專利名稱：凋亡相關(guān)疾病的治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于抑制凋亡的藥劑，其包括一種屬于midkine家族的蛋白質(zhì)作為有效成分，而且本發(fā)明還涉及用于治療或預(yù)防凋亡相關(guān)疾病的藥劑。
背景技術(shù)：
由于與壞死的形態(tài)學(xué)差別而發(fā)現(xiàn)了凋亡(Kerr,J.F.R.等英國癌癥雜志(Brit.J.Cancer),26:239-257,1972)。在壞死中，整個細胞以及線粒體逐漸脹大而且發(fā)生細胞質(zhì)的改變。最后，細胞膜崩解引起細胞溶解，通常伴有炎癥。相反，在凋亡中，最早的改變發(fā)生在細胞核中，而且細胞核和細胞均皺縮。在細胞質(zhì)中，細胞器例如線粒體仍保持正常。最終，形成凋亡小體，細胞完全被巨噬細胞或鄰近的吞噬細胞吞噬。無炎癥發(fā)生。
壞死為一種“病理性細胞死亡”，其中被病理性因素例如燒傷所損傷的一群細胞同時死亡，而凋亡為一種“生理性細胞死亡”，其不僅由病理性因素引起，而且由各種生理性因素例如發(fā)育、免疫或激素作用引起。凋亡在時間和部位上隨機散在發(fā)生，而且作為對生物學(xué)現(xiàn)象至關(guān)重要的一種細胞死亡發(fā)揮重要的作用。
凋亡不僅在形態(tài)學(xué)上與壞死不同，而且在功能上也不同，其在組織中同與其對應(yīng)的細胞分裂一起在細胞動力學(xué)上發(fā)揮重要的功能。因此，凋亡性異常與各種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。與凋亡減少相關(guān)的疾病包括癌癥、自身免疫病、病毒感染等。凋亡增加可以引起獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、阿耳茨海默病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、色素性視網(wǎng)膜病、小腦變性、再生障礙性貧血、心肌梗死、腦卒中、再灌注損傷、酒精性肝病、牙周病等(Craig,B.T.科學(xué)(Science),267:1456-1462,1995)。自從1993年，在其它凋亡研究后出現(xiàn)了在區(qū)域性腦缺血模型(大鼠)中支持凋亡的報道(Linnik,M.D.等中風(fēng)(Stroke),24:2002-2009,1993；Li,Y.等大腦血流和代謝雜志(J.Cereb.Blood Flow.Metab.),15:389-379,1995；Linnik,M.D.等分子腦研究(Mol.Brain Res.),32:116-124,1995；Islam,N.等神經(jīng)科學(xué)通訊(Neurosci.Lett.),188:159-162,1995；Soriano,M.A.等神經(jīng)報道(Neuroreport),7:425-428,1996；Charriaut-Marlangue,C.等大腦血流和代謝雜志，16:186-194,1996；Du,C.等大腦血流和代謝雜志，16:195-201,1996)。
最近，已經(jīng)通過誘導(dǎo)或抑制凋亡嘗試對凋亡相關(guān)疾病進行治療或預(yù)防。例如，已知的方法包括通過給藥治療上有效且生理上可接受的二氧代哌嗪阻止或推遲凋亡的方法(WO95/03054)、通過由凋亡相關(guān)基因誘導(dǎo)或抑制凋亡治療和預(yù)防凋亡相關(guān)疾病(WO96/12017)、通過提高細胞中Bcl-2的活性來治療或預(yù)防引起凋亡的疾病或病態(tài)的方法(WO94/27426)、通過給藥治療上有效劑量的新型Fas蛋白質(zhì)治療患者Fas介導(dǎo)的細胞死亡的方法(WO95/13701)、通過特異性結(jié)合人Fas抗原的一種單克隆抗體抑制Fas配體介導(dǎo)的凋亡的藥物組合物(WO95/10640)，等等。
發(fā)明公開無法提供治療眾多引起異常凋亡性細胞死亡的疾病的有效方法，所述的疾病包括上述所有的疾病。本發(fā)明的一個目的是提供一種通過抑制上述的凋亡來治療或預(yù)防凋亡相關(guān)疾病的方法。本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)midkine(MK)可以抑制由抑癌劑和缺血性應(yīng)激所引起的凋亡，由此完成本發(fā)明，所述的midkine為一種結(jié)合肝素的生長和分化因子，其具有多種生物學(xué)活性，例如軸突的延長、神經(jīng)細胞的存活以及血管內(nèi)皮細胞中纖維蛋白溶解系統(tǒng)的激活。
本發(fā)明涉及用于抑制凋亡的藥劑，其包括一種屬于MK家族的蛋白質(zhì)作為有效成分，更具體涉及(1)用于抑制凋亡的藥劑，其包括一種屬于MK家族的蛋白質(zhì)作為有效成分；(2)(1)的用于抑制凋亡的藥劑，其中屬于MK家族的蛋白質(zhì)為midkine；(3)用于治療或預(yù)防凋亡相關(guān)疾病的藥劑，其包括一種屬于MK家族的蛋白質(zhì)作為有效成分；(4)(3)的用于治療或預(yù)防凋亡相關(guān)疾病的藥劑，其中凋亡相關(guān)疾病為心臟??；(5)(3)的用于治療或預(yù)防凋亡相關(guān)疾病的藥劑，其中凋亡相關(guān)疾病為腎病；(6)(3)的用于治療或預(yù)防凋亡相關(guān)疾病的藥劑，其中凋亡相關(guān)疾病為肝??；(7)(3)的用于治療或預(yù)防凋亡相關(guān)疾病的藥劑，其中凋亡相關(guān)疾病為神經(jīng)變性疾??；(8)(3)至(7)的用于治療或預(yù)防凋亡相關(guān)疾病的藥劑，其中屬于MK家族的蛋白質(zhì)為midkine；以及(9)一種Bcl-2增強劑，包括屬于MK家族的蛋白質(zhì)作為有效成分。
本發(fā)明還涉及下述利用屬于MK家族的蛋白質(zhì)的方法。
本發(fā)明涉及通過給藥一種屬于MK家族的蛋白質(zhì)抑制凋亡的方法、通過給藥一種屬于MK家族的蛋白質(zhì)治療或預(yù)防凋亡相關(guān)疾病的方法，以及通過給藥一種屬于MK家族的蛋白質(zhì)增強Bcl-2表達的方法。
本發(fā)明進一步還涉及屬于MK家族的蛋白的下述用途。具體為，本發(fā)明涉及一種屬于MK家族的蛋白用于制備抑制凋亡的藥物組合物的用途、一種屬于MK家族的蛋白質(zhì)用于制備治療或預(yù)防凋亡相關(guān)疾病的藥物組合物的用途以及一種屬于MK家族蛋白質(zhì)用于制備增強Bcl-2的藥物組合物的用途。
本發(fā)明基于發(fā)明者發(fā)現(xiàn)MK，一種結(jié)合肝素的生長和分化因子，可以抑制由抑癌劑和缺血性應(yīng)激所引起的凋亡。因此，本發(fā)明的第一個方面為通過一種屬于MK家族的蛋白抑制凋亡。
Midkine被發(fā)現(xiàn)為一種基因的產(chǎn)物，所述基因在由視黃酸引起的胚胎腫瘤細胞的分化和誘導(dǎo)過程的早期階段被誘導(dǎo)表達(Kadomatsu,K.等生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.RES.Commun.),151:1312-1318,1988)。Pleiotrophin(PTN)發(fā)現(xiàn)于新生大鼠的腦中，是一種具有軸突延長能力的肝素結(jié)合蛋白質(zhì)(Rauvala,H.等歐洲分子生物學(xué)組織雜志(EMBOJ.)8:2933-2941,1989)。Midkine和Pleiotrophin都是肝素結(jié)合蛋白質(zhì)，能夠控制發(fā)育過程中的細胞增殖、存活和分化(Tomomura,M.等生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),265:10765-10770；Li,Y.等科學(xué)，250:1690-1694,1990；Rauvala,H.等歐洲分子生物學(xué)組織雜志，8:2933-2941,1989；Wellstein,A.等生物化學(xué)雜志，267,2582-2587,1992)。成熟的MK和PTN分別由123和136個氨基酸組成，其中富含基本氨基酸和半胱氨酸，相互之間具有50％的同源性(Tomomura,M.等生物化學(xué)雜志，265:10765-10770；Kuo,M.等生物化學(xué)(Biol.Chem.),265:18749-18752；Tsutsui,J.等生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊，176:792-797,1991)，并且組成了MK家族(Muramatsu,T.發(fā)育生長分化(Dev.Growth Differ.),36:1-8,1994)。
抑癌劑通過誘導(dǎo)凋亡殺傷細胞(Gunji,H.等癌癥研究(CancerRes.),51:747-743,1991；Kaufmann,S.H.癌癥研究，49:5870-5878,1989)。已知輻射和紫外線也能夠誘導(dǎo)凋亡(Miura,M.,Yamada,T.編輯實驗醫(yī)學(xué)增刊(Experimental Medicine Supplement)“術(shù)語庫凋亡”1996)。已經(jīng)證實由缺血引起的腦細胞的延遲神經(jīng)元死亡也是由于凋亡(神經(jīng)科學(xué)雜志(J.Neurosci.),19:4200-4210,1999)。
基于上述背景，本發(fā)明參照下列圖和表進行說明。

圖1顯示在用抑癌劑處理誘導(dǎo)凋亡的培養(yǎng)細胞中活細胞的數(shù)量(通過MTT法計數(shù))。與只用抑癌劑處理的對照組相比，在MK+抑癌劑處理組中，活細胞數(shù)依照MK的濃度而增加。圖2顯示了用抑癌劑處理誘導(dǎo)凋亡并用Hoechst33342染色的培養(yǎng)細胞。圖案B(培養(yǎng)12小時)和E(培養(yǎng)24小時)明確顯示在只用抑癌劑處理的對照組中染色質(zhì)的凝聚以及凋亡特異的凋亡小體的形成。相比之下，圖案C(培養(yǎng)12小時)和圖案F(培養(yǎng)24小時)顯示該現(xiàn)象在MK+抑癌劑處理組中受到抑制。圖3用數(shù)字說明了圖2的結(jié)果。結(jié)果表明，與僅用抑癌劑處理的對照組相比，在MK+抑癌劑處理組中凋亡細胞死亡率依MK的濃度而下降。
在培養(yǎng)的細胞系中，凋亡與細胞增殖相似，是由細胞周期控制的。在細胞周期中，G1期具有最低的DNA含量(2C)，而G2期的DNA含量是G1期的2倍(4C)。在S期，DNA含量依據(jù)DNA的合成率而介于2C和4C之間。在M期，DNA含量在細胞分裂過程中從4C降至2C。因此，通過用結(jié)合DNA的熒光染料(例如碘化丙啶、溴化乙錠等)對細胞進行染色并通過流式細胞儀(FACS)測定熒光強度來確定細胞DNA的含量可以確定在細胞周期中細胞的分布。在DNA染色之前，通過用70％乙醇固定而斷裂的低分子量DNA從細胞中滲漏，使得可以檢測到DNA含量低于G1期的凋亡細胞。本發(fā)明的發(fā)明者測定了存活細胞的DNA含量來確定細胞在G1、S和S/M期的分布。在MK存在或不存在的情況下，將神經(jīng)細胞暴露于紫外線，并用DNA結(jié)合的顏料進行染色，通過FACS檢測DNA來分析細胞周期。如在表1中所示，與對照組相比，在MK存在的情況下，G1期細胞的數(shù)量幾乎增加10倍，但在S期降低了八分之一到四分之一。這些結(jié)果表明MK抑制由紫外線或輻射誘導(dǎo)的細胞凋亡。
此外，MK可以減輕藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)病和肝病(國際專利申請PCT/JP98/01050號)。進行下述的分析來證實MK是否抑制在泌尿小管細胞中的凋亡。凋亡細胞以染色質(zhì)DNA在核小體(185bp)水平的斷裂為特征。通過TdT介導(dǎo)的dUTP-生物素切口末端標記(TUNEL方法)可以對斷裂DNA的量進行組織化學(xué)檢測。TUNEL方法通過用生物素-dUTP標記DNA的3’-OH末端檢測DNA。
將抑癌劑給藥MK基因敲除的小鼠，并制備表現(xiàn)強烈損傷的代表性組織小鼠腎臟的石蠟切片，通過TUNEL方法檢測DNA斷裂(原位凋亡檢測試劑盒；TaKaRa)。在給藥鹽水的組中存在一些TUNEL陽性細胞核，而在給藥MK的組中觀察到少得相當(dāng)多的TUNEL陽性細胞核(圖5)。在未處理的正常小鼠組中，未觀察到TUNEL陽性細胞核。這些結(jié)果表明MK可以抑制由抑癌劑引起的泌尿小管細胞凋亡。
本發(fā)明在MK存在下通過體外和體內(nèi)凋亡誘導(dǎo)實驗首次證實MK可以抑制由各種刺激引起的凋亡性細胞死亡。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地料想屬于MK家族的PTN可能類似地抑制凋亡，而通過進行已建立的凋亡實驗方法可以證實該假設(shè)。因此，PTN也包括在本發(fā)明之中。
本發(fā)明提供對于緩解或抑制凋亡有效的藥劑。本發(fā)明還包括給藥在治療上抑制或延遲凋亡有效數(shù)量的MK家族蛋白質(zhì)。體內(nèi)抑制凋亡的癥狀包括由正常血液循環(huán)下降導(dǎo)致的瞬時缺血中凋亡性細胞死亡的抑制以及再灌注損傷后在心肌、腦和腎臟中凋亡性細胞死亡的抑制。已知，凋亡是由于冠狀動脈阻塞而發(fā)生再灌注損傷的一個原因；由脊髓/頭部損傷引起的或伴隨之的重度癱瘓以及由其它損傷例如凍傷引起的再灌注損傷。MK家族對于治療這些凋亡相關(guān)疾病特別有效。MK家族對于治療被認為通過超氧化物歧化酶(SOD)或抗氧化劑可治療的適應(yīng)癥也有效。冠狀動脈阻塞后缺血性細胞損傷可以導(dǎo)致急性心肌梗死(AMI)。已知AMI在微小的區(qū)域內(nèi)引起栓子、血栓或局部壞死。隨后，由低血壓引起的突發(fā)的富氧血液不足影響心臟、腦、脾、腎、腸、肺和睪丸。直至最近，梗死相關(guān)的細胞死亡被認為是由缺血直接導(dǎo)致的。目前，已知凋亡是由缺血區(qū)中的組織以及富氧血在這些區(qū)域中的再灌注引起的。圖8和9顯示通過將MK給藥瞬時前腦缺血模型小鼠抑制了海馬區(qū)中的凋亡。此外，圖12顯示通過將MK給藥相同的缺血模型小鼠抑制了由凋亡引起的海馬區(qū)中的延遲神經(jīng)元死亡。這些結(jié)果提示屬于MK家族的蛋白質(zhì)可以抑制由缺血應(yīng)激引起的凋亡。
另外，圖16顯示甚至在缺血發(fā)生后通過將MK給藥缺血模型小鼠也抑制了凋亡。這說明屬于MK家族的蛋白可以是治療各種因凋亡而導(dǎo)致的疾病的有效藥物。
在蒙古沙鼠中觀察到MK減輕瞬時前腦缺血后的海馬延遲細胞死亡。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NGF和bFGF在該系統(tǒng)中改善延遲神經(jīng)元死亡(Shigeno,T.等，神經(jīng)科學(xué)雜志(J.Neurosci.),11:2914-2919,1991；Nakata,N.等腦研究(BrainRes.),605:354-356,1993)。用于保護所需的NGF靜脈注射劑量為10μg(Shigeno,T.等，神經(jīng)科學(xué)雜志，11:2914-2919,1991)，而對于bFGF需要用滲透性微型泵持續(xù)注射(Nakata,N.等腦研究，605:354-356,1993)。通過該方法檢測的MK在體內(nèi)表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)營養(yǎng)活性。
此外，給藥NGF對于在缺血損傷發(fā)生后7天挽救海馬神經(jīng)細胞不發(fā)生延遲神經(jīng)元死亡有效，然而在損傷后28天則無效(Ishimura,H.等腦研究，789:194-200,1998)。本發(fā)明的發(fā)明者證實MK即使在損傷后28天時也表現(xiàn)出顯著的活性。更重要的是，損傷后給藥的MK提高了神經(jīng)細胞的存活。
MK在體內(nèi)具有防止神經(jīng)細胞死亡的活性的事實提示可以將MK用作在大腦梗塞和神經(jīng)變性疾病中防止神經(jīng)細胞死亡的藥物。在性質(zhì)上MK蛋白為堿性的，其在一定程度上可以通過血腦屏障。已經(jīng)觀察到MK和NGF在促進胚胎神經(jīng)細胞的存活上的協(xié)同效應(yīng)(Michikawa,M.等神經(jīng)科學(xué)研究雜志(J.Neurosci.Res.)35:530-539,1993)。這提示同時給藥MK和其它神經(jīng)營養(yǎng)因子的可能性。
因此，在急性缺血的開始和在富氧血液的循環(huán)過程中或循環(huán)之后立即給藥屬于MK家族的蛋白質(zhì)也是有效的。
圖6的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示在培養(yǎng)細胞中MK增強了Bcl-2的表達。在用抑癌劑處理細胞時也觀察到這種表達增強。
在Tsujimoto等克隆了Bcl-2基因后(Tsujimoto.Y.等科學(xué)，226:1097-1099,1984),Bcl-2基因是在凋亡調(diào)節(jié)機制研究領(lǐng)域中研究最深入研究的基因之一。利用雙雜交方法等，根據(jù)在Bc1-2編碼區(qū)間的同源性已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了組成該家族的一些分子。通過結(jié)合這些分子以及分子間的相互作用，很多研究集中在控制凋亡的機制上。對該家族分子的鑒定增加了涉及Bcl-2的凋亡調(diào)節(jié)機制的復(fù)雜性，而且人們必須考慮各分子間的關(guān)聯(lián)和量的平衡以了解全局。
各種刺激可以誘導(dǎo)凋亡，例如癌基因，如p53抑癌基因、c-myc、ras等，抑癌劑、紫外線和輻射以及以Fas配體為代表的某些種類細胞因子。許多誘導(dǎo)信號最終匯入一個由凋亡執(zhí)行因子半胱天冬氨酸酶(caspase)和凋亡抑制因子Bcl-2家族控制的共同通路(Vaux,D.L.等自然(Nature),335:440-442,1998)。
在這些情況下，本發(fā)明提供了在由伴有凋亡的疾病或紊亂所影響的細胞中提高Bcl-2的藥劑，以及在癌癥或病毒感染細胞中降低Bcl-2活性以提高細胞對治療的敏感性的藥劑。
本發(fā)明利用了Bcl-2的凋亡抑制活性。針對很多種疾病的共同生理學(xué)機制是有效而經(jīng)濟的，因為這樣無須對每種特定的疾病研制不同的藥物。
用于實施該發(fā)明的MK和PTN可以是天然的、化學(xué)合成的或重組的蛋白質(zhì)等等。MK和PTN的氨基酸序列并不僅限于完整的序列。對MK和PTN可以進行部分修飾而不破壞它們的生物學(xué)功能。通過修飾，例如對序列中氨基酸的缺失、插入或置換，可以獲得生物學(xué)上與MK和PTN相似的基因。例如，修飾為在特定的位點對遺傳序列的改變，其產(chǎn)生在化學(xué)上等價的氨基酸。這樣的改變應(yīng)該基于氨基酸殘基間的相對相似性，包括疏水性、親水性、電荷和大小?？紤]這些特性，優(yōu)選的置換是本領(lǐng)域技術(shù)人員所共知的，其包括，但不限于，甘氨酸/丙氨酸、纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸、天門冬酰胺/谷氨酰胺、天門冬氨酸/谷氨酸、絲氨酸/蘇氨酸、賴氨酸/精氨酸以及苯丙氨酸/酪氨酸。
具有MK或PTN完整蛋白質(zhì)的至少一種功能的片段包括于本發(fā)明之中。例如，MK C-末端的60-121位的C-末端部分或62-104位的C-末端部分(Muramatsu,H.等生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊203:1131-1139,1994)具有軸突延長能力和肝素結(jié)合位點，其應(yīng)用屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)。本發(fā)明中的蛋白質(zhì)包括多肽。
此外，通過定點誘變可以制備MK或PTN的生物學(xué)或功能等價體。
通過在宿主細胞中表達克隆的MK或PTN而獲得的蛋白質(zhì)的修飾類型和程度主要取決于宿主細胞的翻譯后修飾能力以及在蛋白質(zhì)的氨基酸序列中存在的修飾信號。例如，眾所周知，在細菌細胞例如大腸桿菌中不發(fā)生糖基化。因此，當(dāng)需要糖基化時，通常將蛋白質(zhì)在真核細胞中表達。酵母或昆蟲細胞像哺乳動物細胞那樣通常進行翻譯后糖基化。本發(fā)明中所用的MK或PTN包括這些修飾。
在口服給藥蛋白質(zhì)例如MK或PTN時，它們在消化道內(nèi)迅速被蛋白酶快速消化。為了使MK或PTN在體內(nèi)穩(wěn)定，可以通過將其結(jié)合于水溶性大分子，例如聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮來制備雜合的MK或雜合的PTN。已經(jīng)制備了它們與IL-6或TNF-α的雜合體，而且通過篩選最適雜合條件已經(jīng)增強了其功能(Tsutsumi,Y.等英國癌癥雜志(Br.J.Cancer),74:1090-1095；Tsutsumi,Y.等控制釋放雜志(J.Control Release),33:447-451,1995)。
只要疾病與凋亡相關(guān)，并未特別限定由本發(fā)明的藥劑治療或預(yù)防的凋亡相關(guān)疾病。例如，藥劑可以用于腎小球腎炎，如急性腎小球腎炎、慢性腎小球腎炎、糖尿病性腎炎、腎小球硬化或紅斑狼瘡、由腎母細胞瘤、中毒或缺血引起的泌尿小管疾病、免疫相關(guān)疾病，如AIDS、由免疫抑制劑或抑癌劑引起的胸腺細胞異常、外周T細胞下降、或免疫缺陷疾病、循環(huán)器官疾病，例如血管狹窄或缺血；肝病，如由藥物或病毒感染引起的肝病、消化道疾病、神經(jīng)病，如由大腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)細胞疾病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、神經(jīng)變性疾病，如阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈病或帕金森病、神經(jīng)元發(fā)育疾病(精神病)等、伴隨器官或組織移植物的排斥；由細菌毒素、植物毒素或動物毒素引起的損傷；假斑禿、形態(tài)學(xué)異常；組織發(fā)生缺陷；組織萎縮等。上述疾病僅僅為實例，因此本發(fā)明用于治療凋亡相關(guān)疾病的藥劑不僅用于這些實例，而且其它疾病只要與凋亡相關(guān)也可使用。
本發(fā)明治療凋亡相關(guān)疾病的藥劑不僅可以用于治療而且可以用于預(yù)防這些疾病。
雖然根據(jù)經(jīng)驗可以確定有效濃度和劑量，但一天可以給藥大約1μg至100mg/kg一次或多次。確定劑量屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范疇。劑量取決于患者的性別、年齡、體重或狀態(tài)。將治療上有效劑量的MK溶于鹽水、磷酸鹽緩沖液(PBS)等中，可以通過靜脈給藥。其它給藥途徑包括口服、皮下、肌肉內(nèi)、粘膜、腹腔內(nèi)或直接給藥特定的器官，例如給藥心臟來治療心肌梗死伴發(fā)的細胞死亡，但是并不只限于此。
附圖簡述圖1顯示W(wǎng)ilms腫瘤衍生的G401細胞系在未處理組(對照組)、順鉑(100μM)處理組以及MK(1、10或100ng/ml)+順鉑(100μM)處理組中培養(yǎng)12和24小時的存活率，由通過MTT方法測定的吸光度(OD540-655)表示。
圖2顯示對在未處理組(對照組)、順鉑(100μM)處理組以及MK(1、10或100ng/ml)+順鉑(100μM)處理組中培養(yǎng)12和24小時的Wilms腫瘤衍生的G401細胞系的Hoechst 33342染色。圖案A、B和C分別顯示培養(yǎng)12小時的未處理組、順鉑處理組和MK+順鉑處理組。圖案D、E和F分別顯示培養(yǎng)24小時的未處理組、順鉑處理組和MK+順鉑處理組。
圖3顯示表現(xiàn)出細胞核內(nèi)染色質(zhì)凝聚和核碎片的凋亡性細胞死亡數(shù)量對細胞總數(shù)的百分比。
圖4顯示蘇木精-伊紅染色的129/Sv MK基因敲除小鼠(雜合子)(雄性，8至12周齡)腎臟切片。上午將鹽水(10ml)和MK(200μg)分別向鹽水給藥組和MK給藥組腹膜內(nèi)給藥，在下午將順鉑(9.3mg/kg)向各組腹膜內(nèi)給藥(第0天)。從第1天至第3天，將鹽水(10ml)和MK(200μg)向各組腹膜內(nèi)給藥。在第4天，取出腎臟，并用石蠟包埋制備切片。用蘇木精-伊紅對所獲的切片進行染色。從未處理的野生型小鼠中制備切片并用蘇木精-伊紅染色作為對照。
圖5顯示由TUNEL方法對石蠟包埋切片的分析。
圖6顯示由如下蛋白質(zhì)印跡方法對Wilms腫瘤衍生的G401細胞系中Bcl-2表達的分析。準備了6個組，由MK未處理組、人MK(100ng/ml)處理組和小鼠MK(100ng/ml)處理組組成的3個順鉑未處理組以及由MK未處理組、人MK(100ng/ml)處理組和小鼠MK(100ng/ml)處理組組成的3個順鉑(100μM)處理組。
圖7用數(shù)字顯示圖6的結(jié)果。
圖8顯示取自蒙古沙鼠得到的海馬區(qū)CA1神經(jīng)細胞，對所述的蒙古沙鼠在瞬時前腦缺血性損傷發(fā)生前即刻將鹽水或MK(各2μg)注射到腦室，在注射后7天通過TUNEL方法對海馬區(qū)CA1神經(jīng)細胞進行分析。顯微鏡的放大倍數(shù)為25倍。
圖9顯示相同的圖放大100倍。
圖10顯示取自蒙古沙鼠的海馬區(qū)CA1神經(jīng)細胞的蘇木精-伊紅(HE)染色切片。通過在瞬時前腦缺血性損傷發(fā)生前即刻向蒙古沙鼠的腦室中注射鹽水(a)、2μg MK(c)、1μg MK(d)、0.5μg MK(e)或0.25μg MK(f)制備切片并在注射后7天染色。短線的長度代表0.5mm。顯微鏡的放大倍數(shù)為25倍。
圖11顯示與圖10中相同的切片放大100倍。短線的長度代表50μm。
圖12顯示在圖10的海馬區(qū)CA1中HE染色的存活神經(jīng)細胞中細胞核的數(shù)量與CA1區(qū)的全長的比。n代表動物的數(shù)量。
圖13顯示在瞬時前腦缺血性損傷發(fā)生前即刻向腦室內(nèi)注射2μg MK后1、2、3和4周取自蒙古沙鼠的海馬CA1區(qū)中存活的神經(jīng)細胞數(shù)量與CA1區(qū)全長的比。
圖14顯示通過TUNEL方法分析的海馬區(qū)CA1中的神經(jīng)細胞。通過在瞬時前腦缺血性損傷發(fā)生前即刻向蒙古沙鼠的腦室中注射鹽水(a)、2μgMK(c)、1μg MK(d)或0.5μg MK(e)制備神經(jīng)細胞并在注射后7天進行分析。凋亡的細胞深染。短線的長度代表50μm。
圖15顯示海馬區(qū)CA1中凋亡細胞的數(shù)量與整個細胞數(shù)量的比。
圖16顯示海馬區(qū)CA1中存活神經(jīng)細胞的數(shù)量與CA1區(qū)長度的比。通過在蒙古沙鼠中瞬時前腦缺血性損傷發(fā)生后2、4、6、12和24小時向腦室內(nèi)注射2μg MK制備細胞，并在注射后7天對每種處理的存活細胞數(shù)進行計數(shù)。
實施本發(fā)明的最佳方式下面參考實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但不能認為將其限于此。
實施例1MK的制備(1)通過未審查公開的日本專利申請(JP-A)平9-95454號中實施例1的方法制備用于實施例2至7(1)的midkine(SEQ ID NO:3)。
(2)通過下述方法制備用于實施例7(2)至8的midkine。
為了制備人MK蛋白質(zhì)，將包括人MK開放讀框的cDNA片段(1-432位核苷酸，J.Tsutsui等生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊，176卷，792-797,1991)插入到酵母表達載體pPIC9(Invitrogen)中。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到酵母(畢赤酵母(Pichia pasrotis GS115；Research Corporation Technologies)中，并用組氨酸和G418篩選目的克隆。隨后利用柱色譜依下述順序?qū)湍阜置诘脚囵B(yǎng)基中的人MK蛋白質(zhì)進行純化。
1．SP Steamlines(Pharmacia；用20mM pH5.5的醋酸鹽緩沖液吸附并洗滌，用含NaCl的20mM pH3.5的醋酸鹽緩沖液洗脫)2．Sulfated Cellulofine(Seikagaku Kogyo，日本；用10mM pH7.2的磷酸鹽緩沖液吸附，用含0.7M NaCl的緩沖液洗滌，用含2.0M NaCl的緩沖液洗脫)3．Superdex 75pg(Pharmacia；用鹽水進行凝膠過濾)4．Poly Sulfoethyl A(Poly LC Co.；用含0.6M NaCl的20mM緩沖液吸附，用含0.88M NaCl的緩沖液洗滌，用含2M NaCl的緩沖液洗脫)。
5．Superdex 75pg(Pharmacia；用鹽水進行凝膠過濾)將Midkine制劑用鹽水透析，并將純化的蛋白質(zhì)按每份0.1ml分裝儲存于-80℃。在蛋白融化后立即使用，以免反復(fù)冷凍和融化。利用MK促進胚胎神經(jīng)元存活的活性作為指標對純化的MK蛋白質(zhì)的活性進行檢測(M.Michikawa，等神經(jīng)科學(xué)研究雜志(J.Neurosci.Res.)35,530-539,1993)。
實施例2對抑癌劑所誘導(dǎo)凋亡的抑制效應(yīng)(MTT方法)通過抑癌劑在由嬰兒腎癌Wilms腫瘤衍生的G401細胞系中誘導(dǎo)凋亡以通過MTT方法檢測MK的凋亡抑制效應(yīng)。
準備5個組未處理組、順鉑(100μM)處理組以及MK(1、10或100ng/ml)+順鉑處理組。
將G401細胞懸于含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco調(diào)整的Eagle培養(yǎng)基(10％FBS/DMEM)中，并以5000個細胞/孔接種于96孔板中。將培養(yǎng)板在CO2溫箱中溫育(37℃,5％CO2；本文中后面也用此條件)以便細胞能夠貼附于培養(yǎng)板。
用含有0.1％FBS的DMEM(0.1％FBS/DMEM)洗滌細胞兩次(以后除非特別說明，均將0.1％FBS/DMEM用于洗滌。)，并在0.1％FBS/DMEM中培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后，將MK以1、10或100ng/ml加入到MK處理組中。將各組培養(yǎng)6小時。向順鉑處理組中加入0.5mg/ml的順鉑(Bristol-Myers SquibCompany；東京)6μl(100μM)。將各組在0.1％FBS/DMEM中培養(yǎng)2小時。然后將細胞洗滌3次，并向MK處理組中加入MK至1、10或100n/gml。將各組在0.1％FBS/DMEM中培養(yǎng)12小時或24小時。
向上述5組的各孔中加入15μl的MTT試劑(5mg/ml)(Wako PureChemical Laboratories；大阪)并培養(yǎng)4小時。然后向各孔中加入100μl含有20％SDS的10mM鹽酸并在室溫放置24小時。利用微量培養(yǎng)板讀出器測定各孔的吸光度(OD540-655)。結(jié)果示于圖1中。
在12小時培養(yǎng)組中，與順鉑處理組相比，MK(1、10或100ng/ml)+順鉑(100μM)處理組顯示存活細胞數(shù)以MK濃度依賴的方式增加。這個結(jié)果揭示MK抑制由抑癌劑引起的細胞死亡。
實施例3對抑癌劑所誘導(dǎo)凋亡的抑制效應(yīng)(Hoechst染色方法)準備5個組未處理組、順鉑(100μM)處理組以及MK(1、10或100ng/ml)+順鉑處理組。
將G401細胞(2×104)接種于3.5cm培養(yǎng)皿中并在10％FBS/DMEM中培養(yǎng)過夜。向各培養(yǎng)皿中加入10％FBS/DMEM并繼續(xù)培養(yǎng)24到48小時。將細胞洗滌兩次并在0.1％FBS/DMEM中培養(yǎng)過夜。向MK處理組中加入MK至1、10或100ng/ml，并在0.1％FBS/DMEM中培養(yǎng)6小時。向順鉑處理組中加入順鉑至100μM，并在0.1％FBS/DMEM中培養(yǎng)2小時。培養(yǎng)后，將細胞洗滌3次。然后，向MK處理組中加入人MK至1、10或100ng/ml，并在0.1％FBS/DMEM中培養(yǎng)12小時或24小時。
用固定劑(甲醇∶乙酸=3∶1)將細胞在室溫下固定10分鐘，并在室溫下干燥30分鐘。向其中加入Hoechst 33342(ICN Biomedicals；Ohio，美國)在室溫下對細胞染色10到30分鐘。用水洗滌細胞3次，風(fēng)干并放置在熒光顯微鏡上(Olympus,BX60)并照相。圖2A、2B和2C顯示未處理組、順鉑(100μM)處理組以及MK(100ng/ml)+順鉑(100μM)處理組，這些組均培養(yǎng)了12小時。圖2D、2E和2F顯示未處理組、順鉑(100μM)處理組以及MK(100ng/ml)+順鉑(100μM)處理組，這些組均培養(yǎng)了24小時。與B和E相比，含有Hoechst 33342染色的細胞核并帶有凝聚染色質(zhì)和核碎片的細胞數(shù)在C和F中明顯降低。
圖3顯示死于凋亡并含有凝聚染色質(zhì)和核碎片的細胞核的細胞數(shù)與具有Hoechst 33342染色的細胞核的細胞總數(shù)之間的比。與順鉑(100μM)處理組相比，在培養(yǎng)了12小時和24小時的MK(1、10或100ng/ml)+順鉑(100μM)處理組中凋亡性細胞死亡的頻率均以MK濃度依賴的方式降低。在24小時培養(yǎng)組中，與12小時培養(yǎng)組相比，活細胞數(shù)也增加。
實施例4誘導(dǎo)凋亡的神經(jīng)細胞中DNA含量的測定將培養(yǎng)瓶用100ng/ml MK或10μg/ml MK進行包被。還準備了未用MK包被的培養(yǎng)瓶(對照)。
將小鼠神經(jīng)母細胞瘤C1300和膠質(zhì)瘤的雜交細胞(Nelson P.G.等腦研究，147:245,1978)NG108細胞系培養(yǎng)于含有10％FBS/DMEM的Falcon 3110細胞培養(yǎng)瓶(75cm2,BECTON DICKINSON)中直至細胞接近匯合。培養(yǎng)后，將細胞暴露于紫外線數(shù)小時(UV照射量60-100J/m2)以誘導(dǎo)凋亡。
通過離心收集細胞(4℃,100rpm,10min)，并用10到12ml的樣品緩沖液[1g葡萄糖/1L PBS(-)；用0.22μm濾器過濾]洗滌兩次。用樣品緩沖液將細胞調(diào)整為1×106至3×106個細胞/ml，并將其1ml在離心管(FALCON；15×75mm)中離心(4℃,1000rpm,10min)。棄掉上清液并將沉淀劇烈振蕩10秒。向其中滴加冰冷的乙醇(70％)(1ml)并在4℃固定過夜。
將固定過夜的細胞短暫振蕩并離心(3000rpm,5min)。將上清液中的70％乙醇棄掉至0.2ml或更少。緩慢振蕩含有細胞的離心管，并向其中加入1ml碘化丙錠(PI)染劑。PI染劑含有0.5ml的20×PI溶液、0.1ml的100×RNA酶A溶液以及10ml的樣品緩沖液。通過制備1mg/ml的PI溶液(SIGMA)，將其經(jīng)0.22μm濾器過濾并在4℃避光保存獲得PI的20倍稀釋物。通過將核糖核酸酶A(I-A型)(SIGMA)(10000U/ml)調(diào)整至125mg/ml(80U/ml)制備RNA酶A溶液(100×)。
將細胞輕輕晃動，在室溫下溫育30分鐘或更久，并通過流式細胞術(shù)進行檢測。結(jié)果示于表1中。與對照組相比，在MK存在下G1期細胞的比例增加大約10倍，而S期細胞的比例降低了八分之一到四分之一。這些結(jié)果表明MK可以抑制由紫外線或輻射誘導(dǎo)的細胞凋亡。。
表1各細胞周期中細胞的比例(％)

實施例5腎臟泌尿細胞中對凋亡的抑制效應(yīng)將其中破壞了MK基因的部分第2和第3外顯子的129/Sv雜合基因敲除小鼠(雄性，8至12周齡)(生物化學(xué)(Biochemistry)7,1997,68卷，1239頁，4-p-1244)分成2組鹽水給藥組和MK給藥組(每組14只小鼠)。制備未處理的野生型小鼠(4只小鼠)作為對照。MK的劑量為200μg/kg而鹽水的劑量為10ml/kg。
在上午將MK或鹽水向兩個組的小鼠腹膜內(nèi)給藥，在同一天的下午將順鉑9.3mg/kg向兩個組的小鼠腹膜內(nèi)給藥(該天為第0天)。
在第1天的上午，將MK或鹽水以與第1天相同的方式向各小鼠腹膜內(nèi)給藥。
在第2天，從各組(未處理的野生型小鼠組和兩個處理組)中選出4只小鼠收集尿液和全血。將所收集血液中的凝塊在37℃收縮1小時并離心(4℃,8000rpm,10min)以分離血清。將血清在-20℃保存直至實驗。從各小鼠中切除腎臟，用福爾馬林緩沖液固定(2到4天)，并利用自動包埋機(SAKURA,ETP-120A)用石蠟包埋。利用切片機(ERMA OPTICAL WORKSLTD,NO.1061)對石蠟包埋的腎臟進行切割以調(diào)節(jié)至4μm。至于兩組中的其余小鼠，將MK或鹽水以與第1天相同的方式腹膜內(nèi)給藥。
在第3天，以與第2天相同的方式從2個處理組的每個組中選出6只小鼠收集尿液和全血。從各小鼠中切除腎臟，并用石蠟包埋。至于兩組中的其余小鼠，將MK或鹽水以與第2天相同的方式腹膜內(nèi)給藥。
在第4天，即最后一天，從2個處理組的每個組中的4只小鼠收集尿液和全血。切除各小鼠的腎臟并用石蠟包埋。
對日常診斷中通常用作腎功能不全的指標的血液尿素氮(BUN)和血清肌酐進行測定，并對尿液中的蛋白質(zhì)進行簡單定量。用蘇木素-伊紅對腎臟的石蠟切片進行染色(圖4)。在MK給藥組中觀察到MK緩解由順鉑引起的腎功能不全的效應(yīng)。結(jié)果提示MK可以抑制腎臟泌尿小管細胞中的凋亡。隨后，進行了下述的實驗。
在第4天，通過TUNEL方法對腎臟石蠟切片中代表嚴重損傷的DNA斷裂進行分析(原位凋亡檢測試劑盒；TaKaRa)。結(jié)果示于圖5中。在鹽水給藥組中一些細胞核為TUNEL反應(yīng)陽性，而在MK給藥組中TUNEL陽性細胞數(shù)量顯著降低。在未處理的野生型組中未觀察到TUNEL陽性細胞核。這些結(jié)果顯示MK抑制在腎臟泌尿小管細胞中順鉑誘導(dǎo)的凋亡。
實施例6增強Bcl-2表達的效應(yīng)對MK在Bcl-2基因表達上的效應(yīng)進行了檢測。準備了6個組未處理組、順鉑(100μM)處理組、人MK(100ng/ml)處理組、人MK(100ng/ml)+順鉑(100μm)處理組、小鼠MK(100ng/ml)處理組以及小鼠MK(100ng/ml)+順鉑(100μm)處理組。
將G401細胞接種于3.5cm培養(yǎng)皿中并在10％FBS/DMEM中培養(yǎng)直至細胞接近匯合。將細胞洗滌兩次并在0.1％FBS/DMEM中培養(yǎng)過夜。然后，將人MK或小鼠MK(JP-A平8-196293號)以100ng/ml加入到MK處理組中并培養(yǎng)6小時。向順鉑處理組中加入順鉑至100μM，并培養(yǎng)2小時。培養(yǎng)后，用0.1％FBS/DMEM將細胞洗滌3次，在0.1％FBS/DMEM中培養(yǎng)10小時并用PBS洗滌3次。
向每個培養(yǎng)皿中加入200μl緩沖液[1％Triton X-100,150mM NaCl,10mM Tris(pH7.4),1.0mM EGTA,0.5％NP-40,1mM PMSF,0.1μg/mlapiotinin,40nM Iewpeptin]并在冰上放置20分鐘。用細胞刮子將各培養(yǎng)皿中的細胞刮下并利用帶26號針頭的注射器混合8到10次。將各培養(yǎng)皿的細胞在離心管中于4℃以12000rpm離心30分鐘。對沉淀的蛋白進行定量(BCA試劑盒；PIERCE)。通過蛋白質(zhì)印跡法利用抗Bcl-2單克隆抗體(500×)(Dako，丹麥)和抗小鼠HRP抗體(Jackson Immuno Research)對由各培養(yǎng)皿制備的沉淀物(50μg)進行分析(圖6)。將每個泳道中的帶進行數(shù)字化顯示(圖7)。
圖6和7顯示人MK和小鼠MK均增強了培養(yǎng)細胞中Bcl-2的表達。對抑癌劑處理的細胞也觀察到相似的增強效應(yīng)(圖7)。在利用這些細胞時，表現(xiàn)出增強效應(yīng)的濃度為大約10ng/ml或更高(數(shù)據(jù)未示)。
實施例7體內(nèi)凋亡抑制效應(yīng)(在缺血損傷前給藥)(1)將每組6至16只蒙古沙鼠(6至8周齡，體重60-80g)放置于“HONEYMATICM-3”(KIMURA MEDICAL INSTRUMENT LTD.)中，其為一種氟烷的麻醉劑傳送裝置，而且該容器中充滿了適量的吸入麻醉劑“氟烷”(根據(jù)日本藥典為三氟溴氯乙烷)。將被麻醉的動物固定于裝備有注射器的手術(shù)桌(NARISHINGE SCEITIFIC INSTRUMENT LAB.；SR-5N型，第97024號)上。對頭進行中線切開后，用牙鉆在距前囟點2mm的位點處朝左眼球方向鉆一個用于插入適當(dāng)大小注射器的洞。通過這個洞，將2μl 0.25mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml的MK溶液(0.5μg、1.0μg、2.0μg)(在生理鹽水中)用微量注射器(HAMILTON MICROLITER#701)分別注射到腦室中。制備注射鹽水組和偽手術(shù)(Sham-op)組作為對照組。在向腦室中注射后，將小鼠放置4分鐘并縫合手術(shù)部位。將胸部在中線切開以暴露右和左頸總動脈。用兩個Sugita腦動脈夾(標準型；MIZUHO)將兩條動脈都結(jié)扎以停止血流5分鐘，然后讓血液再次循環(huán)。在進行缺血過程中保持腦溫和體溫恒定(37±2℃)。區(qū)別各小鼠，在其從麻醉中蘇醒后并放置于保育籠中飼養(yǎng)使動物可以自由攝水和攝食。一周后，將小鼠在用含有0.2％的肝素(Novo Heparin Injection100；Japan Hoechet Marion Russell LTD)和4％多聚甲醛溶液的鹽水灌注時固定并斷頭。利用剪刀將腦切開取出，并再在4％多聚甲醛固定劑中浸泡一天。利用雙刃刮刀(Feather)將前囟點前2mm后方的部分分成3份。將這些切片進一步固定24小時。將含有背側(cè)海馬的組織脫水、浸染并用石蠟包埋。
由該石蠟塊從距海馬頂端0.5到1.0mm處或從矢狀縫后1.4到1.9mm處制備5μm的切片，并通過TUNEL方法觀察(原位凋亡檢測試劑盒，TaKaRa)。結(jié)果示于圖8(25倍)和圖9(100倍)中。圖8顯示僅僅在鹽水給藥組中在海馬神經(jīng)元區(qū)CA1中觀察到大量含有TUNEL反應(yīng)陽性細胞核的細胞。圖9也顯示只有在鹽水給藥組中觀察到含有TUNEL反應(yīng)陽性細胞核的細胞，而且還顯示很多萎縮的神經(jīng)細胞。在偽手術(shù)組或MK給藥組中，未觀察到這種神經(jīng)細胞。這些結(jié)果揭示MK可以保護神經(jīng)細胞不發(fā)生缺血應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡。
(2)按照在(1)中所述的方法，就在缺血損傷發(fā)生前將MK溶液(0.063μg、0.125μg、0.25μg、0.5μg、1μg或2μg)注射到腦室中來檢驗MK對延遲的神經(jīng)元死亡的保護效應(yīng)。損傷7天后，將CA1區(qū)用蘇木素-伊紅染色。低放大倍數(shù)(25倍)的顯微照片示于圖10中(圖10a鹽水組、圖10b偽手術(shù)組、圖10cMK2μg、圖10dMK1μg、圖10eMK0.5μg、圖10fMK0.25μg)，而高放大倍數(shù)(100倍)的顯微照片示于圖11中(圖11a鹽水組、圖11b偽手術(shù)組、圖11cMK2μg、圖11dMK1μg、圖11eMK0.5μg、圖11fMK0.25μg)。在鹽水給藥組(圖10a)、對照偽手術(shù)組(圖10b)以及施各種濃度MK組(圖10c-f)中未觀察到形態(tài)學(xué)差別。與偽手術(shù)組(圖10b)或施0.5到2μg MK組(圖10c-e)相比，在鹽水給藥組中神經(jīng)細胞的數(shù)量明顯降低。在高放大倍數(shù)下，在鹽水組(圖11a)中觀察到萎縮細胞核的退化，而在偽手術(shù)組(圖11b)或施0.5-2μg MK組(圖11c-e)中觀察到存活的圓形核。在施0.25μg MK組(圖11f,1.0mM EDTA)中觀察到退化的細胞核。
為進行定量評價，獲得了CA1區(qū)中每個單位長度CA1中所含的存活細胞核的數(shù)量(圖12)。該值在鹽水給藥組為18±25/mm(n=15，均值±標準差)，而偽手術(shù)組為265±38/mm(n=23)。對于0.5、1或2μg MK給藥組，該值分別為217±109(n=7)、228±84(n=8)和243±82(n=10)。在低濃度MK時該值降低(圖12)。在鹽水給藥組和MK(0.5至2μg MK)給藥組之間有顯著性差異(ANOVA和post-hoc Fisher’s PLSD分析，p＜0.0001)。
對MK的用藥效果是否持續(xù)進行了檢測。在偽手術(shù)組中神經(jīng)細胞的數(shù)量為263±31個細胞/mm(n=11)，而在鹽水給藥組中為10±10個細胞/mm(n=15)，在這些組中動物在缺血損傷后7天被斷頭。在再次給藥2μg MK并在缺血后1、2、3或4周被斷頭的蒙古沙鼠中，神經(jīng)細胞的數(shù)量如下1周后219±74(n=10)2周后152±72(n=5)3周后185±83(n=4)4周后157±60(n=4)通過ANOVA和post-hoc Fisher’s PLSD分析(p＜0.0001)比較表明在任何測試組中神經(jīng)細胞的存活率均顯著高于鹽水給藥組。與1周時神經(jīng)細胞的數(shù)量相比，2周時神經(jīng)細胞的數(shù)量降低，但該值在此后甚至4周后也沒有降低(圖13)。因此，MK阻止延遲的神經(jīng)元死亡而并非將其延遲。
因為在海馬區(qū)CA1中延遲的神經(jīng)元死亡被認為時由凋亡引起的，所以通過TUNEL方法對切片進行染色來檢測凋亡引起的DNA斷裂。在結(jié)扎前即刻給藥MK，在缺血損傷后7天評價效果。在鹽水給藥組中觀察到大量深染的細胞核(圖14b)，而在偽手術(shù)組中未觀察到著色的細胞核(圖14b)。在施0.5到2μg MK組中觀察到少量著色的細胞核(圖14c-e)。通過測定表現(xiàn)出凋亡陽性反應(yīng)的細胞核的數(shù)量與細胞總數(shù)的比進行定量評價(圖15)。該值對鹽水給藥組為69.7±17.0(n=7)，而對于偽手術(shù)組為0.0±0.0(n=8)。對于施0.5、1或2μg MK組，該值分別為7.8±19.8(n=7)、11.0±14.7(n=8)和4.6±12.2(n=7)。在鹽水給藥組和MK(0.5至2μg MK)給藥組之間在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異(ANOVA和post-hoc Fisher’s PLSD分析，p＜0.0001)。由這些結(jié)果證實MK能夠抑制凋亡引起的延遲的神經(jīng)細胞死亡。
實施例8體內(nèi)凋亡抑制效應(yīng)(缺血損傷后給藥MK)將MK(2.0μg)在缺血損傷后2、4、6、12或24小時注射到蒙古沙鼠瞬時前腦缺血模型的腦室中。在缺血損傷7天后計數(shù)存活海馬神經(jīng)細胞的數(shù)量(圖16)。當(dāng)在損傷后2小時給藥MK時，與偽手術(shù)組相比，存活神經(jīng)細胞的數(shù)量降低，而其大大高于鹽水給藥組。即使在損傷后24小時給藥MK存活率也增加(圖16)。
在結(jié)扎后2、4、6、12或24小時給藥的組中存活海馬神經(jīng)細胞的數(shù)量分別為120±36(n=4)、90±23(n=6)、80±13(n=6)、86±34(n=6)以及93±22(n=4)個細胞/mm(圖16)。這些值顯著高于鹽水給藥組(p＜0.05)。
產(chǎn)業(yè)適用性本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)屬于MK家族的蛋白可以延遲或抑制由各種刺激，如抑癌劑、紫外線和輻射、缺血應(yīng)激等所誘導(dǎo)的凋亡?；谠摪l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防各種凋亡所致疾病，例如腦病、心臟病、腎病、神經(jīng)病或肝病等的新型藥劑，其包括屬于MK家族的蛋白質(zhì)作為有效成為。
權(quán)利要求
1．用于抑制凋亡的藥劑，其包括屬于MK家族的蛋白質(zhì)作為有效成分。
2．權(quán)利要求1的用于抑制凋亡的藥劑，其中屬于MK家族的蛋白質(zhì)為midkine。
3．用于治療或預(yù)防凋亡相關(guān)疾病的藥劑，其包括屬于MK家族的蛋白質(zhì)作為有效成分。
4．權(quán)利要求3的用于治療或預(yù)防凋亡相關(guān)疾病的藥劑，其中凋亡相關(guān)疾病為心臟病。
5．權(quán)利要求3的用于治療或預(yù)防凋亡相關(guān)疾病的藥劑，其中凋亡相關(guān)疾病為腎病。
6．權(quán)利要求3的用于治療或預(yù)防凋亡相關(guān)疾病的藥劑，其中凋亡相關(guān)疾病為肝病。
7．權(quán)利要求3的用于治療或預(yù)防凋亡相關(guān)疾病的藥劑，其中凋亡相關(guān)疾病為神經(jīng)變性疾病。
8．權(quán)利要求3至7中任一項的用于治療或預(yù)防凋亡相關(guān)疾病的藥劑，其中屬于MK家族的蛋白質(zhì)為midkine。
9．一種Bcl-2增強劑，其包括屬于MK家族的蛋白質(zhì)作為有效成分。
全文摘要
一種屬于midkine(MK)家族的蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)抑制由抗癌藥、紫外線照射以及局部缺血性應(yīng)激所誘導(dǎo)的凋亡。該發(fā)現(xiàn)使得提供含有屬于MK家族的蛋白質(zhì)作為活性成分的新型藥物用于治療和預(yù)防由凋亡引起的任何疾病，例如心臟疾病、腎臟疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病或肝臟疾病成為可能。
文檔編號A61K38/18GK1316907SQ99810696
公開日2001年10月10日 申請日期1999年7月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月10日
發(fā)明者池松真也, 小田宗宏, 佐久間貞俊, 吉田義弘, 門松健治, 蘆田欣也, 紀光助, 村松喬 申請人:明治乳業(yè)株式會社, 村松喬