專(zhuān)利名稱：丙型肝炎肽抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療丙型肝炎病毒(HCV)感染的化合物、組合物和方法。尤其是，本發(fā)明提供了其新的肽、其類(lèi)似物和中間體，含這類(lèi)肽的藥物組合物，以及將這些肽用于治療HCV感染的方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)是輸血后和群體傳染的全球性非A非B肝炎的主要病原物。已證實(shí)全球超過(guò)150百萬(wàn)人感染有這種病毒。有較高比例的攜帶者成為慢性感染并且大多數(shù)發(fā)展為慢性肝病，即所謂的慢性丙型肝炎。這些群體隨后有患嚴(yán)重肝病的危險(xiǎn)，例如肝硬變、肝細(xì)胞癌和晚期肝病而導(dǎo)致死亡。HCV形成病毒存留和導(dǎo)致慢性肝病高發(fā)病率的機(jī)制還沒(méi)有完全得到闡明。還不知道HCV是如何相互作用和離開(kāi)宿主免疫系統(tǒng)的。另外，細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答在防止HCV感染和疾病中的作用也還沒(méi)有得以確立。據(jù)報(bào)道免疫球蛋白已用于預(yù)防與輸血相關(guān)的病毒性肝炎。但是，疾病控制中心目前還沒(méi)有推薦用于此目的的免疫球蛋白。缺乏有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答正防礙著對(duì)疫苗和適當(dāng)?shù)暮笃谡丈漕A(yù)防方法的開(kāi)發(fā)，因此，近期把希望專(zhuān)注于抗病毒方法。
為了確定能有效治療患有慢性丙型肝炎患者的HCV感染的藥劑，已經(jīng)進(jìn)行了各種臨床研究。這些研究包括α干擾素的使用，單獨(dú)使用和與其它抗病毒劑聯(lián)合應(yīng)用。這類(lèi)研究表明大多數(shù)參與者對(duì)這些治療沒(méi)有反應(yīng)，并且發(fā)現(xiàn)其中出現(xiàn)有利反應(yīng)的參與者中，在治療結(jié)束后大部分病情復(fù)發(fā)。
直到最近，人們認(rèn)為干擾素(IFN)是唯一能得到的對(duì)慢性丙型肝炎患者產(chǎn)生實(shí)際臨床效果的療法。但是其持續(xù)反應(yīng)速度慢，且干擾素導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，降低被治療患者的生活質(zhì)量(即視網(wǎng)膜病、甲狀腺炎、急性胰腺炎、抑郁癥)。近來(lái)，已允許將干擾素和病毒唑聯(lián)合用于對(duì)單獨(dú)IFN無(wú)反應(yīng)的患者。但是，由IFN導(dǎo)致的這些副作用并沒(méi)有隨著這種聯(lián)合療法而得以緩解。
因此，要開(kāi)發(fā)有效治療HCV感染的抗病毒劑必須解決現(xiàn)有的藥物療法局限性的問(wèn)題。
HCV是Flaviviridae家族中的有包膜正鏈RNA病毒。單鏈HCV RNA基因組長(zhǎng)度約9500個(gè)核苷酸、具有單個(gè)開(kāi)放讀框(ORF)，編碼約3000個(gè)氨基酸的單個(gè)大的多蛋白。在被感染的細(xì)胞中，這種多蛋白通過(guò)細(xì)胞蛋白酶和病毒蛋白酶在多個(gè)位點(diǎn)分裂，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白。在HCV情況中，成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)是通過(guò)兩種病毒蛋白酶的作用而產(chǎn)生的。第一種蛋白酶，表征還不清楚，它是在NS2-NS3連接處分裂；第二種是包含在NS3的N末端區(qū)的絲氨酸蛋白酶(以下稱作NS3蛋白酶)，并介導(dǎo)所有隨后的NS3下游的分裂，該NS3包括順式和反式兩種，順式在NS3-NS4A分裂位點(diǎn)，反式是指剩下的NS4A-NS4B、NS4B-NS5A、NS5A-NA5B位點(diǎn)。NA4A蛋白具有多種功能，作為NS3蛋白酶的輔因子、能輔助NS3和其它病毒復(fù)制酶成分的膜定位。這種NS3蛋白與NS4復(fù)合物的形成對(duì)于這些過(guò)程似乎是需要的，增強(qiáng)了所有位點(diǎn)上的蛋白酶解的功效。這種NS3蛋白也具有核苷三磷酸酶和RNA解旋酶活性。NS5B是一種涉及HCV復(fù)制的RNA依賴性RNA聚合酶。
開(kāi)發(fā)抗病毒劑的總策略是使病毒復(fù)制所必需的病毒性編碼酶失活。為此，專(zhuān)利申請(qǐng)WO97/06804描述了作為抗HCV的核苷類(lèi)似物胞嘧啶-1,3-氧硫烷(oxathiolane)(也叫做3TC)的(-)對(duì)映異構(gòu)體。此化合物，雖然據(jù)報(bào)道它在以前的臨床抗HIV和HBV試驗(yàn)中是安全的，但臨床還需要證實(shí)該化合物具有抗HCV活性，其抗病毒的作用機(jī)制也還未見(jiàn)報(bào)道。
為找到抑制HCV的NS3蛋白酶或RNA解旋酶的化合物而進(jìn)行的認(rèn)真和艱難的嘗試已有了如下發(fā)現(xiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,633,388描述了用作抗HCV活性劑的雜環(huán)取代的羧酰胺和類(lèi)似物。這些化合物具有抗病毒的NS3蛋白的解旋酶活性，但臨床試驗(yàn)還沒(méi)有報(bào)道。
Chu等報(bào)道了(Tet.快報(bào)(1996),7229-7232)菲醌具有抗體外HCV NS3蛋白酶活性。未見(jiàn)對(duì)該化合物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的報(bào)道。
在第9界國(guó)際抗病毒研究會(huì)議上Urabandai,Fukyshima,Japan(1996)公開(kāi)的一篇論文—(抗病毒研究，30,1,1996；A23,(摘要19))報(bào)道了噻唑烷衍生物可抑制HCV蛋白酶。
數(shù)項(xiàng)研究報(bào)道了抑制其它諸如人白細(xì)胞彈性蛋白酶的絲氨酸蛋白酶的化合物。這些化合物的其中一組在WO95/33764(Hoechst Marion Roussel,1995)中有報(bào)道。公開(kāi)在該申請(qǐng)中的肽是嗎啉基羰基-苯甲?；?肽類(lèi)似物，該類(lèi)似物在結(jié)構(gòu)上不同于本發(fā)明的肽。
Vertex藥物公司的WO98/17679公開(kāi)了絲氨酸蛋白酶、尤其是丙型肝炎病毒NS3蛋白酶的抑制劑。這些抑制劑是基于NS5A/5B天然底物的肽類(lèi)似物。所有這些肽均含有C末端活性羰基功能團(tuán)作為它的基本特征。還報(bào)道了這些肽具有抗其它絲氨酸蛋白酶活性，因此它對(duì)HCV NS3蛋白酶不是特異性的。
Hoffman LaRoche也報(bào)道了屬于蛋白酶抑制劑的六肽，它可用作治療HCV感染的抗病毒劑。這些肽在C末端含有醛或硼酸。
Steink hler等和Ingallinella等發(fā)表了N末端分裂產(chǎn)物的抑制作用(生物化學(xué)(1998),37,8899-8905和8906-8914)。但是，其中的肽和肽類(lèi)似物并不包括本發(fā)明肽、也不會(huì)導(dǎo)致構(gòu)思出本發(fā)明肽。
Emory大學(xué)的WO98/46597公開(kāi)了絲氨酸蛋白酶抑制劑，尤其是丙型肝炎蛋白酶抑制劑。所有公開(kāi)的化合物與本發(fā)明肽在結(jié)構(gòu)上是不同的。
肽醫(yī)療有限公司的WO98/46630公開(kāi)了丙型肝炎NS3蛋白酶抑制劑。然而，所公開(kāi)的肽沒(méi)有一種與本發(fā)明肽相關(guān)。
日本Energy公司的JP10298151公開(kāi)了作為絲蛋白酶抑制劑、尤其是作為丙型肝炎病毒蛋白酶抑制劑的N-(2,3-二羥基苯甲?；?-取代的絲氨酸衍生物。這些化合物不包含任何與本發(fā)明肽類(lèi)似物類(lèi)似的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的一大優(yōu)點(diǎn)是提供了抑制丙型肝炎病毒的NS3蛋白酶的肽。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在于這些肽特異地抑制NS3蛋白酶，但它對(duì)其它絲氨酸蛋白酶在濃度約300μM時(shí)沒(méi)有顯著的抑制活性，例如人白細(xì)胞彈性蛋白酶(HLE)、豬胰彈性蛋白酶(PPE)、或牛胰凝乳蛋白酶、或諸如人肝組織蛋白酶B(Cat B)的半胱氨酸蛋白酶。
發(fā)明概述包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的是式(Ⅰ)化合物的外消旋物、非對(duì)映異構(gòu)體和光學(xué)異構(gòu)體，或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯 其中a為0或1；b為0或1；Y為H或C1-6烷基；B為H、式R7-C(O)-的?；苌锘蚴絉7-SO2的磺?；苌铮渲蠷7為(ⅰ)可不被取代或被羧基、C1-6鏈烷醇氧基(alkanoyloxy)或C1-6烷氧基取代的C1-10烷基；(ⅱ)可不被取代或被羧基、(C1-6烷氧基)羰基或苯基甲氧羰基取代的C3-7環(huán)烷基；(ⅲ)C6或C10芳基或C7-16芳烷基、可不被取代或被C1-6烷基、羥基、或可不被取代或被C1-6烷基取代的氨基取代；或(ⅳ)可不被取代或被C1-6烷基、羥基、可不被取代或被C1-6烷基取代的氨基、或可不被取代或被C1-6烷基取代的酰氨基取代的Het；R6，當(dāng)存在時(shí)，它是用羧基取代的C1-6烷基；R5，當(dāng)存在時(shí)，它是可被羧基取代或不取代的C1-6烷基；R4是C1-10烷基、C3-7環(huán)烷基或C4-10(烷基環(huán)烷基)；R3是C1-10烷基、C3-7環(huán)烷基或C4-10(烷基環(huán)烷基)；R2為CH2-R20、NH-R20、O-R20或S-R20，其中R20為可不被取代或被R21單、二或三取代的飽和或不飽和的C3-7環(huán)烷基或C4-10(烷基環(huán)烷基)，或R20為C6或C10芳基或C7-16芳烷基可不被取代或被R21單、二或三取代，或R20為可不被取代或被R21單、二或三取代的Het或(低級(jí)烷基)-Het，其中每個(gè)R21各自為C1-6烷基；C1-6烷氧基；可不被取代或被C1-6烷基單或二取代的氨基；磺?；?；NO2；OH；SH；鹵素；鹵代烷基；可不被取代或被C1-6烷基、C6或C10芳基、C7-16芳烷基、Het或(低級(jí)烷基)-Het單取代的酰氨基；羧基；羧(低級(jí)烷基)；C6或C10芳基，C7-16芳烷基或Het，所述的芳基、芳烷基或Het均可不被取代或被R22取代；其中R22是C1-6烷基；C1-6烷氧基；可被C1-6烷基取代或不取代的氨基；磺酰基；NO2；OH；SH；鹵素；鹵烷基；羧基；酰胺基；(低級(jí)烷基)酰胺基；R1是可被鹵素取代或不取代的C1-6烷基或C2-6鏈烯基；和W為羥基或N-取代的氨基。
包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的是一種藥物組合物，該組合物包括病毒學(xué)上有效量的抗丙型肝炎的式Ⅰ化合物、或其治療上可接受的鹽或酯，以及包括藥學(xué)上可接受的載體介質(zhì)或輔助劑。
本發(fā)明的一個(gè)重要方面是涉及一種治療哺乳動(dòng)物丙型肝炎病毒感染的方法，即給予哺乳動(dòng)物病毒學(xué)上有效量的抗丙型肝炎的式Ⅰ化合物、或其治療上可接受的鹽或酯或上述組合物。
另一重要方面是涉及一種通過(guò)將病毒暴露于丙型肝炎病毒的NS3蛋白酶而抑制丙型肝炎病毒復(fù)制的方法，即給予抑制量的式Ⅰ化合物、或其治療上可接受的鹽或酯、或上述組合物。
還有一方面是涉及一種治療哺乳動(dòng)物丙型肝炎病毒感染的方法，即給予該哺乳動(dòng)物病毒學(xué)上有效量的抗丙型肝炎的式Ⅰ化合物、或其治療上可接受的鹽或酯、和干擾素的組合物。包括上述組合和藥學(xué)上可接受的載體介質(zhì)或輔助劑的藥物組合物也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明定義除非另有說(shuō)明，本文使用了下述定義在各種情況中所提及的(R)或(S)用于表示基團(tuán)的構(gòu)型，例如式Ⅰ化合物的R4，這種表示是以該化合物而論、不是指單獨(dú)的基團(tuán)。
除了甘氨酸外，天然氨基酸包含手性碳原子。除非另有特別指明，優(yōu)選的是含L-構(gòu)型的天然氨基酸的化合物。但是，申請(qǐng)人考慮，在特殊情況時(shí)，式Ⅰ的一些氨基酸可以是D-或L-構(gòu)型、或者可以是D-和L-異構(gòu)體的混合物，包括外消旋混合物。
本文所用的標(biāo)記“P1、P2、P3等”是指從肽類(lèi)似物的C末端開(kāi)始向N末端延伸的氨基酸殘基的位置(即P1指從C末端起的位置1,P2指從C末端起的位置2，等)(見(jiàn)Berger A.和Schechter I.，倫敦皇家學(xué)會(huì)會(huì)報(bào)匯編B257,249-264(1997))。
α-氨基酸的縮寫(xiě)列在表A中。
表A
本文所用的術(shù)語(yǔ)“1-氨基環(huán)丙基-羧酸”(Acca)是指下式化合物
本文所用的術(shù)語(yǔ)“叔-丁基甘氨酸”(Tbg)是指下式化合物
與氨基酸或氨基酸衍生物相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“殘基”意指通過(guò)去除羧基的羥基和α-氨基的一個(gè)氫從相應(yīng)的α-氨基酸產(chǎn)生的基團(tuán)。例如，術(shù)語(yǔ)Gln、Ala、Gly、Ile、Arg、Asp、Phe、Ser、Leu、Cys、Asn、Sar和Tyr分別代表L-谷氨酰胺、L-丙氨酸、甘氨酸、L-異亮氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、肌氨酸和L-酪氨酸。
與氨基酸或氨基酸殘基相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“側(cè)鏈”意指與α-氨基酸的α-碳原子相連的基團(tuán)。例如，甘氨酸的R-基團(tuán)側(cè)鏈?zhǔn)菤?，?duì)丙氨酸的是甲基，纈氨酸的是異丙基。對(duì)于α-氨基酸的特異性R-基團(tuán)或側(cè)鏈，參考A.L.Lehninger的《生物化學(xué)》教科書(shū)(見(jiàn)第4章)。
本文的術(shù)語(yǔ)“鹵”意指選自溴基、氯基、氟基或碘基的鹵素基。
本文的術(shù)語(yǔ)“C1-6烷基”或“(低級(jí))烷基”，單獨(dú)或與另一個(gè)基團(tuán)結(jié)合，都是指含1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基基團(tuán)，包括甲基、乙基、丙基、丁基、己基、1-甲基乙基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1,1-二甲基乙基(例如叔丁基)。
本文的術(shù)語(yǔ)“C3-7環(huán)烷基”，單獨(dú)或與另一個(gè)基團(tuán)結(jié)合，部是指含3-7個(gè)碳原子的環(huán)烷基基團(tuán)，包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)庚基。
術(shù)語(yǔ)“不飽和的環(huán)烷基”包括，例如環(huán)己烯基 本文的術(shù)語(yǔ)“C4-10(烷基環(huán)烷基)”意指含3-7個(gè)碳原子與烷基基團(tuán)相連的環(huán)烷基基團(tuán)，被連接的基團(tuán)含1-10個(gè)碳原子；例如，環(huán)丙基甲基、環(huán)戊基乙基、環(huán)己基甲基、環(huán)己基乙基或環(huán)庚基乙基。
本文的術(shù)語(yǔ)“C2-10鏈烯基”，單獨(dú)或與另一個(gè)基團(tuán)結(jié)合，都是指如上所述的含2-10個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)，并且還含至少一個(gè)雙鍵。例如鏈烯基包括烯丙基和乙烯基。
本文的術(shù)語(yǔ)“C1-6烷?；?，單獨(dú)或與另一個(gè)基團(tuán)結(jié)合，都是指含1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈1-氧烷基基團(tuán)，包括甲?；⒁阴；?、1-氧丙基(丙?；?、2-甲基-1-氧丙基、1-氧己基，等等。
本文的術(shù)語(yǔ)“C1-6烷氧基”，單獨(dú)或與另一個(gè)基團(tuán)結(jié)合，都是指-O(C1-6烷基)基團(tuán)，其中烷基如上所述含1-6個(gè)碳原子。烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、1-甲基乙氧基、丁氧基和1,1-二甲基乙氧基。后面這一基團(tuán)通常叫做叔丁氧基。
本文的術(shù)語(yǔ)“C3-7環(huán)烷氧基”，單獨(dú)或與另一個(gè)基團(tuán)結(jié)合，都是指與一個(gè)氧原子連接的C3-7環(huán)烷基基團(tuán)，例如 本文的術(shù)語(yǔ)“C6或C10芳基”，單獨(dú)或與另一個(gè)基團(tuán)結(jié)合，都是指含6個(gè)碳原子的芳族單環(huán)基團(tuán)或含10個(gè)碳原子的芳族二環(huán)基團(tuán)。例如，芳基包括苯基、1-萘基或2-萘基。
本文的術(shù)語(yǔ)“C7-16芳烷基”，單獨(dú)或與另一個(gè)基團(tuán)結(jié)合，都是指上述與一個(gè)烷基連接的C6或C10芳基，其中烷基如上所述含1-6個(gè)碳原子。C7-16芳烷基包括例如芐基、丁基苯基和1-萘基甲基。
本文的術(shù)語(yǔ)“氨基芳烷基”，單獨(dú)或與另一個(gè)基團(tuán)結(jié)合，都是指被C7-16芳烷基取代的氨基基團(tuán)，例如，氨基芳烷基 本文的術(shù)語(yǔ)“羧基(低級(jí))烷基”，單獨(dú)或與另一個(gè)基團(tuán)結(jié)合，都是指通過(guò)上述的(低級(jí))烷基連接的羧基(COOH)，包括例如酪酸。
本文的術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)”或“Het”，單獨(dú)或與另一個(gè)基團(tuán)結(jié)合，都是指通過(guò)從含1-4個(gè)雜原子的5-、6-或7-節(jié)飽和或不飽和(包括芳族)雜環(huán)中去掉一個(gè)氫而衍生的一價(jià)基團(tuán)，其中的雜原子選自氮、氧和硫。另外，本文的“Het”意指上述與一個(gè)或多個(gè)可以是雜環(huán)或任何其它環(huán)的另外的環(huán)稠合的雜環(huán)。適合的雜環(huán)例如包括吡咯烷、四氫呋喃、噻唑烷、吡咯、噻吩、二氮雜、1H-咪唑、異噁唑、噻唑、四唑、哌啶、1,4-二噁烷、4-嗎啉、吡啶、嘧啶、噻唑[4,5-b]-吡啶、喹啉、或吲哚、或下列雜環(huán) 本文的術(shù)語(yǔ)“(低級(jí)烷基)-Het”，意指通過(guò)一種鏈或支鏈烷基連接的上述雜環(huán)基團(tuán)，其中烷基如上所述含1-6個(gè)碳原子。(低級(jí)烷基)-Het的例子包括
本文的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的酯”，單獨(dú)或與另一個(gè)基團(tuán)結(jié)合，都是指式Ⅰ化合物的酯，其中分子的任何羧基官能團(tuán)、但優(yōu)選羧基末端，被烷氧基羰基官能團(tuán)代替 其中酯的R部分選自烷基(例如甲基、乙基、正丙基、叔丁基、正丁基)；烷氧基烷基(例如甲氧基甲基)；烷氧基?；?例如乙氧基甲基)；芳烷基(例如芐基)；芳氧基烷基(例如苯氧基甲基)；芳基(例如苯基)，可用鹵素、C1-4烷基或C1-4烷氧基取代或不取代。其它適合的前藥酯可以在此引用的《前藥設(shè)計(jì)》，Bundgssrd,H.Ed.Elsevier(1985)中找到。當(dāng)這些藥學(xué)上可接受的酯注射在哺乳動(dòng)物中時(shí)它通常在體內(nèi)水解、并轉(zhuǎn)化為式Ⅰ化合物的酸形式。
關(guān)于上述酯，除非另有說(shuō)明，任何所出現(xiàn)的烷基部分優(yōu)選含1-16個(gè)碳原子，特別是1-6個(gè)碳原子。在這些酯中所出現(xiàn)的任何芳基部分優(yōu)選包含苯基。
尤其是這些酯可以是C1-16烷基酯，未取代的芐基酯或被至少一種鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、硝基或三氟甲基取代的芐基酯。
本文的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”包括那些從藥學(xué)上可接受的堿衍生的鹽。適合的堿例如包括膽堿、乙醇胺和1,2-二乙胺。Na+、K+和Ca++鹽也應(yīng)包含在本發(fā)明范圍內(nèi)(也參見(jiàn)“藥物鹽”，Birge,S.M.等，《藥物科學(xué)雜志》(1997),66,1-19，將其在此引作參考)。優(yōu)選的實(shí)施方式包含在本發(fā)明化合物范圍內(nèi)的式Ⅰ化合物是其中B優(yōu)選為R7-SO2，其中R7優(yōu)選C6或C10芳基、C7-16芳烷基或Het，它們均可被C1-6烷基取代或不取代。
或者，B優(yōu)選H或式R7C(O)-的?；苌铮渲蠷7優(yōu)選C1-6烷基；C1-6烷氧基；可被羥基取代或不取代的C3-7環(huán)烷基；可被C1-6烷基或Het取代或不取代的酰氨基；C6或C10芳基、C7-16芳烷基或Het，這些均可被C1-6烷基或羥基取代或不取代。更優(yōu)選是，B為H或R7C(O)-，其中R7更優(yōu)選C1-6烷基或雜環(huán)，例如 最優(yōu)選是B為H、乙?；?、甚至最優(yōu)選是B為乙?；?。
包含在本發(fā)明化合物范圍內(nèi)的是其中當(dāng)R6存在時(shí)、它優(yōu)選是Asp或Glu的側(cè)鏈的式Ⅰ化合物。最優(yōu)選是，當(dāng)R6存在時(shí)、它是Asp的側(cè)鏈?；蛘?，優(yōu)選a為0、而沒(méi)有R6。
包含在本發(fā)明化合物范圍內(nèi)的是其中當(dāng)R5存在時(shí)、它優(yōu)選是一種氨基酸的側(cè)鏈的式Ⅰ化合物，該氨基酸選自D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Val、L-Val、D-叔-丁基甘氨酸(Tbg)和L-Tbg。更優(yōu)選是，當(dāng)R5存在時(shí)，它是D-Asp、D-Val或D-Glu的側(cè)鏈。最優(yōu)選是，當(dāng)R5存在時(shí)，它是D-Glu的側(cè)鏈?；蛘?，優(yōu)選a為0且b為0，并且同時(shí)沒(méi)有R6和R5。
包含在本發(fā)明化合物范圍內(nèi)的是其中R4優(yōu)選是一種氨基酸的側(cè)鏈的式Ⅰ化合物，該氨基酸選自Val、環(huán)己基甘氨酸(Chg)、Tbg、Ile、或Leu。更優(yōu)選是，R4為Chg或Ile的側(cè)鏈。最優(yōu)選是，R4為Chg的側(cè)鏈。
包含在本發(fā)明化合物范圍內(nèi)的是其中Y優(yōu)選H或Me的式Ⅰ化合物。最優(yōu)選是Y為H。
包含在本發(fā)明化合物范圍內(nèi)的是其中R3優(yōu)選是一種氨基酸的側(cè)鏈的式Ⅰ化合物，該氨基酸選自Ile、Chg、Val、或Tbg。更優(yōu)選是，R3是Val、Chg或Tbg的側(cè)鏈。最優(yōu)選是，R3是Val或Tbg的側(cè)鏈。
包含在本發(fā)明化合物范圍內(nèi)的是R2優(yōu)選是S-R20或O-R20的式Ⅰ化合物，其中R20優(yōu)選C6或C10芳基、C7-16芳烷基、Het或-CH2-Het，它們均可不被取代或被R21單、二或三取代；
R21優(yōu)選C1-6烷基；C1-6烷氧基；氨基；單或二(低級(jí)烷基)氨基；可不被取代或被C1-6烷基、C6或C10芳基、C7-16芳烷基、Het或(低級(jí)烷基)-Het單取代的酰氨基；NO2；OH；鹵素；三氟甲基；羧基；C6或C10芳基，C7-16芳烷基，或Het，所述的芳基、芳烷基或Het可不被取代或被R22取代；更優(yōu)選是R21為C1-6烷基；C1-6烷氧基；氨基、二(低級(jí)烷基)氨基；(低級(jí)烷基)酰胺；C6或C10芳基，或Het，所述的芳基或Het可被R22取代或不取代。
R22優(yōu)選C1-6烷基；C1-6烷氧基；氨基；單或二(低級(jí)烷基)氨基；(低級(jí)烷基)酰胺；NO2；OH；鹵素；三氟甲基；或羧基。更優(yōu)選是R22為C1-6烷氧基；氨基；二(低級(jí)烷基)氨基；(低級(jí)烷基)酰胺；鹵素或三氟甲基。
更優(yōu)選是R2為1-萘甲氧基；2-萘甲氧基；芐氧基；1-萘氧基；2-萘氧基；或被上述R21不取代、單或二取代的喹啉氧基。最優(yōu)選是R2為1-萘甲氧基；或被上述R21不取代、單或二取代的喹啉氧基。
還有最佳優(yōu)選是R2為 更優(yōu)選是R21A為可不被取代或被C1-6烷基、C6或C10芳基、C7-16芳烷基或Het單取代的酰氨基；可不被取代或被R22取代的C6或C10芳基或Het。R21A最優(yōu)選C6或C10芳基或Het，它們均可不被取代或被R22取代。R22最優(yōu)選氨基、二(低級(jí)烷基)氨基、或(低級(jí)烷基)酰胺。R22甚至最優(yōu)選氨基、二甲基氨基或乙酰氨基。
另外R21A最優(yōu)選均未被取代的C6或C10芳基或Het。
R21B優(yōu)選C1-6烷基；C1-6烷氧基；氨基；二(低級(jí)烷基)氨基；(低級(jí)烷基)酰胺；NO2；OH；鹵素；三氟甲基或羧基。R21B更優(yōu)選是C1-6烷氧基或二(低級(jí)烷基)氨基。R21B最優(yōu)選為甲氧基。
包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的是其中R1優(yōu)選甲基、乙基、丙基、乙烯基的式Ⅰ化合物，這些基團(tuán)均可被鹵素取代或不取代。更優(yōu)選是R1為乙基、乙烯基或溴乙烯基。最優(yōu)選是R1為乙烯基。
包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的是其中W優(yōu)選羥基或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯；或(低級(jí)烷基)氨基、二(低級(jí)烷基)氨基或氨基芳烷基的式Ⅰ化合物。更優(yōu)選是W為羥基、或N(R13a)R13b，其中R13a和R13b各自為H、芳基或者可被羥基或苯基取代或不取代的C1-6烷基；或其藥學(xué)上可接受的鹽。最優(yōu)選是W為-OH、-NH-芐基或-NH-CH(Me)Ph。另外W還最優(yōu)選-OH、-NH-(S)CH(Me)-苯基。
當(dāng)W為一種酯時(shí)，所述的酯選自C1-6烷氧基、苯氧基、或芳基(C1-6烷氧基)。這些酯更優(yōu)選是甲氧基、乙氧基、苯氧基、芐氧基或PhCH(Me)-O-。
如上所述，式Ⅰ化合物的P1片段是下式的環(huán)丙基環(huán)系統(tǒng) 其中C1和C2各自代表環(huán)丙基環(huán)的位置1和2上的不對(duì)稱的碳原子。雖然在式Ⅰ化合物的其它片段上有其它可能的不對(duì)稱中心，但這兩種不對(duì)稱中心的存在意味著式Ⅰ化合物可以以非對(duì)映異構(gòu)體的外消旋混合物的形式存在。如后面實(shí)施例所例證的，可以制備該外消旋混合物、然后將其分離成單個(gè)旋光異構(gòu)體，或者通過(guò)手性合成法制備這些旋光異構(gòu)體。
因此，式Ⅰ化合物可以以一種非對(duì)映異構(gòu)體的外消旋混合物的形式存在，其中位置2上的R1與位置1上的羰基以順式定向，以下列基團(tuán)表示 或者式Ⅰ化合物可以以一種非對(duì)映異構(gòu)體的外消旋混合物的形式存在，其中位置2上的R1與位置1上的羰基以反式定向，以下列基團(tuán)表示 接下來(lái)，可以將該外消旋混合物分離成單個(gè)光學(xué)異構(gòu)體。
本發(fā)明最有趣的發(fā)現(xiàn)是有關(guān)P1片段的立體定向。該發(fā)現(xiàn)涉及位置1上的不對(duì)稱碳的構(gòu)型。一種優(yōu)選的實(shí)施方式是其中位置1上的不對(duì)稱碳具有R構(gòu)型。 更詳細(xì)地說(shuō)，當(dāng)碳1具有R構(gòu)型時(shí)，通過(guò)環(huán)丙基環(huán)的碳2上的取代基R1(如烷基或亞烷基)的位置，HCV NS3蛋白酶抑制進(jìn)一步增強(qiáng)。最優(yōu)選的化合物是一種旋光異構(gòu)體其在下式絕對(duì)構(gòu)型中具有順式定向的R1取代基和羰基 在R1為乙基的情況中，位置1和2上的不對(duì)稱碳原子具有R,R構(gòu)型。
通過(guò)舉例說(shuō)明取代基的絕對(duì)構(gòu)型對(duì)化合物的位能水平的作用，具有絕對(duì)構(gòu)型1R,2R的化合物112(表1)具有1.6M的IC50，而對(duì)應(yīng)的1S,2S異構(gòu)體(化合物113)的IC50為27.5ìM。因此，1R、2R異構(gòu)體的位能較1S,2S異構(gòu)體強(qiáng)25倍。
包含在本發(fā)明范圍中的還有下列式Ⅰ化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯，其中B為H、低級(jí)烷基-C(O)-或Het-C(O)-；R6，當(dāng)它存在時(shí)，它是Asp或Glu的側(cè)鏈；R5，當(dāng)它存在時(shí)，它是D-或L-Asp、Glu、Val或Tbg的側(cè)鏈；Y是H或甲基；R4是Val、Chg、Tbg、Ile或Leu的側(cè)鏈；R3是氫或Ile、Chg、Val或Tbg的側(cè)鏈；R2是1-萘甲氧基、2-萘甲氧基、O-Bn、 其中R22為氨基、二(低級(jí)烷基)氨基、(低級(jí)烷基)酰胺、NO2、OH、鹵、CF3或羧基；P1為下式的環(huán)丙基環(huán)系統(tǒng) 其中R1為乙基、乙烯基或溴乙烯基；和W為羥基或N(R13a)R13b，其中R13a和R13b各自為H、芳基或者可被羥基或苯基取代或不取代的C1-6烷基。
進(jìn)一步優(yōu)選的化合物組是這些式Ⅰ化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯，其中B為H、乙酰基或Het-C(O)-；R6，當(dāng)它存在時(shí)，它是Asp的側(cè)鏈；R5，當(dāng)它存在時(shí)，它是D-Asp、D-Glu、或D-Val的側(cè)鏈；Y是H；R4是Chg或Ile的側(cè)鏈；R3是Val、Chg或Tbg的側(cè)鏈；R2是1-萘甲氧基、芐氧基、4-喹啉氫基、或 P1為下式的環(huán)丙基環(huán)系統(tǒng) 其中R1為Et或-CH=CH2或-CH=CHBr；和W為羥基或-NH-(S)-CHMePh。
還進(jìn)一步優(yōu)選的化合物組是這些式Ⅰ化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯，其中B為乙酰基；R6，當(dāng)它存在時(shí)，它是Asp的側(cè)鏈；R5，當(dāng)它存在時(shí)，它是D-Glu的側(cè)鏈；Y是H；R4是Chg的側(cè)鏈；R3是Val或Tbg的側(cè)鏈；R2是 P1是 W為羥基。
最后，包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的是表1-5所列出的每個(gè)式Ⅰ化合物。
根據(jù)一種可替代的實(shí)施方式，本發(fā)明的藥物組合物還可以包括另一種抗HCV劑?？笻CV劑的例子包括α或β干擾素、病毒唑和金剛胺。
根據(jù)另一種可替代的實(shí)施方式，本發(fā)明的藥物組合物還可包括HCV蛋白酶的其它抑制劑。
還根據(jù)另一種可替代的實(shí)施方式，本發(fā)明的藥物組合物還可包括HCV存活期中的其它目標(biāo)的抑制劑，包括但不限于，例如解旋酶、聚合酶、金屬蛋白酶或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。
本發(fā)明的藥物組合物可以口服、非腸道或通過(guò)一種植入的貯主給藥。優(yōu)選口服或注射給藥。本發(fā)明的藥物組合物也可含有常規(guī)的藥學(xué)上可接受的無(wú)毒載體、輔助劑或賦形劑。在某些情況中，可以用藥學(xué)上可接受的酸、堿或緩沖液調(diào)節(jié)制劑的pH，以增強(qiáng)所配制的化合物或其傳送形式的穩(wěn)定性。本文所用的術(shù)語(yǔ)非腸道包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑液內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)和損害內(nèi)注射或輸注技術(shù)。
本藥物組合物可以是無(wú)菌的可注射制劑形式，例如，無(wú)菌的可注射含水懸浮液或油狀懸浮液?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)、使用適合的分散劑或潤(rùn)濕劑(例如吐溫80)和懸浮劑制備該懸浮液。
本發(fā)明的藥物組合物可以以任何口服可接受的劑型進(jìn)行口服給藥，它包括但不限于，膠囊、片劑以及含水懸浮液和溶液。在口服使用的片劑中，通常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。也可以有代表性地加入諸如硬脂酸鎂之類(lèi)的潤(rùn)滑劑。對(duì)于膠囊形式的口服給藥，有用的稀釋劑包括乳糖和干玉米淀粉。當(dāng)將含水懸浮液口服給藥時(shí)，可將活性成分與乳化劑和懸浮液組合使用。如需要，可以加入某些甜咪劑和/或調(diào)味劑和/或著色劑。
用于上述制劑和組合物的其它適合的賦形劑或載體可以在標(biāo)準(zhǔn)的藥物教科書(shū)中找到，例如在《藥學(xué)科學(xué)和實(shí)踐》第19版，Mack出版公司，Easton,Penn.,(1995)的“Remington的藥物科學(xué)”中。
劑量為大約0.01-100mg/kg體重/天的本文所述的蛋白酶抑制劑化合物可用于預(yù)防和治療HCV介導(dǎo)性疾病的單一療法，其劑量?jī)?yōu)選約0.5-75mg/kg體重/天。典型的是，本發(fā)明藥物組合物可以每天給藥約1-5次，或者連續(xù)輸注。這種給藥方法可用于慢性或急性治療。可與載體物質(zhì)結(jié)合而產(chǎn)生單一劑型的活性成分的用量將根據(jù)所治療的患者和給藥的特殊方式的不同而改變。典型的制劑包含約5％-約95％的活性化合物(w/w)。這種制劑優(yōu)選包含約20％-約80％活性化合物。
正如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所共知的，可能需要較上述劑量更低或更高的用量。對(duì)任何特殊患者的特定劑量和治療方案是根據(jù)各種因素而決定的，該因素包括所用的特定化合物的活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥時(shí)間、排泄速度、聯(lián)合用藥、感染的嚴(yán)重程度和過(guò)程、患者對(duì)感染的處置和主治醫(yī)生的判斷。一般而言，基本上以小于肽的最佳劑量的小劑量開(kāi)始治療。此后，按小增量增大劑量直至在該情況下達(dá)到最佳效果?？傊詈虾跣枰氖菍⒃摶衔镆阅苓_(dá)到抗病毒效果而不產(chǎn)生任何有害或造成傷害的副作用的濃度水平進(jìn)行給藥。
當(dāng)本發(fā)明組合物包括式Ⅰ化合物和一種或多種附加治療劑或預(yù)防劑的組合時(shí)，該化合物和附加劑兩者應(yīng)大約占單一治療方案中的正常給予劑量的10-100％，更優(yōu)選約10-80％。
當(dāng)將這些化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽與藥學(xué)上可接受的載體一同進(jìn)行配制時(shí)，所得到的組合物可以對(duì)諸如人的哺乳動(dòng)物體內(nèi)給藥，以抑制HCV NS3蛋白酶或者治療或預(yù)防HCV病毒感染。也可聯(lián)合使用本發(fā)明化合物與包括但不限于下列試劑達(dá)到這種治療免疫調(diào)節(jié)劑、例如α-、β-、γ-干擾素；其它抗病毒劑，例如病毒唑、金剛胺；其它HCV NS3蛋白酶抑制劑；HCV生存期的其它目標(biāo)的抑制劑，它包括但不限于解旋酶、聚合酶、金屬蛋白、或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)、或其組合。也可將附加劑與本發(fā)明化合物組合以形成單一劑型?；蛘邔⑦@些附加劑作為復(fù)合劑型的一部分單獨(dú)給哺乳動(dòng)物服用。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是提供服用式Ⅰ化合物(其中取代基如上所述)而抑制哺乳動(dòng)物的HCV NS3蛋白酶活性的方法。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，這些方法用于降低哺乳動(dòng)物的HCV NS3蛋白酶活性。如果藥物組合物僅包括本發(fā)明化合物作為活性成分，則這些方法可另外包括下列步驟給所述哺乳動(dòng)物服用選自下列的試劑免疫調(diào)節(jié)劑，抗病毒劑，HCV蛋白酶抑制劑，或HCV生存期的其它目標(biāo)的抑制劑，例如解旋酶、聚合酶、金屬蛋白、或IRES。這些附加試劑可以在本發(fā)明化合物之前、同時(shí)、或之后服用。
在一種替代的優(yōu)選實(shí)施方式中，這些方法用于抑制哺乳動(dòng)物的病毒復(fù)制。這類(lèi)方法用于治療或預(yù)防HCV疾病。如果藥物組合物僅包括本發(fā)明化合物作為活性成分，則這些方法可另外包括下列步驟給所述哺乳動(dòng)物服用選自下列的試劑免疫調(diào)節(jié)劑，抗病毒劑，HCV蛋白酶抑制劑，或HCV生存期的其它目標(biāo)的抑制劑。這些附加劑可以在本發(fā)明化合物之前、同時(shí)、或之后服用。
前面所述化合物也可用作實(shí)驗(yàn)室試劑。本發(fā)明化合物也可用于治療或預(yù)防物質(zhì)的病毒污染，因而降低與這些物質(zhì)(如血液、組織、外科儀器和覆蓋物、實(shí)驗(yàn)室儀器和覆蓋物、以及血液收集裝置和物質(zhì))接觸的實(shí)驗(yàn)室人員或醫(yī)療人員或患者感染病毒的危險(xiǎn)。
前面所述化合物也可用作研究試劑。也可將本發(fā)明化合物用作陽(yáng)性控制以驗(yàn)證基于細(xì)胞的代用品測(cè)定或者體外或體內(nèi)病毒復(fù)制測(cè)定。方法根據(jù)下列合成方案舉例說(shuō)明的方法合成本發(fā)明化合物(其中CPG為羧基保護(hù)基團(tuán)、APG為氨基保護(hù)基團(tuán))合成方案Ⅰ 簡(jiǎn)言之，P1、P2、P3、P4、和可存在或不存在的P5和P6可通過(guò)公知的肽偶聯(lián)技術(shù)連接。P1、P2、P3、P4、和可存在或不存在的P5和P6基團(tuán)可以以任何順序連接在一起，只要最終化合物與式Ⅰ的肽一致。例如，P6可與P5連接得到與P4-P3-P2-P1相連的P5-P6；或者P6與P5-P4-P3-P2連接、然后與適合的C末端保護(hù)性P1相連。
通常，通過(guò)使用上述方法、脫保護(hù)N-末端殘基的α氨基、并通過(guò)肽連接而偶聯(lián)下一個(gè)適合的N-保護(hù)性氨基酸的未保護(hù)羧基，從而使肽延長(zhǎng)。重復(fù)這種脫保護(hù)和偶聯(lián)過(guò)程直至得到所需的序列。這種偶聯(lián)可以用如方案Ⅰ所述的分段方式中的氨基酸組分來(lái)進(jìn)行，或者通過(guò)片段(兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸)的縮合，或兩種方法的結(jié)合，或通過(guò)在此引用的Merrifield，《美國(guó)化學(xué)會(huì)雜志》(1963),85,2149-2154中原來(lái)所述的方法的固相肽合成來(lái)進(jìn)行。
可以用標(biāo)準(zhǔn)的偶聯(lián)方法進(jìn)行兩個(gè)氨基酸、一個(gè)氨基酸和一個(gè)肽、或兩個(gè)肽片段之間的偶聯(lián)，這些標(biāo)準(zhǔn)的偶聯(lián)方法例如疊氮化物法、混合碳酸-羧酸酐(氯甲酸異丁酯)法、碳二亞胺(二環(huán)己基碳二亞胺、二異丙基碳二亞胺、或水溶性碳二亞胺)法、活性酯(對(duì)硝基苯基酯、N-羥基琥珀亞氨基酯)法、Woodward試劑K方法、羰基二咪唑法、磷試劑法或氧化-還原法。這些方法中有些方法(尤其是碳二亞胺法)可通過(guò)加入1-羥基苯并三唑使其增強(qiáng)。這些偶聯(lián)反應(yīng)可以在溶液(液相)或固相中進(jìn)行。
更清楚地說(shuō)，這種偶聯(lián)步驟包括在偶聯(lián)劑存在下一個(gè)反應(yīng)物的游離羧基與另一個(gè)反應(yīng)物的游離氨基的脫水偶聯(lián)、以形成連接酰胺鍵。這些偶聯(lián)劑的說(shuō)明可在有關(guān)肽化學(xué)的普通教科書(shū)中找到，例如，M.Bodanszky,“肽化學(xué)”，第二次修訂版，Springer-Verlag，柏林，德國(guó)，(1993)。適合的偶聯(lián)劑例如有N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺、N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺中的1-羥基苯并三唑或N-乙基-N’-[(3-二甲基氨基)丙基]碳二亞胺。非常實(shí)際且有用的偶聯(lián)劑是單獨(dú)形式或存在于1-羥基苯并三唑中的市售可得到的(苯并三唑-1-基氧)三-(二甲基氨基)六氟磷酸鹽。另一種非常實(shí)際且有用的偶聯(lián)劑是市售可得到的2-(1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基四氟硼酸脲。還有一個(gè)非常實(shí)際且有用的偶聯(lián)劑是市售可得到的O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基六氟磷酸脲。
偶聯(lián)反應(yīng)是在惰性溶劑中進(jìn)行的，該惰性溶劑例如二氯甲烷、乙腈或二甲基甲酰胺。加入過(guò)量的叔胺例如二異丙基乙基胺、N-甲基嗎啉或N-甲基吡咯烷以保持反應(yīng)混合物pH約為8。反應(yīng)溫度通常是在0℃-50℃的范圍內(nèi)，反應(yīng)時(shí)間通常為15分鐘至24小時(shí)。
當(dāng)使用固相合成法時(shí)，將C末端羧酸與不溶性載體(通常為聚苯乙烯)相連。這些不溶性載體包括與羧基反應(yīng)形成一種鍵的載體，這種鍵對(duì)于延長(zhǎng)情況是穩(wěn)定的、但此后易于裂解。這些載體例如有氯或溴甲基樹(shù)脂、羥甲基樹(shù)脂、和氨基甲基樹(shù)脂。這些樹(shù)脂中有許多是市售可得到的、并已經(jīng)加入了所需的C末端氨基酸?；蛘撸梢园凑誛ang,S.-S.,《美國(guó)化學(xué)會(huì)雜志》(1973),95,1328；Atherton,E.,Shepard,R.C.“固相肽合成；一種實(shí)用方法”牛津IRL出版社，(1989)；131-148中的已知方法將氨基酸加在固體載體上。除了上述以外，其它肽合成方法在Stewart和Young,“固相肽合成”，第二版，Pierce化學(xué)公司，Rockford,IL(1984)；Gross,Meienhofer,Udenfriend，編輯，“肽分析、合成、生物學(xué)”，卷1、2、3、5和9,Academic出版社，紐約，(1980-1987)；Bodansky等，“肽合成實(shí)踐”Springer-Verlag，紐約(1984)中有描述，將這些公開(kāi)出版物均為本發(fā)明參考文獻(xiàn)。
在偶聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中通常必須保護(hù)組分氨基酸的功能基團(tuán)，以避免形成不必要的鍵?？梢允褂玫谋Ｗo(hù)基團(tuán)列在Greene，“有機(jī)化學(xué)的保護(hù)性基團(tuán)”，JohnWiley和Sons，紐約(1981)和“肽分析、合成、生物學(xué)”卷3,Academic出版社，紐約，(1981)中，將這些公開(kāi)出版物均為本發(fā)明參考文獻(xiàn)。
通常將C末端殘基的α羧基保護(hù)成一種可裂解形成羧酸的酯(CPG)。可以使用的保護(hù)性基團(tuán)包括1)烷基酯，例如甲基酯、三甲基甲硅烷基乙基酯和叔丁基酯，2)芳烷基酯，例如芐基酯和取代的芐基酯，或3)可以通過(guò)弱堿處理或輕度還原方法而被裂解的酯，例如三氯乙基和苯甲酰甲基酯。
與生長(zhǎng)肽鏈偶聯(lián)的每個(gè)氨基酸的α氨基(APG)必須保護(hù)。可以使用任何本領(lǐng)域已知的保護(hù)性基團(tuán)。這些基團(tuán)例如包括1)酰基，例如甲酰基、三氟乙?；⑧彵蕉；⒑蛯?duì)甲苯磺?；?)芳族氨基甲酸酯基團(tuán)，例如芐氧基羰基(Cbz或Z)和取代的芐氧基羰基，以及9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)；3)脂族氨基甲酸酯基團(tuán)，例如叔丁氧基羰基(Boc)、乙氧基羰基、二異丙基甲氧基羰基、和烯丙氧基羰基；4)環(huán)烷基氨基甲酸酯基團(tuán)，例如環(huán)戊氧基羰基和金剛烷氧基羰基；5)烷基，例如三苯基甲基和芐基；6)三烷基甲硅烷基，例如三甲基甲硅烷基；和7)含諸如苯基硫代羰基和二硫琥珀?；幕鶊F(tuán)的巰基。優(yōu)選的α氨基保護(hù)基團(tuán)是Boc或Fmoc。適合用于肽合成保護(hù)的許多氨基酸衍生物可從市售獲得。
新近所加的氨基酸殘基的α氨基保護(hù)基團(tuán)在下一個(gè)氨基酸偶聯(lián)之前被裂解。當(dāng)使用Boc基團(tuán)時(shí)，選擇的方法是凈三氟乙酸或二氯甲烷中的三氟乙酸、或二噁烷或乙酸乙酯中的HCl。然后在偶聯(lián)之前或在偶聯(lián)的當(dāng)時(shí)用堿性溶液例如含水緩沖液、或二氯甲烷中的叔胺或乙腈或二甲基甲酰胺中和所得到的銨鹽。當(dāng)使用Fmoc基團(tuán)時(shí)，選擇的試劑是二甲基甲酰胺中的哌啶或取代的哌啶，但是也可使用任何仲胺。脫保護(hù)是在0℃-室溫(RT)的溫度下進(jìn)行的，通常是20-22℃。
具有側(cè)鏈官能度的任何氨基酸必須在肽制備過(guò)程中用任何上述基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道用于這些側(cè)鏈官能度的適合的保護(hù)基團(tuán)的選擇和使用是根據(jù)氨基酸和肽中的其它保護(hù)性基團(tuán)的存在而決定的。對(duì)這些保護(hù)性基團(tuán)的選擇的重要性在于該基團(tuán)在脫保護(hù)和α氨基的偶聯(lián)過(guò)程中必須不被去除。
例如，當(dāng)Boc用作α氨基保護(hù)性基團(tuán)，下列側(cè)鏈保護(hù)性基團(tuán)是適合的可用于保護(hù)諸如Lys和Arg的氨基酸的氨基側(cè)鏈的對(duì)甲苯磺?；?甲苯磺?；?部分；可用于保護(hù)半胱氨酸的含硫化物側(cè)鏈的乙酰氨基甲基、芐基(Bn)、或叔丁基磺?；糠郑豢捎糜诒Ｗo(hù)絲氨酸、蘇氨酸或羥基脯氨酸的含羥基側(cè)鏈的芐基(Bn)醚；以及可用于保護(hù)天門(mén)冬氨酸和谷氨酸的含羧基側(cè)鏈的芐基酯。
當(dāng)選擇Fmoc用于α-氨基保護(hù)時(shí)，通?；谑宥』谋Ｗo(hù)性基團(tuán)是可以接受的。例如，可用于賴氨酸和精氨酸的Boc，用于絲氨酸、蘇氨酸或羥基脯氨酸的叔丁基醚；和用于天門(mén)冬氨酸和谷氨酸的叔丁基酯。三苯基甲基(三苯甲基)部分可用于保護(hù)半胱氨酸的含硫化物側(cè)鏈。
當(dāng)W為酰胺(w)時(shí)，P1在與P2偶聯(lián)之前與適合的胺偶聯(lián)。對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)很容易明白這種胺化作用。
一旦完成了肽的延長(zhǎng)，則去除所有保護(hù)性基團(tuán)。當(dāng)使用液相合成時(shí)，在選擇保護(hù)性基團(tuán)所采取的無(wú)論什么方法中，應(yīng)將保護(hù)性基團(tuán)去除。這些方法對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的。
當(dāng)使用固相合成時(shí)，肽從樹(shù)脂裂解、同時(shí)伴有保護(hù)性基團(tuán)的去除。當(dāng)Boc保護(hù)方法用于合成時(shí)，用0℃的含無(wú)水HF的添加劑例如二甲硫、茴香醚、茴香硫醚或?qū)追舆M(jìn)行處理是從樹(shù)脂裂解肽的優(yōu)選方法。肽的裂解也可通過(guò)其它諸如三氟甲烷磺酸/三氟乙酸混合物的酸性試劑而實(shí)現(xiàn)。如果使用Fmoc保護(hù)方法，則用較早所述的試劑使N末端Fmoc基團(tuán)裂解。用三氟乙酸溶液和各種添加劑如茴香醚等使其它保護(hù)性基團(tuán)和肽從樹(shù)脂裂解。端基基團(tuán)B和P6、P5、P4和P3部分的合成使用市售的或本領(lǐng)域所公知的方法合成的適當(dāng)?shù)孽；然蚧酋Ｂ龋瑢⒉煌亩嘶鶊F(tuán)B引入到保護(hù)的P4、P5或P6或引入到任何肽片段。
不同的P6-P3部分可從市售獲得或者其合成是本領(lǐng)域公知的。1．P2部分的合成。1．1前體的合成A)鹵芳基甲烷衍生物的合成。
根據(jù)K.N.Campbell等，《美國(guó)化學(xué)會(huì)雜志》，(1946),68,1844所述的方法進(jìn)行鹵甲基-8-喹啉Ⅱd的制備。
合成方案Ⅱ 簡(jiǎn)言之，通過(guò)相應(yīng)的?；u化物Ⅱb與諸如氫化鋁鋰的還原劑的還原反應(yīng)將8-喹啉羧酸Ⅱa轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇Ⅱc。用適當(dāng)?shù)臍潲u酸處理醇Ⅱb得到所需的鹵衍生物Ⅱd。這種方法的一個(gè)具體實(shí)施方式
見(jiàn)實(shí)施例1A。B)芳基醇衍生物的合成根據(jù)Giardina等(《美國(guó)化學(xué)會(huì)雜志》，(1997),40,1794-1807)所述的方法制備2-苯基-4-羥基喹啉衍生物Ⅲc。
合成方案Ⅲ R22和R21B=烷基、OH、SH、鹵、NH2或NO2。
將苯甲酰基乙酰胺(Ⅲa)與適合的苯胺(Ⅲb)縮合、并用多磷酸使所得到的亞胺環(huán)化得到相應(yīng)的2-苯基-4-羥基喹啉(Ⅲc)。這種方法的一個(gè)具體實(shí)施方式
見(jiàn)實(shí)施例1B和1C。1．2．P2的合成A)4-取代的脯氨酸(其中R2通過(guò)碳原子與環(huán)相連)(立體化學(xué)如下所示)的合成 是根據(jù)J.Ezquerra等(《四面體》,(1993),38,8665-8678)和C.Pedregal等(《四面體快報(bào)》,(1994),35,2053-2056)所述的方法按方案Ⅳ所示的方法進(jìn)行合成方案Ⅳ
簡(jiǎn)言之，將Boc-焦谷氨酸保護(hù)為芐基酯。酰胺的還原反應(yīng)和酯的脫保護(hù)后，用諸如二異丙基酰胺鋰的強(qiáng)堿處理、然后加入烷化劑(Br-R20或I-R20)得到所需的化合物Ⅳe。
B)O-芳烷基化4-(R)-羥基脯氨酸的合成 當(dāng)R20為芳基、Het、芳烷基、或(低級(jí)烷基)-Het時(shí)，該合成過(guò)程根據(jù)E.M.Smith等(《醫(yī)用化學(xué)雜志》(1988),31,875-885)所述的方法進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，用諸如氫化鈉或K-tBuO的堿處理市售的Boc-4(R)-羥基脯氨酸，所得到的醇化物與鹵-R20(Br-R20,I-R20，等)反應(yīng)生成所需的化合物。這種方法的一個(gè)具體實(shí)施方式
見(jiàn)實(shí)施例2、3和4B。
C)或者，當(dāng)R20為芳基、Het時(shí)，這些化合物也可通過(guò)Mitsunobu反應(yīng)(Mitsunobu(1981)，合成，1月，1-28；Rano等(1995)；《四面體快報(bào)》36(22),3779-3792；Krchnak等，(1995)；《四面體快報(bào)》36(5),62193-6196；Richter等，(1994)；《四面體快報(bào)》快報(bào)35(27),4705-4706)來(lái)制備。簡(jiǎn)言之，即用三苯基膦和二乙基偶氮二羧酸鹽(DEAD)中的適當(dāng)?shù)姆蓟蓟蛄虼继幚鞡oc-4(S)-羥基脯氨酸甲基酯，將所得到的酯水解成酸。這種方法的具體實(shí)施方式
見(jiàn)實(shí)施例4A。
合成方案Ⅴ 或者，可在固相中進(jìn)行Mitsunobu反應(yīng)(合成方案Ⅴ)。將等分樹(shù)脂結(jié)合的化合物(Ⅴa)加入396型合成器(高級(jí)Chem Tech)的96孔分塊(block)中，再加入各種芳基醇或硫醇和適當(dāng)?shù)脑噭Ｅ囵B(yǎng)后，洗滌、干燥每一樹(shù)脂結(jié)合的產(chǎn)品(Ⅴb)，并使其從樹(shù)脂裂解。
Suzuki反應(yīng)(Miyaura等，(1981),《工業(yè)合成》11,513；Sato等，(1989),《化學(xué)快報(bào)》1405；Watanabe等，(1992),Syn快報(bào)，207；Takayuki等，(1993),《有機(jī)化學(xué)雜志》58,2201；Frenette等，(1994),Tet.快報(bào)35(49),9177-9180；Guiles等，(1996),《有機(jī)化學(xué)雜志》61,5169-5171)也可用于進(jìn)一步使芳基取代基官能化。2．P1部分(2-取代的1-氨基環(huán)丙基羧酸)的合成根據(jù)方案Ⅵ進(jìn)行合成。
合成方案Ⅵ a)簡(jiǎn)言之，即在堿條件下使二保護(hù)性丙二酸鹽Ⅵa和1,2-二鹵烷烴Ⅵb或環(huán)硫酸鹽Ⅵc(根據(jù)K.Burgess和Chun-Yen KE(合成，(1996),1463-1467的方法合成的)反應(yīng)得到二酯Ⅵd。b)進(jìn)行較少受阻酯的區(qū)域選擇性水解得到酸Ⅵe。c)將這種酸Ⅵe進(jìn)行Curtius重排得到1-氨基環(huán)丙基羧酸衍生物Ⅵf的外消旋混合物，其中R1與羧基同向。這種合成方法的具體實(shí)施方式
見(jiàn)實(shí)施例5。d,e)或者，從酸Ⅵe選擇性形成的酯與適合的鹵化物(P*Cl)或醇(P*OH)形成二酯Ⅵg，其中P*與P酯的選擇性水解是相容的。P酯的水解得到酸Ⅵh。f)Ⅵh的Curtius重排得到1-氨基環(huán)丙基羧酸衍生物Ⅵi的外消旋混合物，其中R1基團(tuán)與羧基反向。這種合成方法的具體實(shí)施方式
見(jiàn)實(shí)施例10。
另一種制備衍生物Ⅵf(當(dāng)R1為乙烯基、與羧基同向時(shí))的合成法如下所述。
合成方案Ⅶ 用堿中的1,4-二鹵丁烯Ⅶb處理市售的亞胺Ⅶa，所得的亞胺Ⅶc水解后，產(chǎn)生與羧基同向的烯丙基取代基的Ⅶd，這種方法見(jiàn)實(shí)施例11。
所有上述碳1(Ⅵe和Ⅶd)上的對(duì)映異構(gòu)混合物可通過(guò)以下方法進(jìn)行拆分1) 酶分離(實(shí)施例9和13)；2)用手性酸結(jié)晶(實(shí)施例14)；或3)化學(xué)衍生(實(shí)施例6)。
拆分后，可按實(shí)施例7所示進(jìn)行絕對(duì)立體化學(xué)的判定。
可以以同樣的方法對(duì)碳1上的對(duì)映異構(gòu)混合物進(jìn)行拆分和立體化學(xué)判定，該混合物中C2上的取代基與羧基反向(Ⅵi)。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步包括式(Ⅰ)的肽類(lèi)似物的制備方法，其中P1為取代的氨基環(huán)丙基羧酸殘基，該方法包括下列步驟將選自APG-P6-P5-P4-P3-P2、APG-P5-P4-P3-P2、APG-P4-P3-P2、APG-P3-P2和APG-P2的肽；與下式的P1中間體偶聯(lián) 其中R1為可不被取代或被鹵原子取代的C1-6烷基或C2-6鏈烯基，CPG是羧基保護(hù)基團(tuán)，APG是氨基保護(hù)基，P6-P2如上所定義。
最后，本發(fā)明還包括下式的中間體用于制備如上所述式Ⅰ化合物的應(yīng)用 其中R1為可不被取代或被鹵原子取代的C1-6烷基或C2-6鏈烯基。
實(shí)施例通過(guò)下列非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步舉例說(shuō)明。
將溫度設(shè)為攝氏溫度。除非另有說(shuō)明，溶液百分比表示重量與體積關(guān)系，溶液比例表示體積與體積關(guān)系。在Bruker 400MHz分光計(jì)上記錄核磁共振(NMR)光譜；將化學(xué)位移(a)記作部分/百萬(wàn)。根據(jù)Still的閃光色譜技術(shù)(W.C.Still等，《有機(jī)化學(xué)雜志》,(1978),43,2923)在硅膠(SiO2)上進(jìn)行閃光色譜法。
用于本實(shí)施例的縮寫(xiě)包括Bn芐基；Boc叔丁氧基羰基{Me3COC(O)｝；BSA牛血清白蛋白；CHAPS:3-[(3-氯酰氨基丙基)-二甲基銨]-1-丙烷磺酸鹽；DBU:1,8-二氮雜二環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯；CH2Cl2=DCM二氯甲烷；DEAD二乙基偶氮二羧酸鹽；DIAD二異丙基偶氮二羧酸鹽；DIPEA二異丙基乙胺；DMAP二甲基氨基吡啶；DDC:1,3-二環(huán)己基碳二亞胺；DME:1,2-二甲氧乙烷；DMF二甲基甲酰胺；DMSO二甲基亞砜；DTT二硫蘇糖醇或蘇-1,4-二巰基-2,3-丁二醇；DPPA二苯基磷?；B氮化物；EDTA乙二胺四乙酸；Et乙基；EtOH乙醇；EtOAc乙酸乙酯；Et2O二乙醚；HATU:[O-7-(氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲]；HPLC高效液相層析；MS質(zhì)譜(MALDI-TOF基質(zhì)輔助性激光解吸(disorption)電離-飛行時(shí)間，F(xiàn)AB快速原子轟擊)；LAH氫化鋁鋰；Me甲基；MeOH甲醇；MES:(2-{N-嗎啉代}乙烷-磺酸)；NaHMDS:雙(三甲基甲硅烷基)酰胺鈉；NMM:N-甲基嗎啉；NMP:N-甲基吡咯烷；Pr丙基；Succ:3-羧基丙?；?propanoyl)；PNA:4-硝基苯基氨基或?qū)ο趸桨?；TBAF叔-丁基氟化物銨；TBTU:2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基四氟硼酸脲；TCEP鹽酸三(2-羧乙基)膦；TFA三氟乙酸；THF四氫呋喃；TIS三異丙基硅烷；TLC薄層色譜法；TMSE三甲基甲硅烷基乙基；Tris/HCl鹽酸三(羥甲基)氨基甲烷。
P2結(jié)構(gòu)單元實(shí)施例1A溴甲基-8-喹啉(1A)的合成 向市售獲得的8-喹啉羧酸(2.5g,14.4mmol)中加入純亞硫酰氯化物(10ml,144mmol)中。在過(guò)量的亞硫酰氯化物在減壓下被蒸餾之前將此混合物在80℃加熱1小時(shí)。將在80℃加熱了1小時(shí)的無(wú)水乙醇(15mL)在真空濃縮之前加入所得到的呈褐色固體中。殘余物分配在EtOAc和飽和含水NaHCO3之間，并將有機(jī)相干燥(MgSO4)、過(guò)濾和濃縮得到呈褐色的油(2.8g)。將該物質(zhì)(約14.4mmol)在35分鐘內(nèi)滴加到冷卻至-60℃的LAH(0.76g,20.2mmol)/Et2O懸浮液中，反應(yīng)完成之前，將反應(yīng)混合物在1.5小時(shí)內(nèi)緩慢升溫至-35℃。在30分鐘內(nèi)緩慢加入MgSO4·10H2O然后加濕THF使該反應(yīng)停止。將混合物分配在Et2O和10％含水NaHCO3之間。并將有機(jī)相干燥(MgSO4)、過(guò)濾和濃縮得到相應(yīng)的醇呈黃色的固體(2.31g,2步80％)。將該醇(2.3g,11.44mmol)溶解在AcOH/HBr(20Ml,Aldrich的30％溶液)中并在70℃加熱2.5小時(shí)。將混合物在真空下濃縮至干燥，分配在EtOAc(100mL)和飽和含水NaHCO3之間，然后干燥(MgSO4)、過(guò)濾和濃縮得到呈褐色固體(2.54g,100％)的所需化合物(1A)。實(shí)施例1B2-苯基-4-羥基喹啉(1B)的合成 將市售可獲得的苯甲酰乙酸乙酯(6.00g,31.2mmol)于85℃(封閉管)在75mL30％的NH4OH中加熱2小時(shí)。冷卻后的固體過(guò)濾并在水中回流2小時(shí)。用CH2Cl2萃取該溶液三次。合并有機(jī)層、經(jīng)MgSO4干燥、過(guò)濾并濃縮。將黃色殘余物在硅膠上進(jìn)行閃光色譜分析、用EtOAc∶己烷(3∶7)洗脫、得到1.60g呈白色固體的相應(yīng)酰胺，得率31％。
使用Dean-Stark裝置用苯胺(143mg,1.53mmol)和甲苯(10mL)中的鹽酸苯胺(10mg,0.08mmol)回流此酰胺(250mg,1.53mmol)。濃縮該溶液得到棕色油，將這種油與多磷酸(2g)混合并在135℃加熱20分鐘。將該反應(yīng)混合物注入水中并用5M NaOH調(diào)節(jié)pH為8。用乙酸乙酯萃取該含水懸浮液兩次。有機(jī)層合并、用鹽水洗滌、經(jīng)MgSO4干燥、過(guò)濾并濃縮。將殘余物在硅膠上進(jìn)行閃光色譜分析、用乙酸乙酯中的3％MeOH洗脫、得到67mg2-苯基-4-羥基喹啉(1B)，得率20％。1H NMR(DMSO-d6)δ8.11(d,J=7Hz,1H),7.86-7.83(m,2H),7.77(d,J=8Hz,1H),7.68(dd,J=8,7Hz,1H),7.61-7.58(m,3H),7.35(dd,J=8,7Hz,1H),6.34(s,1H).實(shí)施例1C4-羥基-2-苯基-7-甲氧喹啉(1C)的合成 4-羥基-2-苯基-7-甲氧喹啉(e)將苯甲酰基乙酸乙酯(b)(100.0g,0.52mol)、間茴香胺(a)(128.1g,1.04mmol)和4N HCl/二烷(5.2mL)的甲苯(1.0L)溶液在Dean-Stark裝置中回流6.25小時(shí)。用含水10％HCl(2×300mL)、1N NaOH(2×300mL)、H2O(300mL)和鹽水(15mL)依次洗滌被冷卻的甲苯溶液。將甲苯相干燥(MgSO4)、過(guò)濾并在減壓下濃縮得到1.2∶1.0的酯c和酰胺d混合物(144.6g,45％/38％粗制得率)，它是一種深棕色油。將該粗的油加熱80分鐘至280℃、同時(shí)蒸餾所產(chǎn)生的乙醇。用CH2Cl2(200mL)研制所得到的冷卻暗色固體。過(guò)濾懸浮液、用CH2Cl2洗滌所得到的固體，得到淺褐色固體e(22.6g,由a得到17％)1H NMR(DMSO-d6)δ8.00(d,J=9.0Hz,1H),7.81-7.82(m,2H),7.57-7.59(m,3H),7.20(d,J=2.2Hz,1H),6.94(dd,J=9.0,2.2Hz,1H),6.26(s,1H),3.87(s,3H).4-氯-2-苯基-7-甲氧喹啉(1C)將e(8.31g,33.1mmol)的POCl3(90mL)懸浮液加熱回流2小時(shí)(加熱后得到的清亮溶液)。在減壓下濃縮該反應(yīng)混合物。將殘余物分配在1NNaOH(加入放熱的10N NaOH以保持高pH)和EtOAc(500mL)之間。用H2O(100mL)和鹽水(100mL)洗滌有機(jī)層、然后干燥(MgSO4)、過(guò)濾和在減壓下濃縮得到淺黃色固體1C(8.60g,96％)1H NMR(DMSO-d6)δ8.28-8.30(m,2H),8.20(s,1H),8.10(d,J=9.1Hz,1H),7.54-7.58(m,3H),7.52(d,J=2.5Hz,1H),7.38(dd,J=9.1,2.5Hz,1H),3.98(s,3H).This reaction was repeated three times and always gave 96-98％yield which is significantly higher that the 68％ yield reported in J.Med.Chem.1997,40,1794.該反應(yīng)重復(fù)三次，總是得到96-98％的得率，這明顯高于《醫(yī)用化學(xué)雜志》1997,40,1794中所報(bào)道的68％得率。實(shí)施例2Boc-4(R)-(萘-1-基甲氧基)脯氨酸(2)的合成 將市售的BoC-4(R)-羥基脯氨酸(5.00g,21.6mmol)溶解在THF(100mL)中并冷卻至0℃。在10分鐘內(nèi)分批添加氫化鈉(60％油懸浮液，1.85g,45.4mmol)，將懸浮液在室溫?cái)嚢?小時(shí)。然后，加入1-(溴甲基)萘(8.00g,36.2mmol)(如EA.Dixon等，《加拿大化學(xué)雜志》(1981),59,2629-2641所述的制備)、將混合物回流加熱18小時(shí)。將混合物注入水(300mL)中、用己烷洗滌。用10％含水HCl酸化含水層、并用乙酸乙酯提取兩次。合并有機(jī)層并用鹽水洗滌、干燥(MgSO4)、過(guò)濾并濃縮。將殘余物通過(guò)閃蒸色譜法(49∶49∶2∶己烷∶乙酸乙酯∶乙酸)純化得到為無(wú)色油的標(biāo)題化合物(4.51g,56％得率)。1H NMR(DMSO-d6)顯示存在兩種旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體δ8.05(m,1H),7.94(m,1H),7.29(d,J=14Hz,1H),7.55-7.45(m,4H),4.96(m,2H),4.26(br.s,1H),4.12(dd,J=J=8Hz,1H),3.54-3.42(m,2H),2.45-2.34(m,1H),2.07-1.98(m,1H)1.36(s,(3/9)9H),1.34(s,(6/9)9H).實(shí)施例3Boc-4(R)-(8-喹啉-甲氧基)脯氨酸(3)的合成 將無(wú)水THF(20mL)中的Boc-4(R)-羥基脯氨酸(1.96g,8.5mmol)加入THF(100mL)中的NaH(1.4g,60％油,34mmol)懸浮液中。在將實(shí)施例1A的甲基-8-喹啉(2.54g,11.44mmol)加入THF(30mL)之前攪拌該混合物30分鐘。在70℃加熱該反應(yīng)混合物(5小時(shí))后用濕THF仔細(xì)去除過(guò)量NaH。真空濃縮反應(yīng)物、并將所得到的物質(zhì)溶解在EtOAc和水中。分離堿性含水相并在用EtOAc(150mL)提取之前用10％含水HCl酸化至pH約為5。將有機(jī)相干燥(MgSO4)、過(guò)濾并濃縮得到一種棕色油。通過(guò)閃蒸色譜法(洗脫液10％MeOH/CHCl3)純化得到為淺黃色固體的所需化合物(2.73g,86％得率)。HPLC(97.5％)；1H NMR(DMSO-d6)顯示比例為6∶4的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體數(shù)δ12-11.4(bs,1H),8.92(2×d,J=4.14and4.14Hz,1H),8.38(2×d,J=8.27and8.27Hz,1H),7.91(d,J=7.94Hz,1H),7.77(d,J=7.0Hz,1H),7.63-7.54(m,2H),5.14(2×s,2H),4.32-4.29(m,1H),4.14-4.07(m,1H),3.52-3.44(m,2H),2.43-2.27(m,1H),2.13-2.04(m,1H),1.36 and 1.34(2×s,9H).實(shí)施例4ABoc-4(R)-(7-氯喹啉-4-氧)脯氨酸(4A)的制備 將市售可獲得的Boc-4(S)-羥基脯氨酸甲基酯(500mg,2.04mmol)和7-氯-4-羥基喹啉(440mg,2.45mmol)置于0℃的干THF(10mL)中。加入三苯基膦(641mg,2.95mmol)，然后緩慢加入DIAD(642mg,2.45mmol)。將混合物在室溫?cái)嚢?0小時(shí)。然后,濃縮該反應(yīng)混合物，將其溶解在乙酸乙酯中，用1N HCl提取三次。用Na2CO3堿化含水相、并用乙酸乙酯提取兩次。混合有機(jī)層、經(jīng)MgSO4干燥、過(guò)濾并濃縮得到一種黃色油。將這種油通過(guò)閃蒸色譜法純化得到498mg為白色固體的化合物4A甲基酯，58％得率。
用甲醇(4mL)中的1M含水氫氧化鈉(1.7 M1,1.7mmol)在0℃水解這種甲基酯(400mg,0.986mmol)3小時(shí)。濃縮該溶液以去除甲醇，并用1M含水HCl中和。濃縮懸浮液至干、并溶解在甲醇(20mL)中，過(guò)濾掉鹽、濃縮濾液得到387mg定量得率的所需化合物4A，為白色固體。
1H NMR(DMSO-d6)(約1∶1旋光異構(gòu)體的混合物)δ8.74(d,J=5Hz,1H),8.13-8.09(m,1H),7.99and7.98(s,1H),7.58(d,J=9Hz,1H),7,02(d,J=5Hz,1H),5.26-5.20(m,1H),4.10-4.01(m,1H),3.81-3.72(m,1H),3.59(dd,J=12,10Hz,1H),2.41-2.31(m,2H),1.34and1.31(s,9H).實(shí)施例4BBoc-4(R)-(2-苯基-7-甲氧基喹啉-4-氧)脯氨酸(4B)的合成 1-[(1,1-二甲基甲氧基)羰基]-4(R)-(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧]-L-脯氨酸(4B)將叔丁氧化鉀(8.16g,72.7mmol)在15分鐘內(nèi)分小批加入市售的、保持在25℃的DMSO(83mL)中的4(S)-羥基脯氨酸(6.73g,29.1mmol)中,共計(jì)15分鐘以上。將混合物在25℃攪拌1.5小時(shí)。將氯-2-苯基-7-甲氧基喹啉1C(8.61g,32.0mmol)分4批加入該反應(yīng)混合物中(在15分鐘內(nèi))。將該反應(yīng)混合物在25℃攪拌19小時(shí)。將所得到的懸浮液注入水(650mL)中、并用Et2O(3×150mL)洗滌混合物以去除過(guò)量的氯喹啉(后來(lái)發(fā)現(xiàn)EtOAc更有效)。用含水1N HCl(約1.5當(dāng)量、38mL，需要43.6mL)酸化含水層至pH為4-5。通過(guò)過(guò)濾回收被沉淀的白色固體。在減壓下經(jīng)P2O5干燥濕的固體得到為淺褐色固體的脯氨酸衍生物4B(12.6g,91％，含2.3％w/w DMSO)1H NMR(DMSO-d6)δ(2∶1旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的混合物)8.27(d,J=7.0Hz,2H),8.00,7.98(2d,J=9.2,-9.2Hz,1H),7.48-7.56(m,3H),7.45,7.43(2s,1H),7.39(d,J=2.5Hz,1H),7.17(dd,J=9.2,2.5Hz,1H),5.53-5.59(m,1H),4.34-4.41(m,1H),3.93(s,3H),3.76(broad s,2H),2.63-2.73(m,1H),2.32-2.43(m,1H),1.36,1.33(2s,9H).
P1結(jié)構(gòu)單元實(shí)施例5(1R,2R)/(1S,2R)1-氨基-2-乙基環(huán)丙基羧酸的混合物的合成 a)將二叔丁基丙二酸鹽(20.0g,92.47mmol)和1,2-二溴丁烷(30.0g,138.93mmol)依次加入50％NaOH水溶液(185mL H2O中含92.4g)中的芐基三乙基氯化銨(21.0g,92.19mmol)中。在室溫下用力攪拌該反應(yīng)混合物過(guò)夜，然后加入冰和水的混合物。用CH2Cl2(3x)提取粗制品，接著用水(3x)和鹽水洗滌。將有機(jī)層干燥(MgSO4)、過(guò)濾并濃縮。將殘余物通過(guò)閃蒸色譜分析(7cm，己烷中含2-4％Et2O)得到所需環(huán)丙烷衍生物5c(19.1g,70.7mmol,76％得率)。
1H NMR(CDCl3)δ1.78-1.70(m,1H),147(s,9H)1.46(s,9H),1.44-1.39(m,1H),1.26-1.64(m,3H),1.02(t,3H,J=7.6Hz).b)在0℃干醚(100 mL)中的叔丁氧化鉀(6.71g,59.79mmol,4.4當(dāng)量)懸浮液中加入水(270ìL,15.00mmol,1.1當(dāng)量)。5分鐘后，將醚(10mL)中的二酯5c(3.675g,13.59mmol)加入懸浮液中。在室溫下將反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜，然后加入冰和水的混合物并用醚(3x)洗滌。在0℃用10％檸檬酸水溶液酸化含水層、并用AcOEt(3x)提取。用水(2x)和鹽水連續(xù)洗滌混合的有機(jī)層。常規(guī)處理(Na2SO4，過(guò)濾，濃縮)后，分離出為淺黃色油的所需酸5d(1.86g,8.68mmol,64％得率)。
1H NMR(CDCl3)δ2.09-2.01(m.1H),1.98(dd,J=3.8,9.2Hz,1H),1.81-1.70(m,1H),1.66(dd,J=3.0,J=8.2Hz,1H),1.63-1.56(m,1H),1.51(s,9H),1.0(t,J=7.3Hz,3H).c)在干苯(32mL)中的酸5d(2.017g,9.414mmol)中依次加入Et3N(1.50mL,10.76mmol,1.14當(dāng)量)和DPPA(2.20mL,10.21mmol,1.08當(dāng)量)。將反應(yīng)混合物回流3.5小時(shí)，然后加入2-三甲基甲硅烷基乙醇(2.70mL,18.84mmol,2.0當(dāng)量)。使回流保持過(guò)夜，然后用Et2O稀釋反應(yīng)混合物，并依次用10％檸檬酸水溶液、水、飽和含水NaHCO3、水(2x)和鹽水連續(xù)洗滌。常規(guī)處理(MgSO4，過(guò)濾，濃縮)后，將殘余物通過(guò)閃蒸色譜(5cm,10％AcOEt-己烷)純化得到為淺黃色油的所需氨基甲酸酯5e(2.60g,7.88 mmol,84％得率)。MS(FAB)330(MH+)；1H NMR(CDCl3)δ5.1(bs,1H),4.18-4.13(m,2H),1.68-1.38(m,4H),1.45(s,9H),1.24-1.18(m,1H),1.00-0.96(m,5H),0.03(s,9H).d)在氨基甲酸酯5e(258mg,0.783mmol)中加入THF(940ìL,0.94mmol,0.8當(dāng)量)中的1.0M TBAF溶液。4.5小時(shí)后，另外加入(626ìL,0.63mmol,0.8當(dāng)量)1.0M TBAF。在室溫下將反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜，回流30分鐘，然后用AcOEt稀釋。用水(2x)和鹽水連續(xù)洗滌該溶液。常規(guī)處理(MgSO4，過(guò)濾和濃縮)后，分離出(84mg,0.453mmol,58％得率)為淺黃色液體的所需胺5f。
1H NMR(CDCl3)61.96(bs,2H),1.60-1.40(m,2H),1.47(s,9H),1.31-1.20(m,1H),1.14(dd,J=4.1,7.3Hz,1H),1.02(dd,J=4.1,9.2Hz,1H),0.94(t,J=7.3Hz,3H).實(shí)施例6叔丁基-(1R,2R)/(1S,2R)1-氨基-2-乙基環(huán)丙基羧酸鹽(來(lái)自實(shí)施例5)的化學(xué)拆分 用1M TBAF/THF(26mL)回流處理由實(shí)施例5得到的混合物5e(8.50g,25.86mmol)45分鐘。用AcOEt稀釋冷卻的反應(yīng)混合物，用水(3x)和鹽水(1x)洗滌，然后干燥(MgSO4)、過(guò)濾并蒸發(fā)得到為淺黃色油的游離胺。將該游離胺溶解在無(wú)水CH2Cl2(120mL)中，依次加入NMM(8.5mL,77.57mmol)、化合物2(實(shí)施例2)(10.08g,27.15mmol)和HATU(11.79g,31.03mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜，然后按前面所述逐步進(jìn)行。通過(guò)閃蒸色譜(洗脫液-己烷∶Et2O；25∶75)分離粗制非對(duì)映異構(gòu)體混合物得到白色泡沫(4.42g,64％理論得率)的二肽6a(較少極性洗脫斑)和為乳白色泡沫(4g,57％理論得率)的6b(較多極性洗脫斑)。此時(shí)分離出兩種異構(gòu)體，但絕對(duì)的立體化學(xué)仍是未知的。實(shí)施例7通過(guò)與已知的叔丁基(1R-氨基-2R-乙基環(huán)丙基)羧酸鹽的相互關(guān)系確定化合物6a和6b的絕對(duì)立體化學(xué) Montreal大學(xué)的A.Charette教授提供了具有所示絕對(duì)立體化學(xué)的化合物7a，它是通過(guò)X線結(jié)晶學(xué)(《美國(guó)化學(xué)會(huì)雜志》1995,117,12721)確定的。將化合物7a(13.2mg,0.046mmol)溶解在1M HCl/EtOAc(240 L)中，并攪拌約48小時(shí)。蒸發(fā)該混合物至干得到呈淺黃色膏的化合物7b，再按實(shí)施例6所述、使用CH2Cl2中的NMM(20.3ìL,0.185mmol)和HATU(21.1mg,0.056mmol)將該化合物與化合物2(18mg,0.049mmol)偶聯(lián)。通過(guò)閃蒸色譜(洗脫液-己烷Et2O；50祆0)純化該粗制物質(zhì)得到二肽7c為一種油(7.7mg,31％)。通過(guò)TLC、HPLC和NMR對(duì)比，發(fā)現(xiàn)二肽7c與實(shí)施例6所得到的較低極性化合物6a是相同的，由此確定6a的絕對(duì)立體化學(xué)為(1R,2R)。實(shí)施例8(1R,2R)/(1S,2R)1-Boc-氨基-2-乙基環(huán)丙基羧酸(8a)的制備 將實(shí)施例5的氨基甲酸酯(2.6g,7.88mmol)在TFA中于0℃攪拌40分鐘。然后濃縮該混合物，用THF(10mL)稀釋。加入NaOH水溶液(700mg,8.8mL水中含17.5mmol)、再加入(Boc)2O(2.06g,9.44mmol,1.2當(dāng)量)的THF(13mL)溶液。在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物過(guò)夜(需要時(shí)通過(guò)加入10％NaOH水溶液保持pH為8)，然后用水稀釋?zhuān)肊t2O(3X)洗滌，再在0℃用10％檸檬酸水溶液酸化。用EtOAc(3x)提取含水層，再用水(2x)和鹽水連續(xù)洗滌。常規(guī)處理(MgSO4，過(guò)濾和濃縮)后，分離出所需的Boc-保護(hù)性氨基酸(8a)(788mg,3.44mmol,44％得率)。
1H NMR(CDCl3)δ5.18(bs,1H),1.64-1.58(m,2H),1.55-1.42(m,2H),1.45(s,9H),1.32-1.25(m,1H),0.99(t,3H,J=7.3Hz).(1R,2R)/(1S,2R)1-Boc-氨基-2-乙基環(huán)丙基羧酸甲基酯(8b)的制備 將Boc衍生物8a(0.30g,1.31mmol)溶解在Et2O(10mL)中，并在0℃用剛剛制備的Et2O中的二偶氮甲烷處理，直至留下黃色稍過(guò)量的二偶氮甲烷。在室溫下攪拌20分鐘后，濃縮該反應(yīng)混合物至干得到為澄清無(wú)色油的8b(0.32g,100％)。
1H NMR(CDCl3)δ5.1(bs,1H),3.71(s,3H),1.62-1.57(m,2H),1.55(s,9H),1.53-1.43(m,1H),1.28-1.21(m,2H),0.95(t,J=7.3Hz,3H).實(shí)施例9甲基(1R,2R)/(1S,2R)Boc-1-氨基-2-乙基環(huán)丙基羧酸鹽的酶促拆分 *使用ChiralcelOD-H柱的HPLC分析**也可接受的其它酯(如Et)a)將實(shí)施例8的(1R,2R)/(1S,2R)1-Boc-氨基-2-乙基環(huán)丙基羧酸甲基酯(0.31g,1.27mmol)對(duì)映異構(gòu)體混合物溶解在丙酮(3mL)中，然后用水(7mL)稀釋?zhuān)瑫r(shí)快速攪拌。在加入阿卡酶(Alcalase)[2.4 L從Novo Nordisk工業(yè)公司提取](300mg)之前用0.05M含水NaOH將溶液pH調(diào)至7.5。培養(yǎng)過(guò)程中用NaOH穩(wěn)定pH，設(shè)立pH穩(wěn)定計(jì)以監(jiān)控NaOH溶液的加入。40小時(shí)后用EtOAc和水(含5mL飽和NaCO3)稀釋混合物，并分離該相。用10％含水HCl酸化含水相、并用EtOAc提取、干燥(MgSO4)、過(guò)濾并濃縮得到酸9a(48.5mg)。使用實(shí)施例6和7所述的相互關(guān)系確定絕對(duì)立體化學(xué)。b)用Et2O中的二偶氮甲烷處理等分酸9a，得到甲基酯，然后通過(guò)使用手性柱[ChiralcelOD-H,2.5％異丙醇/己烷，等度]的HPLC分析顯示(1S,2R)異構(gòu)體的比例為51∶1。a)將有機(jī)相干燥(MgSO4)、過(guò)濾并濃縮得到未水解酯(0.248mg)。將這種物質(zhì)再進(jìn)行上述酶方法直至pH保持穩(wěn)定(98小時(shí))。按照上述提取后，回收到0.146mg(100％)未水解酯。通過(guò)使用手性柱的HPLC分析顯示(1R,2R)異構(gòu)體的比例＞50∶1。b)用10％含水HCl酸化含水相，并用EtOAc提取、干燥(MgSO4)、過(guò)濾并濃縮得到酸類(lèi)似物(82mg)。用二偶氮甲烷處理一部分這種物質(zhì)，然后按上述通過(guò)使用手性柱的HPLC分析顯示(1S,2R)衍生物的比例為65∶1。實(shí)施例10(1R,2S)/(1S,2S)1-氨基-2-乙基環(huán)丙基羧酸的合成 從實(shí)施例5所述的酸5d起始c)向CH3CN(25mL)中的5d(1.023g,4.77mmol)中依次加入DBU(860ìL,5.75mmol,1.2當(dāng)量)和烯丙基溴化物(620ìL,7.16mmol,1.5當(dāng)量)。在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物4小時(shí)，然后濃縮。用Et2O稀釋殘余物，并依次用10％檸檬酸水溶液(2X)、水、飽和含水NaHCO3、水(2x)和鹽水洗滌。常規(guī)處理(MgSO4，過(guò)濾和濃縮)后，分離出為無(wú)色油的所需酯10a(1.106g,3.35mmol,91％得率)。MS(FAB)255(MH+)；1H NMR(CDCl3)δ5.96-5.86(m,1H),5.37-5.22(m,2H),4.70-4.65(m,1H),4.57-4.52(m,1H),1.87-1.79(m,1H),1.47(s,9H),1.45-1.40(m,1H),1.33-1.24(m,3H),1.03(t,J=7.3Hz,3H).d)將TFA(5mL)加入室溫的干CH2Cl2(5mL)中的酯10a(1.106g,4.349mmol)中。攪拌該反應(yīng)混合物1小時(shí)，然后濃縮得到10b(854mg,4.308mmol,99％得率)。MS(FAB)199(MH+)；1H NMR(CDCl3)δ5.99-5.79(m,1H),5.40-5.30(m,2H),4.71-4.62(m,2H),2.22-2.00(m,2H),1.95-1.88(m,1H),1.84-1.57(m,2H),0.98(t,J=7.3Hz,3H).e)在干苯(14.8mL)中的酸10b(853mg,4.30mmol)中依次加入Et3N(684ìL,4.91mmol,1.14當(dāng)量)和DPPA(992ìL,4.60mmol,1.07當(dāng)量)。將反應(yīng)混合物回流4.5小時(shí)，然后加入2-三甲基甲硅烷基乙醇(1.23mL,8.58mmol,2.0當(dāng)量)。使回流保持過(guò)夜，然后用Et2O稀釋反應(yīng)混合物，并依次用10％檸檬酸水溶液、水、飽和含水NaHCO3、水(2x)和鹽水連續(xù)洗滌。常規(guī)處理(MgSO4，過(guò)濾，濃縮)后，將殘余物通過(guò)閃蒸色譜(5cm,10-15％AcOEt-己烷)純化得到為淺黃色油的所需氨基甲酸酯10c(1.212g,3.866mmol,90％得率)。MS(FAB)314(MH+)；1H NMR(CDCl3)δ5.93-5.84(m,1H),5.32-5.20(m,2H),5.05(bs,1H),4.60-4.56(m,2H),4.20-4.11(m,2H),1.71-1.60(m,3H),1.39-1.22(m,1H),1.03(t,J=7.6Hz,3H),0.96-0.86(m,1H),0.04(s,9H).f)在氨基甲酸酯10c(267mg,0.810mmol)中加入THF(1.62mL,162mmol,2.0當(dāng)量)中的1.0 M TBAF溶液。在室溫下將反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜，回流30分鐘，然后用AcOEt稀釋。用水(2x)和鹽水依次洗滌該溶液。常規(guī)處理(MgSO4，過(guò)濾和濃縮)后，分離出(122mg,0.721mmol,89％得率)為淺黃色液體的所需胺10d。
1H NMR(CDCl3)δ5.94-5.86(m,1H),5.31-5.22(m,2H),4.58(d,J=5.7Hz,2H),1.75(bs,2H),1.61-1.53(m,2H),1.51-1.42(m,2H),1.00(t,J=7.3Hz,3H),0.70-0.62(m,1H).實(shí)施例11乙基-(1R,2S)/(1S,2S)-1-氨基-2-乙烯基環(huán)丙基羧酸鹽的合成 a)將市售可獲得的THF(45mL)中的亞胺11a(10.0g,37.41mmol)加到-78℃的叔丁氧化鉀(4.62g,41.17mmol,1.1當(dāng)量)的THF溶液(180mL)中。將反應(yīng)混合物升溫至0℃，并在此溫度下攪拌40分鐘。然后加入1,4-二溴丁烯11b(8.0g,37.40mmol)將混合物冷卻至-78℃，再在0℃攪拌1小時(shí)，加入叔丁氧化鉀(4.62g,41.17mmol,1.1當(dāng)量)使之冷卻回到-78℃。最后再在0℃將反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)、并濃縮得到化合物11c。b,c,d)將11c溶解在Et2O(265mL)中、并用1N HCl水溶液(106mL)處理。在室溫下3.5小時(shí)后，分離各層，用Et2O(2X)洗滌含水層，并用飽和NaHCO3水溶液使之堿化。用Et2O(3X)提取所需的胺，并用鹽水洗滌混合的有機(jī)提取物。常規(guī)處理(MgSO4、過(guò)濾并濃縮)后，用二噁烷(187mL,748mmol)中的4N HCl溶液處理殘余物。濃縮后，分離出棕色固體的鹽酸鹽11d(2.467g,12.871mmol,34％得率)。
1H NMR(CDCl3)δ9.17(bs,3H),5.75-5.66(m,1H),5.39(d,J=17.2Hz,1H),5.21(d,J=10.2 Hz,1H),4.35-4.21(m,2H),2.77-2.70(m,1H),2.05(dd,J=6.4,10.2Hz,1H),1.75(dd,J=6.4,8.3Hz,1H),1.33(t,J=7.0Hz,3H).實(shí)施例12(1R,2R)/(1S,2R)-1-Boc-氨基-2-乙烯基環(huán)丙基羧酸乙基酯的制備 乙烯基與酯順式定向?qū)Ⅺ}酸鹽Ⅱd(1.0g,5.2mmol)和(Boc)2O(1.2g,5.7mmol)溶解在THF(30mL)中，并用DMAP(0.13g,1.04mmol,0.2當(dāng)量)和二異丙基乙基胺(2.8mL,15.6mmol)處理。在用EtOAc(40mL)稀釋前攪拌該反應(yīng)化合物24小時(shí)，依次用飽和NaHCO3(含水)、5％含水HCl和飽和鹽水洗滌。將有機(jī)相干燥(MgSO4)、過(guò)濾和濃縮，通過(guò)閃蒸色譜(15％EtOAc/己烷)得到12a(0.29g,23％)。
1H NMR(CDCl3)δ5.80-5.72(m,1H),5.29-5.25(dd,J=17.2,17.2Hz,1H),5.24-5.1(bs,1H),5.10(dd,J=9.2,9.2Hz,1H),4.22-4.13(m,2H),2.15-2.04(m,1H),1.85-1.73(bs,1H),1.55-1.5(m,1H),1.49(s,9H),1.26(t,J=7.3Hz,3H).實(shí)施例13(1R-2S)/(1S,2S)1-氨基-2-乙烯基環(huán)丙基羧酸乙酯的酶促拆分
*使用Chiralcel OD-H柱的HPLC分析a)將外消旋衍生物12a(0.29g,1,14mmol)溶解在丙酮(5mL)中，再用水(10mL)稀釋。在加入Alcalase(300mg)之前用0.2N含水NaOH將pH調(diào)至7.2。為了在培養(yǎng)過(guò)程中保持pH恒定，通過(guò)pH穩(wěn)定滴定計(jì)加入NaOH溶液9天以上，直至加入了理論數(shù)量的堿。接著按實(shí)施例9所述進(jìn)行酸/堿提取，分離出未水解酯(0.15g,100％)和水解物質(zhì)(0.139g,95％)。通過(guò)使用手性柱的HPLC對(duì)未水解酯分析顯示所需化合物13c的比例為43∶1。將化合物206(其中R1為乙烯基，表2)氫化(10.8mg,0.015mmol，在含約1mL 20％Pd(OH)2的1mL EtOH中，在1個(gè)H2大氣壓下，氫化45分鐘)得到化合物214(其中R1為乙基，表2)?；衔?14的(1R,2R)立體化學(xué)排布是基于如實(shí)施例6和7所述的化學(xué)上相互關(guān)系，這表明化合物206(R1為乙烯基)具有13c(盡管1R,2S，因?yàn)镽1為乙烯基)所代表的同樣的絕對(duì)構(gòu)型。
HPLC分析的條件ChiralcelOD-H(4.6mm×25cm)，使用2.5％異丙醇/己烷流動(dòng)相的等度條件。實(shí)施例14用二苯甲?；?D-酒石酸結(jié)晶對(duì)(1R-2S)/(1S,2S)1-氨基-2-乙烯基環(huán)丙基羧酸鹽進(jìn)行拆分 將二苯甲?；?D-酒石酸(33.5g,93.5mmol)加到EtOAc(800mL)中的粗制外消旋(1S,2S和1R,2S)1-氨基-2-乙烯基環(huán)丙基羧酸乙酯[按實(shí)施例13所述從N-(二苯基亞甲基)甘氨酸乙基乙酯(25.0g,93.5mmol)獲得]溶液中。將混合物加熱回流，在室溫下放置15分鐘，然后冷卻至0℃。30分鐘后得到白色固體。過(guò)濾該固體，用EtOAc(100mL)洗滌并風(fēng)干。將固體懸浮在丙酮(70mL)中，超聲(sonicated)并過(guò)濾(3x)。在熱丙酮中將該固體再結(jié)晶兩次(A批)。濃縮母液、在熱丙酮中將該殘余物再結(jié)晶三次(B批)。混合(5.53g)二苯甲?；?D-酒石酸鹽的兩批無(wú)水白色固體，并將其懸浮在Et2O(250mL)和飽和NaHCO3溶液(150mL)的混合物中。用鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(MgSO4)并過(guò)濾。用1N HCl/Et2O(100mL)稀釋濾液，并在減壓下濃縮。用CCl4蒸發(fā)油性殘余物得到為白色吸濕性固體的鹽酸1(R)-氨基-2(R)-乙烯基環(huán)丙烷羧酸乙酯(940mg,11％得率)，其絕對(duì)立體化學(xué)根據(jù)與實(shí)施例13的化合物13c的相互關(guān)系進(jìn)行排布。[α]25D+39.5℃(c1.14MeOH)；[a]25365+88.5℃(c1.14MeOH)；1H NMR(DMSO-d6)δ9.07(broad s,2H),5.64(ddd,J=17.2,10.4,8.7Hz,1H),5.36(dd,J=17.2,1.6Hz,1H),5.19(dd,J=10.4,1.6Hz,1H),4.24-4.16(m,2H),2.51-2.45(m,peaks hinderedby DMSO,1H),1.84(dd,J=10.0,6.0Hz,1H),1.64(dd,J=8.3,6.0Hz,1H),1.23(t,J=7.1Hz,3H)；MS(ESl)m/z156(MH)+；通過(guò)Boc衍生物的HPLC分析(CHIRALPAK AS嚨-Hex:I-PrOH)確定對(duì)映體的純度約為91％ee。(實(shí)施例13)P4-P2結(jié)構(gòu)單元實(shí)施例15Ac-Chg-Chg-Pro-(4(R)-萘-1-基甲氧基)-OH(15g)片段的合成 將化合物15a(與實(shí)施例2的化合物2相同)(4.45g,11.98mmol)溶解在無(wú)水CH3CN(60mL)中，依次加入DBU(2.2mL,14.38mmol)和烯丙基溴化物(1.1mL,13.18mmol)并在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物24小時(shí)。濃縮該混合物，用EtOAc和水稀釋所得到的油，并用水(2x)和鹽水(1x)連續(xù)洗滌。將EtOAc層干燥(MgSO4)、過(guò)濾并蒸發(fā)至干。通過(guò)閃蒸色譜(洗脫液∶己烷∶EtOAc；90∶10-85∶15)純化該黃色油得到為黃色油的產(chǎn)品15b(2,4.17g,85％得率)。MS(FAB)412 MH+1H NMR(CDCl3)，旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體混合物約1∶2,δ(d,J=8Hz,1H),7.87(d,J=8Hz,1H),7.82(d,J=8Hz,1H),7.55-7.41(m,4H),5.95-5.85(m,1H),5.34-5.21(m,2H),5.03-4.88(m,2H),4.70-4.56(m,2H),4.48 & 4.39(t,J=8,15Hz,1H),4.28-4.23(m,1H),3.81-3.55(m,2H),2.46-2.36(m,1H),2.13-2.05(m,1H),1.44 & 1.41(s,9H).
在室溫下用4N HCl/二噁烷處理化合物15b(2.08g,5.05mmol)30分鐘。蒸發(fā)至干得到相應(yīng)的一種油鹽酸胺。將鹽酸胺15c溶解在無(wú)水DCM(25mL)和NMM(2.2mL,20.22mmol)中，依次加入Boc-Chg-OH·H2O(1.53g,5.56mmol)和TBTU(1.95g,6.07mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過(guò)夜，然后，用EtOAc稀釋?zhuān)⒂?0％含水檸檬酸(2x)、飽和含水NaHCO3(2x)、水(2x)和鹽水(1x)連續(xù)洗滌。將EtOAc層干燥(MgSO4)、過(guò)濾并蒸發(fā)至干得到為黃白色泡沫的粗制品15d(約2.78g,100％得率)。MS(FAB)551.4 MH+。1H NMR(CDCl3)δ8.03(d,J=8Hz,1H),7.86(bd,J=8.5Hz,1H),7.84(d,J=8Hz,1H),7.56-7.40(m,4H),5.92-5.85(m,1H),5.31(dd,J=1,17Hz,1H),5.22(dd,J=1,10Hz,1H),5.17(d,J=9Hz,1H),5.05(d,J=12Hz,1H),4.91(d,J=12Hz,1H),4.67-4.60(m,3H),4.31-4.27(m,2H),4.16(bd,J=11Hz,1H),3.71(dd,J=4,11Hz,1H),2.47-2.41(m,1H),2.08-1.99(m,1H),1.85-1.63(m,5H),1.44-1.40(m,1H),1.36(s,9H),1.28-1.00(m,5H).
按照所述的化合物15c的合成法用4N HCl/二噁烷(25mL)處理粗制二肽15d(約5.05mmol)。按照所述的化合物15d的合成法用DCM(25mL)中的NMM(2.22mL,20.22mmol)和TBTU(1.95g,6.07mmol)使粗制鹽酸鹽與Boc-Chg-OH·H2O(1.53g,5.55mmol)偶聯(lián)，得到黃色油泡沫的粗制三肽15e。粗制物用閃蒸色譜純化(洗脫液∶EtOAC；80∶20-75∶25)得到三肽15e白色泡沫(2.75g,2步以上79％得率)。MS(FAB)690.5 MH+。1H NMR(CDCl3)，主要是一種旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ 8.06(d,J=8Hz,1H),7.87(bd,J=8.5Hz,1H),7.82(d,J=8Hz,1H),7.57-7.40(m,4H),6.41(d,J=8.5Hz,1H),5.92-5.84(m,1H),5.31(dd,J=1,17Hz,1H),5.23(dd,J=1,10.5Hz,1H),5.04(d,J=12Hz,1H),4.98(bd；J=7Hz,1H),4.93(d,J=12Hz,1H),4.63-4.58(m,4H),4.29-4.25(m,1H),4.10-4.07(m,1H),3.90-3.84(m,1H),3.72(dd,J=4,11Hz,1H),2.48-2.40(m,1H),2.07-1.99(m,1H),1.83-1.55(m,12H),1.43(s,9H),1.23-0.89(m,10H).
按照所述的化合物15c的合成法用4N HCl/二噁烷(25 mL)處理三肽15e(2.75g,3.99mmol)。將粗制鹽酸鹽溶解在無(wú)水DCM(20mL)中，并依次加入NMM(1.75mL,15.94mmol)和乙酸酐(752ìL,15.94mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過(guò)夜，然后，用EtOAc稀釋。并用10％含水檸檬酸(2x)、飽和含水NaHCO3(2x)、水(2x)和鹽水(1x)依次洗滌有機(jī)層，干燥(MgSO4)、過(guò)濾并蒸發(fā)至干得到為白色泡沫的粗制三肽15f(2.48g,98％得率)。
MS(FAB)632.4 MH+。1H NMR(CDCl3)，主要是一種旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體。
δ 8.06(bd,J=8Hz,1H),7.87(bd,J=8Hz,1H),7.83(d,J=8Hz,1H),7.58-7.40(m,4H),6.36(d,J=9Hz,1H),6.01(d,J=9Hz,1H),5.94-5.83(m,1H),5.34-5.28(m,1H),5.25-5.21(m,1H),5.05(d,J=12Hz,1H),4.94(d,J=12Hz,1H),4.64-4.57(m,4H),4.30-4.23(m,2H),4.12-4.08(m,1H),3.73(dd,J=4,11Hz,1H),2.49-2.42(m,1H),2.08-2.01(m,1H),1.99(s,3H),1.85-1.53(m,11H),1.25-0.88(m,11H).
將粗制三肽15f(2.48g,3.93mmol)溶解在CH3CN∶DCM(20mL)的無(wú)水混合物中。依次加入三苯基膦(53.5mg,0.200mmol)和四(三苯基膦)-鈀(O)催化劑(117.9mg,0.102mmol)，再加入吡咯烷(353.9L,4.24mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物18小時(shí)。此后，蒸發(fā)溶劑。將殘余物溶解在EtOAc和10％含水檸檬酸中，進(jìn)一步用10％含水檸檬酸、水(2x)和鹽水(1x)洗滌兩次以上。將有機(jī)層干燥(MgSO4)、過(guò)濾并蒸發(fā)。在Et2O∶DCM(85∶15)中研制粗制品、過(guò)濾后得到為白色固體的三肽15g(2.09g,90％得率)。MS(FAB)592.4 MH+。1H NMR(CDCl3)，主要是一種旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ 8.08(d,J=8Hz,1H),7.93(bd,J=9Hz,1H),7.88(bd,J=8Hz,1H),7.82(d,J=8Hz,1H),7.57-7.41(m,4H),6.47(d,J=8.5Hz,1H),5.05(d,J=12.5Hz,1H),4.94(d,J=12.5Hz,1H),4.73(t,J=9.5,19Hz,1H),4.44-4.35(m,2H),4.26(bs,1H),4.19(d,J=11.5Hz,1H),3.75(dd,J=4,11Hz,1H),2.47(bdd,J=7.5,13.5Hz,1H),2.20-2.11(m,1H),2.04(s,3H),1.88-1.41(m,11H),1.30-0.80(11H).實(shí)施例16Ac-Chg-Val-Pro-(4(R)-萘-1-基甲氧基)-OH(16e)片段的合成 16a16b 16c 16d 16e按照所述的化合物15c的合成法用4N HCl/二噁烷(30mL)處理化合物16a(2.89g,7.02mmol)。按照所述的化合物15d的合成法用DCM(35mL)中的NMM(3.1mL,28.09mmol)和TBTU(2.71g,8.43mmol)使粗制鹽酸鹽與Boc-Val-OH(1.53g,7.73mmol)偶聯(lián)3.5小時(shí)，得到乳白色油狀泡沫的粗制二肽16b(約3.60g,100％得率)。
MS(FAB)509.3 MH-511.3 MH+533.2(M+Na)+.1H NMR(CDCl3)δ8.04(bd,J=8Hz,1H),7.87(bd,J=7Hz,1H),7.82(d,J=8Hz,1H),7.56-7.40(m,4H),5.93-5.85(m,1H),5.34-5.28(m,1H),5.24-5.19(m,2H),5.04(d,J=12Hz,1H),4.92(d,J=12Hz,1H),4.67-4.60(m,3H),4.31-4.26(m,2H),4.11-4.09(m,1H),3.72(dd,J=4,11Hz,1H),2.48-2.41(m,1H),2.07-1.99(m,1H),1.44-1.36(m,1H),1.37(s,9H),1.01(d,J=7Hz,3H),0.93(d,J=7Hz,3H).
按照所述的化合物15c的合成法用4N HCl/二噁烷(30mL)處理粗制二肽16b(約7.02mmol)。按照所述的化合物15d的合成法用CH2Cl2(35mL)中的NMM(3.1mL,28.09mmol)和TBTU(2.71g,8.43mmol)使粗制鹽酸鹽與Boc-Chg-OH H2O(2.13g,7.73mmol)偶聯(lián)，得到乳白色泡沫的粗制三肽16c(約4.6g,100％得率)。MS(FAB)648.5 MH-672.4(M+Na)+.1H NMR(CDCl3)δ8.06(bd,J=8Hz,1H),7.87(bd,J=7.5Hz,1H),7.82(bd,J=8Hz,1H),7.57-7.40(m,4H),6.46(bd,J=8.5Hz,1H),5.94-5.84(m,1H),5.31(dd,J=1,17Hz,1H),5.23(dd,J=1,10.5Hz,1H),5.03(d,J=12Hz,1H),5.00-4.97(m,1H),4.93(d,J=,12Hz,1H),4.63-4.59(m,4H),4.29-4.27(m,1H),4.10-4.07(m,1H),3.92-3.86(m,1H),3.72(dd,J=5,11Hz,1H),2.48-2.41(m,1H),2.10-1.99(m,1H),1.76-1.57(m,6H),1.43(s,9H),1.20-0.92(m,6H),1.00(d,J=7Hz,3H),0.93(d,J=7Hz,3H).
按照所述的化合物15c的合成法用4N HCl/二噁烷(30mL)處理粗制三肽16c(約7.02mmol)。按照所述的化合物15d的合成法用CH2Cl2(35mL)中的乙酸酐(1.33g,14.05mmol)和NMM(3.1mL,28.09mmol)進(jìn)一步處理粗制鹽酸鹽。將粗制品經(jīng)過(guò)色譜純化(洗脫液∶己烷∶EtOAc；30∶70)得到白色泡沫的乙?；Ｗo(hù)性三肽16d(3.39g，三步以上81％得率)。MS(FAB)590.3 MH+592.4 MH+614.4(M+Na)+1H NMR(CDCl3)，主要是一種旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ8.06(d,J=8Hz,1H),7.88(bd,J=8Hz,1H),7.83(d,J=8Hz,1H),7.58-7.41(m,4H),6.37(d,J=9Hz,1H),5.97(d,J=8.5Hz,1H),5.94-5.84(m,1H),5.31(dd,J=1,17Hz,1H),5.24(dd,J=1,10.5Hz,1H),5.05(d,J=12Hz,1H),4.94(d,J=12Hz,1H),4.66-4.57(m,4H),4.31-4.22(m,2H),4.11-4.05(m,1H),3.73(dd,J=4.5,11Hz,1H),2.50-2.43(m,1H),2.09-2.01(m,2H),2.00(s,3H),1.68-1.55(m,5H),1.15-0.89(m,6H),0.99(d,J=7Hz,3H),0.91(d,J=7Hz,3H).
按照所述的化合物15g的合成法，通過(guò)四(三苯基膦)-鈀(O)催化劑(117.9mg,0.102mmol)與在無(wú)水CH3CN∶DCM(20mL)的1∶1混合物中的三苯基膦(78.1mg,0.298mmol)和吡咯烷(516ìL,6.19mmol)使乙?；?6d(3.39g,5.73mmol)脫保護(hù)。在Et2O∶DCM(85∶15)中研制粗制淺黃色泡沫制品、過(guò)濾后得到為灰白色固體的三肽16e(3.0g,95％得率)。MS(FAB)550.3 MH+。1H NMR(CDCl3)δ8.08(d,J=8Hz,1H),8.04(bd,J=9Hz,1H),7.88(bd,J=7.5Hz,1H),7.82(d,J=8Hz,1H),7.58-7.37(m,5H),5.05(d,J=12Hz,1H),4.94(d,J=12Hz,1H),4.61(t,J=9.5,19.5Hz,1H),4.46-4.37(m,2H),4.27(bs,1H),4.17(d,J=11Hz,1H),3.74(dd,J=4,11Hz,1H),2.49(bdd,J=7.5,13Hz,1H),2.17-2.09(m,1H),2.04(s,3H),2.03-1.94(m,1H),1.79(bd,J=12.5Hz,1H),1.62-1.43(m,5H),1.08-0.85(m,5H),1.00(d,J=7Hz,3H),0.90(d,J=7Hz,3H).
表1-4的化合物實(shí)施例17表1的化合物104的合成 17a=6a 17b17c 17d 17e 17f化合物104按照所述的化合物15c的方法用4N HCl/二噁烷(40mL)處理化合物17a(4.27g,7.93mmol，如實(shí)施例6的化合物6a所述)5小時(shí)。將粗制鹽酸鹽溶解在THF(10mL)中，加入NaOH(348.7mg,8.72mmol)的水(5mL)溶液，接著逐滴加入溶解在THF(13mL)中的(Boc)2O(1.73g,7.93mmol)。根據(jù)需要加入10％含水NaOH使pH保持8。用力攪拌該反應(yīng)混合物，然后用Et2O和水稀釋、并用Et2O提取一次以上。用10％含水檸檬酸酸化水層至pH為3。用EtOAc(3x)提取混合物。用水(3x)和鹽水(1x)洗滌混合的EtOAc提取物，干燥(MgSO4)、過(guò)濾并蒸發(fā)至干得到乳白色泡沫的粗制混合物17b(約7.93mmol)。MS(FAB)481.3 MH+1H NMR(CDCl3)，約1∶1旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的混合物， δ8.04(bd,J=7.5Hz,1H),7.87(bd,J=7.5Hz,1H),7.82(d,J=7.5Hz,1H),7.56-7.40(m,5H),4.96(bs,2H),4.33(t,J=7.5,14.5Hz,1H),4.21-4.09(m,0.5H),3.99-3.84(m,0.5H),3.78-3.75(m,0.5H),3.68-3.62(m,0.5H),3.61-3.42(m,1H),2.55-2.41(m,1H),2.22-2.11(m,1H),1.61-1.52(m,3H),1.43(s,9H),1.40-1.31(m,1H),1.25-1.19(m,1H),0.99(t,J=7.5,14.5Hz,3H).
按照所述的化合物15b的方法用無(wú)水CH3CN(40mL)中的DBU(1.18 Ml,93mmol)和烯丙基溴化物(4.12mL,47.61mmol)處理化合物17b(約7.93mmol)48小時(shí)、得到乳白色泡沫的烯丙基化二肽17c(3.54g；2步以上86％得率)。MS(FAB)521.3 MH+545.2(M+Na)+1H NMR(CDCl3),(約)1∶1旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的混合物，δ8.05(bd,J=8Hz,1H),7.86(bd,J=7.5Hz,1H),7.82(d,J=8Hz,1H),7.55-7.40(m,5H),5.88-5.79(m,1H),5.27(bd,J=17.5Hz,1H),5.18(bd,J=10Hz,1H),5.03-4.89(m,2H),4.63-4.50(m,2H),4.44-4.19(m,2H),4.00-3.40(m,2H),2.70-2.02(m,2H),1.66-1.35(m,5H),1.44(s,9H),0.95(t,J=7.5,14.5Hz,3H).
按照所述的化合物15c的方法用4N HCl/二噁烷(35mL)處理粗制二肽17c(1.18g,2.26mmol)。按照所述的化合物15d的方法用DCM(11mL)中的NMM(993μL,9.03 mmol)和TBTU(870 mg,2.71 mmol)使粗制鹽酸鹽與Boc-Chg-OH H2O(684 mg,2.48 mmol)偶聯(lián)，得到乳白色泡沫的粗制三肽17d(1.41g,95％)。MS(FAB)660.4 MH+662.3 MH+。1H NMR(CDCl3)，主要是一種旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體， δ 8.03(bd,J=8Hz,1H),7.85(bd,J=8Hz,1H),7.81(d,J=8Hz,1H),7.56-7.39(m,5H),5.88-5.77(m,1H),5.26(dd,J=1.5,17Hz,1H),5.15(dd,J=1.5,10.5Hz,1H),5.12(s,1H),5.02-4.92(m,2H),4.72-4.59(m,1H),4.57-4.46(m,1H),4.42-4.35(m,1H),4.33-4.20(m,1H),4.02-3.90(m,1H),3.78-3.70(m,1H),3.67-3.51(m,1H),2.71-2.61(m,1H),2.12-2.02(m,1H),1.79-1.48(m,10H),1.45-1.39(m,1H),1.38(s,9H),1.25-1.01(m,5H),0.94(t,J=7.5.14Hz,3H).
按照所述的化合物15c的方法用4N HCl/二噁烷(35mL)處理粗制S三肽17d(265mg,0.400mmol)。按照所述的化合物15d的方法用DCM(3mL)中的NMM(176μL,1.60mmol)和TBTU(154.3mg,0.481mmol)使粗制鹽酸鹽與Boc-Chg-OH H2O(143.3mg,0.521mmol)偶聯(lián)，得到乳白色泡沫的粗制四肽17e(約0.400mmol；100％)。MS(FAB)799.5 MH+801.5 MH+823(M+Na)+1H NMR(CDCl3)，約1∶1旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的混合物，
δ8.05(bd,J=8.5Hz,1H),7.87(bd,J=7.5Hz,1H),7.81(d,J=8.5Hz,1H),7.55-7.40(m,4H),7.37(s,1H),6.58-6.41(m,1H),5.89-5.78(m,1H),5.26(bdd,J=1.5,17Hz,1H),5.16(bdd,J=1.5,10.5Hz,1H),5.20-4.92(m,3H),4.68-4.58(m,2H),4.57-4.47(m,1H),4.43-4.26(m,1H),3.99-3.81(m,2H),3.78-3.60(m,2H),2.67-2.60(m,1H),2.11-2.02(m,1H),1.78-1.42(m,14H),1.44 & 1.43(s,9H),1.25-0.91(m,13H),0.95(t,J=7.5,15Hz,3H).
按照所述的化合物15c的方法用4N HCl/二噁烷(3mL)處理粗制四肽17e(約0.400mmol)。按照所述的化合物15f的方法用DCM(3mL)中的乙酸酐(83μL,0.884mmol)和NMM(194μL,1.77mmol)進(jìn)一步處理粗制鹽酸鹽得到乳白色泡沫的粗制乙?；碾?7f(約0.400mmol)。
MS(FAB)741.5MH+743.4MH+765.4(M+Na)+1H NMR(CDCl3)δ8.05(bd,J=8.5Hz,1H),7.87(bd,J=7.5Hz,1H),7.82(d,J=8.5Hz,1H),7.55-7.41(m,4H),7.39(s,1H),6.63-6.48(m,1H),6.01(d,J=8.5Hz,1H),5.90-5.79(m,1H),5.27(bdd,J=1.5,17Hz,1H),5.16(bdd,J=1.5,10.5Hz,1H),5.01(d,J=12Hz,1H),4.96(d,J=12Hz,1H),4.69-4.48(m,3H),4.44-4.37(m,1 H),4.36-4.22(m,1H),3.96(dd,J=4,11Hz,1H),3.78-3.60(m,2H),2.67-2.59(m,1H),2.10-2.00(m,1H),2.01(s,3H),1.78-1.48(m,13H),1.45-1.35(m,1H),1.26-0.89(m,13H),0.95(t,J=7.5,15Hz,3H).
按照所述的化合物15g的方法，通過(guò)四(三苯基膦)-鈀(O)催化劑(11.3mg,0.010mmol)與在無(wú)水CH3CN∶DCM(2mL)的1∶1混合物中的三苯基膦(5.12mg,0.020mmol)和吡咯烷(34ìL,0.406mmol)使乙?；碾?7f(約0.400mmol)脫保護(hù)。將粗制品經(jīng)閃蒸色譜(洗脫液-首先EtOAc，然后，1.92％HOAc,DCM中的3.85％MeOH)純化、冷凍干燥后得到為灰白色無(wú)定形固體的表1中的四肽化合物104(193.1mg,5步以上73％得率)。
MS(FAB)701.4MH+703.4MH+725.4(M+Na)+1H NMR(CDCl3)，約1∶5旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的混合物，δ8.57 & 8.32(s,1H),8.04(d,J=7.5Hz,1H),7.94(bd,J=7.5Hz,1H),7.88(d,J=8Hz,1H),7.83-7.78(m,2H),7.58-7.30(m,4H),4.99(d,J=12Hz,1H),4.90(d,J=12Hz,1H),4.44-4.29(m,2H),4.29-4.05(m,3H),3.87-3.73(m,1H),2.23-2.13(m,1H),2.05-1.95(m,1H),1.91 & 1.84(s,3H),1.75-1.40(m,15H),1.29-0.84(m,12H),0.91(t,J=7.5,14.5Hz,3H).實(shí)施例18表1的化合物105的合成 18a18b化合物105將化合物18b，即相應(yīng)于實(shí)施例5的化合物5f，與前面實(shí)施例15所述的預(yù)制三肽18a偶聯(lián)。尤其是，將化合物18b(約0.521mmol)與化合物18a(323.6mg,0.547mmol)在DCM(3mL)和NMM(172μL,1.562mmol)中混合，然后加入HATU(237.6mg,0.625mmol)。在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物18小時(shí)，然后按化合物15d中所述的進(jìn)行、得到P1上的外消旋混合物粗制四肽。通過(guò)閃光色譜(洗脫液-甲苯∶EtOAc；40∶60)使兩種異構(gòu)體部分分離。合并首先洗脫部分得到9∶1混合物，其中主要成分(58mg)為17f的類(lèi)似物叔丁基酯。中間部分含不同比例的17f的相應(yīng)叔丁基酯和化合物105叔丁基酯(163mg)。后洗脫部分提供了作為主要異構(gòu)體(75.8mg)的化合物105的相應(yīng)叔丁基酯。
將后者的酯(74mg,0.0975mmol)溶解在4N HCl/二噁烷(2mL)中，在室溫下攪拌5.5小時(shí)，然后蒸發(fā)至干得到一種油。經(jīng)閃蒸色譜(洗脫液-首先EtOAc，然后，1.92％HOAc,3.85％MeOH,DCM中)純化、冷凍干燥后得到為白色無(wú)定形固體的化合物105(38.7mg,56％得率)。HPLC分析顯示化合物105與化合物104的比例為3∶1?；衔?05的MS和NMR數(shù)據(jù)MS(FAB)701.5 MH+703.5 MH+725.6(M+Na)+。1H NMR(DMSO)，約1∶2.5旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的混合物，δ8.76 & 8.34(s,1H),8.05(bd,J=7.5Hz,1H),7.94(bd,J=8Hz,1H),7.88(d,J=8.5Hz,1H),7.85-7.78(m,2H),7.59-7.43(m,4H),4.99(d,J=12Hz,1H),4.89(d,J=12Hz,1H),4.41-4.05(m,5H),3.82-3.66(m,1H),2.25-2.11(m,1H),2.11-1.98(m,1H),1.90 & 1.84(s,3H),1.78-1.40(m,15H),1.39-0.82(m,12H),0.90(t,J=7,14Hz,3H).實(shí)施例19表1化合物103的合成根據(jù)實(shí)施例17所述的化合物104的合成方法，將實(shí)施例10制備的中間體化合物10d的1(R),2(R)和1(R),2(S)異構(gòu)體的混合物與化合物2偶聯(lián)得到異構(gòu)中間體化合物19a和19b的化合物。 19a 19b按照實(shí)施例18的方法，分離異構(gòu)化合物19a和19b，并將其轉(zhuǎn)化為其相應(yīng)的式Ⅰ化合物；分離表1的相應(yīng)化合物103。
光譜數(shù)據(jù)化合物103通過(guò)NMR的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體數(shù)約(1∶8.7)MS(FAB)m/z:703(MH+)；1H-NMR(DMSO-d6)δ8.21-8.09(bs,1H),8.05(bd,J=7.63Hz,1H),7.94(bd,J=7.0Hz,1H),7.91-7.83(m,2H),7.83-7.76(m,1H),7.59-7.5(m,3H),7.5-7.43(m,1H),4.99(d,J=11.8Hz,1H),4.89(d,J=11.8Hz,1H),4.43-4.30(m,3H),4.23-4.16(m,1H),4.13(bd,J=10.8Hz,1H),3.71(dd,J=11.1,4Hz,1H),2.2-2.02(m,2H),1.87and1.84(2×s,3H),1.81-1.71(m,2H),1.70-1.40(m,12H),1.26-1.06(m,4H),1.04-0.83(m,11H),0.59(m,1H).實(shí)施例20表1的化合物108的合成 20c 20d 化合物108按照所述的化合物15c的方法用4N HCl/二噁烷(5mL)處理實(shí)施例17的粗制四肽17e(約0.963mmol)。按所述的化合物15d的方法用DCM(5mL)中的NMM(423μL,3.850mmol)和TBTU(370.8mg,1.155mmol)使粗制鹽酸鹽與Boc-(D)Glu(O-烯丙基)-OH(331.9mg,1.155mmol)偶聯(lián)，得到乳白色泡沫的粗制五肽20b(約933.9mg,0.963mmol)。MS(FAB)968.6 MH+970.6 MH+992.5(M+Na)+1H NMR(CDCl3)，約1∶4旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的混合物，δ8.05(d,J=8.5Hz,1H),7.87(bd,J=7.5Hz,1H),7.81(d,J=8.5Hz,1H),7.58-7.34(m,5H),6.77-6.25(m,2H),5.98-5.77(m,2H),5.38-5.21(m,4H),5.16(dd,J=1.5,10.5Hz,1H),5.06-4.89(m,2H),4.68-4.13(m,7H),3.96-3.52(m,4H),2.69-2.38(m,3H),2.23-1.87(m,2H),1.78-1.37(m,17H),1.46 & 1.44(s,9H),1.22-0.87(m,11H),0.95(t,J=7,14.5Hz,3H).
按照所述的化合物15c的方法用4N HCl/二噁烷(5mL)處理實(shí)施例17的粗制五肽20b(約0.963mmol)。按所述的化合物15d的方法用DCM(5mL)中的NMM(423μL,3.85mmol)和TBTU(370.8mg,1.155mmol)使粗制鹽酸鹽與Boc-Asp(O-烯丙基)-OH(315.6mg,1.155mmol)偶聯(lián)，得到乳白色泡沫的粗制六肽20c(約1.083g,0.963mmol)。MS(FAB)1147.6(M+Na)+1H NMR(CDCl3)，約1∶1旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的混合物，δ8.06(bd,J=8Hz,1H),7.86(d,J=8Hz,1H),7.81(d,J=8Hz,1H),7.59-7.39(m,5H),7.39-6.34(m,4H),5.98-5.76(m,3H),5.38-5.10(m,6H),5.10-4.89(m,2H),4.66-4.05(m,10H),3.87-3.58(m,4H),3.30-2.65(m,2H),2.65-1.89(m,3H),1.79-1.33(m,19H),1.47 & 1.45(s,9H),1.33-0.86(m,14H).
按照所述的化合物15c的方法用4N HCl/二噁烷(5mL)處理粗制六肽20c(約0.963mmol)。按照所述的化合物15f的方法用DCM(5mL)中的乙酸酐(182μL,1.193mmol)和NMM(423.5μL,3.850mmol)使粗制鹽酸鹽乙?；玫酱种埔阴；碾?。將泡沫殘余物經(jīng)閃蒸色譜(洗脫液-首先己烷∶EtOAc 20∶80-10∶90，然后，純EtOAc)純化得到為乳白色泡沫的乙?；?0d(528mg,4步以上51％得率)。MS(FAB)1067.6(MH+)1088.6(M+Na)。
將乙?；?0d(528mg,0.495mmolr)溶解在DCM(3mL)中,并用預(yù)混合的、DCM(3mL)中的四(三苯基膦)-鈀(O)催化劑(90mg,0.078mmol)與吡咯烷(134ìL,1.603mmol)的15分鐘攪拌溶液進(jìn)行處理。在室溫下攪拌反應(yīng)化混合物48小時(shí)，然后蒸發(fā)溶劑。通過(guò)在Et2O∶DCM(85∶15)中研制使粗制品部分純化，然后，通過(guò)制備HPLC分兩批純化。將部分純化的物質(zhì)的一半溶解在冰HOAc(5mL)中，通過(guò)MilliporeMillexHV 0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾，并注入平衡Whatman Partisil10-ODS-3(2.2×50cm)C18反相柱中。純化程序15mL/分鐘的線性梯度，230μm，以5％A注入；一旦所有HOAc被洗脫則開(kāi)始下列程序-以5％A 10分鐘，5-58％A 70分鐘；A:0.06％TFA/CH3CN；B:0.06％TFA/H2O。通過(guò)分析HPLC對(duì)各部分進(jìn)行分析，收集兩種HPLC純化的適當(dāng)部分、并冷凍干燥得到白色無(wú)定形固體的所需六肽化合物108(218.3mg,47％得率)。
MS(FAB)945.5 MH-947.4 MH+ 969.5(M+Na)+ 985.4(M+K)+1H NMR(CDCl3)，約1∶9旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的混合物，δ8.55 & 8.31(s,1H),8.16(d,J=7.5Hz,1H),8.11(d,J=8Hz,1H),8.05(d,J=8.5Hz,1H),7.97-7.85(m,2H),7.88(d,J=8.5Hz,1H),7.75(d,J=9Hz,1H),7.59-7.39(m,4H),4.99(d,J=12Hz,1H),4,89(d,J=12Hz,1H),4.53(dd,J=7,14Hz,1H),4.08-4.45(m,6H),3.77(bdd,J=4,11Hz,1H),2.64(dd,J=6.5,16.5Hz,1H),2.48-2.41(m,1H),2.25-2.12(m,3H),2.07 & 1.82(s,3H),2.04-1.86(m,2H),1.80-1.35(m,14H),1.32-0.80(m,14H),0.91(t,J=7.5,14.5Hz,3H).實(shí)施例21表3的化合物301的合成 21a≡9c 21b 21c 化合物301將水(4mL)中的氫氧化鋰一水合物(23mg,0.56mmol)加入MeOH(3.5mL)和THF(3.5mL)中的酯化合物21a(45mg,0.185mmol，如前面所述的(R,R)異構(gòu)體9c)的溶液中。用力攪拌所得到的溶液16小時(shí)，然后將其分配在EtOAc(60mL)和10％含水HCl(20mL)之間。分離有機(jī)相，干燥(MgSO4)、過(guò)濾并濃縮得到定量得率的相應(yīng)酸。
將此物質(zhì)(約0.185mmol)與DCM(5mL)中的(S)-(-)-α甲基芐基胺(27mg,0.22mmol)、HATU(77mg,0.22mmol)和DIPEA(0.11mL,0.65mmol)混合。20小時(shí)后，濃縮反應(yīng)物。將殘余物溶解在EtOAc中，隨后用飽和含水NaHCO3、10％含水HCl和鹽水洗滌該溶液，然后干燥(MgSO4)、過(guò)濾并真空濃縮。經(jīng)閃蒸色譜(洗脫液-35％EtOAc/己烷)純化得到11mg(28％)偶聯(lián)產(chǎn)品21b。用4N HCl/二噁烷處理該物質(zhì)(11mg,0.033mmol)35分鐘。此后濃縮該反應(yīng)化合物至干得到相應(yīng)胺的鹽酸鹽。將后一產(chǎn)品與DMF(4mL)中的式 (33mg,0.036mmol，用實(shí)施例15和20的類(lèi)似方法制備)、HATU(14mg,0.036mmol)和DIPEA(0.116mg,0.02mmol)偶聯(lián)。反應(yīng)混合物攪拌16小時(shí)后濃縮將殘余物溶解在EtOAc中。隨后用飽和含水NaHCO3、10％含水HCl和鹽水洗滌該溶液，干燥(MgSO4)、過(guò)濾并真空濃縮得到白色固體。將物質(zhì)(約0.033)溶解在EtOH(6mL)中、并在氫氣大氣壓下用乙酸銨(7mg,0.09mmol)和10％Pd/C(10mg)處理。3小時(shí)后，通過(guò)硅藻土過(guò)濾該反應(yīng)混合物。將濾液濃縮至干。然后將殘余物溶解在DMSO中、通過(guò)制備HPLC純化，冷凍干燥后得到白色固體(17.6mg,2步以上57％得率)。
光譜數(shù)據(jù)MS(FAB)ES-932.6(M-H)-,954.5(M-Na)；HRMS calcd forC48H67N7O12(MH+)934.49261,found:934.49010；1H-NMR(DMSO,d6)δ8.90(s,1H),8.24(d,J=7.95Hz,1H),8.14(d,J=7.63Hz,1H),7.99(d,J=8.26Hz,1H),7.79(d,J=8.9Hz,1H),7.75(d,J=8.26Hz,1H),7.42-7.17(m,10H),5.00(quintet,J=7.63Hz,1H),4.7(m,1H),4.52(d,J=11.76Hz,1H),4.43(d,J=11.4Hz,1H),4.33-4.2(m,6H),3.70(dd,J=11.4and11.1Hz,2H),2.63(dd,J=5.7and5.7Hz,1H),2.45(dd,J=7.95and7.95Hz,1H),2.21-2.11(m,3H),2.07-1.97(m,1H),1.93-1.83(m,2H),1.81(s,3H),1.78-1.63(m,2H),1.54-1.41(m,2H),1.39(d,J=7.0Hz,3H),1.29(dd,J=7.94and7.63Hz,1H),1.15(quintet,J=7.0Hz,1H),1.05(m,1H),0.90(d,J=6.36Hz,6H),0.88-0.83(m,1H),0.71(m,9H).實(shí)施例22根據(jù)實(shí)施例17所述的方法合成表1的化合物107通過(guò)NMR的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體數(shù)(1∶7.6)MS(FAB)m/z:675(MH+)；1H-NMR(DMSO-d6)δ8.35-8.19(bs,1H),8.04(d,J=7.63Hz,1H),7.93(bd,J=7.31Hz,1H),7.88(d,J=8.27Hz,1H),7.86-7.79(m,2H),7.59-7.49(m,3H),7.46(dd,J=7.95,7.95Hz,1H),4.98(d,J=11.8Hz,1H),4.89(d,J=11.8Hz,1H),4.40-4.34(m,1H),4.32(bs,1H),4.29-4.24(m,1H),4.22-4.15(m,1H),4.09(d,J=11.8Hz,1H),3.74(dd,J=11.1,4Hz,1H),2.20-2-12(m,1 H),2.05-1.94(m,2H),1.84(s,3H),1.72-1.42(m,7H),1.20-1.13(m,1H),1.08-0.87(m,13H),0.85(d,J=6.68Hz,6H).實(shí)施例23根據(jù)實(shí)施例17所述的方法合成表1的化合物114通過(guò)NMR的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體數(shù)(1∶7.5)MS(FAB)m/z:747(M+Na+)；1H-NMR(DMSO-d6)δ8.40-8.24(bs,1H),8.07-8.01(m,1H),7.96-7.91(m,1H),7.87(dJ=8.26Hz,1H),7.85-7.78(m,2H),7.58-7.49(m,3H),7.46(dd,J=7.95,7.95Hz,1H),7.30-7.21(m,4H),7.20-7.14(m,1H),4.98(d,J=11.8Hz,1H),4.89(d,J=11.8Hz,1H),4.40-4.34(m,1H),4.34-4.29(m,1H),4.29-4.25(m,1H),4.22-4.15(m,1H),4.09(d,J=11.8Hz,1H),3.74(dd,J=11.1,4Hz,1H),2.95-2.79(m,2H),2.21-2.11(m,1H),2.05-1.94(m,2H),1.89-1.83(2×s,3H),1.63-1.41(m,7H),1.38-1.30(m,1H),1.27-1.22(m,1H),1.12-0.94(m,5H),0.89(d,J=6.4Hz,3H),0.84(d,J=6.4Hz,3H).實(shí)施例24根據(jù)實(shí)施例17所述的方法合成表1的化合物118通過(guò)NMR的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體數(shù)(1∶6.3)MS(FAB)m/z:677.4(MH+)；1H-NMR(DMSO-d6)δ8.58and8.38(2×bs,1H),8.04(d,J=7.63Hz,1H),7.93(d,J=7.63Hz,1H),7.91-7.81(m,3H),7.59-7.49(m,3H),7.49-7.43(m,1H),4.98(d,J=12.1Hz,1H),4.89(d,J=12.1Hz,1H),4.41-4.29(m,2H),4.29-4.14(m,2H),4.1(d,J=10.8Hz,1H),3.74(bd,J=7.63Hz,1H),2.21-2.12(m,1H),2.04-1.92(m,2H),1.90and1.84(2×s,3H),1.63-1.41(m,9H),1.39-1.26(m,3H),1.21-1.15(m,1H),1.06-0.92(m,5H),0.92-0.80(m,9H).實(shí)施例25根據(jù)實(shí)施例17所述的方法合成表1的化合物1161H NMR(DMSO-d6)δ8.36(s,1H),8.14(d,J=8Hz,1H),8.04(d,J=8Hz,1H),7.99(d,J=9Hz,1H),7.79(d,J=9Hz,1H),7.33-7.26(m,5H),4.54-4.42(m,3H),4.30-4.21(m,5H),4.06(d,J=11Hz,1H),3.69(dd,J=Hz,1H),2.62(dd,J=16,10Hz,1H),2.47-2.42(m,1H),2.18-2.14(m,3H),2.02-1.87(m,2H),1.82(s,3H),1.74-1.66(m,2H),1.54-1.47(m,2H),1.38-1.27(m,2H),1.21-1.18(m,1H),0.97-0.85(m,11H),0.80-0.70(m,7H).實(shí)施例26根據(jù)實(shí)施例17所述的方法合成表1的化合物1211H NMR(DMSO-d6)δ9.12(d,J=6Hz,1H),8.64(s,1H),8.30(d,J=8Hz,1H),8.12(d,J=9Hz,1H),8.05(dd,J=8,7Hz,1H),7.97(d,J=8Hz,1H),7.80(dd,J=8,7Hz,1H),7.66(d,J=9Hz,1H),7.54(d,J=6Hz,1H),5.70-5.61(m,2H),5.26(d,J=17Hz,1H),5.07(d,J=12Hz,1H),4.52(d,J=12Hz,1H),4.39(dd,J=9,8Hz,1H),4.23-4.12(m,2H),4.03-3.99(m,1H),2.66-2.54(m,1H),2.35-2.28(m,1H),2.08(dd,J=9,17Hz,1H),2.01-1.93(m,1H),1.83(s,3H),1.65-1.46(m,5H),1.41-1.38(m,1H),1.24-1.20(dd,J=9,5Hz,1H),01.05-0.78(m,12H).實(shí)施例27根據(jù)實(shí)施例17所述的方法合成表1的化合物2051H NMR(DMSO-d6)δ9.14(d,J=6Hz,1H),8.60(s,1H),8.32(d,J=8Hz,1H),8.14-8.06(m,2H),7.98(d,J=8Hz,1H),7.82(dd,J=8,7Hz,1H),7.66(d,J=9Hz,1H),7.55(d,J=8Hz,1H),5.75-5.66(m,2H),5.22(d,J=17Hz,1H),5.07(d,J=10Hz,1H),4.50(d,J=12 Hz,1H),4.39(dd,J=9,9Hz,1H),4.23-4.08(m,3H),2.56-2.50(m,1H),2.36-2.28(m,1H),2.04-1.97(m,1H),1.82(s,3H),1.62-1.41(m,7H),1.24(dd,J=5,4Hz,1H),0.94-0.75(m,12H).實(shí)施例28根據(jù)實(shí)施例20所述的方法合成表1的化合物1171H NMR(DMSO-d6)δ8.36(s,1H),8.17(d,J=8Hz,1H),8.09(d,J=8Hz,1H),8.04(d,J=8Hz,1H),7.96-7.92(m,2H),7.87(d,J=8 Hz,1H),7.77(d,J=9Hz,1H),7.56-7.45(m,4H),4.99(d,J=12Hz,1H),4.89(d,J=12Hz,1H),4.52(dd,J=14,7Hz,1H),4.37-4.12(m,6H),3.78-3.73(m,1H),2.63(dd,J=17,6Hz,1H),2.47-2.42(m,1H),2.22-2.16(m,3H),2.04-1.86(m,2H),1.82(s,3H),1.77-1.71(m,1H),1.69-1.42(m,8H),1.30(quint.,J=8Hz,1H),1.20(dd,J=12,8Hz,1H),1.10-0.85(m,15H),0.76-0.72(m,1H).實(shí)施例29根據(jù)實(shí)施例20所述的方法合成表1的化合物1201H NMR(DMSO-d6)δ8.34(s,1H),8.12(d,J=8Hz,1H),8.05(d,J=8Hz,1H),7.95-7.87(m,3H),7.81(d,J=9Hz,1H),7.64-7.52(m,4H),7.46(dd,J=8,7Hz,1H),4.99(d,J=12Hz,1H),4.89(d,J=12Hz,1H),4.63(dd,J=14,7Hz,1H),4.37-4.14(m,4H),3.74(dd,J=11,4Hz,1H),3.41-3.35(m,2H),2.61(dd,J=16,7Hz,1H),2.44(dd,J=16,8Hz,1H),2.20-2.15(m,1H),2.04-1.96(m,3H),1.82(s,3H),1.70-1.64(m,1H),1.56-1.43(m,7H),1.30(quint.,J=8Hz,1H),1.20(dd,J=8,5Hz,1H),0.99-0.72(m,21H).實(shí)施例30重組HCV NS3蛋白酶1b型的克隆、表達(dá)和純化通過(guò)外部合作(Bernard Willems MD,Hópital St-Luc,Montréal,Canada和Dr.Donald Murphy,Laboratoire de SantéPublique du Québec,Ste-Anna deBellevue,Canada)獲得感染HCV的患者的血清。從通過(guò)血清RNA的逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)獲得的DNA片段并使用根據(jù)其它1b系基因型之間的同源性所選擇的特異性引物，構(gòu)建HCV基因組的基因工程全長(zhǎng)cDNA模板。由整個(gè)基因組序列的確定，根據(jù)Simmonds等(《臨床微生物學(xué)雜志》(1993),31,1493-1503)的分類(lèi)將1b基因型排布于HCV分離物。非結(jié)構(gòu)區(qū)域NS2-NS4B的氨基酸序列顯示93％以上與HCV 1b基因型(BK、JK和483分離物)相同，88％與HCV 1a基因型(HCV-1分離物)相同。通過(guò)PCR產(chǎn)生編碼多蛋白前體(NS3/NS4A/NS4B/NS5A/NS/5B)DNA片段，并將其引入真核生物表達(dá)載體。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，通過(guò)成熟NS3蛋白的存在、使用蛋白質(zhì)印跡分析說(shuō)明由HCV NS3蛋白酶介導(dǎo)的多蛋白加工。沒(méi)有觀察到成熟NS3蛋白伴有含突變S1165A的多蛋白前體的表達(dá)，其中的突變S1165A可使NS3蛋白酶失活，這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了HCV NS3蛋白酶的功能。
在pET11的細(xì)菌表達(dá)載體中克隆編碼重組HCV NS3蛋白酶(氨基酸1027-1206)的DNA片段。通過(guò)在20℃用1mM IPTG培養(yǎng)3小時(shí)誘導(dǎo)大腸桿菌BL21(DE3)pLys中的NS3蛋白酶表達(dá)。典型的發(fā)酵(18L)得到約100g濕細(xì)胞糊。將該細(xì)胞再懸浮在由25mM磷酸鈉、pH7.5 10％甘油(v/v)、1mM EDTA、0.01％NP-40的裂解緩沖液(3.0mL/g)中、并于-80℃儲(chǔ)藏。加入5mM DTT使細(xì)胞解凍和均化。然后在最后濃度分別為20mM和20μg/mL勻漿中加入氯化鎂和DN酶。在4℃培養(yǎng)25分鐘后，將勻漿在4℃超聲并以15000×g離心30分鐘。然后用1M磷酸鈉溶液調(diào)節(jié)上清液的pH至6.5。
將另外一種凝膠過(guò)濾層析步驟加到WO95/22985(本發(fā)明參考文獻(xiàn))所述的2步純化方法中。簡(jiǎn)言之，即將從細(xì)菌提取物得到的上清液載在SPHiTrap柱(Pharmacia)上，此柱在緩沖液A(50mM磷酸鈉、pH6.5 10％甘油、1mM EDTA、0.01％NP-40)中以2mL/分鐘的流速預(yù)先進(jìn)行了平衡。然后用含0.15 M NaCl的緩沖液A洗滌該柱，通過(guò)使用10柱體積的線性0.15-0.3M NaCl梯度洗脫蛋白酶。合并含蛋白酶的NS3組分并稀釋至0.1M的最終NaCl濃度。將酶在HiTrap肝素柱(Pharmacia)上進(jìn)-步純化，該柱在緩沖液B(25mM磷酸鈉、pH7.5 10％甘油、5mM DTT、0.01％NP-40)中進(jìn)行了平衡。以3mL/分鐘的流速加樣。然后用含0.15 M NaCl的緩沖液B以1.5mL/分鐘的流速洗滌該柱。兩步洗滌是在含0.3或-1M NaCl的緩沖液B存在時(shí)進(jìn)行的。在0.3M NaCl洗滌中回收蛋白酶，并用緩沖液B稀釋3倍，再將其用于HiTrap肝素柱上、并用含0.4M NaCl的緩沖液B洗脫。最后，將含蛋白酶的NS3組分用于Superdex 75HiLoad 16/60柱(Pharmacia)上，該柱在含0.3M NaCl的緩沖液B中進(jìn)行了平衡。通過(guò)SDS-PAGE、再通過(guò)光密度測(cè)定分析判定從混合組分獲得的HCV NS3蛋白酶的純度大于95％。實(shí)施例31重組HCV NS3蛋白酶/NS4A輔因子肽放射分析測(cè)定。
根據(jù)實(shí)施例30所述的方案對(duì)酶進(jìn)行克隆、表達(dá)和制備。將酶儲(chǔ)藏在-80℃，在用于含NS4A輔因子肽的測(cè)定緩沖液中之前將其在冰上解凍并稀釋。
將用于NS3蛋白酶/NS4A輔因子肽放射測(cè)定的底物，DDIVPC-SMSYTW，在半胱氨酸和絲氨酸殘基之間通過(guò)酶進(jìn)行裂解。序列DDIVPC-SMSYTW相應(yīng)于NS5A/NS5B天然裂解位點(diǎn)，其中P2中的半胱氨酸殘基取代了脯氨酸。在有或無(wú)抑制劑時(shí)，用重組NS3蛋白酶和NS4A肽輔因子KKGSVVIVGR[ILSGRK(酶與輔因子的摩爾比1∶100)培養(yǎng)肽底物DDIVPC-SMSYTW和示蹤生物素-DDIVPC-SMS[125I-Y]TW。通過(guò)在過(guò)濾后的測(cè)定混合物中加入包覆親和素的瓊脂糖珠而從產(chǎn)品分離底物。在濾液中出現(xiàn)的SMS[125I-Y]TW產(chǎn)品數(shù)量可用于計(jì)算底物轉(zhuǎn)化的百分比和抑制百分比。A．試劑從Gibco-BRL.獲得Tris和Tris-HCl(超純的)。甘油(超純的)、MES和BSA是從Sigma購(gòu)得。從Pierce獲得TCEP,DMSO來(lái)自Aldrich,NaOH來(lái)自Anachemia。
測(cè)定緩沖液50mM Tris HCl,pH7.5,30％(w/v)甘油，1mg/mLBSA,1mM TCEP(使用前所加入的TCEP是來(lái)自水中的1M貯存液)。
底物DDIVPCSMSYTW，最終濃度25μM(來(lái)自儲(chǔ)藏在-20℃的DMSO中的2mM貯存液，以避免氧化)。
示蹤物還原的單碘化底物生物素DDIVPC SMS[125I-Y]TW(終濃度約1nM)。
HCV NS3蛋白酶1b型，最終濃度25nM(來(lái)自50mM磷酸鈉、pH7.510％甘油、300mM NaOH,5mM DTT、0.01％NP-40中的貯存液)。
NS4A輔因子肽KKGSVVIVGRIILSGRK，最終濃度2.5μM(來(lái)自儲(chǔ)藏于-20℃的DMSO中的2mM貯存液)。B．方法測(cè)定是在Coster的96孔聚丙烯平板上進(jìn)行的，每個(gè)孔包含·測(cè)定緩沖液中的20μL底物/示蹤物；·10μL±20％DMSO/測(cè)定緩沖液中的抑制劑；·10μLNS3蛋白酶1b/NS4輔因子肽(摩爾比例1∶100)。
空白(無(wú)抑制劑和酶)和對(duì)照(無(wú)抑制劑)在同樣的測(cè)定平板上進(jìn)行制備。
通過(guò)加入酶/NS4A肽溶液開(kāi)始酶促反應(yīng)，將測(cè)定混合物在23℃在溫和的振蕩下培養(yǎng)40分鐘。加入10μL 0.5 NaOH，再加入10μL MES pH5.8以使酶促反應(yīng)猝停。
在Millipore MADP N65過(guò)濾板上加入20μL包覆親和素的瓊脂糖珠(從Pierce購(gòu)得)。將猝停的測(cè)定混合物轉(zhuǎn)移至過(guò)濾板，并在23℃在溫和的振蕩下培養(yǎng)60分鐘。
用Milipore Multiscreen Vacuum Manifold過(guò)濾裝置過(guò)濾該平板，將40μL濾液轉(zhuǎn)移在不透明的96孔平板上，每孔含60μL閃爍液。
用125I液體方法在Packard TopCount儀對(duì)濾液進(jìn)行計(jì)數(shù)1分鐘。
采用下列等式計(jì)算抑制％100-[(抑制數(shù)-空白數(shù))/(對(duì)照數(shù)-空白數(shù))×100]將與希爾模型擬合的非線性曲線用于抑制-濃度數(shù)據(jù)，通過(guò)使用SAS軟件(數(shù)據(jù)軟件系統(tǒng)；SAS協(xié)會(huì)，Inc.Cary,N.C.)計(jì)算50％有效濃度(IC50)。實(shí)施例32全長(zhǎng)NS3-NS4A異二聚體蛋白測(cè)定使用從HCV 1b基因型感染個(gè)體的血清(由Dr.Bernard Wilems,HōpitalSt-Luc,Montrēal,Quēbec,Canada提供)提取的RNA、通過(guò)RT-PCR將NS2-NS5B-3’非編碼區(qū)克隆在pCR3載體(Invitrogen)上。然后通過(guò)PCR將NS3-NS4A DNA區(qū)亞克隆在pFastBacTMHTa桿狀病毒表達(dá)載體(Gibol/BRL)上。該載體序列包括編碼含六組氨酸t(yī)ag的28-殘基N-末端序列的區(qū)域。將Bac-to-BacTM桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Gibol/BRL)用于制備重組桿狀病毒。通過(guò)在27℃以0.1-0.2感染復(fù)數(shù)用重組桿狀病毒感染106Sf21細(xì)胞/mL，來(lái)對(duì)全長(zhǎng)成熟NS3和NS4A異二聚體蛋白(His-NS3-NS4AFL)進(jìn)行表達(dá)。收獲感染的培養(yǎng)物48-64小時(shí)后在4℃離心。在蛋白酶抑制劑混合物存在下，將細(xì)胞粒狀沉淀在50mM NaPO4、pH7.5、40％甘油(w/v)、2mM β-氫硫基乙醇中勻漿。然后用1.5％NP-40、0.5％Triton X-100、0.5M NaCl和DN酶處理從細(xì)胞裂解物中提取His-NS3-NS4AFL。超離心后，將可溶性提取物稀釋4倍，并結(jié)合在Pharmacia Hi-Trap Ni-螯合柱上。使用50-400 mM咪唑梯度，將His-NS3-NS4AFL在＞90％純形式(如SDS-PAGE所判定)中洗脫。將His-NS3-NS4AFL在-80℃貯存在50mM磷酸鈉、pH7.5、10％(w/v)甘油、0.5M NaCl、0.25M咪唑、0.1％NP-40中。將其在冰上解凍、并在使用前稀釋。
在50mM Tris-HCl、pH8.0、0.25M檸檬酸鈉、0.01％(w/v)n-十二烷基-β-D-麥芽糖甙、1mM TCEP中測(cè)定His-NS3-NS4AFL的蛋白酶活性。在23℃用1.5nM His-NS3-NS4AFL對(duì)各種濃度的抑制劑中的內(nèi)部驟冷的底物氨茴內(nèi)酐基-DDIVPAbu[C(O)-O]-AMY(3-NO2)TW-OH進(jìn)行培養(yǎng)45分鐘。最終的DMSO濃度沒(méi)有超過(guò)5.25％。加入pH5.8的1M MES使反應(yīng)終止。在裝有96孔平板讀數(shù)器的Perkin-Elmer LS-50B熒光計(jì)(激發(fā)波長(zhǎng)325nm；發(fā)射波長(zhǎng)423nm)上監(jiān)測(cè)N-末端產(chǎn)品的熒光。然后將使用希爾模型的非線性曲線擬合用于％抑制-濃度數(shù)據(jù)，并通過(guò)使用SAS(數(shù)據(jù)軟件系統(tǒng)；SAS協(xié)會(huì)，Inc-Cary,N.C.)計(jì)算50％有效濃度(IC50)。實(shí)施例33基于NS3蛋白酶細(xì)胞的測(cè)定用Huh-7細(xì)胞進(jìn)行該測(cè)定，此細(xì)胞來(lái)源于肝癌的人細(xì)胞系，用2 DNA構(gòu)件共轉(zhuǎn)染-一種表達(dá)多蛋白的構(gòu)件(叫做NS3)，該蛋白包含與按下列頁(yè)序NS3-NS4A-NS4B-NS5A-tTA的tTA融合的HCV非結(jié)構(gòu)蛋白；-另一種在tTA控制下表達(dá)報(bào)道蛋白、分泌堿性磷酸酶的構(gòu)件(叫做SEAP)。
必須通過(guò)用于成熟蛋白酶釋放的NS3蛋白酶使多蛋白裂解。在成熟蛋白釋放時(shí)，一般認(rèn)為病毒蛋白會(huì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜上形成一種復(fù)合體，同時(shí)tTA將向核遷移并反式激活SEAP基因。因此，NS3蛋白酶解活性的降低將導(dǎo)致成熟tTA水平下降和伴隨SEAP活性降低。
為了控制化合物的其它作用，進(jìn)行了平行轉(zhuǎn)染，而將僅表達(dá)tTA的構(gòu)件(叫做tTA)與SEAP構(gòu)件共轉(zhuǎn)染以便SEAP活性不依賴于NS3蛋白酶解活性。
測(cè)定方法使用FuGene方法(Boehringer Mannheim)將Huh-7細(xì)胞(生長(zhǎng)在CHO-SFMII+10％FCS(胎牛血清)中)與NS3和SEAP或者與tTA和SEAP共轉(zhuǎn)染。在37℃放置5小時(shí)后，洗滌細(xì)胞，進(jìn)行胰蛋白酶消化、并在含一定濃度范圍的試驗(yàn)化合物的96孔平板中制板(80000細(xì)胞/孔)。為期24小時(shí)的培養(yǎng)后，抽取等份培養(yǎng)基，并用Phospha-Light試劑盒(Ttopix)測(cè)定此等份中的SEAP活性。
用SAS軟件分析關(guān)于化合物濃度的SEAP活性的百分抑制得到EC50。
然后用下列MTT測(cè)定法測(cè)定化合物的毒性(TC50)每孔中加入20μL MTT溶液(5mg/ml培養(yǎng)基)并在37℃培養(yǎng)4小時(shí)；去除培養(yǎng)基，并加入50μL 0.01N HCl+10％Triton X-100；在室溫下?lián)u動(dòng)至少1小時(shí)后在595nm波長(zhǎng)處讀取每個(gè)孔的OD。
按與EC50同樣的方法計(jì)算TC50。實(shí)施例34特異性測(cè)定測(cè)定化合物對(duì)抗各種絲氨酸蛋白酶的特異性，這些蛋白酶為人白細(xì)胞彈性蛋白酶、豬胰腺?gòu)椥缘鞍酌负团Ｒ认佴撩拥鞍酌负鸵环N半胱氨酸蛋白酶人肝臟B組織蛋白酶。在所有情況下均使用對(duì)每種酶特異的比色的對(duì)硝基苯胺(pNA)底物的96孔平板式方法，每種測(cè)定包括1小時(shí)于30℃的酶抑制劑預(yù)培養(yǎng)、然后加入底物并水解至UV Thermomax微板讀數(shù)器所測(cè)定的約30％轉(zhuǎn)化。盡可能使底物濃度保持可與KM相比的低水平、以減少底物的競(jìng)爭(zhēng)。根據(jù)化合物的效價(jià)，其濃度可在300--0.06μM不等。每種測(cè)定的最終條件如下50 mM Tris-HCl pH8,0.5 M Na2SO4,50mM NaCl,0.1 mMEDTA,3％DMSO,0.01％Tween-20與；[100mM Succ-AAPF-pNA和250pMα糜蛋白酶]，[133μM Succ-AAA-pNA和8nM豬彈性蛋白酶],[133μM Succ-AAA-pNA和8nM白細(xì)胞彈性蛋白酶]；或。
有關(guān)豬胰腺?gòu)椥缘鞍酌傅拇硇岳涌偨Y(jié)如下用Biomek液體操作器(handler)(Beckman)在聚苯乙烯平底96孔平板中加入·40μL測(cè)定緩沖液(50mM Tris-HCl pH8,50mM NaCl,0.1 mM EDTA)·20μL酶溶液(50mM Tris-HCl pH8,50mM NaCl,0.1 mMEDTA,0.02％Tween-20,40nM豬胰腺?gòu)椥缘鞍酌?；和·20μL抑制劑溶液(50mM Tris-HCl pH8,50mM NaCl,0.1 mMEDTA,0.02％Tween-20,1.5mM-0.3μM抑制劑，15％v/v DMSO)。
在30℃預(yù)培養(yǎng)60分鐘后，在每孔中加入20μL底物溶液(50mMTris/HCl pH8,0.5 M Na2SO4,50mM NaCl,0.1 mM EDTA,655μM Succ-AAA-pNA)，并將該反應(yīng)在30℃進(jìn)一步培養(yǎng)60分鐘，然后在UVThermomax板讀數(shù)器上讀取吸光度。將各排孔分配為對(duì)照(無(wú)抑制劑)和空白(無(wú)抑制劑和酶)。
通過(guò)液體操作器、用50mM Tris-HCl pH8,50mM NaCl,0.1mMEDTA,0.02％Tween-20,15％DMSO在分離平板上對(duì)抑制劑溶液依序進(jìn)行的2倍稀釋。所有其它特異性測(cè)定按同樣方式進(jìn)行。
采用下式計(jì)算抑制百分比[1-((UV抑制-UV空白)/(UV對(duì)照-UV空白)×100]將與希爾模型擬合的非線性曲線用于抑制-濃度數(shù)據(jù)，通過(guò)使用SAS軟件(數(shù)據(jù)軟件系統(tǒng)；SAS協(xié)會(huì)，Inc.Cary,N.C.)計(jì)算50％有效濃度(IC50)。
化合物表在實(shí)施例31測(cè)定法和實(shí)施例32測(cè)定法之一或兩者中對(duì)本發(fā)明化合物進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物小于50μM(4)、5μM(B)或0.5μM(C)的IC50具有活性。細(xì)胞中的活性和特異性本發(fā)明的一些有代表性化合物也在實(shí)施例33的基于替代細(xì)胞測(cè)定法和實(shí)施例34的一種或幾種測(cè)定法中進(jìn)行了測(cè)試。例如，發(fā)現(xiàn)表2的化合物233在實(shí)施例32的測(cè)定法中測(cè)得1nM的IC50。通過(guò)實(shí)施例33的測(cè)定法所測(cè)定的EC50為5.4μM，而在高達(dá)120μM的濃度時(shí)無(wú)法檢測(cè)到其它作用(tTA)。在MTT測(cè)定法中也對(duì)化合物233進(jìn)行了測(cè)試，其測(cè)出TC50大于120μM，這表明該化合物在其有效濃度時(shí)沒(méi)有毒性。在實(shí)施例34的特異性測(cè)定中，發(fā)現(xiàn)同一化合物具有下列活性HLE＞75μM；PE＞75μM；α-Chym.＞75μM；Cat.B＞75μM.
這些結(jié)果顯示此化合物族對(duì)NS3蛋白酶具有高度特異性。
下表列出了本發(fā)明的代表性化合物。使用了下列縮寫(xiě)MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)；Ac乙?；?；Bn芐基；Chg環(huán)己基甘氨酸(2-氨基-2-環(huán)己基-乙酸)；Dnl丹磺酰；O-Bn芐氧基；Pip:2-哌啶酸；Tbg叔丁基甘氨酸。
表1

表2 *Br異構(gòu)體比率5.5∶2
表3 表4
表5
權(quán)利要求
1．一種式(Ⅰ)化合物，包括外消旋物、非對(duì)映異構(gòu)體和旋光異構(gòu)體、或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯 其中a為0或1；b為0或1；Y為H或C1-6烷基；B為H、式R7-C(O)-的?；苌锘蚴絉7-SO2的磺?；苌铮渲蠷7為(ⅰ)可不被取代或被羧基、C1-6鏈烷醇氧基(alkanoyloxy)或C1-6烷氧基取代的C1-10烷基；(ⅱ)可不被取代或被羧基、(C1-6烷氧基)羰基或苯基甲氧羰基取代的C3-7環(huán)烷基；(ⅲ)C6或C10芳基或C7-16芳烷基、可不被取代或被C1-6烷基、羥基、或可不被取代或被C1-6烷基取代的氨基取代；或(ⅳ)可不被取代或被C1-6烷基、羥基、可不被取代或被C1-6烷基取代的氨基、或可不被取代或被C1-6烷基取代的酰氨基取代的Het；R6，當(dāng)存在時(shí)，它是用羧基取代的C1-6烷基；R5，當(dāng)存在時(shí)，它是可被羧基取代或不取代的C1-6烷基；R4是C1-10烷基、C3-7環(huán)烷基或C4-10(烷基環(huán)烷基)；R3是C1-10烷基、C3-7環(huán)烷基或C4-10(烷基環(huán)烷基)；R2為CH2-R20、NH-R20、O-R20或S-R20，其中R20為可不被取代或被R21單、二或三取代的飽和或不飽和的C3-7環(huán)烷基或C4-10(烷基環(huán)烷基)，或R20為C6或C10芳基或C7-16芳烷基可不被取代或被R21單、二或三取代，或R20為可不被取代或被R21單、二或三取代的Het或(低級(jí)烷基)-Het，其中每個(gè)R21各自為C1-6烷基；C1-6烷氧基；可不被取代或被C1-6烷基單或二取代的氨基；磺?；?；NO2；OH；SH；鹵素；鹵代烷基；可不被取代或被C1-6烷基、C6或C10芳基、C7-16芳烷基、Het或(低級(jí)烷基)-Het單取代的酰氨基；羧基；羧(低級(jí)烷基)；C6或C10芳基，C7-16芳烷基或Het，所述的芳基、芳烷基或Het均可不被取代或被R22取代；其中R22是C1-6烷基；C1-6烷氧基；可被C1-6烷基取代或不取代的氨基；磺?；籒O2；OH；SH；鹵素；鹵烷基；羧基；酰胺基；(低級(jí)烷基)酰胺基；R1是可被鹵素取代或不取代的C1-6烷基或C2-6鏈烯基；和W為羥基或N-取代的氨基。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中，B為H或式R7C(O)-的?；苌?，其中R7為C1-6烷基；C1-6烷氧基；可被羥基取代或不取代的C3-7環(huán)烷基；可被C1-6烷基或Het取代或不取代的酰氨基；C6或C10芳基、C7-16芳烷基或Het，它們均可被C1-6烷基或羥基取代或不取代。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的化合物，其中R7為C1-6烷基或Het。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的化合物，其中所述的Het是選自下組
5．根據(jù)權(quán)利要求2的化合物，其中B選自H；乙酰；
6．根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，其中B為乙?；?。
7．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中B為R7-SO2,R7為C6或C10芳基、C7-16芳烷基或Het，它們均可被C1-6烷基取代或不取代。
8．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中當(dāng)R6存在時(shí)，它是Asp或Glu的側(cè)鏈。
9．根據(jù)權(quán)利要求8的化合物，其中當(dāng)R6存在時(shí)，它是Asp的側(cè)鏈。
10．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中a為0、并且沒(méi)有R6。
11．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中，當(dāng)R5存在時(shí)，它是一種氨基酸的側(cè)鏈，該氨基酸選自D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Val、L-Val、D-叔-丁基甘氨酸(Tbg)和L-Tbg。
12．根據(jù)權(quán)利要求11的化合物，其中當(dāng)R5存在時(shí)，它是D-Asp、D-Val或D-Glu的側(cè)鏈。
13．根據(jù)權(quán)利要求12的化合物，其中當(dāng)R5存在時(shí)，它是D-Glu的側(cè)鏈。
14．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中a為0且b為0，并且均不存在R6和R5。
15．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R4是一種氨基酸的側(cè)鏈，該氨基酸選自Val、環(huán)己基甘氨酸(Chg)、Tbg、Ile或Leu。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的化合物，其中R4是Chg或Ile的側(cè)鏈。
17．根據(jù)權(quán)利要求16的化合物，其中R4是Chg的側(cè)鏈。
18．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中Y是H或Me。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的化合物，其中Y是H。
20．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R3是一種氨基酸的側(cè)鏈，該氨基酸選自Ile、Chg、Val或Tbg。
21．根據(jù)權(quán)利要求20的化合物，其中R3是Val、Chg或Tbg的側(cè)鏈。
22．根據(jù)權(quán)利要求21的化合物，其中R3是Val或Tbg的側(cè)鏈。
23．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R2是S-R20、O-R20，其中R20為C6或C10芳基、C7-16芳烷基、Het或-CH2-Het，它們均可被R21單、二或三取代或不取代；其中R21為C1-6烷基；C1-6烷氧基；氨基、單或二(低級(jí)烷基)氨基；可被C1-6烷基、C6或C10芳基、C7-16芳烷基、Het或(低級(jí)烷基)-Het單取代或不取代的酰氨基；NO2；OH；鹵素；三氟甲基；羧基；C6或C10芳基，C7-16芳烷基，或Het，所述的芳基、芳烷基或Het可被R22取代或不取代；其中R22為C1-6烷基；C1-6烷氧基；氨基；單或二(低級(jí)烷基)氨基；(低級(jí)烷基)酰胺；NO2；OH；鹵素；三氟甲基；羧基。
24．根據(jù)權(quán)利要求23的化合物，其中R21為C1-6烷基；C1-6烷氧基；氨基、二(低級(jí)烷基)氨基；(低級(jí)烷基)酰胺；C6或C10芳基，或Het，所述的芳基或Het可被R22取代或不取代；其中R22為C1-6烷氧基；氨基；二(低級(jí)烷基)氨基；(低級(jí)烷基)酰胺；鹵素或三氟甲基。
25．根據(jù)權(quán)利要求23的化合物，其中R2為1-萘甲氧基；2-萘甲氧基；芐氧基；1-萘氧基；2-萘氧基；或喹啉氧基，可被R21單或二取代或不取代，其中R21如權(quán)利要求23所述。
26．根據(jù)權(quán)利要求23的化合物，其中為R2為1-萘甲氧基；喹啉氧基，被R21單或二取代或不取代，其中R21如權(quán)利要求23所述。
27．根據(jù)權(quán)利要求26所述的化合物，其中R2為 其中R21A為可被C1-6烷基、C6或C10芳基、C7-16芳烷基或Het取代或不取代的酰氨基；可被R22取代或不取代的C6或C10芳基或Het，且R22為氨基、二(低級(jí)烷基)氨基；或(低級(jí)烷基)酰胺；R21B為C1-6烷基；C1-6烷氧基；氨基；二(低級(jí)烷基)氨基；(低級(jí)烷基)酰胺；NO2；OH；鹵素；三氟甲基或羧基。
28．根據(jù)權(quán)利要求27的化合物，其中R21A為C6或C10芳基或Het，它們均可被R22取代或不取代而R22為氨基、二甲基氨基或乙酰氨基。
29．根據(jù)權(quán)利要求27的化合物，其中R21B為C1-6烷氧基或二(低級(jí)烷基)氨基。
30．根據(jù)權(quán)利要求29的化合物，其中R21B為甲氧基。
31．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中位置1上的不對(duì)稱碳原子具有R構(gòu)型，它以下列絕對(duì)構(gòu)型表示 其中R1如權(quán)利要求1所述。
32．根據(jù)權(quán)利要求31的化合物，其中P1上的R1取代基與羰基以順式定向如下列絕對(duì)構(gòu)型表示 其中R1為甲基、乙基、丙基、乙烯基，它們均可被鹵素取代或不取代。
33．根據(jù)權(quán)利要求32的化合物，其中R1為乙基、乙烯基或溴乙烯基。
34．根據(jù)權(quán)利要求33的化合物，其中R1為乙烯基。
35．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中W為羥基或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯；或(低級(jí)烷基)氨基、二(低級(jí)烷基)氨基或氨基芳烷基。
36．根據(jù)權(quán)利要求33的化合物，其中W為羥基、或N(R13a)R13b，其中R13a和R13b各自為H、芳基或可被羥基或苯基取代或不取代的C1-6烷基；或其藥學(xué)上可接受的鹽。
37．根據(jù)權(quán)利要求36的化合物，其中W為-OH、-NH-芐基或-NH-CH(Me)Ph。
38．根據(jù)權(quán)利要求37的化合物，其中W為-OH或-NH-(S)CH(Me)-苯基。
39．根據(jù)權(quán)利要求38的化合物，其中當(dāng)W為一種酯時(shí)，所述的酯選自C1-6烷氧基、苯氧基、或芳基(C1-6烷氧基)。
40．根據(jù)權(quán)利要求39的化合物，其中所述的酯是甲氧基、乙氧基、苯氧基、芐氧基或PhCH(Me)-O-。
41．根據(jù)權(quán)利要求1的式Ⅰ化合物，其中B為H、低級(jí)烷基-C(O)-或Het-C(O)-；R6，當(dāng)它存在時(shí)，它是Asp或Glu的側(cè)鏈；R5，當(dāng)它存在時(shí)，它是D-或L-Asp、Glu、Val或Tbg的側(cè)鏈；Y是H或甲基；R4是Val、Chg、Tbg、Ile或Leu的側(cè)鏈；R3是氫或Ile、Chg、Val或Tbg的側(cè)鏈；R2是1-萘甲氧基、2-萘甲氧基、O-Bn、 其中R22為氨基、二(低級(jí)烷基)氨基、(低級(jí)烷基)酰胺、NO2、OH、鹵素、CF3或COOH；P1為下式的環(huán)丙基環(huán)系統(tǒng) 其中R1為乙基、乙烯基或溴乙烯基；和W為羥基或N(R13a)R13b，其中R13a和R13b各自為H、芳基或者可被羥基或苯基取代或不取代的C1-6烷基；或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯。
42．根據(jù)權(quán)利要求1的式Ⅰ化合物，其中B為H、乙酰基或Het-C(O)-；R6，當(dāng)它存在時(shí)，它是Asp的側(cè)鏈；R5，當(dāng)它存在時(shí)，它是D-Asp、D-Glu、或D-Val的側(cè)鏈；Y是H；R4是Chg或Ile的側(cè)鏈；R3是Val、Chg或Tbg的側(cè)鏈；R2是1-萘甲氧基、芐氧基、4-喹啉氧基、或 P1為下式的環(huán)丙基環(huán)系統(tǒng) 其中R1為Et或CH=CH2或CH=CHBr；和W為羥基或NH-(S)-CHMePh，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
43．根據(jù)權(quán)利要求1的式Ⅰ化合物，其中B為乙?；?；R6，當(dāng)它存在時(shí)，它是Asp的側(cè)鏈；R5，當(dāng)它存在時(shí)，它是D-Glu的側(cè)鏈；Y是H；R4是Chg的側(cè)鏈；R3是Val或Tbg的側(cè)鏈；R2是式 P1為 ；和W為羥基，或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯。
44．根據(jù)權(quán)利要求41的化合物，它由下式表示式見(jiàn)原文第94頁(yè) 其中B,P6,P5,P4,P3,R2，和R1定義如下表1 BP6P5 P4P3 R2R1P1化合物 C1-C2101 Ac ----Chg Val OBn Et 1R,2R102 Ac ----Chg Val OBn Et 1R,2？103 Ac ----Chg Chg 1-NpCH2O Et 1R,2？104 Ac ----Chg Chg 1-NpCH2O Et 1R,2R105 Ac ----Chg Chg 1-NpCH2O Et 1S,2S106 Ac ----Chg Val 1-NpCH2O Me 1R,2？107 Ac ----Chg Val 1-NpCH2OCHMe21R,2？108 Ac Asp D-Glu Chg Chg 1-NpCH2O Et 1R,2R109 Ac ----Chg Val 1-NpCH2OCH2O1R,2？CH2Ph110 Ac ----Chg Val 1-NpCH2OCH2OCH21R,2？Ph111 Ac ----Chg Val 1-NpCH2O(CH2)21R,2？Ph112 Ac ----Chg Val 1-NpCH2O Et 1R,2R113 Ac ----Chg Val 1-NpCH2O Et 1S,2S114 Ac ----Chg Val 1-NpCH2O Bn 1R,2？115 Ac ----Chg Val 1-NpCH2O Bn 1R,2？116 Ac Asp D-Glu Ile Val OBn Et 1R,2R117 Ac Asp D-Glu Chg Val 1-NPCH2O Et 1R,2R表1 BP6P5P4P3 R2R1P1化合物C1-C2118Ac----Chg Val1-NpCH2O Pr 1R,2？119Ac----Chg Val1-NpCH2O Pr 1R,2？120AcAsp D-Val Chg Val1-NpCH2O Et 1R,2R
45.權(quán)利要求41的化合物，由下式表示 其中P6,P5,P4,P3,R2，和R1定義如下表2 P6P5P4 P3 R2R1化合物201----ChgValOBn CH=CH2202----ChgChg 1-NpCH2O CH=CH2203----ChgVal 1-NpCH2O CH=CH2204----ChgValOBn CH=CHBr*表2 P6 P5 P4 P3 R2R1化合物 表2 P6 P5 P4P3 R2R1化合物 表2 P6P5 P4P3 R2R1化合物 表2 P6 P5P4 P3 R2R1化合物
48.權(quán)利要求41的化合物，由下式表示 其中B,P6,P5,P4,P3,R2,R1和W定義如下
47.權(quán)利要求41的化合物，由下式表示 其中B,Y,P4,P3,R2，和R1定義如下
48.權(quán)利要求41的化合物，由下式表示 其中B和R20定義如下
49．一種如權(quán)利要求44所述式Ⅰ的六肽，它選自化合物#:116；117；和120。
50．一種如權(quán)利要求45所述式Ⅰ的六肽，它選自化合物#:212；222；236；和238。
51．一種如權(quán)利要求46所述式Ⅰ的六肽，它選自化合物#:301和302。
52．一種如權(quán)利要求44所述式Ⅰ的四肽，它選自化合物#:122；和123。
53．一種如權(quán)利要求45所述式Ⅰ的四肽，它選自化合物#:202；203；205；206；207；208；209；210；211；214；215；216；218；219；220；221；223；224；225；226；228；229；230；231；232；233；234；235。
54．一種如權(quán)利要求47所述式Ⅰ的四肽，它選自化合物#:401。
55．一種如權(quán)利要求或48所述式Ⅰ的四肽，它選自化合物#:501；502；503；504；505；506；507；508；509；510和511。
56．一種藥物組合物，包括病毒學(xué)上有效量的抗丙型肝炎的權(quán)利要求1所述式Ⅰ化合物、或其治療上可接受的鹽或酯，以及包括藥學(xué)上可接受的載體介質(zhì)或輔助劑。
57．一種治療哺乳動(dòng)物丙型肝炎病毒感染的方法，即給哺乳動(dòng)物服用病毒學(xué)上有效量的抗丙型肝炎的權(quán)利要求1所述式Ⅰ化合物、或其治療上可接受的鹽或者酯或者上述組合物。
58．一種抑制丙型肝炎病毒復(fù)制的方法，將病毒暴露于丙型肝炎病毒的NS3蛋白酶抑制量的權(quán)利要求1所述式Ⅰ化合物、或其治療上可接受的鹽或酯、或權(quán)利要求56所述的組合物。
59．一種治療哺乳動(dòng)物丙型肝炎病毒感染的方法，即給該哺乳動(dòng)物服用病毒學(xué)上有效量的抗丙型肝炎的權(quán)利要求1所述式Ⅰ化合物、或其治療上可接受的鹽或酯、以及干擾素的組合物。
60．根據(jù)權(quán)利要求56所述的藥物組合物，還包括第二抗病毒劑。
61．根據(jù)權(quán)利要求60所述的藥物組合物，其中第二抗病毒劑是病毒唑或金剛胺。
62．根據(jù)權(quán)利要求56所述的藥物組合物，還包括其它HCV蛋白酶的抑制劑。
63．根據(jù)權(quán)利要求56所述的藥物組合物，還包括HCV生存期中其它目標(biāo)的抑制劑，選自解旋酶、聚合酶、金屬蛋白酶或IRES。
64．一種制備權(quán)利要求1的式(Ⅰ)的肽類(lèi)似物的方法，其中P1是取代的氨基環(huán)丙基羧酸殘基，該方法包括下列步驟·將選自APG-P6-P5-P4-P3-P2、APG-P5-P4-P3-P2、APG-P4-P3-P2、APG-P3-P2和APG-P2的肽；·與下式P1中間體偶聯(lián) 其中R1為可被鹵原子取代或不取代的C1-6烷基或C2-6鏈烯基，CPG是羧基保護(hù)基團(tuán)、P6-P2如權(quán)利要求1所定義。
65．一種制備權(quán)利要求1的式(Ⅰ)的肽類(lèi)似物的方法，其中P1是取代的氨基環(huán)丙基羧酸殘基，該方法包括下列步驟·將選自APG-P6-P5-P4-P3-P2、APG-P5-P4-P3-P2、APG-P4-P3-P2、APG-P3-P2和APG-P2的肽；·與下式P1中間體偶聯(lián) 其中R1為乙基、乙烯基或溴乙烯基，CPG是羧基保護(hù)基團(tuán)、P6-P2如權(quán)利要求1所定義。
66．一種制備權(quán)利要求1的式(Ⅰ)的肽類(lèi)似物的方法，其中P1是取代的氨基環(huán)丙基羧酸殘基，該方法包括下列步驟·將選自APG-P6-P5-P4-P3-P2、APG-P5-P4-P3-P2、APG-P4-P3-P2、APG-P3-P2和APG-P2的肽；·與下式P1中間體偶聯(lián) 其中CPG是羧基保護(hù)基團(tuán)、P6-P2如權(quán)利要求1所定義。
67．根據(jù)權(quán)利要求64、65或66的方法，其中所述的羧基保護(hù)基團(tuán)(CPG)選自烷基酯、芳烷基酯、和可通過(guò)弱堿法或輕度還原法裂解的酯。
68．下式的氨基酸類(lèi)似物用于制備權(quán)利要求1所述式Ⅰ化合物的應(yīng)用 其中R1為可被鹵原子取代或不取代的C1-6烷基或C2-6鏈烯基。
69．下式的氨基酸類(lèi)似物用于制備權(quán)利要求1所述式Ⅰ化合物的應(yīng)用 其中R1為乙基、乙烯基或溴乙烯基。
70．下式的氨基酸類(lèi)似物用于制備權(quán)利要求1所述式Ⅰ化合物的應(yīng)用
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于治療丙型肝炎病毒(HCV)感染的式(Ⅰ)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯,其中a為0或1;b為0或1;Y為H或C
文檔編號(hào)A61K38/00GK1315965SQ99810449
公開(kāi)日2001年10月3日 申請(qǐng)日期1999年8月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月10日
發(fā)明者蒙特斯·林納斯-布魯內(nèi)特, 默里·D·貝利, 戴爾·卡梅倫, 埃莉斯·吉羅, 納塔利·古德若, 馬克-安德烈·波帕特, 瓊·蘭考特, 揚(yáng)拉·S·桑特雷佐斯 申請(qǐng)人:貝林格爾·英格海姆加拿大有限公司