專利名稱：移植物抗宿主病的抑制的制作方法
發(fā)明范圍本發(fā)明涉及用于醫(yī)學(xué)治療的細(xì)胞成分，其制備方法及其在醫(yī)學(xué)治療中的用途。更特別地，本發(fā)明涉及在哺乳動(dòng)物類患者，特別是人類患者中，用于減輕稱作移植物抗宿主病的同種異體(allogeneic)骨髓移植術(shù)后并發(fā)癥的細(xì)胞成分，以及制備這種成分物質(zhì)的方法。
移植物抗宿主病，GVHD，是一種免疫疾病，是限制為治療無法治愈的血液系統(tǒng)惡性疾病的一些類型，如白血病，所使用的同種異體骨髓或干細(xì)胞移植(在此均指allo-BMT)成功和施行的主要因素。GVHD是一個(gè)全身性炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致宿主慢性疾病的產(chǎn)生和死亡。目前，同種異體移植總是冒著伴隨GVHD的嚴(yán)重危險(xiǎn)，即使供體與宿主具有很高的組織相容性。
GVHD由供體T-細(xì)胞與全身分布的不相容的宿主抗原相反應(yīng)所致，引起強(qiáng)烈的炎癥。在GVHD中，識(shí)別供體與宿主間差異的供體成熟T-細(xì)胞全面激活。目前防止和治療GVHD的方法包括給予藥物如環(huán)孢菌素-A和皮質(zhì)激素。這些有嚴(yán)重的副作用，必須長(zhǎng)時(shí)間給藥且對(duì)于給藥和監(jiān)控很昂貴。也曾試圖應(yīng)用T細(xì)胞消耗以防止GVHD，但這需要復(fù)雜和昂貴的設(shè)備和專業(yè)技術(shù)。T-細(xì)胞過度消耗導(dǎo)致嚴(yán)重的問題，骨髓干細(xì)胞灌輸失敗、造血重建失敗、感染或復(fù)發(fā)。過多限制的T-細(xì)胞消耗殘留下的細(xì)胞仍能夠啟動(dòng)GVHD。其結(jié)果，目前治療GVHD的方法僅在有限的供體和宿主結(jié)合中取得成功，以致不能給許多病人提供有效的挽救生命的治療。
本發(fā)明的目的是提供一種減輕接受同種異體-BMT的哺乳動(dòng)物類患者GVHD并發(fā)癥形成的方法。
相應(yīng)的，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種哺乳動(dòng)物類患者減輕骨髓性疾病并減輕因此而發(fā)生的移植物抗宿主病(GVHD)的治療方法，它包括給予患者同種異體造血干細(xì)胞和同種異體T-細(xì)胞，至少部分上述T-細(xì)胞在給予患者前體外接受了氧化應(yīng)激，以誘導(dǎo)其中細(xì)胞因子生成狀態(tài)的改變和增殖反應(yīng)的減小。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種哺乳類T-細(xì)胞群，特別是不含干細(xì)胞，所述的T-細(xì)胞在體外接受了氧化應(yīng)激，在所述細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞因子生成狀態(tài)的改變和增殖反應(yīng)的減小。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種制備給予患骨髓性疾病病人的同種異體細(xì)胞群的方法，它包括在體外使富含在T-細(xì)胞內(nèi)的供體細(xì)胞群接受氧化應(yīng)激，以在所述T-細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞因子生成狀態(tài)的改變和增殖反應(yīng)的減小。
圖3是對(duì)下面的實(shí)例4所得結(jié)果的描述。
優(yōu)選實(shí)例的描述本發(fā)明的方法涉及最初從供體中采集造血干細(xì)胞和T-細(xì)胞。這種細(xì)胞的優(yōu)選來源是動(dòng)員的供體外周血干細(xì)胞和T-細(xì)胞。外周血中的干細(xì)胞數(shù)量非常少，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的操作方法是濃集供體外周血的干細(xì)胞群，然后提取供體的外周血作為干細(xì)胞和T細(xì)胞的來源，用上述的方法進(jìn)行治療，然后注入患者體內(nèi)。在從供體中提取外周血前，給供體注射一個(gè)療程的適當(dāng)生長(zhǎng)因子，連續(xù)幾天，如5天，可達(dá)到濃集的目的。通過一個(gè)已知的程序，白細(xì)胞分離置換可從血中收集到合適的細(xì)胞部分，提取時(shí)，血漿和紅細(xì)胞在一個(gè)密閉的流式系統(tǒng)中回到供體體內(nèi)。含有干細(xì)胞(大約3％)和T細(xì)胞(大約40％)，以及B細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和其他白細(xì)胞的白細(xì)胞收集液，可被處理以改變其中T細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生狀態(tài)和減小增殖反應(yīng)，然后根據(jù)本發(fā)明，作為細(xì)胞(外周血單核細(xì)胞)的整體采集注入到宿主體內(nèi)。然而，供體T-細(xì)胞首選地從其它細(xì)胞中分離，使得僅有T-細(xì)胞接受氧化應(yīng)激并給予患者，而給患者注入的干細(xì)胞與處理的T細(xì)胞分開。但是，在實(shí)際應(yīng)用中，外周血單核細(xì)胞收集液對(duì)應(yīng)激物的反應(yīng)是滿意的，無需進(jìn)一步分離以游離T-細(xì)胞，這是一個(gè)困難而昂貴的步驟。特別優(yōu)選分別給予干細(xì)胞。
如果因某原因需要將整個(gè)白細(xì)胞收集部分進(jìn)行氧化應(yīng)激，以在其中的T-細(xì)胞部分內(nèi)誘導(dǎo)前述的改變，然后將整個(gè)部分輸給患者，優(yōu)選的防止干細(xì)胞受到氧化應(yīng)激任何損害效應(yīng)的方法如下所述。
在一個(gè)可供選擇，但非優(yōu)選的方法中，供體的整體骨髓可被用作本發(fā)明方法的T-細(xì)胞和干細(xì)胞來源。在過去，整體骨髓是同種異體骨髓移植方法通常的細(xì)胞來源，也確實(shí)可用在本發(fā)明方法中。然而，這對(duì)供體是一個(gè)不方便和不適的方法，需要麻醉和較長(zhǎng)的抽提過程。原則上，供體的任何T-細(xì)胞和干細(xì)胞來源均可用，但富含干細(xì)胞和T-細(xì)胞的外周血在臨床上是最方便的。
在本發(fā)明方法中T-細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)的細(xì)胞因子生成狀態(tài)的改變優(yōu)選炎癥細(xì)胞因子生成的減少，如干擾素-γ和組織壞死因子-α。
氧化應(yīng)激可通過將T-細(xì)胞置于氧化環(huán)境而實(shí)施，如添加氣態(tài)、液態(tài)或固態(tài)的化學(xué)氧化劑(臭氧、分子氧、臭氧/氧混合氣、高錳酸鹽、高碘酸鹽、過氧化物、通過氧化機(jī)制作用于生物系統(tǒng)的藥物，如阿霉素，以及類似物)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方法，懸液狀態(tài)的T-細(xì)胞接受氣態(tài)氧化劑，如臭氧/氧混合氣泡通過細(xì)胞懸液，可選擇與同時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)劑量的紫外照射相結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方法，對(duì)來自供體的同種異體白細(xì)胞，包括干細(xì)胞和T-細(xì)胞，進(jìn)行氧化應(yīng)激。這消除了將T-細(xì)胞與白細(xì)胞組份中的其它細(xì)胞成分分開所需要的復(fù)雜和費(fèi)錢的步驟。但是，這種情況下，特別優(yōu)選的是要防止組份中的干細(xì)胞受到應(yīng)激的有害影響。這可通過在接受應(yīng)激時(shí)，在細(xì)胞組份中含有一種或多種干細(xì)胞生長(zhǎng)因子而實(shí)現(xiàn)。氧化應(yīng)激對(duì)干細(xì)胞的有害作用可通過生長(zhǎng)因子存在而得到防護(hù)，因此，在干細(xì)胞-T-細(xì)胞組分接受氧化應(yīng)激前，一種或多種干細(xì)胞生長(zhǎng)因子被加進(jìn)組分中。用在方法中的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子是在此應(yīng)激過程中促進(jìn)干細(xì)胞(而非T-細(xì)胞)生存的細(xì)胞因子。它們是與干細(xì)胞上生長(zhǎng)受體相作用的細(xì)胞因子。它們被確信可激活細(xì)胞的MAP-激酶通路，導(dǎo)致erk活化。這種適合的生長(zhǎng)因子的實(shí)例包括干細(xì)胞特異的生長(zhǎng)因子、kit-配體、IL-3、GM-CSF和FLT3配體，它們均是已知的。優(yōu)選添加精確劑量的提取和純化的生長(zhǎng)因子，或特別是市場(chǎng)上可買到的重組生長(zhǎng)因子，或兩者結(jié)合，適當(dāng)?shù)厝芙饣驊腋∮谶m宜的、生物學(xué)可接受的液體中。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)給同種異體T-細(xì)胞氧化應(yīng)激的優(yōu)選方法包括，將細(xì)胞懸液置于醫(yī)用級(jí)的氧氣和臭氧中，例如含有臭氧作為較小成分的醫(yī)用級(jí)氧氣流沸泡經(jīng)過細(xì)胞懸液。懸浮介質(zhì)可以是任何通用的生物學(xué)可接受的媒介，它保持細(xì)胞處于有活力的狀態(tài)。臭氧氣可由本領(lǐng)域內(nèi)已知的傳統(tǒng)來源提供。氣流中適合的臭氧含量約為1.0-100μg/ml，優(yōu)選3-70μg/ml，最優(yōu)選約為5-50μg/ml。給予液體中的氣流速度為每分鐘大約0.01-2升，優(yōu)選每分鐘0.05-1.0升，最優(yōu)選每分鐘大約0.06-0.30升(STP)。
另一個(gè)給予T-細(xì)胞氧化應(yīng)激使之適合在本發(fā)明中使用的方法，是在細(xì)胞懸液中加入生物學(xué)可接受的劑量的適當(dāng)?shù)纳飳W(xué)可接受的化學(xué)氧化劑。高錳酸鹽、高碘酸鹽和過氧化物在適量使用時(shí)是適合的。為實(shí)用的原因，過氧化氫在顯示本發(fā)明方法的有效性和指導(dǎo)所用氧化劑的合適劑量中是有用的，盡管它不是本發(fā)明的首選藥物。因此，適合的氧化劑劑量是濃度從1mmol到2mmol的過氧化氫，與含10-6-10-8細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液10ml接觸20分鐘，或來自不同氧化劑的相當(dāng)?shù)难趸瘧?yīng)激。最佳的是約1mmol過氧化氫在上述懸液中約20分鐘，或計(jì)算給予細(xì)胞相應(yīng)氧化應(yīng)激程度的相當(dāng)?shù)牧硪粋€(gè)氧化劑。
要接受氧化應(yīng)激的細(xì)胞懸液的體積通常從大約0.1ml到大約1000ml，優(yōu)選大約1-500，含有隨后給予進(jìn)行同種異體-BMT病人的適合數(shù)量的T-細(xì)胞。這些數(shù)量通常與以前的方法中同種異體-BMT相關(guān)的同種異體T-細(xì)胞輸入所需的數(shù)量相當(dāng)，為本領(lǐng)域內(nèi)的工作人員所熟知。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特殊方法是，細(xì)胞懸液同時(shí)接受氧/臭氧氣泡經(jīng)過和紫外照射。這也對(duì)T-細(xì)胞特性造成適當(dāng)改變。必須注意不要采用過高劑量的氧/臭氧或UV，以免造成細(xì)胞膜破壞，或?qū)Υ罅考?xì)胞造成不可逆的損傷。
T-細(xì)胞懸液接受氧化應(yīng)激的溫度看起來不嚴(yán)格，只要它保持懸液處于液相，并且不太高以致使細(xì)胞膜破壞。溫度應(yīng)當(dāng)不高于大約45℃。
當(dāng)紫外照射與氧/臭氧氧化應(yīng)激因素一起使用時(shí)，應(yīng)當(dāng)在來自合適的UV射線源處理下，通過照射懸液而合理使用，同時(shí)液體保持在前述的溫度，并且氧/臭氧混合氣同時(shí)通過液體。紫外射線可由本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何傳統(tǒng)來源提供，例如通過一組低壓紫外燈。優(yōu)選使用標(biāo)準(zhǔn)的紫外照射UV-C源，也就是說UV燈主要在C段波長(zhǎng)發(fā)射，即短于大約280nm的波長(zhǎng)。相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)UV-A和UV-B源的紫外照射也可使用。優(yōu)選應(yīng)用的是低壓紫外燈，其產(chǎn)生的光譜中至少90％的射線波長(zhǎng)為大約254nm。與前述溫度和氧化應(yīng)激因素一起使用的這種UV射線的適合劑量，是從輸出能量為約5至約25瓦的燈獲得的，優(yōu)選地大約5-約10瓦，在所選的波長(zhǎng)下，置于盛有液體的樣本容器周圍。每個(gè)這種燈在1米距離下可提供大約每平方米40-80毫瓦的能量強(qiáng)度。圍繞著樣本容器的數(shù)個(gè)燈，在最大強(qiáng)度下工作是可方便地使用的，其在254nm處的結(jié)合輸出大約為15-40瓦，優(yōu)選地20-40瓦。在液體的入射表面，3分鐘的照射時(shí)間內(nèi)，UV能量可提供約0.25-4.5j/cm2，優(yōu)選0.9-1.8j/cm2。這種處理可提供一種根據(jù)本發(fā)明適當(dāng)修飾，準(zhǔn)備注射給病人的懸液。
液體接受應(yīng)激因素的時(shí)間可從數(shù)秒到大約60分鐘。通常在約0.5-60分鐘范圍內(nèi)。這在一定程度上依賴于選擇的UV照射強(qiáng)度、溫度和應(yīng)用于液體的氧化劑濃度和速度。一旦其他應(yīng)激因素水平被設(shè)置，對(duì)操作人員來講，進(jìn)行一些試驗(yàn)以確定最適時(shí)間和劑量可能是必要的。在大多數(shù)應(yīng)激因素條件下，優(yōu)選的時(shí)間在大約0.5-10分鐘范圍內(nèi)，最優(yōu)選的為2-5分鐘，通常在3分鐘左右。
在實(shí)施本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方法時(shí)，細(xì)胞懸液可用氧/臭氧混合氣處理，也可選擇地用美國(guó)專利4,968,483 Mueller中描述的儀器一起進(jìn)行UV照射。懸液置于一合適的、消毒的、可透射UV-輻射的容器內(nèi)，然后安裝進(jìn)儀器中。通過應(yīng)用合適的熱源，如一個(gè)紅外線燈，將液體的溫度調(diào)整到預(yù)先確定的值，如42.5±1℃，在氣流用于液體以提供氧化應(yīng)激之前，打開UV燈一段固定的時(shí)間以使UV燈的輸出得以穩(wěn)定。已知組份和控制流速的氧/臭氧混合氣以預(yù)先確定的0.5-60分鐘給予液體，如上所述，優(yōu)選地1-5分鐘，更優(yōu)選地大約3分鐘。以此方式，懸液根據(jù)本發(fā)明被適當(dāng)?shù)匦揎椬阋垣@得所期望的減輕或防止GVHD的作用。
從另一個(gè)方面，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例可被看作是通過體外應(yīng)激T-細(xì)胞在給予病人之前處理同種異體T-細(xì)胞的方法，它包括給予T-細(xì)胞諸如臭氧和臭氧/氧暴露的氧化應(yīng)激。從本發(fā)明方法中得到的經(jīng)處理的同種異體T-細(xì)胞對(duì)GVHD的形成和發(fā)展具有直接的作用。在注入宿主患者之前，根據(jù)本發(fā)明方法預(yù)先處理的供體T-細(xì)胞已被修飾，因而不再具有有害的反應(yīng)。他們產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子反應(yīng)的能力被降低了。例如它們分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2的能力，以及對(duì)標(biāo)準(zhǔn)分裂素的增殖反應(yīng)被減小了。因此他們不再對(duì)不相容的全身分布的宿主組織相容性抗原產(chǎn)生任何程度的反應(yīng)而造成炎癥。給予病人的同種異體干細(xì)胞可繼續(xù)進(jìn)行灌輸而成功的機(jī)會(huì)提高。一段時(shí)間以后，處理的T-細(xì)胞大多恢復(fù)其增殖能力和免疫反應(yīng)功能，但仍對(duì)不同的宿主組織相容性抗原相當(dāng)不反應(yīng)(耐受)。
為說明起見，本發(fā)明在下面的特殊實(shí)例中被進(jìn)一步描述。最佳實(shí)例的具體描述哺乳動(dòng)物的脾提供了一個(gè)方便、易得的細(xì)胞來源，特別是T-細(xì)胞，也包括小量的干細(xì)胞，在為實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡膭?dòng)物模型中是特別有用的。
為獲得應(yīng)用本發(fā)明方法的指征進(jìn)行的試驗(yàn)采用SCID小鼠的急性GVHD模型。來源于C57B1/6J(B6)小鼠的T-細(xì)胞被靜脈注射給接受亞致死量照射的CB-17SCID小鼠。后者先天性淋巴細(xì)胞減少，且由于其主要組織相容性位點(diǎn)(MHC)完全不一致而為供體細(xì)胞提供了強(qiáng)烈的刺激。在此模型中，宿主小鼠的平均生存時(shí)間是14天。GVHD表現(xiàn)為抑制宿主從照射中恢復(fù)造血；T-細(xì)胞膨脹而用Vβ3鏈形成其T-細(xì)胞受體復(fù)合物(TCR’s)；供體T-細(xì)胞自發(fā)分泌干擾素-γ和TNF-α；和供體T-細(xì)胞在脾紅質(zhì)中的異常分布。如果供體骨髓與T-細(xì)胞共同注射，則形成慢性GVHD。實(shí)例1來自C57B1/6J(B6)小鼠的脾細(xì)胞在α-MEM、2ME和10％小牛血清(FCS)中懸浮至密度為107/ml。FCS含有細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。細(xì)胞懸液在42.5℃接受UV-C燈253.7nm波長(zhǎng)的紫外照射，同時(shí)14-15mcg/ml臭氧/醫(yī)用級(jí)氧的混合氣沸泡通過懸液。處理進(jìn)行3分鐘。
處理后即刻，細(xì)胞僅有約10％的活力。實(shí)例2除細(xì)胞懸浮在100％FCS中以外，基本重復(fù)了實(shí)例1的試驗(yàn)。在此情況下，細(xì)胞的即刻生存是50-60％，表明FCS中存在的因子對(duì)至少部分細(xì)胞具有保護(hù)作用。實(shí)例3懸浮在100％FCS中的B6鼠脾細(xì)胞接受了UV-氧化-熱處理。在42.5℃下，細(xì)胞懸液接受253.7nm波長(zhǎng)的UV-C燈紫外照射，同時(shí)14-15mcg/ml臭氧/醫(yī)用級(jí)氧的混合氣沸泡通過懸液。處理進(jìn)行3分鐘。不同數(shù)量注射入經(jīng)亞致死量照射的CB-17 SCID小鼠內(nèi)。它們隨后的表現(xiàn)與接受同樣數(shù)量未經(jīng)處理的B6脾細(xì)胞者相比。


圖1是這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖解說明，其中每一組中動(dòng)物的生存％繪制為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)注射處理的和未處理的細(xì)胞后的天數(shù)。與未處理的細(xì)胞相對(duì)，當(dāng)使用經(jīng)處理的細(xì)胞時(shí)，在所有的劑量水平生存均有顯著的改善，顯示本發(fā)明的方法減輕GVHD的可能性。
圖2是同一實(shí)驗(yàn)中，對(duì)應(yīng)于GVHD誘導(dǎo)后天數(shù)的每個(gè)脾供體細(xì)胞數(shù)量的繪制圖。它顯示處理的供體T-細(xì)胞在宿主小鼠內(nèi)生存和數(shù)量擴(kuò)大，盡管同對(duì)照、未處理的B6 T-細(xì)胞相比程度非常有限。實(shí)例4通過注射供體細(xì)胞(處理的和未處理的)在小鼠啟動(dòng)GVHD后6天，供體T-細(xì)胞經(jīng)密度梯度離心法從SCID脾細(xì)胞中分離出來。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色根據(jù)Ferrick,D.A.等在NATURE373225,257,1995中發(fā)表的方法進(jìn)行。在注射B6脾細(xì)胞后第8天對(duì)脾細(xì)胞懸液進(jìn)行染色。在存在布雷費(fèi)的菌素-A的情況下，用植物細(xì)胞凝集素和伊屋諾霉素體外刺激后4小時(shí)，并選擇了CD4+和CD8+后進(jìn)行細(xì)胞因子生成的測(cè)定。結(jié)果用細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)并在附圖3中描述。記錄每個(gè)象限內(nèi)每種細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。附圖顯示，如實(shí)例1所描述的被應(yīng)激的T-細(xì)胞同未處理的和對(duì)照細(xì)胞相比，炎癥細(xì)胞因子干擾素-γ(INF)和組織壞死因子-α(TNF)水平顯著降低，右象限較低。實(shí)例5CD4+對(duì)CD8+T-細(xì)胞正常比例(通常為大約2∶1)的反轉(zhuǎn)已知是伴隨于GVHD的。按Ferrick,D.A.等在NATURE 373225,257,1995中發(fā)表的方法進(jìn)行的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和采用抗CD4和CD8三色抗體，測(cè)定CD4/CD8的比例。未處理的供體脾細(xì)胞在注入經(jīng)亞致死量照射的小鼠后，正常比例的反轉(zhuǎn)得到證實(shí)。對(duì)未應(yīng)激的B6和C3H供體T-細(xì)胞，在許多動(dòng)物患了GVHD的第13天，CD4/CD8的最初比例分別從1.3±0.2和2.2±0.3降低到0.33±0.05和0.9±0.1。相反，當(dāng)供體細(xì)胞用如實(shí)例1所述的應(yīng)激因素預(yù)先處理時(shí)，該比例在所有的時(shí)間仍大于1且缺少GVHD的臨床表現(xiàn)。實(shí)例6本實(shí)例單獨(dú)采用氧化應(yīng)激說明本發(fā)明的原理，該氧化應(yīng)激由一有效的化學(xué)氧化劑過氧化氫提供，并代表了許多其它的、可能生物學(xué)更適合的化學(xué)氧化劑。
人外周血單核細(xì)胞PBMCs是含約40％T-細(xì)胞的血白細(xì)胞集合液，通過與不同濃度的過氧化氫水溶液接觸20分鐘而被應(yīng)激。測(cè)定其即刻的生存和即刻植物血凝素(PHA)反應(yīng)。然后測(cè)定其24小時(shí)后的生存，隨后測(cè)定其7天后的PHA反應(yīng)(用PHA進(jìn)行致有絲分裂刺激后的氚化胸苷攝取)和細(xì)胞因子狀態(tài)。結(jié)果列于下表。
表
這些結(jié)果表明單獨(dú)接受氧化應(yīng)激的T-細(xì)胞發(fā)生增殖反應(yīng)下降和炎癥細(xì)胞生成減少，適用于本發(fā)明。
權(quán)利要求
1．一種制備同種異體細(xì)胞群的方法，所述同種異體細(xì)胞群用于給予患有通過骨髓移植術(shù)而可能治療的骨髓疾病的病人，該方法包括體外給予富含T-細(xì)胞的供體細(xì)胞群以氧化應(yīng)激，在所述的T-細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)改變的細(xì)胞因子生成狀態(tài)和減小增殖反應(yīng)。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過提供臭氧/氧氣混合氣而給與氧化應(yīng)激。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中的臭氧/氧氣混合氣是以大約每分鐘0.01-2升的速率沸泡所述的含有T-細(xì)胞的細(xì)胞群的水性懸液。
4．根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法，其中臭氧/氧氣混合氣的臭氧含量大約為1.0-100μg/ml。
5．根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中臭氧/氧氣混合氣以大約每分鐘0.05-1.0升的速率沸泡所述含有T-細(xì)胞的細(xì)胞群的水性懸液，混合氣的臭氧含量大約為3-70μg/ml。
6．根據(jù)前述的任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中給予含有T-細(xì)胞的細(xì)胞群額外的UV照射。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中含有T-細(xì)胞的細(xì)胞群同時(shí)接受氧化應(yīng)激和UV照射。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中的UV照射是UV-C。
9．根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中同時(shí)接受氧化應(yīng)激和UV照射的時(shí)間是0.5-60分鐘。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述的時(shí)間是2-5分鐘。
11．根據(jù)前述的任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中含有T-細(xì)胞的細(xì)胞群是通過白細(xì)胞分離置換法從人外周血中獲得的人白血細(xì)胞成分。
12．根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中含有T-細(xì)胞的細(xì)胞群是來自人外周血單核細(xì)胞成分。
13．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中氧化應(yīng)激是通過在所述的富含T-細(xì)胞的供體細(xì)胞群懸液中加入一種化學(xué)氧化劑而給予的。
14．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中富含T-細(xì)胞的供體細(xì)胞群是來自人血的外周血單核細(xì)胞成分。
15．一種治療哺乳類病人方法，該方法用于減輕通過骨髓移植術(shù)而可能治療的骨髓疾病，并減輕必然發(fā)生的移植物抗宿主病，包括給予病人同種異體造血干細(xì)胞和同種異體T細(xì)胞，在給予病人之前，至少一部分所述的T細(xì)胞在體外已接受氧化應(yīng)激，以誘導(dǎo)其中炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的減少和增殖反應(yīng)的減小。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述的T細(xì)胞與干細(xì)胞是分別給予的。
17．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述的T-細(xì)胞基本上由來自人外周血的外周血單核細(xì)胞組成。
18．根據(jù)權(quán)利要求15、16或17的方法，其中所述的T-細(xì)胞已通過在其中應(yīng)用氧/臭氧混合氣而受到氧化應(yīng)激。
19．根據(jù)權(quán)利要求15、16或17的方法，其中所述的T-細(xì)胞已通過在其中應(yīng)用化學(xué)氧化劑而受到氧化應(yīng)激。
20．根據(jù)權(quán)利要求18或19的方法，其中所述的T-細(xì)胞已在接受氧化應(yīng)激的同時(shí)額外地接受了紫外照射。
21．一種基本上不含干細(xì)胞的哺乳類T-細(xì)胞群，所述的T細(xì)胞已在體外接受了氧化應(yīng)激以致在所述細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子生成的減少和增殖反應(yīng)的減小。
全文摘要
哺乳動(dòng)物類患者為治療骨髓源性疾病而進(jìn)行的細(xì)胞移植治療中產(chǎn)生的移植物抗宿主病,可通過至少將同種異體細(xì)胞移植成分中的T－細(xì)胞在體外以適當(dāng)?shù)膭┝拷o予氧化應(yīng)激而得到預(yù)防和減輕,例如用臭氧和氧氣的混合氣泡通過T－細(xì)胞懸液。此方法也包括在應(yīng)用氧化應(yīng)激的同時(shí)用紫外光照射細(xì)胞。氧化應(yīng)激引起T－細(xì)胞內(nèi)炎癥因子生成減少和增殖反應(yīng)減小。
文檔編號(hào)A61K35/14GK1314939SQ99810240
公開日2001年9月26日 申請(qǐng)日期1999年7月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月30日
發(fā)明者D·E·斯潘內(nèi) 申請(qǐng)人:瓦索根愛爾蘭有限公司