jīng)膠質(zhì)、小神經(jīng)膠質(zhì)和血管內(nèi)皮細(xì)胞更能抵抗缺血應(yīng)激。從對(duì)彌散的腦缺血模型實(shí)進(jìn)行的檢查中已知神經(jīng)細(xì)胞中對(duì)缺血應(yīng)激的抵抗力是有區(qū)別的。所知最脆弱細(xì)胞包括海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，齒狀回門的神經(jīng)細(xì)胞和頭部枕葉的前庭核，它們表現(xiàn)出延遲的細(xì)胞死亡。延遲的神經(jīng)細(xì)胞死亡是選擇性神經(jīng)細(xì)胞死亡的良好模型，其高度再現(xiàn)性與能量不足無關(guān)，極有助于闡明缺血性細(xì)胞死亡的分子機(jī)制。已有許多報(bào)導(dǎo)用這些模型系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)，例如，神經(jīng)細(xì)胞走向死亡有哪些級(jí)聯(lián)反應(yīng)，該級(jí)聯(lián)反應(yīng)中哪一步對(duì)保護(hù)細(xì)胞至關(guān)重要，延遲的神經(jīng)細(xì)胞死亡可歸類于哪種細(xì)胞死亡等等。
實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)物經(jīng)常用大鼠、沙土鼠和小鼠。用這些動(dòng)物對(duì)因該腦缺血模型動(dòng)物整個(gè)腦部幾分鐘至幾十分鐘缺血導(dǎo)致的缺血敏感區(qū)，如海馬，及紋狀體等等的病理改變進(jìn)行研究和治療。大鼠四血管閉塞模型，大鼠低血壓的雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞模型，沙土鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞模型等是常用的缺血模型。本發(fā)明者們應(yīng)用沙土鼠的雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞模型進(jìn)行缺血實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)已知道當(dāng)沙土鼠遭受短時(shí)間(5分鐘)缺血時(shí)，其細(xì)胞死亡主要發(fā)生于海馬CA1區(qū)的多數(shù)錐體細(xì)胞，因此，本發(fā)明者進(jìn)行了一項(xiàng)旨在防止缺血后細(xì)胞脫落的實(shí)驗(yàn)，其方法是在SeV中導(dǎo)入能阻止細(xì)胞死亡的基因并將該所得復(fù)合體施予沙土鼠的海馬。<沙土鼠缺血性細(xì)胞死亡模型的制備>
實(shí)驗(yàn)用沙土鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞(5分鐘)模型來完成。經(jīng)閉塞(5分鐘)沙土鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈，海馬錐體細(xì)胞于閉塞后3-5天選擇性脫落。然而，由于這種現(xiàn)象在沙土鼠中未能普遍觀察到，因此有必要從商業(yè)來源獲得的沙土鼠中篩選優(yōu)秀的作為模型動(dòng)物。經(jīng)篩分挑選出的沙土鼠(得自Instructor Dr.Maeda，解剖學(xué)1系，Osaka City University)用于實(shí)驗(yàn)。
將動(dòng)物用氯胺酮麻醉后，行胸部切開術(shù)找出氣管左側(cè)和右側(cè)的頸總動(dòng)脈，剝?nèi)ジ街陬i動(dòng)脈上的脂肪。剝?nèi)ブ竞?，用夾子夾閉頸動(dòng)脈5分鐘。在此過程中，由于當(dāng)腦部溫度和體溫較低時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞死亡率明顯下降，所以給動(dòng)物保溫以維持體溫37.5℃，體溫用插入肛門的溫度計(jì)監(jiān)測(cè)。5分鐘后放開夾子，使血液再灌注。5天后，處死沙土鼠，顱骨切開術(shù)后，切下腦制備石蠟組織切片。神經(jīng)細(xì)胞的情況經(jīng)甲苯胺染色確定。如所期望，在海馬CA-1區(qū)觀察到錐體細(xì)胞的脫落(圖8)。因此，沙土鼠的缺血細(xì)胞死亡模型已制備好。<通過導(dǎo)入重組SeV而阻止神經(jīng)細(xì)胞死亡的實(shí)驗(yàn)>
按以下步驟將上述制備的SeV載體用于檢測(cè)SeV載體對(duì)防止神經(jīng)細(xì)胞死亡是否有效缺血前一天，將病毒僅導(dǎo)入沙土鼠右腦，第二天實(shí)施缺血，5-6天后處死動(dòng)物來觀察海馬錐體細(xì)胞。<FGF-1/SeV向海馬的轉(zhuǎn)移>
挑選重60-80g的沙土鼠用于本實(shí)驗(yàn)。用氯胺酮麻醉后，將動(dòng)物固定于立體定位儀上。然后腦部脫毛，沿腦的中線切開頭皮。在距前囟5mm，中線右側(cè)2mm處用牙科鉆在頭顱骨上鉆一洞，并小心不要破壞顱骨下血管。鉆洞后，用鑷子剝開硬腦膜和其他組織。將給藥用的玻璃針插入此部位1.4mm深，使動(dòng)物站立2分鐘。通過此玻璃針，在12分鐘內(nèi)向此處注射0.5-1.0μl的FGF-1/SeV載體溶液(1.0×106pfu載體到2.0×106pfu載體)，使動(dòng)物再站立10分鐘。移去針頭，縫合切口。在此步驟中，病毒只給入右腦，缺血后神經(jīng)細(xì)胞的脫落通過對(duì)比左、右腦來判定。<缺血的手術(shù)操作>
將動(dòng)物用氯胺酮麻醉后，行胸廓切開術(shù)找出氣管左側(cè)和右側(cè)的頸總動(dòng)脈，剝?nèi)ジ街陬i動(dòng)脈上的脂肪。剝?nèi)ブ竞?，用夾子夾閉頸動(dòng)脈5分鐘。在此過程中，由于當(dāng)腦部溫度和體溫較低時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞死亡率明顯下降，所以給動(dòng)物保溫以維持體溫37℃，體溫用插入肛門的溫度計(jì)監(jiān)測(cè)。5分鐘后放開夾子，使血液再灌注。5-6天后，處死動(dòng)物。<石蠟切片的制備>
動(dòng)物被處死后，制備厚30-500μm的后腦額狀切面切片，浸泡于4％多聚甲醛中過夜，在用于固定和包埋的自動(dòng)儀器上包埋于石蠟中。切片(5μm)經(jīng)制備，脫蠟，用于免疫組化染色和其他染色。<免疫組化染色>
制備給予FGF-1的腦組織切片以檢測(cè)對(duì)以下抗體的反應(yīng)性抗病毒抗體，抗微管蛋白抗體(判斷缺血手術(shù)的效果)，抗GFAP抗體(檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移)，凋亡標(biāo)記抗體(檢測(cè)細(xì)胞凋亡的存在)。結(jié)果簡(jiǎn)略歸納如下(表2)。
表2

在海馬CA-1區(qū)錐體細(xì)胞內(nèi)，對(duì)照樣品未經(jīng)受缺血，其神經(jīng)細(xì)胞HE染色未發(fā)現(xiàn)任何變化。在大腦經(jīng)受缺血但未給予病毒的一側(cè)多數(shù)細(xì)胞是萎縮的神經(jīng)細(xì)胞，呈現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)的核濃縮和胞質(zhì)內(nèi)的嗜酸性改變，即所謂的缺血性變化。與此對(duì)照，在腦的經(jīng)受缺血且給予病毒的另一側(cè)觀察到少數(shù)變形的神經(jīng)細(xì)胞彌散分布，但大多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞保持原始形態(tài)。在給予病毒的一側(cè)，觀察到抗病毒抗體陽(yáng)性區(qū)域，在經(jīng)受缺血但未給予病毒的神經(jīng)細(xì)胞中，絕大多數(shù)變形細(xì)胞是凋亡標(biāo)記染色陽(yáng)性。與之對(duì)照，在經(jīng)受缺血且給予病毒的細(xì)胞中，只有HE染色并表現(xiàn)出形態(tài)變化的極少數(shù)細(xì)胞的凋亡標(biāo)記染色陽(yáng)性，說明這一側(cè)大部分細(xì)胞的凋亡被抑制(圖9)。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了一種向組織中神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移基因的方法，所述組織包括中樞神經(jīng)組織，向此處轉(zhuǎn)移基因曾經(jīng)是困難的。用本發(fā)明中的方法能夠有效地轉(zhuǎn)移目的基因進(jìn)入基因治療的細(xì)胞中，等等。
權(quán)利要求
1．一種向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移核酸的方法，包括使神經(jīng)細(xì)胞與負(fù)鏈RNA病毒載體或包含該載體的細(xì)胞相接觸的步驟。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)細(xì)胞為中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞。
3．權(quán)利要求2的方法，其中所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞為腦室的室管膜細(xì)胞。
4．權(quán)利要求2的方法，其中所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞為海馬細(xì)胞。
5．權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中負(fù)鏈RNA病毒載體所含的核酸包含外源基因。
6．權(quán)利要求5的方法，還可使所述外源基因短暫表達(dá)。
7．權(quán)利要求5的方法，其中所述外源基因編碼一種分泌蛋白。
8．權(quán)利要求7的方法，其中所述蛋白質(zhì)作用于下丘腦神經(jīng)核。
9．權(quán)利要求7的方法，其中所述蛋白質(zhì)能夠保護(hù)腦組織不被缺血損傷。
10．權(quán)利要求5的方法，其中所述外源基因選自FGF-1,FGF-5,NGF,CNTF,BDNF,GDNF,p35,CrmA,ILP,bcl-2和0RF 150。
11．一種控制動(dòng)物攝食行為的方法，此方法包括施予動(dòng)物負(fù)鏈RNA病毒載體，此載體包含F(xiàn)GF-1或FGF-5作為外源基因。
12．一種控制動(dòng)物血糖水平的方法，此方法包括施予動(dòng)物負(fù)鏈RNA病毒載體，此載體包含F(xiàn)GF-1或FGF-5作為外源基因。
13．權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中所述負(fù)鏈RNA病毒屬于副粘液病毒科。
14．權(quán)利要求13的方法，其中所述屬于副粘液病毒科的病毒是仙臺(tái)病毒。
15．一種負(fù)鏈RNA病毒載體，其通過應(yīng)用權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)的方法用于向神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移核酸。
全文摘要
一種可向神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移基因的負(fù)鏈RNA病毒載體,它使向神經(jīng)細(xì)胞,包括向基因治療中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織,等等內(nèi)高效率轉(zhuǎn)移基因成為可能。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1314949SQ99810224
公開日2001年9月26日 申請(qǐng)日期1999年7月1日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月3日
發(fā)明者福村正之, 長(zhǎng)谷川護(hù), 淺川誠(chéng) 申請(qǐng)人:株式會(huì)社載體研究所