專(zhuān)利名稱：得到高純度HMG－CoA還原酶抑制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀、atorvastatin及其衍生物和類(lèi)似物已知是HMG-CoA還原酶抑制劑，而且被用做抗高膽固醇血藥。它們中的大多數(shù)是通過(guò)不同物種的微生物發(fā)酵而生產(chǎn)的，這些物種屬于曲霉屬、紅曲屬、諾卡氏菌屬、擬無(wú)枝酸菌屬、毛霉菌屬或青霉屬，一些是通過(guò)使用化學(xué)合成的方法處理發(fā)酵產(chǎn)物而得到，或者它們是全化學(xué)合成的產(chǎn)物。
活性成分的純度是生產(chǎn)安全有效的藥物的重要因素，特別是如果該藥物產(chǎn)品必須在治療或預(yù)防高血漿膽固醇中長(zhǎng)期使用。低純度藥物中的雜質(zhì)的累積在醫(yī)療中可能會(huì)引起許多副作用。
本發(fā)明涉及使用所謂“頂替色譜法”分離HMG-CoA還原酶抑制劑的一種新的工業(yè)方法。使用本發(fā)明可以得到高純度的HMG-CoA還原酶抑制劑，而且收率高，生產(chǎn)成本低，適合生態(tài)平衡。
已有技術(shù)在以前的專(zhuān)利中公開(kāi)的抗高膽固醇血藥的分離和純化方法包括萃取、色譜、內(nèi)酯化和結(jié)晶方法的各種組合。經(jīng)過(guò)這些過(guò)程得到的終產(chǎn)物的純度遵守USP標(biāo)準(zhǔn)，但是期望的產(chǎn)物的收率相對(duì)較低。另外，它們不僅需要大量有機(jī)溶劑，還需要適合這些量級(jí)的巨大設(shè)備。
WO 92/16276中公開(kāi)的分離方法提供了使用工業(yè)HPLC(高效液相色譜)設(shè)備得到純度高于99.5％的HMG-CoA還原酶抑制劑的方案。根據(jù)WO 92/16276，純度≥85％的粗HMG-CoA還原酶抑制劑被溶解在有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑和水的溶液中。然后將混合物緩沖至pH值在2-9之間，并置于HPLC柱上。收集所關(guān)心的HMG-CoA還原酶抑制劑峰后，除去部分溶劑并加入水，或者三分之二的溶劑混合物被除去，HMG-CoA還原酶抑制劑結(jié)晶。最后，通過(guò)該方法得到的產(chǎn)物的純度至少為99.5％，收率約90％。
WO 92/16276中公開(kāi)的方法能得到高純度的HMG-CoA還原酶抑制劑，收率相對(duì)較高，該方法與常規(guī)色譜柱相比的缺點(diǎn)是相對(duì)小的每根HPLC柱的載樣量。加在柱子上的小量樣品也與為得到足夠量的期望的物質(zhì)而增加的分離操作的次數(shù)，以及導(dǎo)致更高生產(chǎn)成本的大量溶劑的使用有關(guān)。
本發(fā)明的基礎(chǔ)一頂替色譜法與以前所用的色譜方法沒(méi)有本質(zhì)區(qū)別。
頂替色譜法是基于加在柱上的樣品中的組分對(duì)固定相上活性位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)。樣品中的各組分象火車(chē)(train)一樣相互頂替，與固定相有非常高親和性而在過(guò)柱時(shí)落在所加樣品的后面的頂替劑，驅(qū)動(dòng)與頂替劑移動(dòng)速度相同的樣品組分成為單室區(qū)帶(one-compartmentzones)。各組分的濃縮與純化同時(shí)進(jìn)行。
頂替色譜法的原理相對(duì)比較古老，它從1943年開(kāi)始就為人所知，但是由于缺少有效的柱子，它直到1981年才被引入實(shí)際應(yīng)用(Cs.Horvath et al.,J.Chromatogr.,215(1981)295；J.Chromatogr.,330(1985)1；J.Chromatogr.440(1988)157)。這些文章引入本文作參考，它們描述了使用反相高效液相色譜柱，以頂替模式進(jìn)行生物活性肽和多粘菌素抗生素(多肽)的分析的和制備的分離和純化。對(duì)于多粘菌素，使用250×4.6mm的十八烷基硅膠柱，粒徑5μm,10％乙腈在水中作為流動(dòng)相，不同的鹵化四烷基季銨作為頂替劑。
在頂替色譜法領(lǐng)域的最近的研究(S.M.Cramer et al.,EnzymeMicrob.Technol.,11(1989)74；Prep.Chromatogr.,1(1988)29；J.Chromatogr.,394(1987)305；J.Chromatogr.,439(1988)341；J.Chromatogr.,454(1988)1(理論優(yōu)化)；A.Felinger et al.,J.Chromatogr.,609(1992)35(理論優(yōu)化)，所有文章引入本文作參考)中，使用了相似的柱子，流動(dòng)相為甲醇在磷酸鹽緩沖液中，頂替劑為乙腈中的2-(2-叔丁氧乙氧基)乙醇(BEE)，蛋白質(zhì)和抗生素頭孢菌素C用作樣品。
美國(guó)專(zhuān)利第5,043,432號(hào)(27.08.1991)和EP 416.416分別描述了用頂替離子交換色譜法純化某種低分子的(低于1000道爾頓)肽(特別是，促吞噬素及其合成的衍生物)的方法，使用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂做為固定相，遷移溶劑(transporter solvent)為水或各種強(qiáng)酸的稀溶液，所用的頂替劑為不同濃度的三亞乙基季銨鹽。在還未公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第08/875,422號(hào)中，描述了使用頂替色譜法分離和純化萬(wàn)古霉素。
技術(shù)方案有時(shí)得到大量高純度的活性物質(zhì)是困難的，因?yàn)楹芏噙m合于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的技術(shù)從其使用而言在大規(guī)模生產(chǎn)操作中是不夠經(jīng)濟(jì)的，或者未達(dá)到環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)。以上事實(shí)迫使工業(yè)上尋找新的技術(shù)，它提供既是高質(zhì)量又是經(jīng)濟(jì)和生態(tài)上可接受的產(chǎn)品。
本發(fā)明解決了從較早的專(zhuān)利和其它文獻(xiàn)中得到的方法的缺點(diǎn)，因?yàn)樗軌虻玫郊僅MG-CoA還原酶抑制劑，另外，該純化方法本身是省時(shí)的，提供高收率，使用小量溶劑。該方法是有利自然的，另外，它不需要大的空間和能量，因而能夠大規(guī)模經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)。
要純化的HMG-CoA還原酶抑制劑是，例如，選自由美伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、atorvastatin組成的組。選擇的用頂替色譜法進(jìn)行純化的抑制劑可以是內(nèi)酯的形式或酸或其鹽的形式。
作為本發(fā)明特征的頂替色譜法優(yōu)選包括以下步驟a)用合適的流動(dòng)相調(diào)節(jié)色譜柱，b)將溶解在流動(dòng)相中的粗HMG-CoA還原酶抑制劑進(jìn)樣，c)引入從柱子上頂替HMG-CoA還原酶抑制劑的頂替劑，以及d)得到純化的HMG-CoA還原酶抑制劑。
純化的HMG-CoA還原酶抑制劑優(yōu)選通過(guò)以下途徑得到d1)收集組分，以及d2)用分析HPLC分析組分以及根據(jù)純度質(zhì)量合并組分。
得到純化的HMG-CoA還原酶抑制劑以后，色譜柱可以通過(guò)用醇/水混合物沖洗以洗脫掉頂替劑而再生。
然后，用本文描述的方式得到的HMG-CoA還原酶抑制劑根據(jù)從已有技術(shù)的陳述中已知的方法從流動(dòng)相中分離，例如通過(guò)冷凍干燥，或者優(yōu)選地，通過(guò)結(jié)晶得到內(nèi)酯的形式、酸的形式或鹽的形式(優(yōu)選是堿或堿土鹽)。
除了雜質(zhì)還含有很高百分比HMG-CoA還原酶抑制劑的組分可以用該方法再處理，使總收率超過(guò)95％。
所使用的固定相為反相固定相，天然的(帶有不同長(zhǎng)度烷基鏈的硅膠)或合成的(C-8或C-18)有機(jī)的固定相是合適的。優(yōu)選地，使用苯乙烯和二乙烯基苯的合成交聯(lián)聚合物基質(zhì)。固定相的粒徑在3到20μm之間是合適的，優(yōu)選在7-15μm之間。
所用的流動(dòng)相優(yōu)選選自水、乙腈/水溶液和低級(jí)(優(yōu)選是C1-C4)醇水溶液、有機(jī)酸、鹵代有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸的稀緩沖液如，蟻酸、醋酸、丙酸、鹽酸、硼酸、磷酸、碳酸或硫酸與堿金屬陽(yáng)離子、氨或胺。水、乙腈的水溶液，特別是甲醇或乙醇的水溶液是特別優(yōu)選的，且水溶液中有機(jī)溶劑含量?jī)?yōu)選是80％或更低，更優(yōu)選是45％或更低，特別是30％或更低。因?yàn)榱鲃?dòng)相中毒性的甲醇可以被毒性較低的乙醇代替，或者至少部分地被水代替，而結(jié)果較好，廢溶劑的除去更簡(jiǎn)單，因而從生態(tài)方面而言，與已有技術(shù)相比，本發(fā)明是顯著進(jìn)步的。
所用的流動(dòng)相的pH值優(yōu)選在4.5到10.5之間，更優(yōu)選在6.5到8之間，特別是約7。流動(dòng)相通過(guò)柱子的流速被適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)在1.5到30ml/(min cm2)之間，優(yōu)選在3到15ml/(min cm2)之間。當(dāng)頂替劑通過(guò)與流動(dòng)相混合被引入色譜柱的同時(shí)，流速優(yōu)選調(diào)節(jié)在1.5到15ml/(min cm2)之間，特別是在3到10ml/(min cm2)之間，因?yàn)楦叩牧魉贂?huì)導(dǎo)致要收集的樣品的稀釋?zhuān)曳蛛x也會(huì)變差。
合適的頂替劑是具有兩親結(jié)構(gòu)的化合物，如表面活性劑、洗滌劑等。頂替劑的例子是長(zhǎng)鏈醇、長(zhǎng)鏈羧酸、長(zhǎng)鏈烷基銨鹽、芳香族二羧酸酯、羰基合成醇和二羰基合成醇(dioxo-alcohols)、聚亞烷基聚乙二醇醚如二亞乙基乙二醇單(或二)烷基醚、聚芳基醚或聚亞烷基聚芳基醚如TritonX-100等。前述的“長(zhǎng)鏈”指含有至少C4-鏈，優(yōu)選是至少C10-鏈，更優(yōu)選是至少C14鏈或更長(zhǎng)的烷基鏈。
流動(dòng)相中頂替劑的濃度適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)在1％到35％之間，優(yōu)選是2-20％，特別是7-14％。
在控制從色譜柱洗脫下來(lái)地的各組分的純度質(zhì)量的優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于要分析的HMG-CoA還原酶抑制劑的分析HPLC方法可以如下進(jìn)行。
要分析的樣品用含有20mM NH4HCO3溶液和乙腈(乙腈的比例調(diào)節(jié)到使分析物的保留因子在5到10之間)的流動(dòng)相稀釋100倍。10μl該樣品被加到Hypersil ODS柱(Hypersil，英國(guó)，粒徑3μm，柱尺寸50×4.6mm)進(jìn)行高效液相色譜分析。柱子用流動(dòng)相在2ml/min的流速下沖洗。在235nm測(cè)定吸光度。樣品的HPLC純度用色譜圖上各峰面積的比來(lái)計(jì)算。
完成色譜后，固定相優(yōu)選進(jìn)行再生，例如用20-100％低級(jí)醇的水溶液做流動(dòng)相。
本方法用以下實(shí)施例說(shuō)明，但不限于這些實(shí)施例。
純度≥99.5％的組分被合并。合并的組分的HPLC純度為99.7％。
純度≥99.5％的組分被合并。合并后的組分的HPLC純度為99.8％。
純度≥99.5％的組分被合并。合并的組分的HPLC純度為99.8％。
純度≥99.5％的組分被合并。合并的組分的HPLC純度為99.8％。
純度≥99.5％的組分被合并。合并的組分的HPLC純度為99.8％。
純度≥99.5％的組分被合并。合并的組分的HPLC純度為99.8％。
純度≥99.5％的組分被合并。合并的組分的HPLC純度為99.9％。
得到的組分用實(shí)施例9中描述的方法分析。純度≥99.5％的組分被合并。合并的組分的HPLC純度為99.8％。
得到的組分用上述HPLC分析方法分析。
純度≥99.5％的組分被合并。合并的組分的HPLC純度為99.8％。
權(quán)利要求
1．得到HMG-CoA還原酶抑制劑的方法，特征在于該純化粗HMG-CoA還原酶抑制劑的方法中的一個(gè)步驟包括頂替色譜法。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，特征在于HMG-CoA還原酶抑制劑選自由美伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀和atorvastatin組成的組。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，特征在于HMG-CoA還原酶抑制劑是內(nèi)酯的形式或其酸或鹽的形式。
4．根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，特征在于頂替色譜法包括以下步驟a)用流動(dòng)相調(diào)節(jié)色譜柱，b)將溶解在流動(dòng)相中的HMG-CoA還原酶抑制劑進(jìn)樣，c)引入從柱子上頂替HMG-CoA還原酶抑制劑的頂替劑，以及d)得到純化的HMG-CoA還原酶抑制劑。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特征在于純化的HMG-CoA還原酶抑制劑通過(guò)以下途徑得到d1)收集組分，以及d2)用分析HPLC分析組分并根據(jù)純度質(zhì)量合并組分。
6．根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，特征在于頂替色譜法另外包括接著的步驟e)通過(guò)用醇/水混合物沖洗柱子洗脫掉頂替劑而再生色譜柱。
7．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特征在于流動(dòng)相選自由水、乙腈/水溶液或低級(jí)醇水溶液，以及有機(jī)酸、鹵代有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸與堿金屬陽(yáng)離子、氨或胺的稀緩沖液組成的溶劑組。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，特征在于流動(dòng)相是水、乙腈/水溶液或低級(jí)醇水溶液中的任一種。
9．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特征在于所用流動(dòng)相的pH值在4.5到10.5之間。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，特征在于所用流動(dòng)相的pH值在6.5到8之間。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，特征在于所用流動(dòng)相的pH值為7。
12．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特征在于流動(dòng)相通過(guò)色譜柱的流速在1.5到30ml/(min cm2)之間。
13．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特征在于所用流動(dòng)相/頂替劑混合物通過(guò)色譜柱的流速在3到15ml/(min cm2)之間。
14．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，特征在于色譜結(jié)束后，用20-100％的低級(jí)醇水溶液再生固定相。
15．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特征在于固定相為反相。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的方法，特征在于固定相為天然的反相，如帶有不同長(zhǎng)度烷基鏈的硅膠。
17．根據(jù)權(quán)利要求15的方法，特征在于固定相為C-8或C-18。
18．根據(jù)權(quán)利要求15的方法，特征在于固定相為合成交聯(lián)聚合物基質(zhì)。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的方法，特征在于交聯(lián)聚合物基質(zhì)為苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物。
20．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特征在于固定相粒徑在3到20μm之間。
21．根據(jù)權(quán)利要求20的方法，特征在于固定相粒徑在7-15μm之間。
22．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特征在于頂替劑選自由長(zhǎng)鏈醇、長(zhǎng)鏈羧酸、長(zhǎng)鏈烷基銨鹽、芳香族二羧酸酯、羰基合成醇和二羰基合成醇、聚亞烷基聚乙二醇醚和聚芳基醚或聚亞烷基聚芳基醚組成的組。
23．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特征在于流動(dòng)相中頂替劑的濃度在1％到35％之間。
24．根據(jù)權(quán)利要求23的方法，特征在于流動(dòng)相中頂替劑的濃度在2-20％之間。
25．根據(jù)權(quán)利要求1到24中任一項(xiàng)的方法，用以生產(chǎn)HPLC純度超過(guò)99.7％的HMG-CoA還原酶抑制劑的用途。
26．通過(guò)包括頂替色譜法的純化方法純化粗HMG-CoA還原酶抑制劑而得到的HPLC純度超過(guò)99.7％的HMG-CoA還原酶抑制劑。
27．根據(jù)權(quán)利要求26的物質(zhì)，特征在于HMG-CoA還原酶抑制劑選自由洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、atorvastatin、美伐他汀和氟伐他汀組成的組。
28．根據(jù)權(quán)利要求27的物質(zhì)，特征在于所選擇的HMG-CoA還原酶抑制劑為洛伐他汀、辛伐他汀或普伐他汀。
29．根據(jù)權(quán)利要求26的物質(zhì)，特征在于所選擇的HMG-CoA還原酶抑制劑是內(nèi)酯的形式或酸或其鹽的形式。
全文摘要
洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀、atorvastatin及其衍生物和類(lèi)似物已知是HMG－CoA還原酶抑制劑，而且被用做抗高膽固醇血藥。它們中的大多數(shù)是通過(guò)不同物種的微生物發(fā)酵而生產(chǎn)的，這些物種屬于曲霉屬、紅曲屬、諾卡氏菌屬、擬無(wú)枝酸菌屬、毛霉菌屬或青霉屬，一些是通過(guò)使用化學(xué)合成的方法處理發(fā)酵產(chǎn)物而得到，或者它們是全化學(xué)合成的產(chǎn)物。活性成分的純度是生產(chǎn)安全有效的藥物的重要因素，特別是如果該藥物產(chǎn)品必須在治療或預(yù)防高血漿膽固醇中長(zhǎng)期使用。低純度藥物中的雜質(zhì)的累積在醫(yī)療中可能會(huì)引起許多副作用。本發(fā)明涉及使用所謂“頂替色譜法”分離HMG－CoA還原酶抑制劑的一種新的工業(yè)方法。使用本發(fā)明能夠得到高純度的HMG－CoA還原酶抑制劑，而且收率高，生產(chǎn)成本低，適合生態(tài)平衡。
文檔編號(hào)A61K31/22GK1318063SQ99811076
公開(kāi)日2001年10月17日 申請(qǐng)日期1999年9月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月18日
發(fā)明者羅克·格拉?？? 杜尚·米利沃耶維奇, 安德烈·巴斯塔達(dá) 申請(qǐng)人:萊克制藥與化學(xué)公司