專利名稱：含乙酰L－肉堿和α－硫辛酸的抗氧化劑組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防和/或治療下列病癥的組合物因環(huán)境污染而產(chǎn)生的自由基的存在而引起的組織疾?。挥纱竽X或心肌缺血之后產(chǎn)生的自由基和伴隨的再灌注引起的腦損傷或心肌損傷；中毒性或糖尿病性神經(jīng)病以及葡萄糖利用中的代謝紊亂。
因此，所述組合物可能呈食物增補(bǔ)劑或?qū)嶋H藥物的形式和起食物增補(bǔ)劑或?qū)嶋H藥物的作用，取決于載體或預(yù)防作用，或者嚴(yán)格的治療作用，這是希望所述組合物(相對(duì)于組合物將被應(yīng)用的具體個(gè)體來說)產(chǎn)生的作用。
更具體地說，本發(fā)明涉及一種可經(jīng)口、腸胃外、經(jīng)直腸或經(jīng)皮施用的組合物，它包含下列物質(zhì)的組合(a)乙酰L-肉堿或其藥物上可接受的鹽，任選與至少另一種“肉堿”組合，其中，“肉堿”是指L-肉堿或選自下組的烷?；鵏-肉堿丙酰-L-肉堿、戊酰L-肉堿、異戊酰L-肉堿或其藥物上可接受的鹽；以及(b)α-硫辛酸。
已知，系統(tǒng)性缺乏烷?；鵏-肉堿(普遍天然存在的化合物，發(fā)現(xiàn)它們的最大濃度尤其是在骨骼肌和心肌中)導(dǎo)致肌功能缺損，這可通過外源性施用這些化合物恢復(fù)到正常。
在大腦水平和外周神經(jīng)組織中確定了乙酰L-肉堿的存在(其中，它的存在是正常神經(jīng)傳導(dǎo)所必需的)。
通過下列現(xiàn)象發(fā)生了由肉堿產(chǎn)生能量線粒體內(nèi)脂肪酸的β-氧化，以及支鏈氨基酸的氧化和胰島素活性的調(diào)節(jié)。
對(duì)于肉堿的生物活性的表征來說重要的是，研究表明了它們對(duì)細(xì)胞磷脂膜以及對(duì)紅細(xì)胞的完整性和變形性的穩(wěn)定化效果。
乙酰L-肉堿尤其保護(hù)大腦組織而抗過氧化現(xiàn)象。雖然弄清了肉堿是正常生長(zhǎng)所需的，但同樣真實(shí)的是，在衰老過程中檢測(cè)到與正常相比肉堿水平的降低。
在與衰老相關(guān)的代謝過程中，經(jīng)常檢測(cè)到氧化過程的延長(zhǎng)與自由基的相關(guān)增加，它促進(jìn)糖尿病性損傷的發(fā)作。
線粒體活性的降低導(dǎo)致氧化劑的增加，細(xì)胞防御作用不再能有效地抵抗氧化劑的增加。
由有氧代謝產(chǎn)生的過氧化物、氫氧化物和單線態(tài)氧的增加可導(dǎo)致對(duì)大分子(DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì))的破壞，這是變性疾病(包括糖尿病，它通常是在衰老過程中出現(xiàn)的)發(fā)作的緣故。隨著衰老而發(fā)生的線粒體活性的降低還伴隨心磷脂(一種雙磷脂酰甘油(diphosphatyl-glycerol)衍生物)的減少，心磷脂構(gòu)成線粒體膜的結(jié)構(gòu)的一部分，并且在保持線粒體活性中(尤其在脂肪酸β-氧化過程的水平上)起重要作用。線粒體活性(包括脂肪酸β-氧化過程)可通過施用乙酰L-肉堿再活化，它還能恢復(fù)線粒體中的正常心磷脂濃度。
乙酰L-肉堿對(duì)線粒體活性的正效應(yīng)還通過它促進(jìn)生產(chǎn)ATP的糖酵解途徑的利用的能力得到了證實(shí)。特別是在神經(jīng)元水平檢測(cè)到了這些效果(其中，證實(shí)了乙酰L-肉堿能防止神經(jīng)元損傷或慢性神經(jīng)元變性)。
除了在衰老過程中體內(nèi)存在的肉堿減少之外，還檢測(cè)到生長(zhǎng)因子(GF-Ⅰ)的減少，尤其是IGF-Ⅰ(胰島素樣生長(zhǎng)因子)的減少。
IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ和松弛素是屬于胰島素原(也稱為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素)的肽。
IGFs發(fā)揮體內(nèi)穩(wěn)態(tài)作用和營(yíng)養(yǎng)作用(尤其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)水平)，這些肽在很多變性神經(jīng)病(包括糖尿病性神經(jīng)病)的臨床應(yīng)用中產(chǎn)生了有益的結(jié)果。
在衰老與肉堿和生長(zhǎng)因子(包括IGF-Ⅰ)的減少之間存在相互關(guān)系，而這些因子的水平通過外源性施用乙酰L-肉堿而恢復(fù)，這些證明人們對(duì)于肉堿的興趣[即，關(guān)于它們?cè)陬A(yù)防和治療神經(jīng)變性疾病(包括糖尿病性神經(jīng)病)中的應(yīng)用]是正確的。
已證實(shí)了α-硫辛酸對(duì)于糖代謝和胰島素活性也起重要的調(diào)節(jié)作用。α-硫辛酸廣泛分布于自然界的動(dòng)植物界中，也可能與食物一起被攝食。首先作為一些微生物的生長(zhǎng)因子被識(shí)別，然后是在牛肝中將它分離的(因?yàn)樗c許多動(dòng)物蛋白結(jié)合)。它作為自由基(尤其是那些因環(huán)境污染而產(chǎn)生的自由基)的重要清除劑。最近，證實(shí)了該化合物還適用于調(diào)節(jié)葡萄糖利用和胰島素活性，達(dá)到了構(gòu)成預(yù)防糖尿病性神經(jīng)病的重要因子的程度。
證實(shí)了，通過施用α-硫辛酸或它的對(duì)映體之一，在大腦水平和在坐骨神經(jīng)或眼晶狀體水平可控制和減小脂質(zhì)過氧化作用(它在糖尿病性神經(jīng)病中增大了)。此外，α-硫辛酸抑制高血糖活化的醛糖還原酶，所以，α-硫辛酸在糖尿病并發(fā)癥中還可能起重要的治療作用。
α-硫辛酸增強(qiáng)胰島素引起的葡萄糖的肌利用，而且在糖尿病患者中減小對(duì)于胰島素對(duì)葡萄糖的作用的抗性。與α-硫辛酸的抗氧化效果相關(guān)的還有它抗局部缺血引起的腦損傷的神經(jīng)保護(hù)能力和它在帕金森病和艾滋病中的推定的治療作用。
α-硫辛酸的抗氧化作用可能是直接的或間接的，通過恢復(fù)谷胱甘肽和抗壞血酸濃度起作用。
雖然α-硫辛酸對(duì)糖代謝的作用主要是由于它在如下方面起輔酶作用的能力即，丙酮酸和其它α-酮酸的氧化性脫碳羥基化(oxidativedecarbohydroxylation)中，以及通過乙酸酯在導(dǎo)致形成ATP的三羧酸循環(huán)的活化中；但為了解釋這種化合物在預(yù)防糖尿病性損傷中具有的多個(gè)有利的生物效果，還應(yīng)考慮α-硫辛酸發(fā)揮它的保護(hù)作用的其它途徑。
在這些效果中，尤其要考慮構(gòu)成它的能力的機(jī)制，所述能力即在還原成二氫硫辛酸后，它通過活性氧物質(zhì)(ROS)抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF-kB)的活化，于是，又抑制神經(jīng)毒性因子和細(xì)胞毒性因子的相關(guān)級(jí)聯(lián)。
因?yàn)楹芏嗯c糖尿病有關(guān)的并發(fā)癥(例如，神經(jīng)病和眼白內(nèi)障)是由ROS介導(dǎo)的，對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子活化的抑制可能構(gòu)成一種機(jī)制，通過它α-硫辛酸可能介入與糖尿病相關(guān)的疾病的預(yù)防。此外，還應(yīng)考慮到，在糖尿病患者中，α-硫辛酸的濃度低于正常值，所以，施用α-硫辛酸可能恢復(fù)這些值到正常。因此，它對(duì)于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜中的胰島素有加性效應(yīng)。
長(zhǎng)期暴露于高濃度的葡萄糖中可能導(dǎo)致葡萄糖和蛋白質(zhì)之間的非酶促反應(yīng)，并且導(dǎo)致被稱為糖基化的終產(chǎn)品(高級(jí)糖基化終產(chǎn)品=AGEs)的高度活性蛋白質(zhì)的自發(fā)形成。在這些物質(zhì)中，研究得最多的是葡萄糖和白蛋白、葡萄糖和膠原、以及葡萄糖和血紅蛋白的糖基化產(chǎn)品。AGEs在組織和細(xì)胞中引起的效果都是在神經(jīng)水平、肌水平和內(nèi)皮水平解釋大部分糖尿病性疾病中的相關(guān)因子。
AGEs實(shí)際上增強(qiáng)胞外基質(zhì)的組分的合成，增強(qiáng)內(nèi)皮的滲透性以及免疫復(fù)合物和細(xì)胞因子的形成，而且引起神經(jīng)元的和視網(wǎng)膜的局部缺血，髓磷脂積聚和髓磷脂變性。這些化合物中的一些是在糖尿病期間和衰老過程中形成的。
最近闡述了AGEs和激活NF-IKB之間的關(guān)系，例如具有α-硫辛酸抑制該反應(yīng)的能力。
因而，蛋白質(zhì)糖化和葡萄糖被高濃度的葡萄糖和自由基氧化可能是與糖尿病相關(guān)的組織異常(特別是神經(jīng)組織異常)的另一個(gè)原因。α-硫辛酸的存在還抑制或限制糖基化作用或葡萄糖氧化反應(yīng)的進(jìn)展。
還在與炎性劑接觸的胰細(xì)胞中觀察到α-硫辛酸的另一保護(hù)效果。
至于α-硫辛酸在預(yù)防和治療內(nèi)障中的作用，這可能不但是由于上述其它機(jī)制，而且由于眼內(nèi)維生素C濃度的恢復(fù)，因葡萄糖與維生素C轉(zhuǎn)運(yùn)的競(jìng)爭(zhēng)而引起的高血糖使眼內(nèi)維生素C濃度減小。
除了維生素E的缺乏和谷胱甘肽濃度的增大之外，α-硫辛酸抗神經(jīng)病發(fā)作的保護(hù)作用還通過臨床研究證實(shí)了。觀察到神經(jīng)損傷的減小還伴隨過氧化反應(yīng)產(chǎn)物的減少(由丙二酰醛(malonylaldehyde)濃度的降低檢測(cè)的)。其它多中心研究證實(shí)了它在糖尿病性神經(jīng)病的治療中的活性。
意外地發(fā)現(xiàn)了，一種包含作為其特征組分的下列物質(zhì)的組合的組合物(a)乙酰L-肉堿或其藥物上可接受的鹽；以及(b)α-硫辛酸在下列疾病的預(yù)防和/或治療中特別有效因環(huán)境污染而產(chǎn)生的自由基的存在所引起的組織損傷；由大腦或心肌缺血之后產(chǎn)生的自由基和由于再灌注引起的腦損傷或心肌損傷；中毒性或糖尿病性神經(jīng)病，以及葡萄糖利用中的代謝紊亂。
還發(fā)現(xiàn)了，有利的是，組分(a)可進(jìn)一步包含選自下組含L-肉堿的“肉堿”丙酰L-肉堿、戊酰L-肉堿和異戊酰L-肉堿或其藥物上可接受的鹽。
(a)∶(b)重量比在100∶1～1∶10范圍內(nèi)。
毒理學(xué)試驗(yàn)肉堿和α-硫辛酸因它們很有限的毒性和良好的耐受性而眾所周知。肉堿和α-硫辛酸的這些有利的毒理特性已通過將這些組分結(jié)合并以高劑量對(duì)大鼠和小鼠施用得到了證實(shí)。其實(shí)，在這些動(dòng)物中，證明了有可能經(jīng)腸胃外施用高達(dá)250mg/kg以上的乙酰L-肉堿或100mg/kgα-硫辛酸，以及250mg/kg肉堿混合物(乙酰L-肉堿、丙酰L-肉堿、異戊酰L-肉堿，彼此以1∶1的重量比混合)；經(jīng)口施用500mg/kg以上的乙酰L-肉堿，500mg/kg所述肉堿混合物和200mg/kgα-硫辛酸，但這樣處理的動(dòng)物都沒有死亡。
還通過食物在連續(xù)30天對(duì)大鼠組和小鼠組長(zhǎng)期施用200mg/kg乙酰L-肉堿或200mg/kg所述肉堿混合物和100mg/kgα-硫辛酸，結(jié)果表明良好地耐受和未檢測(cè)到中毒的跡象。在這些動(dòng)物中進(jìn)行的增重和血液化學(xué)試驗(yàn)顯示正常值，在處理結(jié)束時(shí)殺死動(dòng)物后對(duì)主要器官進(jìn)行的組織病理學(xué)的結(jié)果也一樣。
關(guān)于實(shí)驗(yàn)性大腦缺血的神經(jīng)保護(hù)活性試驗(yàn)鑒于這一事實(shí)，即，大腦缺血引起的損傷與自由基和一氧化二氮的產(chǎn)生有關(guān)，并且肉堿和α-硫辛酸這二者都提供抗自由基的毒性作用的保護(hù)作用，于是，在這些試驗(yàn)中通過下述方法阻塞大腦中動(dòng)脈(MCA)而引起大腦缺血按Scharkey描述的方法[Scharkey,Y.，自然(Nature)371～336,1994]通過在大腦中動(dòng)脈水平用定向置于梨狀腦皮層中的微型插管在三分鐘內(nèi)將內(nèi)皮縮血管肽-1(120 pmol于3nl中)注入麻醉的大鼠。引起了動(dòng)脈阻塞，可在該操作三天后通過穿心灌注多聚甲醛溶液(4％于PBS中)檢測(cè)產(chǎn)生的局部缺血。
摘除腦后，將它置于含10％蔗糖的固定劑中，在光學(xué)顯微鏡下檢查用羥甲苯基紫(cresyl violet)固定的恒冷箱切片(20nm)。在內(nèi)皮縮血管肽注射5分鐘后靜脈內(nèi)施用乙酰L-肉堿(50mg/kg)，或者肉堿混合物(50mg/kg 乙酰L-肉堿、丙酰L-肉堿和異戊酰L-肉堿彼此以1∶1的重量比混合的混合物)，或者α-硫辛酸(20mg/kg)。
按Park描述的方法(Park C.K.，神經(jīng)病學(xué)紀(jì)事(Anns.Neurol.),20～150,1989)計(jì)算梗死部位的體積。這些試驗(yàn)結(jié)果闡明了乙酰L-肉堿、肉堿混合物和α-硫辛酸都能減小局部缺血面積，但是意外地，可用這些產(chǎn)品的組合(特別用乙酰L-肉堿和α-硫辛酸的組合)獲得最大和最顯著的結(jié)果。
表1由于MCA的阻塞引起局部缺血(以mm3表示的體積)的程度(與對(duì)比動(dòng)物相比，體積減小的百分?jǐn)?shù))體積(mm3)乙酰L-肉堿 25.6±1.5α-硫辛酸34.5±2.1肉堿混合物 35.8±3.1乙酰L-肉堿+α-硫辛酸 85.3±4.4肉堿混合物+α-硫辛酸 80.5±6.1實(shí)驗(yàn)性糖尿病高血糖試驗(yàn)高血糖(不論是通過蛋白質(zhì)糖基化產(chǎn)物(AGEs)的形成還是通過代謝性低氧引起的)是導(dǎo)致糖尿病性疾病(尤其是糖尿病性神經(jīng)病)的潛在因子之一。
因此，控制血清葡萄糖是預(yù)防與糖尿病相關(guān)的疾病最重要的方法之一。在這些試驗(yàn)中，在大鼠內(nèi)誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性糖尿病，然后進(jìn)行試驗(yàn)從而確定引起的高血糖是否能通過施用乙酰L-肉堿、或者肉堿混合物、或者α-硫辛酸、或者這些產(chǎn)物的組合而降低。高血糖是通過對(duì)大鼠皮下注射四氧嘧啶(100mg/kg)引起的，而在四氧嘧啶注射七天后表現(xiàn)出高于450mg/dl的血清葡萄糖含量的那些大鼠就被認(rèn)為患高血糖。
用試驗(yàn)物質(zhì)經(jīng)口處理達(dá)三周的時(shí)間。在這段時(shí)間結(jié)束時(shí)，測(cè)定各組大鼠(高血糖的和處理的)的血清葡萄糖。
獲得的結(jié)果闡明了，單獨(dú)的肉堿和單獨(dú)的α-硫辛酸都只能稍微降低高初始血清葡萄糖值，但最顯著的結(jié)果是在施用了與α-硫辛酸摻和的肉堿后出現(xiàn)的。在該情況下，尤其是乙酰L-肉堿與α-硫辛酸的組合，存在這兩種產(chǎn)物顯著的協(xié)同作用，它們能使血清葡萄糖值降到幾乎正常。
表2在大鼠中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)性高血糖試驗(yàn)血清葡萄糖(mg/dl)處理 初始21天后對(duì)比動(dòng)物456.8±26505.5±31乙酰L-肉堿 509.5±28405.9±25肉堿混合物 490.2±32410.5±35α-硫辛酸 502.8±36360.4±30乙酰L-肉堿+α-硫辛酸489.6±40145.5±21肉堿混合物+α-硫辛酸505.5±39170.5±36乙酰L-肉堿=200mg/kg肉堿混合物=乙酰L-肉堿+丙酰-L-肉堿+異戊酰-L-肉堿，彼此以1∶1的比率混合α-硫辛酸=50mg/kg糖尿病大鼠的眼晶狀體和坐骨神經(jīng)內(nèi)山梨糖醇含量的測(cè)試由糖尿病性高血糖引起的損傷以及與之相關(guān)的眼神經(jīng)疾病或周圍神經(jīng)疾病的最常見起因之一是山梨糖醇的細(xì)胞內(nèi)積累，隨之發(fā)生滲透能力和細(xì)胞完整性的降低。
在一組大鼠中進(jìn)行了這些試驗(yàn)，其中，通過靜脈內(nèi)施用50mg/kg鏈脲佐菌素誘發(fā)糖尿病。注射一周后，測(cè)試血清葡萄糖，表現(xiàn)出高于450mg/dl的血清葡萄糖值的那些大鼠就被認(rèn)為患糖尿病。然后，這些大鼠連續(xù)八天接受腹膜內(nèi)注射乙酰L-肉堿(100mg/kg)、或者肉堿混合物(乙酰L-肉堿+丙酰L-肉堿+異戊酰L-肉堿，彼此以1∶1的重量比混合)(100mg/kg)、或者α-硫辛酸(25mg/kg)，或者單獨(dú)地或者以各種組合形式注射。
處理八天后，在適當(dāng)分離后，在進(jìn)行處理之前或之后測(cè)定糖尿病大鼠的坐骨神經(jīng)和眼晶狀體中存在的山梨糖醇濃度。在所有處理的動(dòng)物中，山梨糖醇濃度看來都降低了，但在用α-硫辛酸和肉堿的組合物處理的動(dòng)物中可檢測(cè)到最顯著的降低，在用乙酰L-肉堿和α-硫辛酸的組合物處理的組中記錄了最低值。
這些試驗(yàn)結(jié)果還顯示了α-硫辛酸和肉堿之間協(xié)同增強(qiáng)活性意外的程度。
表3糖尿病大鼠中眼晶狀體和坐骨神經(jīng)內(nèi)的山梨糖醇含量山梨糖醇(nmol/mg)處理 晶狀體 坐骨神經(jīng)對(duì)比動(dòng)物0.44±0.06 0.078±0.008糖尿病 40.2±3.91.85±0.21乙酰L-肉堿 32.7±2.51.15±0.11肉堿混合物 30.5±2.91.05±0.09α-硫辛酸 30.8±3.21.08±0.10乙酰L-肉堿+α-硫辛酸14.7±2.80.55±0.08肉堿混合物+α-硫辛酸16.4±1.90.65±0.07用IGF-Ⅰ、肉堿和α-硫辛酸處理的神經(jīng)細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)的試驗(yàn)鑒于胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-Ⅰ)在保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞功能完整性(尤其是抗毒性損傷，例如在糖尿病過程中表現(xiàn)的那些)中所起的重要作用，我們猜測(cè)是否因培養(yǎng)基中肉堿或α-硫辛酸或這些產(chǎn)品組合物的存在而促進(jìn)有利于腦細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的IGF-Ⅰ的活性。為此，按Thanguipon描述的方法[Thanguipon W.，腦研究進(jìn)展(Dev.Brain Res.),11,177,1983]分離了Wistar大鼠的腦細(xì)胞，以3×105/cm2的密度分布在板上。往培養(yǎng)基中添加胞嘧啶阿拉伯呋喃糖苷(10mM)而防止非神經(jīng)元細(xì)胞的復(fù)制。八天后，洗滌細(xì)胞，保存在培養(yǎng)基中，其中，血清被含5mM KCl濃度的BME(Basal Eagles Medium,Life Technologies,Gaithersburg,MD)置換了。將試驗(yàn)產(chǎn)品直接加到這樣制備的血清中IGF-Ⅰ相當(dāng)于25ng/ml乙酰L-肉堿(100ng/ml)或肉堿混合物(100ng/ml)或α-硫辛酸，或者單獨(dú)地或者組合地。
按Jones描述的方法[Jones K.H.，組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)雜志(J.Histoehem.Cytochem.),33,77,1985]在35mm圓片上將所述物質(zhì)加到培養(yǎng)基中與10ng/ml醋酸熒光素接觸，添加24小時(shí)后，觀察到培養(yǎng)基中細(xì)胞存活和生長(zhǎng)。用熒光顯微鏡將細(xì)胞計(jì)數(shù)。該試驗(yàn)的結(jié)果表明IGF-Ⅰ對(duì)分離的腦細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)效果因肉堿和α-硫辛酸的存在而被顯著增強(qiáng)了，但是單獨(dú)的肉堿和α-硫辛酸不引起顯著變化，而且，當(dāng)肉堿(尤其乙酰L-肉堿)和α-硫辛酸組合時(shí)，引起最大的生長(zhǎng)增強(qiáng)效果。
表4乙酰L-肉堿、肉堿混合物和α-硫辛酸增強(qiáng)IGF-Ⅰ對(duì)分離的腦細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)效果試驗(yàn)處理 細(xì)胞生長(zhǎng)(與對(duì)比動(dòng)物相比的％)IGF-Ⅰ 45±2.8乙酰L-肉堿 5±0.51肉堿混合物 9±0.91α-硫辛酸 5±0.39IGF-Ⅰ+乙酰L-肉堿 65±5.8IGF-Ⅰ+肉堿混合物 60±3.5IGF-Ⅰ+α-硫辛酸70±6.1IGF-Ⅰ+乙酰L-肉堿+α-硫辛酸 98±7.3IGF-Ⅰ+肉堿混合物+α-硫辛酸 90±6.9糖尿病大鼠中的坐骨神經(jīng)再生試驗(yàn)割斷了坐骨神經(jīng)的、誘發(fā)糖尿病的大鼠表現(xiàn)出比正常大鼠更差的再生活性。
進(jìn)行了這些試驗(yàn)以研究通過用乙酰L-肉堿、肉堿混合物或α-硫辛酸或者這些產(chǎn)品的組合物處理是否可以促進(jìn)糖尿病大鼠中坐骨神經(jīng)的再生。在這些試驗(yàn)中應(yīng)用的方法是Fernandez描述的方法[Fernandez E.,國(guó)際臨床藥理學(xué)研究雜志(Int.J.Clin.Pharmacol.Res.),10,85,1990」。
在一組大鼠中，通過皮下注射100mg/kg 四氧嘧啶誘發(fā)糖尿病(血清葡萄糖高于450mg/dl)。按這種方式與食物一起施用乙酰L-肉堿、肉堿混合物和α-硫辛酸以致日攝食量為200mg/kg乙酰L-肉堿、200mg/kg肉堿混合物(乙酰L-肉堿+丙酰L-肉堿+異戊酰L-肉堿，彼此以1∶1的重量比混合)和50mg/kgα-硫辛酸。在割斷坐骨神經(jīng)前一周和割斷后三十天施用所述化合物。
在麻醉下和暴露1cm后在坐骨孔(sciatic foramen)的水平下割斷坐骨神經(jīng)。用神經(jīng)弓上的縫線(epineural suture)標(biāo)記損傷的邊緣。割斷神經(jīng)三十天后，殺死動(dòng)物，檢查脛神經(jīng)(坐骨神經(jīng)的主要組成部分之一)的組織。通過半自動(dòng)圖象分析儀(Zeiss Videoplan Image Analyser)對(duì)長(zhǎng)度大約為4mm的脛神經(jīng)的四個(gè)截面進(jìn)行形態(tài)檢查和形態(tài)度量檢查。
計(jì)數(shù)再生的軸突數(shù)和每100nm2它們的密度，以及變性成分。這樣證明了有可能檢測(cè)糖尿病誘發(fā)的脛神經(jīng)成分的變性，通過用乙酰L-肉堿、肉堿混合物和α-硫辛酸處理修正到幾乎恢復(fù)正常值的程度。
就防止糖尿病對(duì)神經(jīng)再生的傷害來說，施用與α-硫辛酸組合的乙酰L-肉堿或肉堿混合物獲得了最明顯的結(jié)果；所以，在該試驗(yàn)中也證實(shí)了在按本發(fā)明的組合方面顯著的和意外的協(xié)同作用。
表5在糖尿病大鼠中割斷坐骨神經(jīng)后脛神經(jīng)變性成分的數(shù)量和密度處理 數(shù)量 密度(每100nm2)對(duì)比動(dòng)物 965±141 0.31±0.04乙酰L-肉堿 560±61 0.16±0.02肉堿混合物 520±55 0.14±0.02α-硫辛酸590±0.70 0.20±0.04乙酰L-肉堿+α-硫辛酸 340±0.41 0.10±0.01肉堿混合物+α-硫辛酸 360±0.55 0.11±0.02神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)試驗(yàn)外周神經(jīng)病(特別是糖尿病性神經(jīng)病)最顯著的異常之一是神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)作用(它在運(yùn)動(dòng)活性的變化中反映出來)的降低。
在這些試驗(yàn)中，我們通過用50mg/kg鏈脲佐菌素靜脈內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(平均重量為300g的大鼠)在大鼠內(nèi)誘發(fā)實(shí)驗(yàn)型糖尿病。在誘發(fā)了糖尿病的動(dòng)物(血清葡萄糖高于450mg/dl)中測(cè)定了神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)速度(NMCV)。為此，分離了坐骨神經(jīng)(2cm長(zhǎng))，將比目魚肌與腓腸肌分離，割斷它的遠(yuǎn)端腱，連到等長(zhǎng)傳感器[它記錄肌肉收縮力(MCF)]上。通過(插在離坐骨神經(jīng)10mm處并與刺激器連接的)兩個(gè)電極經(jīng)坐骨神經(jīng)刺激肌肉。
將一個(gè)雙極電極置于肌肉遠(yuǎn)端而通過示波器顯示肌電圖。
測(cè)定NMCV(以m/sec表示)，將刺激電極之間的距離除以兩位點(diǎn)中開始誘發(fā)ECG電位的等待時(shí)間的平均差異。以mm表示MCF。
表6糖尿病大鼠中的神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)試驗(yàn)(4周后)處理 NMCVMCF(m/sec) (mm)對(duì)比動(dòng)物 42.2±2.4 49.3±3.1糖尿病 34.5±2.1 34.6±2.9糖尿病+乙酰L-肉堿 38.5±1.9 40.6±3.4糖尿病+肉堿混合物 39.9±2.1 41.2±2.7糖尿病+α-硫辛酸 40.1±1.5 41.9±3.3糖尿病+乙酰L-肉堿+α-硫辛酸43.4±2.4 48.9±3.9糖尿病+肉堿混合物+α-硫辛酸42.0±3.1 47.5±4.1運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)異常試驗(yàn)在“wobbler小鼠”中進(jìn)行了這些試驗(yàn)，wobbler小鼠也就是這樣的動(dòng)物表現(xiàn)出不穩(wěn)定的搖擺步態(tài)，爪的畸形位置和運(yùn)動(dòng)速度的降低。這些異常與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和肌皮神經(jīng)纖維的進(jìn)行性萎縮有關(guān)，尤其影響前肢。按Mitsumoto提出的方法[Mitsumoto H.，神經(jīng)病學(xué)紀(jì)事，36,14,1994]進(jìn)行了試驗(yàn)。診斷后，用乙酰L-肉堿(200mg/kg)、或者用肉堿混合物(200mg/kg)、或者用α-硫辛酸(50mg/kg)、或者用這些產(chǎn)品的各種組合物連續(xù)二十天經(jīng)口處理所述wobbler小鼠。通過評(píng)估處理的動(dòng)物和對(duì)比動(dòng)物的下列行為而進(jìn)行檢查每只動(dòng)物抓住傾斜平臺(tái)邊緣的時(shí)間(抓住時(shí)間)，還有它跑10cm的距離所用的時(shí)間(奔跑時(shí)間)。
這些試驗(yàn)的結(jié)果表明用乙酰L-肉堿、肉堿混合物和α-硫辛酸處理這些動(dòng)物改善了抓住時(shí)間和奔跑時(shí)間(與對(duì)比動(dòng)物相比)，而且，施用這些產(chǎn)品的組合物(尤其通過乙酰L-肉堿和α-硫辛酸組合)獲得了最佳效果。在這些試驗(yàn)中，也存在肉堿和α-硫辛酸顯著而意外的協(xié)同增效作用。
表7奔跑時(shí)間增加百分率的測(cè)試對(duì)比動(dòng)物55±4.5乙酰L-肉堿 35±3.2肉堿混合物 38±4.1α-硫辛酸 40±3.9乙酰L-肉堿+α-硫辛酸20±1.9肉堿混合物+α-硫辛酸26±2.1表8抓住時(shí)間增加百分率的測(cè)試對(duì)比動(dòng)物 70±5.5乙酰L-肉堿 55±4.6肉堿混合物 60±3.8α-硫辛酸 50±5.9乙酰L-肉堿+α-硫辛酸 25±3.2肉堿混合物+α-硫辛酸 30±2.8順鉑誘導(dǎo)的感覺神經(jīng)元損傷試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長(zhǎng)期施用順鉑能在感覺神經(jīng)元水平引起損傷并引起顯著的本體感受知覺(propioceptive perception)異常。
在這些試驗(yàn)中，我們?cè)u(píng)估了通過連續(xù)七天施用下列物質(zhì)產(chǎn)生的對(duì)于由連續(xù)七天皮下注射10mg/kg順鉑引起的毒性的保護(hù)作用300mg/kg乙酰L-肉堿(經(jīng)口)、或者300mg/kg肉堿混合物(乙酰L-肉堿+丙酰L-肉堿+異戊酰L-肉堿，彼此以1∶1的重量比混合)、或50mg/kgα-硫辛酸、或這些產(chǎn)品的各種組合。
通過rotarod試驗(yàn)(Apfel,S.C.，神經(jīng)病學(xué)紀(jì)事，29、89,1991)評(píng)估了由順鉑在小鼠內(nèi)引起的本體感受的知覺異常。
在這些試驗(yàn)中獲得的結(jié)果闡明了雖然順鉑在順鉑處理的動(dòng)物中引起平衡時(shí)間的大為縮短(與對(duì)比動(dòng)物相比)，并且在單獨(dú)用乙酰L-肉堿或α-硫辛酸處理的動(dòng)物中引起相同數(shù)量級(jí)的縮短，但另一方面，用乙酰L-肉堿和α-硫辛酸的組合物處理的動(dòng)物組表現(xiàn)的平衡能力實(shí)際上與未經(jīng)受順鉑中毒的動(dòng)物相同。在這些試驗(yàn)中，也存在肉堿和α-硫辛酸顯著的協(xié)同增效作用。
表9由順鉑引起的神經(jīng)感覺異常的試驗(yàn)(rotarod試驗(yàn))順鉑 處理 平衡時(shí)間(秒)…對(duì)比動(dòng)物14.8±1.4順鉑…8.4±0.8順鉑 乙酰L-肉堿 9.5±0.6順鉑 肉堿混合物 8.9±0.6順鉑 α-硫辛酸9.9±0.8順鉑 乙酰L-肉堿+α-硫辛酸14.4±1.8順鉑 肉堿混合物+α-硫辛酸13.8±2.1為評(píng)估所述新組合物能發(fā)揮的活性所進(jìn)行的試驗(yàn)充分證明了本發(fā)明自身的創(chuàng)新性是正確的，尤其闡明了當(dāng)組合應(yīng)用時(shí)，它的組分能引起意外而驚人的協(xié)同作用。
基于它的組分的協(xié)同作用，本文描述的本發(fā)明的組合物適合預(yù)防引起急性或慢性神經(jīng)元損傷的中毒性損傷和代謝損傷。具體地說，它可被用于治療中毒性神經(jīng)病(特別是糖尿病性外周神經(jīng)病)。
鑒于它的抗氧化能力，在與腦、肝、心臟或其它器官和組織中自由基的釋放相關(guān)的毒性源或低氧源異常的預(yù)防或治療中也需要這種組合物。
此外，鑒于所述組合物促進(jìn)IGF-Ⅰ的作用的能力，與衰老相關(guān)的病理異常(例如神經(jīng)變性疾病)也可能從它的應(yīng)用獲得令人滿意的益處。
下文報(bào)導(dǎo)了本發(fā)明的配方的闡述性的、非限制性的實(shí)例1) 乙酰L-肉堿 mg 500α-硫辛酸 mg 502) 肉堿混合物 mg 500(乙酰L-肉堿、丙酰L-肉堿、異戊酰L-肉堿，以相同重量混合)α-硫辛酸 mg 503) 乙酰L-肉堿 mg 250α-硫辛酸 mg 254) 肉堿混合物 mg 250(乙酰L-肉堿、丙酰L-肉堿、異戊酰L-肉堿，以相同的重量混合)α-硫辛酸 mg 255) 乙酰L-肉堿 mg 1α-硫辛酸 mg 1006) 乙酰L-肉堿 mg250α-硫辛酸 mg25甲硫氨酸硒μg50甘氨酸鋅 mg10硬脂酸鎂 mg20牛磺酸 mg50維生素Emg10CoQ10 mg10β-胡蘿卜素mg10維生素Cmg30L-肉堿或烷?；鵏-肉堿的藥物上可接受的鹽指這些活性組分與不引起不希望有的毒性或副作用的酸形成的任意鹽。這些酸是藥劑學(xué)專家熟知的酸。
合適的鹽的非限制性實(shí)例如下氯化物，溴化物，碘化物，天冬氨酸鹽、酸式天冬氨酸鹽，檸檬酸鹽、酸式檸檬酸鹽，酒石酸鹽，磷酸鹽、酸式磷酸鹽，富馬酸鹽、酸式富馬酸鹽，甘油磷酸鹽，葡糖磷酸鹽，乳酸鹽，馬來酸鹽、酸式馬來酸鹽，乳清酸鹽，草酸鹽、酸式草酸鹽，硫酸鹽、酸式硫酸鹽，三氯乙酸鹽，三氟乙酸鹽和甲磺酸鹽。
國(guó)際藥理學(xué)雜志(Int.J.of Pharm.)33,(1986),201～217給出了FDA認(rèn)可的藥物上可接受的鹽一覽表；所述公開內(nèi)容并入本文作參考。
本發(fā)明的組合物還可包含維生素、輔酶、礦物質(zhì)和抗氧化劑。
制藥工業(yè)和食品工業(yè)專家將會(huì)明白用于制備顧及具體施藥途徑的組合物的合適的賦形劑。
權(quán)利要求
1．一種組合物，它包含下列物質(zhì)的組合(a)乙酰L-肉堿或其藥物上可接受的鹽；以及(b)α-硫辛酸。
2．權(quán)利要求1的組合物，其中，組分(a)進(jìn)一步包含選自下組的含L-肉堿的“肉堿”丙酰L-肉堿、戊酰L-肉堿、異戊酰L-肉堿或它們的藥物上可接受的鹽或其混合物。
3．權(quán)利要求1或2的組合物，其中，(a)∶(b)的重量比是100∶1～1∶10。
4．前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，其中L-肉堿或烷?；鵏-肉堿的藥物上可接受的鹽選自下組氯化物；溴化物；碘化物；天冬氨酸鹽，酸式天冬氨酸鹽；檸檬酸鹽，酸式檸檬酸鹽；酒石酸鹽；磷酸鹽，酸式磷酸鹽；富馬酸鹽，酸式富馬酸鹽；甘油磷酸鹽；葡糖磷酸鹽；乳酸鹽；馬來酸鹽，酸式馬來酸鹽；乳清酸鹽；酸式草酸鹽；硫酸鹽，酸式硫酸鹽；三氯乙酸鹽；三氟乙酸鹽和甲磺酸鹽。
5．前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，它進(jìn)一步包含維生素、輔酶、礦物質(zhì)和抗氧化劑。
6．可經(jīng)口施用的、呈食物增補(bǔ)劑形式的、前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物。
7．可經(jīng)口、腸胃外、經(jīng)直腸或經(jīng)皮施用的，呈藥劑形式的前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物。
8．下列用途的、權(quán)利要求6的食物增補(bǔ)劑預(yù)防由環(huán)境污染而產(chǎn)生的自由基引起的組織損傷；預(yù)防大腦或心肌缺血之后產(chǎn)生的自由基和伴隨性再灌注引起的腦損傷或心肌損傷；預(yù)防糖尿病性或中毒性神經(jīng)病以及葡萄糖利用中的代謝紊亂。
9．用于治療下列疾病的、權(quán)利要求7的藥劑由環(huán)境污染而產(chǎn)生的自由基引起的疾?。淮竽X或心肌缺血之后產(chǎn)生的自由基和伴隨性再灌注引起的腦損傷或心肌損傷；動(dòng)脈粥樣硬化損傷和組織增生過程；糖尿病性或中毒性神經(jīng)病以及葡萄糖利用中的代謝紊亂。
10．呈固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)形式的權(quán)利要求6或8的食物增補(bǔ)劑。
11．呈固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)形式的權(quán)利要求9或11的藥劑。
12．呈片劑、錠劑、丸劑、膠囊、顆?；蛱菨{劑形式的權(quán)利要求10的食物增補(bǔ)劑。
13．呈片劑、錠劑、丸劑、膠囊、顆粒、糖漿劑、小瓶或滴劑形式的權(quán)利要求11的藥劑。
全文摘要
公開了一種組合物,它包含作為特征活性組分的乙酰L－肉堿和α－硫辛酸,所述組合物可被用于預(yù)防和/或治療性處理由自由基誘發(fā)的各種變化和病理狀態(tài),它可以呈食物增補(bǔ)劑、營(yíng)養(yǎng)載體或?qū)嶋H的藥劑形式。
文檔編號(hào)A61K9/48GK1315835SQ99810437
公開日2001年10月3日 申請(qǐng)日期1999年8月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月1日
發(fā)明者C·卡瓦扎 申請(qǐng)人:希格馬托保健科學(xué)股份公司