專利名稱：重組人類子宮珠蛋白在炎癥類和纖維變性類疾病治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
概略地，本發(fā)明涉及利用天然人子宮珠蛋白(hUG)或重組人子宮珠蛋白(rhUG)治療炎癥類和纖維變性類疾病。人們已經(jīng)確定UG(hUG或rhUG)的新的生理作用和療法。具體地，本發(fā)明涉及通過施用hUG或rhUG抑制PLA2s和/或防止纖連蛋白沉淀的方法以治療炎癥類和纖維變性類疾病。此外，本發(fā)明提供具有炎癥和纖維變性特征的疾病的治療方法，這些疾病如新生兒呼吸窘迫綜合癥(RDS)、一種危險的臨床疾病-支氣管肺發(fā)育不良(BPD)和腎病之一的腎小球性腎炎。本發(fā)明也提供通過施用子宮珠蛋白促使腫瘤經(jīng)其受體得到抑制以治療癌癥的方法。更進(jìn)一步，本發(fā)明提供從產(chǎn)生子宮珠蛋白受體的細(xì)胞中純化此類受體以及利用純化的受體確定UG受體配基和子宮珠蛋白結(jié)構(gòu)類似物的方法。
本申請引用的文件涉及本發(fā)明現(xiàn)有技術(shù)的，其中的每一方面在此均被引入作為參考。
背景技術(shù)：
炎癥類，纖維變性類和癌癥疾病近年來，有關(guān)炎癥類和纖維變性類疾病的治療藥物的研發(fā)引起了更廣泛的關(guān)注。新生嬰兒呼吸窘迫綜合癥是肺泡表面活性劑缺乏性疾病。由于這種疾病是造成早產(chǎn)兒死亡的主要原因，因而更引起了人們的特別關(guān)注。雖然表面活性劑療法的引用可顯著地提高RDS病人的存活率，但患者中慢性炎癥類和纖維變性類疾病發(fā)生的顯著比例仍然是主要問題。同樣地，當(dāng)患者的腎臟因堵塞而不能其發(fā)揮濾血功能時，遺傳性纖連蛋白沉淀性腎小球腎炎就會導(dǎo)致晚期腎衰竭。腎炎具有纖連蛋白沉淀和腎纖維變性的特征，這將致使腎功能衰竭，最后，會致使腎不能支持生命體的活動。
PLA2(磷脂酶A2)是水解甘油磷脂Sn2位點酯鍵的內(nèi)源酶，該酶是參與炎癥類和纖維變性類疾病的眾多蛋白之一。PLA2也能水解肺泡表面活性劑的磷脂。子宮珠蛋白(也稱CC10,CC16,CC17，尿蛋白-1,P-1，孕酮結(jié)合蛋白，PCB結(jié)合蛋白，克拉拉細(xì)胞分泌蛋白(CCSP)，胚泡激酞，視黃酮結(jié)合蛋白，磷脂結(jié)合蛋白，α2微球蛋白)可抑制體外PLA2的活性。
子宮珠蛋白是小球狀同源二聚體蛋白。該蛋白的分子量為15.8kDa，但它在電泳凝膠中的移動卻與10kDa大小的蛋白相一致。在成年人的肺部，人類子宮珠蛋白的含量豐富，約占可溶性蛋白總量的7％。但在發(fā)育的人類胎兒體內(nèi)，直到妊辰后期人類子宮珠蛋白的表達(dá)才被完全激活。因而，足月前嬰兒的細(xì)胞外肺液中人類子宮珠蛋白的含量遠(yuǎn)低于成人體內(nèi)的含量。胰臟中也有UG的表達(dá)。
由于PLA2s從胞外磷脂庫釋放花生四烯酸(AA)，因而其在炎癥性應(yīng)答中發(fā)揮決定性作用。在稱為花生四烯酸級聯(lián)的應(yīng)答過程中，AA可被代謝成若干有效的炎癥性介質(zhì)。
數(shù)種急性和慢性臨床疾病的特征是血漿或局部PLA2活性升高(見下文表1)。
表1．與LA2活力相關(guān)的臨床疾病
a成人呼吸窘迫綜合癥現(xiàn)在還沒有有效的PLA2抑制劑可供臨床使用。到目前為止，只有少數(shù)PLA2抑制劑進(jìn)入臨床試驗階段，但還沒有一種抑制劑能投放市場。
纖連蛋白(Fn)是200kDa的糖蛋白，它以數(shù)種不同形式存在并被分泌到不同組織中。Fn是一種必需的糖蛋白，小鼠Fn基因的靶向破壞顯示了其在胚胎發(fā)育中的主要作用。在炎癥、細(xì)胞粘著、組織修復(fù)和纖維樣變性過程中，F(xiàn)n也起著關(guān)鍵的作用并沉淀在受傷部位。血漿纖連蛋白(pFn)由肝臟分泌并在血漿中循環(huán)。在肺部，當(dāng)炎癥和傷痛發(fā)生時，細(xì)胞纖連蛋白即可被分泌。上述兩種形式的纖連蛋白是炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的趨化性因子。當(dāng)炎癥發(fā)生時，大量炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞會浸入肺部，這能致使肺部纖維樣變性和最終的死亡。在人類臨床疾病，如嬰兒呼吸窘迫綜合癥，支氣管肺發(fā)育障礙和腎小球性腎炎的病人體內(nèi)，人們已檢測到高水平的Fn。
癌癥的治療性和預(yù)防性藥物的研發(fā)代表了人們向科學(xué)和藥物的不間斷的挑戰(zhàn)。因為癌細(xì)胞不能被免疫系統(tǒng)作為異物所識別，所以它們能不受抑制的生長直至重要的身體機(jī)能受到影響。現(xiàn)在，癌癥的治療方法主要包括化療和放療，而上述兩種療法對癌細(xì)胞和正常細(xì)胞同樣是高度有害的。到目前為止，人們已經(jīng)找到非自然發(fā)生的，無毒害的，抑制腫瘤細(xì)胞生長的胞外因子。UG的作用純化的人子宮珠蛋白的氨基酸序列分析顯示它與其他的UG類蛋白如兔子宮珠蛋白結(jié)構(gòu)上相似，但不完全一致。人類子宮珠蛋白與兔子宮珠蛋白的70個氨基酸中的39個是完全相同的(見

圖1)。UG類蛋白包括人UG/CC10、大鼠CC10、小鼠CC10、和兔UG。這些子宮珠蛋白在抗原性方面表現(xiàn)出種屬專一性和組織專一性的差異，同時在組織分布以及體外生化活力方面也具有差異。關(guān)于UG類蛋白的組織和種屬起源，已經(jīng)有多種不同的敘述，如鼠肺、人尿、唾液、血液組分、兔的子宮、鼠和人類的前列腺、和人肺。目前，這些蛋白的生理學(xué)作用還不清楚。
盡管經(jīng)過多年的研究，人們對這些蛋白在體內(nèi)的生物學(xué)作用仍然不清楚。UG類蛋白之間結(jié)構(gòu)一致性的缺乏使得基于體外試驗或其他結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白表現(xiàn)出的活性所作的預(yù)測--某種蛋白在人類體內(nèi)是否具有治療功能，難以成立。例如，在同樣的實驗中，人子宮珠蛋白所結(jié)合的孕酮的量少于兔子宮珠蛋白結(jié)合的孕酮量的5％。人子宮珠蛋白的等電點(4.6)低于兔子宮珠蛋白的等電點(5.4)。
Stipp等(1996)報道了關(guān)于可產(chǎn)生中止子宮珠蛋白表達(dá)的子宮珠蛋白剔除小鼠方面的研究進(jìn)展。這種小鼠具有克拉拉(Clara)細(xì)胞，該細(xì)胞具有替代原有子宮珠蛋白分泌顆粒體的奇特的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。除此之外，該細(xì)胞沒有其他表型。由于可預(yù)期伴隨有肺炎和纖維變性的肺功能，因而，此項發(fā)明是非常有意義的。而且，這種剔除小鼠沒有腎臟、胰臟或生殖系統(tǒng)異常的證據(jù)，這就暗示出子宮珠蛋白在控制體內(nèi)纖維樣變性的炎癥方面不具備顯著的作用。
Leyton等(1994)報道了子宮珠蛋白的抗轉(zhuǎn)移特性，這一特性歸因于子宮珠蛋白對腫瘤細(xì)胞釋放花生四烯酸的抑制作用(授于Patierno等人的美國第5,696,092號專利)。借助多種類型的腫瘤細(xì)胞，Kundu等(1996)繼續(xù)了這方面的研究，并發(fā)現(xiàn)了ECM的侵害性抑制作用。在效應(yīng)細(xì)胞中，ECM入侵與190kDa的UG結(jié)合蛋白的存在相關(guān)。子宮珠蛋白無法抑制缺乏UG結(jié)合蛋白的細(xì)胞的ECM入侵活力。
發(fā)明目的因此，本發(fā)明的目的是提供預(yù)防或治療早期癌細(xì)胞生長的方法，該方法包括施用腫瘤抑制有效量的重組人子宮珠蛋白(rhUG)或其片段或其衍生物。
本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是提供由腫瘤抑制有效量的rhUG和藥品上可接受的載體或稀釋劑組成的藥物組合物。上述組合物應(yīng)由還原型和非還原型、單體和二聚體rhUG混合物組成。優(yōu)選地，該組合物應(yīng)由還原型單體rhUG組成。
本發(fā)明另外的目的是提供通過抑制纖連蛋白凝集和/或沉淀而預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括施用抑制纖連蛋白有效量的rhUG或其片段或其衍生物。
更進(jìn)一步，本發(fā)明的目的是提供刺激血細(xì)胞生成的方法，該方法由施用血細(xì)胞生成有效量的rhUG或其片段或其衍生物組成。
再進(jìn)一步，本發(fā)明的目的是提供包含血細(xì)胞生成刺激有效量的rhUG或其片段或其衍生物和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。
本發(fā)明另外的目的是提供從樣品中純化子宮珠蛋白受體的方法，該方法包含下列步驟(a)使該樣品與結(jié)合在在固相支持物上的rhUG接觸；(b)從固相支持物上洗脫子宮珠蛋白受體的純化樣品。
更進(jìn)一步，本發(fā)明的目的是提供純化的，并可用于篩選含有化合物、多肽或蛋白的樣品的子宮珠蛋白受體。上述的化合物、多肽或蛋白均是UG結(jié)構(gòu)類似物和/或UG受體的配基。
最后，本發(fā)明的目的是提供靶向子宮珠蛋白受體的方法，該方法即施用有效量的rhUG以治療或預(yù)防早期癌細(xì)胞生長和腫瘤的轉(zhuǎn)移，或刺激血細(xì)胞生成。
發(fā)明概述現(xiàn)在已知，在體內(nèi)PLA2s的抑制和防止纖連蛋白沉淀及纖維樣變性方面，子宮珠蛋白發(fā)揮著主要的生理作用。在轉(zhuǎn)基因剔除小鼠的新品系以及涉及肺炎和纖維樣變性的新生兒呼吸窘迫綜合癥(RDS)的猴子模型中所進(jìn)行的結(jié)合實驗證實了這些影響。本發(fā)明中的珠蛋白剔除小鼠(下文稱UG KO小鼠)表現(xiàn)出致死性腎小球性腎炎和腎實質(zhì)纖維變性，這兩種疾病分別是早期和晚期發(fā)作性疾病。對正常小鼠施用外源性Fn會在其腎臟引起Fn的沉積，但施用等摩爾量的Fn和rhUG則不會出現(xiàn)上述現(xiàn)象。
rhUG的存在會引起體內(nèi)PLA2活性的下降。在第一個實驗中，UG KO小鼠的表型顯示與同窩出生且具有功能性UG基因的小鼠的血漿中PLA2的活性相比，UG缺乏時血漿中PLA2的活性顯著地提高。在第二個實驗中，對RDS早期的猴子施用rhUG的結(jié)果顯示肺泡外液中PLA2的活性受到了抑制。
其余的實驗證實在體外條件下，PLA2能降解用于RDS治療的人工表面活性劑(典型的表面活性劑如Survanta)，而UG能抑制PLA2的降解作用。這些實驗證實經(jīng)氣管或靜脈施用UG后，UG介導(dǎo)了PLA2的抑制和Fn的沉淀。
子宮珠蛋白剔除小鼠的實驗證實rhUG可應(yīng)用于一些疾病的治療中，該疾病與子宮珠蛋白的不足或這種蛋白本身發(fā)生了功能性的變性有關(guān)?，F(xiàn)在，人們又發(fā)現(xiàn)rhUG可用于治療或預(yù)防炎癥類或纖維變性類疾病，這些疾病與循環(huán)中或炎癥、纖維變性部位的功能性內(nèi)源rhUG的不足有關(guān)。在某種肺炎或纖維變性類疾病中，包括有可能發(fā)展成新生兒BPD的早產(chǎn)嬰兒，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其血漿和/或支氣管肺泡灌洗液中hUG水平的下降。因而，UG可用于補(bǔ)充不足的或防御性內(nèi)源子宮珠蛋白以預(yù)防或治療上述炎癥類和纖維變性類疾病。
在腺癌和致癌性病毒轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞中，子宮珠蛋白的表達(dá)劇烈地減少或完全消失。通過用人類子宮珠蛋白(hUG)-cDNA構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腺癌細(xì)胞，可發(fā)現(xiàn)抑制貼壁不依賴性生長和胞外基質(zhì)入侵的強(qiáng)制性UG表達(dá)僅存在于表達(dá)了UG受體的細(xì)胞中。利用純化的hUG進(jìn)行的受體陽性細(xì)胞的治療也出現(xiàn)了同樣的結(jié)果。這些資料顯示UG既通過自分泌途徑又通過旁分泌途徑發(fā)揮其對癌細(xì)胞的抑制作用。這是對細(xì)胞外腫瘤抑制劑的首次證明和第一次表明子宮珠蛋白可以被用于治療原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌。而且，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)成年的UG缺陷小鼠可以形成腫瘤，這證明了UG所具有的體內(nèi)腫瘤抑制劑的特性。
根據(jù)其中的一個方面，本發(fā)明提供預(yù)防或治療原發(fā)癌細(xì)胞生長的方法，該方法由施用腫瘤抑制有效量的重組人子宮珠蛋白(rhUG)或其片段或其衍生物組成。
根據(jù)更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供預(yù)防或治療原發(fā)癌細(xì)胞生長的方法，該方法由施用腫瘤抑制有效量的重組人子宮珠蛋白(rhUG)或其片段或其衍生物以靶向子宮珠蛋白受體組成。
更進(jìn)一步，本發(fā)明提供由腫瘤抑制有效量的rhUG和可用于制藥的載體或稀釋劑組成的藥物組合物。在優(yōu)選的實施方案中，rhUG是還原型的和單體的，且純度為約75％～約100％，更優(yōu)選地，純度為約90％～100％最優(yōu)選地，純度至少為約95％。
此外，本發(fā)明提供通過抑制纖連蛋白聚集和/或沉淀以預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，該方法由施用纖連蛋白抑制有效量的rhUG或其片段或其衍生物組成。本發(fā)明的這一方面還包括施用纖連蛋白抑制有效劑量的rhUG以靶向子宮珠蛋白的受體。
更進(jìn)一步，本發(fā)明提供刺激造血作用的方法，該方法由施用刺激造血有效量的rhUG或其片段或其衍生物組成，其中還包括施用纖連蛋白抑制有效量的rhUG以靶向子宮珠蛋白的受體。
本發(fā)明也提供由刺激造血有效量的rhUG或其片段或其衍生物和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組成的藥物組合物，其中rhUG具有約75％～約100％的純度，更優(yōu)選地，具有約90％～約100％的純度，最優(yōu)選地，具有至少95％的純度。
另一方面，本發(fā)明提供從產(chǎn)生子宮珠蛋白受體的細(xì)胞樣品中純化該受體的方法，該方法由下列步驟組成使該樣品與結(jié)合在固相支持物上的rhUG接觸；從固相支持物上洗脫子宮珠蛋白受體的純化樣品。
本發(fā)明也提供還原型rhUG的制備方法，該方法由使氧化型rhUG與還原試劑如二硫蘇糖醇或β-巰基乙醇接觸一段時間并確保足夠的溫度以還原rhUG組成。在優(yōu)選的實施方案中，還原型rhUG是單體的。
更進(jìn)一步，本發(fā)明提供制備子宮珠蛋白受體的抗體的方法，該方法由用純化的子宮珠蛋白受體免疫動物和分離所得抗體組成。
最后，本發(fā)明提供可用于篩選含有化合物、多肽或蛋白的樣品的子宮珠蛋白受體。上述的化合物、多肽或蛋白均是UG結(jié)構(gòu)類似物和/或UG受體的配基。關(guān)于這一點上，子宮珠蛋白受體可應(yīng)用于試劑盒中用以篩選含有化合物、多肽或蛋白的樣品。上述的化合物、多肽或蛋白均是UG結(jié)構(gòu)類似物和/或UG受體的配基。
附圖簡述本發(fā)明將參照附圖更詳細(xì)地描述如下圖1表示UG類蛋白的序列對比；圖2表示轉(zhuǎn)基因剔除小鼠的預(yù)期靶結(jié)構(gòu)；限制性位點B表示BamⅢ,E表示EcoRⅠ,H表示HindⅢ；圖2B-2D表示通過PCR和Southern印跡分析進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因胚胎子代的基因組結(jié)構(gòu)的檢定；(B)ES R1靶細(xì)胞克隆的Southern印跡分析，其中wt表示野生型；(C)來源于子代尾部活體組織的基因組DNA的典型PCR分析；基因型和相應(yīng)PGR產(chǎn)物如下UG+/+,304bp；UG+/-,304和667bp；UG-/-,667bp；(D)小鼠尾部基因組DNA的Southern印跡；圖2E表示RT-PCR分析證實UG-/-小鼠肺部組織中UG-mRNA的缺失；同窩出生且分別具有UG+/+,UG+/-,UG-/-基因型小鼠的肺部組織總RNA的RT-PCR分析；在UG+/+和UG+/-基因型小鼠的肺中，可檢測到273bp的RT-PCR產(chǎn)物，但UG-/-基因型小鼠肺中卻缺乏上述產(chǎn)物；圖2F表示W(wǎng)estern印跡分析證實UG-/-小鼠肺部組織中UG蛋白的缺乏；在非還原條件下，用4～20％的梯度SDS-PAGE對來源于肺溶解產(chǎn)物的蛋白(每一30微克)進(jìn)行分析，并與兔抗鼠UG進(jìn)行免疫雜交；圖2G表示免疫組織化學(xué)法證實UG-/-小鼠肺組織切片中UG的缺乏；UG+/+小鼠(上圖)的支氣管上皮細(xì)胞上的黑色斑點顯示UG的免疫反應(yīng)性；下圖顯示UG-/-小鼠肺中UG的免疫反應(yīng)性的缺乏。
圖3A-3J為正常小鼠與UG-/-小鼠腎臟切片的組織病理學(xué)比較分析，其結(jié)果顯示只有在剔除小鼠體內(nèi)，才會發(fā)生非正常的實質(zhì)性纖維變性和腎小球纖連蛋白沉淀；UG+/+小鼠(A)與同窩出生且基因型為UG-/-小鼠(B)的腎臟蘇木精和伊紅染色切片；(C)10月齡的小鼠腎切片，患有嚴(yán)重的實質(zhì)纖維變性；(D)表示(C)中同一小鼠腎臟的一個區(qū)域，該區(qū)域顯示出腎小管增生(放大倍數(shù)40倍，g表示腎小球；f表示纖維變性；t表示腎小管)；(E)患有嚴(yán)重腎病的UG-/-小鼠腎小球沉淀的透射電鏡圖(放大倍數(shù)6,000倍)；(F)表示(E)中放大60,000倍的插圖，該圖表示膠原蛋白的長線狀纖絲結(jié)構(gòu)以及與纖連蛋白相一致的短擴(kuò)散狀結(jié)構(gòu)；(G)用小鼠Fn抗體進(jìn)行的UG+/+小鼠腎臟切片的Fn免疫熒光檢測；(H)患有嚴(yán)重腎病的UG-/-小鼠腎臟切片的Fn免疫熒光檢測；UG+/+小鼠(I)和UG-/-小鼠(J)腎臟切片的Mason’s trichrome染色；UG-/-小鼠腎臟切片中腎小球上淺藍(lán)色斑點為膠原蛋白(放大倍數(shù)40倍)。
圖4A表示Fn的聚集僅存在于UG-/-小鼠的腎臟中；來源于UG+/+小鼠和UG-/-小鼠的血漿、腎臟和肝臟的Fn的免疫沉淀和Western印跡；多亞基Fn條帶(粗箭頭)僅存在于UG-/-小鼠腎臟的裂解產(chǎn)物中。
圖4B和4C表示體外UG-Fn復(fù)合物的形成；(B)等摩爾濃度UG和Fn的溫育，再用UG或Fn抗體進(jìn)行的免疫沉淀和Western印跡分析；免疫沉淀既包含F(xiàn)n(泳道2上圖)，又包含UG(泳道2，下圖)；上下兩圖的泳道1表示UG和Fn的標(biāo)準(zhǔn)樣；(C)4℃溫育等摩爾濃度125I-UG和Fn一小時，再用6％非還原、非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳以分離上述混合物；泳道1，考馬斯亮藍(lán)染色的UG-Fn復(fù)合物；泳道2，UG-Fn復(fù)合物的放射自顯影圖。
圖4D表示UG-Fn復(fù)合物存在于正常的、非UG-/-小鼠的血漿中；利用Fn抗體進(jìn)行的UG+/+小鼠和UG-/-小鼠血漿的免疫沉淀以及利用Fn和UG抗體進(jìn)行的Western印跡；Fn(上圖)；UG(下圖)；Std表示UG和Fn的標(biāo)準(zhǔn)樣；
圖4E表示體外經(jīng)UG得到的Fn自聚體的劑量依賴性抑制；在UG缺乏(泳道2)和各種劑量UG(泳道3-5)存在條件下，125I-Fn與非標(biāo)記Fn的親和交聯(lián)；UG缺乏條件下形成的高分子量、放射性Fn條帶以劑量依賴性方式還原；泳道1，當(dāng)UG和DSS缺乏時，125I-Fn與非標(biāo)記Fn的親和交聯(lián)；空心箭頭所示為多聚體Fn；下方細(xì)箭頭所示為220kDa Fn。
圖4F表示UG抑制Fn膠原復(fù)合物的形成；在UG缺乏(泳道3)和存在(泳道4)條件下，125I-膠原蛋白I與非標(biāo)記Fn的親和交聯(lián)；泳道1，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色的膠原蛋白I；膠原蛋白I的α1-α1鏈和膠原蛋白I的α2-α2鏈；泳道2,UG和DSS缺乏時，125I-膠原蛋白I與非標(biāo)記Fn的親和交聯(lián)。
圖5A-5F表示UG缺乏條件下，正常小鼠和UG-/-小鼠腎臟Fn沉淀的免疫組織化學(xué)分析；(A)靜脈注射等摩爾濃度Fn和UG的野生型小鼠的腎臟切片；(B)靜脈注射(A)中相同劑量Fn但無UG的UG+/+小鼠的腎臟切片；(C)靜脈注射Fn和UG混合物的、且明顯健康的UG-/-小鼠腎臟切片；(D)靜脈注射Fn(Fn的量與(C)中相同，但無UG)的UG-/-小鼠的腎臟切片；(E)生長于只添加可溶性Fn培養(yǎng)基上的培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的Fn-原纖維的生成；(F)與(E)完全相同的細(xì)胞培養(yǎng)，但其培養(yǎng)基內(nèi)含有等摩爾濃度可溶性hFn和UG混合物(放大倍數(shù)40倍，g表示腎小球)。
圖6A-6B表示為檢測臨床樣品中UG-Fn復(fù)合物而進(jìn)行的癥狀分析的流程圖；圖7表示UG二聚體可通過8.0kDa MWCO透析膜，但無法通過3.4kDa MWCO透析膜。
圖8表示125I-hUG(還原型)與NIH 3T3細(xì)胞特異性結(jié)合的斯卡查德(Scatchard)圖；圖中的數(shù)據(jù)來自三次實驗，其中的每一數(shù)據(jù)點表示三次實驗數(shù)據(jù)的均值。
圖9表示hUG結(jié)合蛋白與NIH 3T3(泳道1-3)，肥大細(xì)胞瘤(泳道4-5)，肉瘤(泳道6-7)，淋巴瘤(泳道8-9)細(xì)胞親和交聯(lián)的SDS-PAGE的放射自顯影圖。將還原型125I-hUG分別與上述每種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)以促使二者在非標(biāo)記的，還原型hUG缺乏或存在條件下的結(jié)合，再將其與二琥珀酰亞胺基辛二酸(DSS)進(jìn)行交聯(lián)(泳道1:(-)DSS；泳道2:(+)DSS；泳道3:(+)非標(biāo)記hUG,(+)DSS；泳道4:(+)DSS；泳道5:(+)非標(biāo)記hUG,(+)DSS；泳道6:(+)DSS；泳道7:(+)非標(biāo)記還原型hUG,(+)DSS；泳道8:(+)DSS；泳道9:(+)非標(biāo)記還原型hUG,(+)DSS；)。
圖10表示親和純化的UG結(jié)合蛋白SDS-PAGE分析的放射自顯影圖。
圖11表示不同的細(xì)胞因子和其他試劑對UG結(jié)合蛋白表達(dá)的影響的SDS-PAGE分析的放射自顯影圖。
圖12表示從Prc/RSV-hUG轉(zhuǎn)染的和野生型(WT)的子宮腺癌和前列腺癌中提取的總RNA的RT-PCR分析。泳道1和泳道2代表不同的克隆的分離株。圖12B表示非轉(zhuǎn)染的和轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群產(chǎn)生的子宮珠蛋白的Western印跡分析。
圖13A和13B表示HEC-1A細(xì)胞侵入ECM時，hUG誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果。
圖14 HEC-1A(a)表示軟瓊脂上對照細(xì)胞(pRC/RSV載體單獨轉(zhuǎn)染子宮腺癌細(xì)胞)的形態(tài)學(xué)，而HEC-1A(b)表示hUG表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。
圖15表示UG-受體存在于HEC-1A(效應(yīng)器)細(xì)胞中，但不存在于HTB-81(非效應(yīng)器)細(xì)胞中(泳道1:(-)DSS；泳道2:(+)DSS；和泳道3:(+)hUG,(+)DSS)。在非轉(zhuǎn)染的(a)和pRSV/hUG轉(zhuǎn)染的HEC-1A與HTB-81細(xì)胞內(nèi)，125I-hUG與其結(jié)合蛋白的親和交聯(lián)。在非標(biāo)記的，還原型hUG缺乏和存在條件下，用還原型125I-hUG培養(yǎng)這些細(xì)胞以促使二者間的結(jié)合，然后再用DSS進(jìn)行交聯(lián)。
優(yōu)選實施方案的詳述rHUG本發(fā)明的rHUG具有與天然人子宮珠蛋白基本上相同的氨基酸序列。具有與天然人子宮珠蛋白“基本上相同”相同的氨基酸序列的一段氨基酸序列包括與天然人類子宮珠蛋白具有至少75％同源性的rHUG。在更優(yōu)選的實施方案中，rHUG至少具有85％的同源性，最優(yōu)選地，rHUG與天然UG至少具有98％同源性。
本發(fā)明提供的方法還包括UG片段或衍生物的應(yīng)用。術(shù)語“片段”是指具有天然蛋白序列中六個或更多連續(xù)氨基酸的天然hUG氨基酸序列的一部分。術(shù)語“衍生物”是指UG多肽類似物，包括一個或更多氨基酸的替代和/或一個或更多化學(xué)部分的添加，如?；噭?，磺酸化試劑，二硫鍵的羧甲基化，或復(fù)合的或螯合的金屬或鹽離子，如Mg+2,Ca+2,Na+，但所有這些修飾的前提條件是該衍生物保留了母體分子的生物學(xué)活性。
UG類蛋白包括從小鼠，大鼠，兔等分離，并基本上具有與天然人子宮珠蛋白相同的氨基酸序列和/或基本上具有序列相似性的蛋白。關(guān)于序列相似性，UG類蛋白中氨基酸可進(jìn)行替代，如酪氨酸替代苯丙氨酸或甘氨酸替代丙氨酸?；旧项愃频腢G類蛋白大約具有30％的序列相似性。優(yōu)選地，具有50％的序列相似性，更優(yōu)選地，至少具有75％的序列相似性，最優(yōu)選地，至少具有90～95％的序列相似性。UG受體配基是與UG受體結(jié)合并調(diào)節(jié)其全部或部分活力的多肽，蛋白或化學(xué)組分(如有機(jī)配基)。子宮珠蛋白結(jié)構(gòu)類似物是具有與天然子宮珠蛋白基本上相似的二級和三級結(jié)構(gòu)特征的化合物，多肽或蛋白，或片段或由此而來的衍生物。同時，該結(jié)構(gòu)類似物至少保留天然蛋白50％的活力，優(yōu)選地，至少保留75％的活力。在最優(yōu)選地實施方案中，結(jié)構(gòu)類似物至少保留天然蛋白90％的活力。
更進(jìn)一步，本發(fā)明中應(yīng)用的的UG是基本上純的。術(shù)語“基本上純的”是指UG具有約75～約100％的純度。在優(yōu)選的實施方案中，UG具有約90～約100％的純度，在最優(yōu)選的實施方案中，UG具有至少95％的純度。UG的臨床應(yīng)用另一方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防炎癥類或纖維變性類或癌癥類疾病的方法，該方法包括給哺乳動物，可能是動物或人類，施用有效劑量的UG。
下表中的一系列疾病是與UG的缺乏，過高的PLA2活力和纖連蛋白沉淀相關(guān)的典型實例。
表2重組子宮珠蛋白的臨床應(yīng)用(按UG特性分類)
表(續(xù))
在人類炎癥類/纖維變性類疾病中，UG缺乏，PLA2活力，纖連蛋白聚集與沉淀和腫瘤抑制，子宮珠蛋白受體之間典型的關(guān)系如下概述。新生兒肺段支氣管發(fā)育不良(嬰兒BPD)新生兒BPD具有嚴(yán)重性炎癥和不可逆轉(zhuǎn)的肺部纖維變性特征，其通常是呼吸窘迫綜合癥(RDS)的結(jié)果。然而，胎糞性呼吸窘迫綜合癥或感染也可能引起嬰兒BPD。
由于肺部hUG的合成可能受發(fā)生在妊辰后期的表面活性劑的共調(diào)節(jié)，故新生兒BPD中已暗示出hUG的缺乏。因而，早產(chǎn)兒就可能缺乏UG和表面活性劑。HUG缺乏可能引起PLA2活力的升高和Fn相關(guān)的纖維變性，而上述兩方面影響均與嬰兒BPD中的炎癥和纖維變性相關(guān)。一些嬰兒對合成性表面活性劑不發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)，這可能歸因于過高的PLA2活力。因此，UG可用于治療新生兒BPD。
優(yōu)選的給藥途徑是經(jīng)氣管內(nèi)的直接滴注法或系統(tǒng)途徑。多器官衰竭(MOF)MOF已暗示出歸因于細(xì)菌性膿毒病或外傷的過高的PLA2活力。該疾病具有系統(tǒng)性炎癥應(yīng)答，包括迅速的，大量的組織損傷和肺、腎臟、胰腺、腸與血管功能喪失的特征。最近的證據(jù)指出MOF引發(fā)系統(tǒng)可溶性磷脂酶A2活力的升高，組織細(xì)胞膜的直接降解和基本磷脂的水解，基本磷脂如肺泡表面活性劑。在臨床環(huán)境中，直接抑制PLA2的嘗試至今還未成功。
在MOF條件下，內(nèi)源性UG的量不足以對抗過度激活的PLA2。外源施用UG用于能治療MOF。
周邊器官衰竭(ROF)包括對器官的損傷，但不包括起初受外傷或感染影響的器官。通常，周邊器官衰竭包括多個周邊器官，并將導(dǎo)致多器官衰竭。例如，胰腺炎是胰腺應(yīng)答酒精攝入、感染或外傷時發(fā)生的炎癥，該疾病可能導(dǎo)致成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)、急性腎衰竭(ARF)和系統(tǒng)性休克。炎癥性腸炎或腹膜炎能導(dǎo)致ROF/MOF。ROF/MOF和高水平的循環(huán)活化PLA2相聯(lián)。系統(tǒng)性施用huG可以防止ROF/MOF。向ROF/MOF病人體內(nèi)直接注射UG能減弱嚴(yán)重程度或消除介導(dǎo)器官衰竭和休克的PLA2。胰腺炎所有類型的胰腺炎均涉及系統(tǒng)性的和局部的Ⅰ型可溶性PLA2活力的升高。通常，胰腺炎會導(dǎo)致肺機(jī)能不全或ARDS，該疾病具有肺部可溶性PLA2活力升高的特性。因而，作為體內(nèi)可溶性Ⅰ型PLA2s的抑制因子，UG是治療兩種類型急性胰腺炎的優(yōu)良候選藥物，并可作為所有類型胰腺炎中肺機(jī)能不全的預(yù)防手段。
優(yōu)選的給藥途徑是靜脈注射途徑。炎癥性腸病炎癥性腸病(IBD)，包括潰瘍性結(jié)腸炎、直腸炎(direticulitis)和克羅恩氏病，該疾病具有局部產(chǎn)生和Ⅱ型可溶性PLA2活力升高的特性。IBD中，循環(huán)性的，可溶性PLA2活力也可能升高。在嚴(yán)重的病例中，作為升高的PLA2活力的結(jié)果(和胰腺炎相似)，IBD導(dǎo)致了肺機(jī)能不全或ARDS。
IBD中外源性UG施用的理論基礎(chǔ)與胰腺炎是相同的通過抑制PLA2,Fn聚集和/或沉淀負(fù)調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答和預(yù)防周邊器官(肺和腎)的涉及。
在住院治療的病人中，優(yōu)選的給藥途徑是靜脈注射途徑。細(xì)菌性肺炎人們發(fā)現(xiàn)與死于細(xì)菌性肺炎的病人相比，幸存者的BAL體液中具有2-3倍水平的UG。肺部細(xì)菌感染可能過度激活內(nèi)源可溶性PLA2?？墒┯肬G以抑制或控制上述影響。
如果病人有插管，優(yōu)選的給藥途徑是氣管內(nèi)途徑；如非插管病人，優(yōu)選靜脈內(nèi)給藥。透析并發(fā)癥主要的透析并發(fā)癥是血栓癥，即自發(fā)形成的血液凝塊。在病人體內(nèi)，這些血液凝塊通常會堵塞血管通路，影響治療，并引起局部缺血，有時會影響生命。血液透析病人的第二個問題是負(fù)責(zé)將透析過的血液返回到病人的主要循環(huán)內(nèi)的近心端靜脈的炎癥和/或纖維變性。由于會導(dǎo)致阻力或壓力的增加，因而，妨礙了透析血液返回的近心端靜脈的纖維變性通常可被檢測到。第三個問題是纖維變性和血管通路位點的關(guān)閉或瘺管。第四個問題是加速的動脈硬化。第五個問題是最有可能歸因于Fn沉淀作用的殘余腎機(jī)能的喪失。
上述過程中內(nèi)源性UG被透析掉的可能性為這些問題提供解釋。內(nèi)源性UG的選擇性去處使得循環(huán)性Fn免于聚集。這就為血液凝塊的形成或沉淀在紅細(xì)胞上作準(zhǔn)備，并通過相互粘著或粘著到血管內(nèi)腔引發(fā)凝集應(yīng)答。谷胺酰轉(zhuǎn)移酶是(TGs)負(fù)責(zé)構(gòu)建發(fā)現(xiàn)于基底膜，皮膚和血液凝塊中的大分子點陣晶格的酶。在作為活化的TGs,Fn和血液其余成分的酶作用底物的自由UG缺乏條件下，凝塊就會交聯(lián)在一起。
血管腔內(nèi)Fn的沉淀可解釋近端靜脈和血管通路位點的炎癥和纖維變性以及加速的動脈硬化。血管內(nèi)皮處的纖連蛋白沉淀促進(jìn)血小板和白細(xì)胞粘著。當(dāng)PLA2抑制作用缺乏時，這兩者可能會被聚集。Fn的血管沉淀物也可能促進(jìn)脂肪、膽固醇和發(fā)現(xiàn)于動脈粥樣斑塊的蛋白的局部堆積。目前已知纖連蛋白是動脈粥樣斑塊和腎小球沉淀的主要成分，該腎小球沉淀與腎病以及主要和殘余腎功能相關(guān)。所以，UG的施用可能會通過減少炎癥和纖連蛋白沉淀從而減弱或消除上述問題。
優(yōu)選，UG施用途徑是透析之前、透析過程中或透析后的靜脈注射。
可替代地，向透析緩沖液中添加UG或用UG預(yù)包被透析膜或兩種方法都采用，可預(yù)防內(nèi)源性UG的喪失。器官移植術(shù)語“器官”是指，例如，實體器官，如腎臟，肝臟和心臟以及骨髓，角膜和皮膚。
有兩種類型的器官排斥急性排斥和慢性排斥。急性排斥是包含PLA2活力和通過破壞移植物的炎癥細(xì)胞進(jìn)行滲透的炎癥過程。
慢性排斥包含F(xiàn)n-介導(dǎo)的移植物的纖維變性，該過程包括限于移植物的動脈粥樣硬化。因而，UG的施用可以用于治療或預(yù)防急性和慢性移植物的排斥。
優(yōu)選的給藥途徑是注射。
器官移植的另外一方面問題是器官在從供體摘除之前、轉(zhuǎn)運過程中以及在受體身體中的局部缺血，這將促進(jìn)急性排斥。局部缺血會引起PLA2的活性升高和組織壞死。所以，子宮珠蛋白可以用來預(yù)防性類局部缺血。所以，子宮珠蛋白的優(yōu)選形式是作為灌流液或者貯藏緩沖液，保存離體的活體器官。Ⅰ型糖尿病的預(yù)防Ⅰ型糖尿病是自身免疫反應(yīng)引起胰腺組織壞死造成的。胰腺在正常情況下，向循環(huán)系統(tǒng)分泌可溶性的PLA2和hUG。本發(fā)明中，報導(dǎo)了在子宮珠蛋白剔除(KO)小鼠的胰腺中有壞死的病灶(下文中稱作“UGKO小鼠”)。
由于缺少子宮珠蛋白，UG KO小鼠表現(xiàn)出了相似的胰腺組織壞死，這種壞死會引發(fā)自身的免疫反應(yīng)。所以子宮珠蛋白可以預(yù)防或者終止Ⅰ型糖尿病的緩慢進(jìn)展。優(yōu)選的給藥途徑是注射。預(yù)防和治療腎病變UG KO小鼠的腎的Fn沉積和纖維變性與人類腎病的腎的Fn沉積和纖維變性相同。所以，子宮珠蛋白給藥可以預(yù)防或者減緩病人危險期腎病變的進(jìn)程，例如Ⅱ型糖尿病。預(yù)防和治療眼部炎癥眼部的炎癥包括色素層炎、視網(wǎng)膜炎、和外科手術(shù)后的炎癥，這些炎癥是以PLA2活性的升高為特征。所以，子宮珠蛋白可以通過局部、眼內(nèi)或者系統(tǒng)的給藥來減輕眼部的炎癥。動脈硬化動脈硬化是指全身的血管纖維加厚。它是Fn在血管壁沉積所引發(fā)或促成的。動脈粥樣硬化是動脈硬化的一種形式，除了Fn沉積，還有膽固醇沉積。所以，施用子宮珠蛋白可以預(yù)防或減輕動脈硬化。急性腎衰竭急性腎衰竭(ARF)是周邊器官炎癥、感染或直接外傷引起PLA2在循環(huán)系統(tǒng)的釋放和激活的典型結(jié)果。急性腎衰竭過程中對腎臟的破壞是非常嚴(yán)重的，炎癥可以造成急性的組織破壞，也可能分解腎臟的纖維質(zhì)生成，而導(dǎo)致長時間的腎功能衰減。子宮珠蛋白的抗炎性和抗纖維質(zhì)變性的特性在UG KO小鼠中表現(xiàn)出特殊的相關(guān)性。
優(yōu)選的給藥途徑是靜脈注射或者系統(tǒng)給藥。預(yù)防和治療原發(fā)腫瘤生長腫瘤發(fā)生是細(xì)胞生長失控和入侵周圍組織的結(jié)果。子宮珠蛋白通過作用于它的細(xì)胞受體而表現(xiàn)出的腫瘤抑制因子活性暗示了它作為一種預(yù)防和/或者治療人類癌癥藥劑的潛力。進(jìn)一步而言，老年缺乏子宮珠蛋白的小鼠的腫瘤發(fā)展表明了長時間缺乏子宮珠蛋白在癌癥中的生理意義。
優(yōu)選的給藥途徑是靜脈注射或者系統(tǒng)給藥。預(yù)防和治療腫瘤的轉(zhuǎn)移纖連蛋白沉積在腫瘤細(xì)胞粘連和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用以被清楚描述(Snyder等人，“纖連蛋白臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用”CRC CriticalREV.Clin.Lab.Sci.23(1):15-34(1985))。子宮珠蛋白在活體中阻止纖連蛋白聚集和沉積的能力表明子宮珠蛋白在預(yù)防和治療人類癌癥轉(zhuǎn)移中的效用。
優(yōu)選的給藥途徑是系統(tǒng)給藥。預(yù)防和治療HIV感染人類白細(xì)胞被人體免疫缺陷病毒感染是通過至少兩類膜結(jié)合HIV受體所促使的。子宮珠蛋白可以通過阻斷一個或者更多的HIV受體而預(yù)防白細(xì)胞的感染。
所以，外源的人類子宮珠蛋白可以通過注射或者系統(tǒng)給藥于感染了HIV的病人或者暴露于HIV的人群。刺激血細(xì)胞生成以缺乏白細(xì)胞和/或者紅細(xì)胞為特征的臨床疾病可以用刺激血細(xì)胞生成的試劑進(jìn)行治療。受上述臨床疾病影響的病人包括接受化學(xué)療法、透析的病人和遺傳性貧血的病人。因為人類子宮珠蛋白已被證實是一種白細(xì)胞生長因子(Aoki等人，1996)和HAF可以刺激紅細(xì)胞和白細(xì)胞生長，所以人類子宮珠蛋白可以用來治療人類貧血。所有的生長因子都是通過膜結(jié)合細(xì)胞受體而發(fā)揮它們的作用，所以，子宮珠蛋白和它的衍生物可以用來靶向子宮珠蛋白的受體，而刺激血細(xì)胞生成。
優(yōu)選的給藥途徑包括注射和系統(tǒng)給藥。
總體上，下述無限制疾病列表與PLA2抑制和/或者纖連蛋白沉積和/或者腫瘤抑制和/或者子宮珠蛋白受體的靶向相關(guān)。借助本發(fā)明的方法，上述每一方面均可作為治療和預(yù)防候選者。關(guān)節(jié)/骨骼類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和肉瘤；自身免疫 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化，Ⅰ型糖尿病，色素層炎，牛皮癬，系統(tǒng)紅斑性狼瘡(SLE)和Crohn疾?。灰? 胰腺炎，肉瘤和癌；腹膜 腹膜炎，闌尾炎，肉瘤和癌；血管/全身敗血性休克，膠原血管疾病，動脈硬化，動脈粥樣硬化，過敏性休克，血吸蟲病，創(chuàng)傷誘導(dǎo)性休克，癌，內(nèi)皮痛和肉瘤；腎 急性腎衰竭，腎的細(xì)菌感染，腎腫瘤造成的炎癥，化療或者抗體治療導(dǎo)致的纖維質(zhì)變性的預(yù)防，糖尿病性腎病的預(yù)防，預(yù)防和/或者治療自發(fā)性腎病，肉瘤和癌肝臟 肝炎，病毒性肝炎，肝硬化，肉瘤，癌；膀胱 膀胱炎，尿道炎，輸尿管炎癥，間質(zhì)膀胱炎，肉瘤和癌；生殖/雌性陰道炎，宮頸炎，骨盆炎癥性疾病，卵巢炎癥(輸卵管炎)，子宮內(nèi)膜炎，陰道白假絲酵母病，輸卵管炎癥或者纖維質(zhì)變性，肉瘤和癌；生殖/雄性陰莖炎，前列腺炎，精管和頂囊炎癥，睪丸炎癥，輸精管、附睪和前列腺炎癥，肉瘤和癌；眼 色素層炎癥，視網(wǎng)膜炎癥，外傷，化學(xué)藥品或者煙霧造成的灼傷，CMV視網(wǎng)膜炎造成的眼部炎癥，結(jié)膜炎(細(xì)菌感染)，病毒感染，傳染性試劑造成的眼部炎癥，眼部外科手術(shù)后造成的眼部炎癥，包括白內(nèi)障摘除，激光外科，角膜移植，腫瘤摘除，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤造成的眼部炎癥(腫瘤)，放射性照射造成的眼部炎癥，變態(tài)性應(yīng)答造成的炎癥，肉瘤和癌；心臟 心內(nèi)膜炎，肉瘤和癌；肺支氣管哮喘，成人呼吸性窘迫綜合癥，肺炎，自發(fā)性纖維質(zhì)變性，化療引起的肺纖維質(zhì)變性(博來霉素，氨甲蝶呤)，暴露于化學(xué)藥品環(huán)境引起的肺纖維質(zhì)變性(石棉，洗滌劑，污染物，例如dioxin和汽車尾氣中的PCB)，煙霧的吸入，溺水恢復(fù)過程中的肺部炎癥，新生兒呼吸窘迫綜合癥，肉瘤和癌；腸炎癥性腸疾病，結(jié)腸炎，Crohn’s疾病，direticulitis，新生期的壞死性小腸炎癥，傳染性試劑、輪狀病毒、脊髓灰質(zhì)類病毒、HIV造成的炎癥，胃潰瘍，胃食管反流疾病，扁桃體炎，肉瘤和癌；痔移植 在進(jìn)行某一器官或組織移植手術(shù)后，為控制炎癥、纖維質(zhì)變性和排斥的給藥；耳部 中耳炎，肉瘤和癌；皮膚 牛皮癬，蕁麻疹，變應(yīng)性和皮膚病，硬皮病，接觸皮炎，化學(xué)藥品引起的皮膚病(毒藥長春藤、橡木和暴露于類似于PCB等化學(xué)藥品引起的)，氯，氨，(洗滌劑，有毒試劑)，肉瘤和癌；脾/胸腺 肉瘤和癌；肌肉 肉瘤和癌；生血細(xì)胞/淋巴 肉瘤和癌；胚胎 肉瘤和癌；腺體 肉瘤和癌；(內(nèi)分泌腺)肉瘤和癌；
此外，子宮珠蛋白可以單獨給藥，也可以與其他的活性試劑或者組分聯(lián)合給藥，用于治療或預(yù)防上述疾病。這里所指的活性試劑或者組分包括但不限于類固醇、非類固醇類抗炎藥(NSAIDs)、化學(xué)劑、止痛藥、免疫活療劑、抗病毒劑、抗真菌劑、疫苗、免疫抑制劑、造血生長因子、激素、細(xì)胞因子、抗體、抗凝劑、心血管藥物、致育藥物，還包括口服耐受性藥物、維生素和礦物質(zhì)。
本發(fā)明是關(guān)于子宮珠蛋白在預(yù)防或者治療PLA2、纖連蛋白以及癌和子宮珠蛋白受體相關(guān)疾病的用途。關(guān)于預(yù)防一種病況中的“預(yù)防”指的是阻止疾病在易感或潛伏易感人群中的發(fā)展，或者限制疾病的惡化或發(fā)展，而術(shù)語“治療”指的是一種疾病或者病理學(xué)狀況的好轉(zhuǎn)。
子宮珠蛋白可以通過給藥而靶向于子宮珠蛋白的受體。子宮珠蛋白受體的靶向是指誘導(dǎo)配基與受體進(jìn)行特異性結(jié)合，而促使對細(xì)胞生長進(jìn)行影響。
子宮珠蛋白可以靜脈內(nèi)給藥，或者在治療新生兒呼吸性窘迫綜合癥RDS/BPD和成人呼吸性窘迫綜合癥，也可以液體或半氣溶膠的形式通過氣管插管給藥。其他可用的給藥途徑包括局部的、眼部的、皮膚的、經(jīng)皮的、肛門的、系統(tǒng)的、肌內(nèi)的、緩釋、口服的、陰道的、十二指腸內(nèi)的、腹膜內(nèi)的和結(jié)腸內(nèi)的給藥。上述的組分可以按照服藥所需劑量給受試者或者病人服藥，或者根據(jù)內(nèi)科的，營養(yǎng)的和獸醫(yī)等領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，同時考慮年齡、性別、體重、和特殊受驗者或病人的疾病和給藥路線因素進(jìn)行給藥。本發(fā)明的組分也可以按照控制釋放的制劑進(jìn)行給藥。組分也可以與其他活性試劑同時給藥或者按照次序給藥，同時考慮年齡、性別、體重、和特殊受驗者或病人的疾病和給藥途徑因素。
本發(fā)明的組合物的例子包括口服給藥的可食性的組分，例如膠囊、片劑、和類似的為口準(zhǔn)備的液體制劑，如口的，鼻的，肛門的，陰道的等等，還有懸液、糖漿和酏劑，和為胃腸外的、皮下的、皮內(nèi)的、肌內(nèi)的和靜脈內(nèi)給藥的制劑(例如，可注射給藥)，例如無菌懸浮液和乳劑。然而，在血液中給藥時，組合物中的活性原料可能與蛋白質(zhì)復(fù)合，血蛋白的沉淀作用可能造成凝血的發(fā)生，技術(shù)人員應(yīng)該考慮到這一點。
在上述的組合物中，子宮珠蛋白可以混合于合適的載體、稀釋劑、或者賦形劑，如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、DMSO、乙醇、或者類似物中。
子宮珠蛋白能以凍干的形式提供并恢復(fù)再組成，例如，在等離子水中，鹽水中，葡萄糖溶液中，或者DMSO緩沖液中。在一定的鹽溶液中，觀察到某些rhUG的沉淀作用；這種觀察可以應(yīng)用于一種分離創(chuàng)造性化合物的方法，例如，用鹽析的方法。
進(jìn)一步而言，本發(fā)明還包括一種提供子宮珠蛋白的試劑盒。這種試劑盒包括一個單獨的容器，里面含有合適的載體、稀釋劑或者賦形劑。這種試劑盒含有一種另外的試劑，它可以通過共同給藥或者按次序給藥來減輕或者緩和上述疾病的影響。另外的試劑可以用單獨的容器提供，也可以與子宮珠蛋白混合。另外，試劑盒包括混合或者調(diào)勻原料以及給藥的說明書。
本發(fā)明還考慮了一種治療或者預(yù)防缺乏內(nèi)源功能子宮珠蛋白為特征的癌癥的方法，這種方法包括給病人服用這種治療所需的補(bǔ)償量子宮珠蛋白。術(shù)語“補(bǔ)償量”指的是使局部肺的或者全局總的子宮珠蛋白的濃度(內(nèi)源功能性子宮珠蛋白和外源子宮珠蛋白)達(dá)到正常范圍所需的子宮珠蛋白的量。特別是，局部內(nèi)源子宮珠蛋白的正常范圍是大約大于50微克子宮珠蛋白每毫克白蛋白或者大于50毫克每升。血漿子宮珠蛋白的濃度的正常范圍是大于15微克每升。此外，可以服用過量的子宮珠蛋白，使其數(shù)量足夠飽和可溶和不可溶(膜結(jié)合)的身體內(nèi)子宮珠蛋白接合部位，這種數(shù)量可以超過上述定義的子宮珠蛋白的補(bǔ)償量，子宮珠蛋白的循環(huán)水平可以接近正常水平的20-200倍。
本發(fā)明的組合包含一定數(shù)量的天然和/或者重組的hUG，以達(dá)到預(yù)期目的，即增長血漿或者組織中子宮珠蛋白的水平，以產(chǎn)生抑制腫瘤和/或者結(jié)合纖連蛋白減輕其在(腫瘤)轉(zhuǎn)移中的作用的預(yù)期效果。組合物包含有效量的基本上純的天然和/或者重組的人類子宮珠蛋白，與藥用可接受的載體或者稀釋劑相聯(lián)合。子宮珠蛋白能以還原或者單體的形式存在，或者兩者共存。
子宮珠蛋白可以一次給藥的數(shù)量是20ng/kg到500mg/kg。一次、多次或者連續(xù)給藥的量可以達(dá)到10克。
這里所用的術(shù)語“腫瘤抑制有效量”指的是子宮珠蛋白抑制腫瘤和預(yù)防或減少腫瘤在病人體內(nèi)或者組織內(nèi)轉(zhuǎn)移所需要的量。術(shù)語“纖連蛋白結(jié)合有效量”指的是子宮珠蛋白結(jié)合纖連蛋白，以減少聚集和/或者沉積，進(jìn)而預(yù)防和減少腫瘤轉(zhuǎn)移所需的量。同樣的，術(shù)語“刺激血細(xì)胞生成有效量”指的是通過子宮珠蛋白給藥刺激紅細(xì)胞和白細(xì)胞生長所需子宮珠蛋白的量。此外，術(shù)語“抗HIV有效量”指的是足夠封閉一個或者多個HIV受體所需子宮珠蛋白的量。典型地，為治療成人癌癥一次服用子宮珠蛋白的量可以從0.2μg/kg到500mg/kg，而一段時間內(nèi)給藥的量可以達(dá)到幾克。對于新生兒而言，在治療新生兒呼吸性窘迫綜合癥時，其一次用量范圍可以從50ng/kg到100mg/kg，或者在一段時間內(nèi)連續(xù)給藥的量可以達(dá)到10克。有效和安全的連續(xù)注入速率在50ng/kg/hr到500mg/kg/hr之間。
此外，本發(fā)明提供一種利用rhUG結(jié)合到固相支持物上進(jìn)行親和層析，從而提純子宮珠蛋白受體的方法。這個方法包括將在親和層析之前溶解或部分提純牛的心臟、脾、器官、肺、肝和主動脈樣品與具有子宮珠蛋白(或其片般或其衍生物，或者子宮珠蛋白類似蛋白質(zhì)或者子宮珠蛋白受體配基)偶聯(lián)配基的固體支持物接觸。子宮珠蛋白可以共價結(jié)合到固相支持物上，例如溴化氰活化的瓊脂糖4B，或者通過本領(lǐng)域已知的任何方法，或者任何固相支持物上。子宮珠蛋白受體蛋白可以被合適的緩沖液從固體支持物上洗脫下來。
進(jìn)一步而言，本發(fā)明提供了一種制備還原型rhUG的方法。本發(fā)明的方法包括在合適的溫度條件和時間內(nèi)，如37℃和15分鐘內(nèi)，將被氧化或者部分氧化的rhGU與還原劑接觸，例如二硫蘇糖醇或者β-巰基乙醇，以還原rhUG。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法產(chǎn)生了還原的單體rhUG。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該可以知道任何合適的還原劑或者還原劑的組合，在正確的時間內(nèi)和合適的溫度條件下，還原rhUG，并可以用高壓液體層析，SDS-PAGE或者其他合適的檢測方法證實。
另外，子宮珠蛋白的受體可以采用該領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的已知標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行提純，并用來篩選具有子宮珠蛋白類似結(jié)構(gòu)化合物、多肽、蛋白質(zhì)和/或者子宮珠蛋白受體配基?；谶@一點，提純的子宮珠蛋白可以應(yīng)用為一種試劑盒，用來篩選子宮珠蛋白類似物和/或者子宮珠蛋白受體配基。這種篩選方法包括將含有一種或者幾種化合物、肽、和/或者蛋白質(zhì)樣品與提純的子宮珠蛋白受體接觸，檢測樣品中一種或多種成分與子宮珠蛋白受體的結(jié)合反應(yīng)。這種結(jié)合相互作用，例如配體和受體的相互作用，可以通過紫外吸收光譜的變化或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行檢測，這種結(jié)合相互作用也暗示了樣品中子宮珠蛋白結(jié)構(gòu)類似物和/或者子宮珠蛋白受體配給的存在。
最后，提純的子宮珠蛋白受體可以用來制備受體的抗體。這種抗體可以用來刺激和激活子宮珠蛋白的受體，也可以應(yīng)用該領(lǐng)域技術(shù)人員中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行抗體制備，例如，用提純的子宮珠蛋白受體免疫小鼠，制備雜交瘤，篩選子宮珠蛋白的受體的抗體。參考Sambrook等人，“分子克隆實驗手冊，第二版”，Cold Spring HarborLaboratory Press,NY,1989。
實施例本發(fā)明將參照下列非限制性的實施例作進(jìn)一步描述。份額和百分比以重量為標(biāo)準(zhǔn)，除非另有說明。實施例1體內(nèi)試驗重組的人子宮珠蛋白可以通過Mantile等人的方法獲得(1993)。在受孕142天通過子宮剖開術(shù)(C-section)分娩后，稱取大約重400g的一個雄性和雌性的P.cynocephalus。這是RDS的確定模型(Coalson,J.J.等人，BPD的狒狒模型Ⅱ病理學(xué)特征。Exp.Mol.Pathol.37:355-350(1982))。
分娩之后，幼兒用Ketamine(10mg/kg)麻醉，并用直徑2.5毫米的氣管插管進(jìn)行插管。血氣與血壓通過經(jīng)皮膚注射到橈動脈的動脈線進(jìn)行監(jiān)測。一個較深的靜脈線經(jīng)皮放入到隱靜脈，用來注入液體、抗體和藥物。動物飼養(yǎng)于伺服控制紅外暖箱里，采用標(biāo)準(zhǔn)的時間周期的，壓力調(diào)控的，帶有增濕器的通氣器進(jìn)行通氣，并維持在36-37℃。初始的設(shè)置是FiO21.0，速率為40每分鐘，I/E比率為1∶1.5，正的末端呼出氣壓(PHEP)為4厘米水柱，需要的吸氣壓峰值應(yīng)該足夠箱內(nèi)空間的巡回。FiO2保持在1.0,PIP通過調(diào)控，維持在PaCO2為40±10托。血氣、血細(xì)胞比容、電解質(zhì)、凝血酶血時間、部分凝血致活酶時間和靈活性(dextrostix)每小時進(jìn)行監(jiān)控。取血研究用相同血容量的成年狒狒血代替。靜脈內(nèi)液體隨同電解質(zhì)給藥的速率為10cckg/ar，當(dāng)心臟速率超過180次每分鐘時可以根據(jù)需要進(jìn)行增加。當(dāng)堿缺乏超過10的時候，可以服用碳酸氫鈉(2mep/kg)。氨芐青霉素(兩次分開給藥的劑量是50毫克每千克每天)和慶大霉素(兩次分開給藥的劑量是5毫克每千克每天)在實驗持續(xù)過程中連續(xù)供給。
一個動物接受了肺泡表面活性劑和PBS(處理1)，第二個動物(處理2)接受了肺泡表面活性劑和兩倍劑量的1mg/kg rhUG?；钚詣┖蛂hUG都是通過氣管插管直接給藥于肺部。所用的肺泡表面活性劑是Survanta(羅斯實驗室)，是從牛的肺部提取的肺泡表面活性劑制劑，除了磷脂外，還含有肺泡表面活性劑脫輔基蛋白質(zhì)B和C。第一劑量的rhUG與肺泡表面活性劑同時給藥，第二劑量的給藥是在第一次給藥的四個小時后。動物的動脈血氣、電解質(zhì)和EKG得到監(jiān)控。在用肺泡表面活性劑治療的50小時后，處死動物。在24小時和48小時，用含有蛋白酶抑制劑(苯甲基磺酰氟，10μg/ml的亮抑酶肽，10μg/ml抑胃酶肽和桿菌肽)的PBS灌洗肺部。肺部灌洗液在-80℃冷凍直至鑒定PLA2活性?？偟鞍子肂radford方法測定(Bio Rad)。肺部灌洗液中的PLA2活性根據(jù)Levin等人(1986；上文)的方法測定，并在下表中列出。
表3．活體內(nèi)測定子宮珠蛋白的結(jié)果
上面所給的數(shù)據(jù)是兩次測定的平均值。這些結(jié)果表明氣管內(nèi)的rhUG給藥抑制了活體內(nèi)PLA2的活性。接受了肺泡表面活性劑和rhUG的動物與只接受肺泡表面活性劑而沒有rhUG的動物相比，其肺部灌洗液中具有可觀察到的較低PLA2活性。這些數(shù)據(jù)證實了rhUG和肺泡表面活性劑的共同給藥，對保護(hù)肺泡表面活性劑磷脂具有意義。
實施例2．體外利用可溶的PLA2抑制人工表面活性劑的的水解體外利用可溶性PLA2,rhUG可以抑制人工表面活性劑的水解。Survanta是從牛的肺部提取的人工表面活性劑制劑，可用來治療未足月呼吸窘迫綜合癥的新生兒和呼吸窘迫綜合癥(ARDS)成人。Survanta被第一組可溶的PLA2水解，如豬的，胰的PLA2，其特征是作為一種底物，具有與熒光卵磷脂底物相競爭的能力，并產(chǎn)生花生四烯酸產(chǎn)物。
Survanta是一種體外的底物，可以被第一組可溶的PLA2降解。在體外，Survanta可以迅速被人的肺部細(xì)胞外液中的PLA2降解。RhUG可以抑制Survanta在體外的降解。實施例3．構(gòu)建子宮珠蛋白剔除小鼠建立一種轉(zhuǎn)基因的子宮珠蛋白剔除小鼠的目的是為了測定子宮珠蛋白在哺乳動物生理中的作用，同時也為了產(chǎn)生一個子宮珠蛋白在幾種炎性臨床疾病治療的模型。第一步是構(gòu)建一個合適的DNA載體，用這種載體，可以靶向并阻礙小鼠的內(nèi)源子宮珠蛋白基因。將來源于129/SVI小鼠品系子宮珠蛋白劑基因(RAY,1993)，含有外顯子3和側(cè)翼序列，長度為3.2個kb的BamHⅠ-EcoRⅠ DNA片段亞克隆到pPNW載體的相應(yīng)位點上，如Lei等人(1996)所述。將NotⅠ和XhoⅠ限制性位點改造，定向亞克隆到基因的目標(biāo)載體上。一個含有部分外顯子2和其上游序列，長度為0.9kb的片段用PCR(引物 引物-L(來源于內(nèi)含子)5’-TTC CAA GGC AGA ACA TTT GAG AC-3’；引物-R(來源于外顯子2):5’-TCT GAG CCA GGG TTG AAA GG C-3’)得到了擴(kuò)增。在構(gòu)建過程中，去除了一個編碼27個氨基酸的79bp的外顯子2。PCR的片段定位于pPNW編碼新霉素抗性基因的上游，產(chǎn)生目的載體pPNWDG。這種載體在圖2A中列出，其PGK-neo彈夾結(jié)構(gòu)阻斷了子宮珠蛋白基因，破壞了蛋白質(zhì)的編碼序列。
根據(jù)Nagy、A.，等人，PNAS 90:8424(1993),pPNWDG基因的目的載體用NotⅠ線性化，通過電穿孔注入ES R1細(xì)胞中。電穿孔細(xì)胞的Gancyclovir和G-418選擇產(chǎn)生了156個克隆。Southern印跡分析鑒定了一個野生型子宮珠蛋白等位基因的5.1kb HindⅢ片段，并在156個可隆中發(fā)現(xiàn)了3個克隆含有同源重組產(chǎn)生一個附加的8.2kbHindⅢ片段，如圖2B所示。根據(jù)Capecchi，科學(xué)244:1288(1989)，將這些ES R1克隆注入到C57BL胚泡中。不同的嵌和體產(chǎn)生了兩種不同品系小鼠。帶有子宮珠蛋白目的基因座的雜合體后代(UG+/-)進(jìn)行配對，其后代的基因型通過PCR分析，如圖2C所示，還有Southern印跡，如圖2D所示。實施例4．子宮珠蛋白基因剔除和鼠類的子宮珠蛋白(mUG)蛋白缺失的確認(rèn)為了證實純合剔除小鼠(UG-/-)不擁有任何可檢測的mUG，子宮珠蛋白基因目標(biāo)小鼠用來檢測包括肺在內(nèi)的幾個器官內(nèi)子宮珠蛋白mRNA和mUG的表達(dá)。一個實驗方案為動物飼養(yǎng)和使用委員會通過。總的mRNA在UG+/+、UG+/-和UG-/-小鼠不同器官的得到分離。逆轉(zhuǎn)錄酶-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用來檢測mUG的mRNA。利用mUG特異性引物，目的分子被逆轉(zhuǎn)錄，mPr(5’-ATC TTG CTT ACA CAG AGG ACT TG-3’)，產(chǎn)生的cDNA利用PCR引物mPr和mP1(5’-ATC GCC ATC ACA ATC ACTGT-3’)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR的產(chǎn)物與寡核苷酸探針雜交，mPp(5’-ATC AGAGTC TGG TTA TGT GGC ATC C-3’)來源于子宮珠蛋白基因序列外顯子2。在小鼠GAPDH RT-PCR中應(yīng)用的引物和探針如下所示mGAPDH-r(5’-GGC ATC GAA GGT GGA AGA GT-3’)；mGAPDH-1(5’-ATG GCC TTCCGT GTT CCT AC-3’)；mGAPDH-p(5’-GAA GGT GGT GAA GCA GGC ATCTGA GG-3’)。圖2E顯示mUG的mRNA在UG+/+、UG+/-小鼠肺中檢測到，而在UG-/-沒有檢測到。相同的數(shù)據(jù)(未顯示)顯示mUG的mRNA在UG-/-小鼠的前列腺或者子宮中沒有出現(xiàn)，但在具有完整子宮珠蛋白基因的小鼠中出現(xiàn)。
用免疫沉淀和Western印跡分析肺中mUG的蛋白產(chǎn)生了相同的確證性結(jié)果，如圖2F所示。UG+/+和UG-/-小鼠的腎、肝和肺的組織溶解產(chǎn)物在含有2mM苯甲基磺酰氟和各20μg/ml的抑酶肽、亮抑酶肽和抑胃酶肽A的緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.5,1％的曲拉通X-100,0.2％脫氧膽酸，150mM的NaCl,5mM EDTA)中勻漿制備。勻漿液在4℃條件下，17,500×g離心30分鐘，通過溫育組織溶解液或血漿蛋白(1mg/ml)和鼠的Fn(1∶100稀釋)兔抗體進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)(E.Harlow和D.Lane，抗體；實驗手冊，第一版，Cold Spring HarborLaboratory Press,NY,1988)。在4℃條件下，等摩爾提純的鼠FN(mFN)與rhUG之間的相互免疫沉淀反應(yīng)在含有10％甘油，50mMTris-HCl,pH7.5,250mM NaCl,4.3mM磷酸鈉液體中進(jìn)行，接著加入抗-mFn的抗體(1∶100稀釋)。在還原狀態(tài)下，等量的提取組織蛋白(30μg)或者免疫沉淀物在4-20％或者6％SDS-PAGE分離，接著用鼠的Fn兔抗體(1∶2000稀釋)或者UG的兔抗體(1∶2000稀釋)進(jìn)行Western印跡。在UG-/-小鼠的組織或者液體中沒有檢測到mUG的存在，而在UG+/+、UG+/-小鼠的組織中確實含有mUG蛋白。
最后，病理學(xué)分析UG-/-小鼠的肺部表明，僅在細(xì)支氣管上皮細(xì)胞缺少特異性免疫染色。將UG-/-、UG+/-和UG+/+小鼠的肺部組織在布安液或者10％的中性福爾馬林固定液中固定，然后用石蠟包埋，以4-6微米厚度進(jìn)行切片。切片用蘇木精和曙紅(H&E)染色。選取的組織用馬森三色法染色，進(jìn)行膠原檢測，PATH用來檢測纖維蛋白，岡果紅用來檢測淀粉樣蛋白。為了檢測mUG和mFn的免疫化學(xué)反應(yīng)，應(yīng)用Vectastain Rabbit Elite ABC試劑盒。根據(jù)mUG的氨基酸序列(Lys28至Thr49，特異性的KPFNPGSDLQNAGTQLKRLVDT)合成多肽，產(chǎn)生mUG的兔抗體(CytImmune)。這種mFn的兔抗體使用時按1∶1000稀釋，mUG抗體使用時按1∶500稀釋。
這三組結(jié)果證實純合子子宮珠蛋白剔除小鼠，UG-/-，缺少mUG蛋白，或者任何可檢測蛋白的一部分。實施例5．子宮珠蛋白剔除小鼠的表型UG+/-小鼠雜交產(chǎn)生的179個后代中，46(26％)個小鼠是+/+基因型，90(50％)個小鼠是+/-基因型，43(24％)個小鼠是UG-/-基因型，表明分離的mUG基因座是按照孟德爾方式遺傳的，UG+/+、UG+/-和UG-/-小鼠在出生上具有相等活力。然而，UG-/-小鼠表現(xiàn)出一種新的表現(xiàn)型，他們發(fā)展了一種進(jìn)化性疾病，這種疾病以惡病質(zhì)、重的蛋白尿、低血鈣，同時伴隨體重的極大喪失為特征。蛋白尿是一種疾病，表現(xiàn)為不正常的高濃度血清白蛋白和其他血清蛋白排泄到尿中。它暗示了腎小球機(jī)能障礙和腎衰竭。對受此影響的動物(上面描述的肺部)進(jìn)行腎的組織病理學(xué)檢查，揭示了爆發(fā)性的腎小球疾病，如圖3所示。與UG+/+小鼠的腎小球相比，UG-/-小鼠的腎小球細(xì)胞數(shù)目過少，并有大量的嗜曙紅蛋白性質(zhì)的沉積。UG-/-小鼠致命性的腎疾病時間過程可以是在起始的早期(4-5周的時期)，也可以是起始的晚期(10個月的時期)。那些在起始4周齡時表現(xiàn)健康的UG-/-小鼠，在兩個月齡后，出現(xiàn)病灶的腎小球沉積。在大約十個月時，這些小鼠出現(xiàn)了類似于早期死于疾病小鼠的極端惡病質(zhì)。雜合體表現(xiàn)出輕微的在UG-/-小鼠觀察到的腎疾病癥狀。晚期出現(xiàn)疾病小鼠的腎的組織病理學(xué)表明不僅出現(xiàn)了嚴(yán)重的早期腎小球疾病，而且還出現(xiàn)了以腎實質(zhì)纖維質(zhì)變性和腎小管增生為特征的疾病(參看圖3)。盡管UG-/-小鼠主要病理學(xué)在腎中發(fā)現(xiàn)，組織病理學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)了在胰中出現(xiàn)壞死的應(yīng)時病灶區(qū)域，這種壞死于血管走向相一致。此外，胸腺和脾病灶區(qū)域中，暗示的細(xì)胞程序性死亡也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)。有趣的是，在胰中表達(dá)了mUG的基因，而這種組織同時又是豐富的第一組胞外PLA2的源泉。因為這是一種消化酶，它的激活可能會造成組織傷害。
據(jù)報導(dǎo)，子宮珠蛋白具有免疫調(diào)控和抗炎的特征，而活性淀粉樣蛋白病在炎癥應(yīng)答時發(fā)生，這可能是因為mUG無效小鼠的腎小球沉積物是淀粉樣蛋白。活性淀粉狀蛋白病以淀粉樣蛋白和具有免疫力復(fù)合物沉積為特征。UG-/-小鼠腎沉積物的同一性通過腎切片免疫組織化學(xué)得到確定。UG-/-小鼠與UG+/+小鼠腎切片用Congo red染色，然后在偏振光下進(jìn)行檢測。淀粉樣蛋白在檢測時產(chǎn)生正的雙折射；然而，UG-/-小鼠的腎小球出現(xiàn)清晰的負(fù)。為了檢測UG-/-小鼠的腎小球中IgA、IgG或者IgM-免疫復(fù)合物的存在而進(jìn)行的免疫熒光研究和為了檢測主要的淀粉樣蛋白的存在而進(jìn)行的免疫組織化學(xué)分析的結(jié)果也都是陰性的。所以，UG-/-小鼠腎小球沉積物既不含有淀粉樣蛋白，也不含有免疫復(fù)合物，所以，腎小球沉積物并不是炎癥反應(yīng)的結(jié)果。實施例6．檢測UG-/-小鼠腎中的Fn和膠原蛋白UG-/-小鼠腎的沉積物用透射電子顯微鏡檢查，以闡明它們的結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)特征。一個出現(xiàn)腎小球病變的UG-/-小鼠的腎在福爾馬林中固定，然后在環(huán)氧樹脂中包埋。薄的切片用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，在電子顯微鏡下觀察。在6000倍或者60,000倍時拍攝顯微照片。這種沉積物主要含有兩種類型的原纖維結(jié)構(gòu)一種是相對罕見的長的紋狀原纖維，另外一種是含量豐富的短的彌散原纖維(圖3E和3F)。因為ECM蛋白質(zhì)，如膠原蛋白和纖連蛋白，可以產(chǎn)生類似的原纖維結(jié)構(gòu)，所以UG-/-小鼠腎小球沉積物可能含有這些蛋白質(zhì)。
腎小球沉積物接著用抗-mFn的抗體進(jìn)行免疫熒光分析。利用兔抗-mFn和FITC結(jié)合的羊抗兔IgG，將福爾馬林固定過的組織切片進(jìn)行免疫熒光反應(yīng)。同樣的，利用mFn、膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ、玻連蛋白、層粘連蛋白和骨橋蛋白特異性抗體，進(jìn)行了免疫熒光研究。利用一個Zeiss Axiophot顯微鏡拍攝落射熒光。在野生型的小鼠的腎小球中，F(xiàn)n特異性熒光實際上是檢測不到的(圖3G)，而在同窩的UG-/-小鼠的腎小球中，特異性熒光非常強(qiáng)烈。當(dāng)使用馬森三色染劑時，UG+/+小鼠的腎小球表現(xiàn)為陰性(圖3I)，而UG-/-小鼠的腎小球表現(xiàn)為陽性，這表明在腎小球沉積物中存在膠原蛋白。用膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ特異性抗體進(jìn)行的免疫熒光反應(yīng)正是這些結(jié)果。因為Fn可以與胞外基質(zhì)蛋白發(fā)生相互作用，我們還利用免疫組織化學(xué)的方法，檢測了UG+/+小鼠和UG-/-小鼠腎小球中層粘連蛋白、玻連蛋白和骨橋蛋白的存在，結(jié)果都是陰性的。實施例7．UG-/-小鼠的腎沒有過量產(chǎn)生Fn為了測定是否Fn過量產(chǎn)生可以解釋它在腎小球中的沉積，我們利用逆轉(zhuǎn)錄酶-多聚鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和光密度測定法確定了UG-/-小鼠和UG+/+小鼠腎、肺和肝中Fn-mRNA的相對數(shù)量。結(jié)果顯示在UG+/+和UG-/-動物中，F(xiàn)n-mRNA的相對數(shù)量基本上相同。所以，F(xiàn)n-mRNA過量產(chǎn)生不可能是Fn在UG-/-小鼠腎小球中沉積的原因。應(yīng)用還原狀態(tài)下的SDS-PAGE和Western印跡，我們還比較了UG-/-小鼠和UG+/+小鼠的血漿、腎和肝中Fn蛋白。在野生型小鼠的血漿、腎和肝中，只有220kD的Fn類型可以檢測到。然而，UG-/-小鼠的血漿和肝的裂解液中，也具有220kD的Fn類型條帶，而腎的裂解液中，明顯含有其他共價連接多聚體的Fn條帶(圖4A)。實施例8．在UG-/-小鼠中升高的血清PLA2活性基于目前的觀念，認(rèn)為Fn基質(zhì)裝配和原纖維生成的關(guān)鍵初始步驟是，至少在一個細(xì)胞表面，包括整聯(lián)蛋白的激活和Fn的自我聚集。因為子宮珠蛋白是可溶的磷脂酶A2有效抑制劑，這種酶是炎癥反應(yīng)途徑中的關(guān)鍵酶，UG-/-小鼠中mUG的缺乏，可以促進(jìn)腎小球腎炎和一種炎性腎疾病的發(fā)展。于是，我們測定了根據(jù)年齡、性別和體重相匹配的UG+/+小鼠(n=3)和UG-/-小鼠(n=3)血漿中PLA2活性。動物處死后，將每個樣品分為三份，根據(jù)制造商的操作指南，使用PLA2測定試劑盒(Caymen Chemical)測定PLA2活性。蛋白濃度用Bradford方法進(jìn)行測定(Bio Rad)，計算PLA2比活。UG-/-小鼠[36+3.3(SEM)]的血漿PLA2比活(μmol/min/mg蛋白)明顯高于(p＜0.05)UG+/+小鼠[18+2.8(SEM)]的血漿PLA2比活。這些結(jié)果產(chǎn)生了一種可能性，即較高的PLA2活性可以導(dǎo)致磷脂酸(LPA)的產(chǎn)量的增長，接下來啟動整合蛋白的活性，使UG-/-小鼠中Fn自我聚集。實施例9．子宮珠蛋白和纖連蛋白在體外的相互反應(yīng)為了進(jìn)一步理解子宮珠蛋白是如何阻止Fn的自我組裝，rhUG干擾mFn-Fn相互反應(yīng)的能力得到了測定。溫育等摩爾濃度的rhUG和mFn，并允許任何蛋白的結(jié)合或者其他作用，然后用抗Fn的抗體進(jìn)行免疫沉淀，免疫沉淀產(chǎn)物在還原的狀態(tài)下，用SDS-PAGE進(jìn)行分離。如前面所述，用mFn或者mUG抗體進(jìn)行Western blotting，分別檢測每一種蛋白。結(jié)果顯示纖連蛋白與rhUG發(fā)生了相互的免疫沉降反應(yīng)(圖4B)。為了證實這些結(jié)果，125I-rhUG與mFn溫育，復(fù)合物在非變性和非還原狀態(tài)下，采用6％聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行電泳分離(圖4C)。在放射自顯影中，檢測到雜聚(heteromer)的Fn-UG(泳道2)，表明可溶的Fn在體外可以與UG相互作用。為了確定是否Fn-UG的雜聚在體內(nèi)也發(fā)生，UG+/+小鼠和UG-/-小鼠的血漿與抗mFn的抗體進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，而這種抗體是不與rhUG發(fā)生交互反應(yīng)的(圖4D)?？筸Fn的抗體可以與UG+/+小鼠血漿中的mFn和rhUG兩者發(fā)生共沉淀反應(yīng)，而不能與來源于UG-/-小鼠的血漿mFn和rhUG發(fā)生共沉淀反應(yīng)，這表明mFn和rhUG雜聚出現(xiàn)在UG+/+小鼠血漿中。所以，F(xiàn)n-UG復(fù)合物不是簡單的在體外人為形成，而是在血漿中自然發(fā)生。
為了確定UG結(jié)合Fn的特異性和親和力，我們在UG存在和缺失的條件下用未標(biāo)記的Fn孵育125I-Fn。用二琥珀酰亞胺基辛二酸(DSS)親和交聯(lián)所有的復(fù)合物。使用人Fn(hFn)包被的24孔板(Collaborative Biomedice)Products,3μl125I-Fn在UG或Fn(10-12-10-6M)存在和缺失的500μl HBSS中，室溫下孵育2小時。SDS-PAGE和用UG抗體對所有的Fn的蛋白印跡沒有檢測到任何UG污染物。放射標(biāo)記的復(fù)合物用PBS沖洗兩遍，然后在1N NaOH中溶解，接著用1N HCl中和，用γ計數(shù)器測量其放射性。在一獨立實驗中，125I-Fn(3μl)與20μl(1mg/ml)小鼠Fn在40μl pH7.6的PBSS中，室溫下孵育2小時，還原性rhUG(5-500μg)在HBSS中缺失或以濃度遞增的形式存在。試樣與0.20mM DSS在室溫下交聯(lián)反應(yīng)20分鐘，然后在SDS-試樣緩沖液中煮沸5分鐘，在4-20％的SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳，最后放射自顯影。在UG缺失情況下，125I-Fn與未標(biāo)記的Fn形成一個高分子量的放射性復(fù)合物，但在UG存在時，形成的Fn-Fn凝集物是以依賴于UG濃度的形式表現(xiàn)出來的(圖4E)。
為了確定UG結(jié)合Fn對UG及對其自身的結(jié)合親和力是否有差異，進(jìn)行了結(jié)合實驗，125I-Fn與未標(biāo)記的Fn孵育，然后與各種濃度的UG固定在多孔板上。在獨立實驗中，將各種濃度未標(biāo)記的可溶性Fn固定后，與125I-Fn進(jìn)行結(jié)合研究。從兩種類型的結(jié)合實驗得到的斯卡查德分析數(shù)據(jù)顯示UG結(jié)合Fn的解離常數(shù)(kds)13nM和Fn結(jié)合自身的解離常數(shù)176nM都表現(xiàn)出線性關(guān)系。這些結(jié)果表明，由于UG對Fn有相對更高的結(jié)合親和力，UG能有效地反作用于Fn的自身聚合。在UG存在和缺失的條件下，放射性碘化(125I)膠原I與未標(biāo)記的Fn孵育，進(jìn)行親和交聯(lián)實驗，方法如同以上對Fn的實驗。15μl失活的或沒有失活的125I-膠原I(Sp.Act.65.4mCi/mg)，在還原性UG(250μg)存在和缺失的條件下，與Fn孵育，親和交聯(lián)，電泳和放射自顯影。結(jié)果表明，UG反作用于高分子量125I-膠原-Fn凝集物的形成。實施例10:rhUG對腎小球hFn沉積的體內(nèi)抑制為檢驗rhUG是否能保護(hù)腎小球免于Fn沉積，將單獨的可溶性人Fn(hFn)或與等克分子數(shù)的rhUG混合的hFn靜脈注射到UG+/+和明顯健康的UG-/-同窩動物上。
將人Fn(500μg/150μl PBS)施用到UG+/+和明顯健康的UG-/-小鼠的尾靜脈中，這些2月齡的小鼠重約22克。與之相似，對照小鼠也注射500μg hFn的混合物，此混合物是在150μl PBS中加入等克分子數(shù)的rhUG或白蛋白形成的。在最后一次注射后24小時，殺死小鼠，在福爾馬林緩沖液中固定各種器官。通過使用單一特異性的抗hFn抗體(GIBCO BRL；clone1)和偶聯(lián)兔抗鼠IgG(Cappel)的FITC產(chǎn)生的免疫熒光檢測腎和其它器官的組織結(jié)構(gòu)部分。在獨立實驗中，每天給UG+/+小鼠注射只加入1mg hFn的150μl PBS，持續(xù)3天。
注射人Fn的基本理論是能夠區(qū)分內(nèi)源鼠Fn和施用的hFn。靜脈注射的方法和hFn在各種組織中的免疫組織化學(xué)檢測的方法已有描述。
不管是單獨注射hFn還是注射hFn與rhUG(分子比1∶1)的混合物，人Fn在野生型UG+/+小鼠腎小球中的免疫熒光結(jié)果是相似的(圖5A和5B)。但是，用hFn和UG混合物注射的小鼠在腎小球中顯示出微弱的hFn特異的免疫熒光(圖5C)，而那些只接受Fn的小鼠卻表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫熒光(圖5D)。施用hFn和BSA的混合物作對照，沒有產(chǎn)生保護(hù)作用。為確定UG的這種保護(hù)作用是否能通過給UG+/+小鼠注射大劑量Fn所克服，我們每天給每個小鼠注射1mg hFn，持續(xù)3天。雖然對UG+/+小鼠小劑量(500μg/小鼠)靜脈注射不能產(chǎn)生任何可見的腎小球沉淀(圖5A)。然而施用更高的劑量(3mg/小鼠)導(dǎo)致明顯的積累。這樣，UG抑制了腎小球中Fn的沉淀，并由于內(nèi)源UG的存在，UG+/+小鼠有比UG-/-小鼠更高的可溶性Fn的沉淀閾值。實施例11組織培養(yǎng)細(xì)胞中rhUG對原纖維生成和基質(zhì)裝配的抑制為確定UG是否能在典型的體外組織培養(yǎng)試樣中抑制Fn-原纖維生成和基質(zhì)裝配，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)鼠胚成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)基中含有單獨的可溶性Fn或等分子克數(shù)的hFn和rhUG的混合物。Fn基質(zhì)裝配和原纖維生成如所描述的那樣在培養(yǎng)細(xì)胞(CRL6336,ATCC)中決定。與那些接受hFn和rhUG混合物的細(xì)胞相比(圖5F)，在單獨用hFn處理的培養(yǎng)細(xì)胞中觀察到更高程度的原纖維生成(圖5E)。實施例12:UG-Fn復(fù)合物在臨床試樣中的檢測UG-Fn復(fù)合物在臨床體液如血清、BAL流體和痰等樣品中的檢測，對確定此復(fù)合物在人類疾病中的作用是很重要的。已經(jīng)建立了一種檢測UG-Fn復(fù)合物的液相診斷法，此方法的形式列于圖6中。獲得的抗體是單一特異的兔抗人蛋白的多克隆抗體，共價聯(lián)接在一固相支持物上。固體支持物可以是破珠，如磁珠、管子或ELISA板。固相支持物在每次結(jié)合反應(yīng)后提供了完成沖洗步驟所需的柔韌性，以便在使用多種樣品時獲得更一致的結(jié)果。檢測用的抗體對Fn是特異的，從許多商業(yè)途徑獲得的抗體也是有效的。與酶如辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的抗IgG抗體可用于檢測標(biāo)準(zhǔn)酶反應(yīng)中分子鏈末端的抗Fn的抗體，在酶反應(yīng)中，酶的底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)色的或發(fā)熒光的復(fù)合物，即可用分光光度計或熒光計定量測定。這種檢測法的檢測限量為500μgUG-Fn復(fù)合物/ml樣品流體。實施例13子宮珠蛋白缺失hUG短暫而嚴(yán)重的缺失可通過臨床透析中熟知的血液凈化技術(shù)創(chuàng)建，這些技術(shù)包括血液透析，腹膜透析和連續(xù)透析(CRRT)。各種形式的臨床透析都包括使用半透膜，從血液中濾去有毒的體內(nèi)廢物，包括如尿素的化學(xué)代謝物和如β-2-微球蛋白的小分子蛋白。
UG是一結(jié)合極其緊密的蛋白，已知該蛋白在SDS-PAGE中有異常的遷移，與之對應(yīng)的分子量大約為10-13KDa，但其真實分子量為15.7KDa。所以，人們猜測在透析實驗中，UG二聚體是以10-13Kda蛋白存在的。令人驚奇的是，該二聚體如此緊密以致能穿過8.0 Kda的MWCO透析膜。UG也能穿過14.0 Kda的MWCO透析膜。
在這些實施例中使用的透析膜的成分，與為臨床透析制造和使用的多數(shù)膜的成分相比，即使不完全相同，也非常相似。它們都是由再生纖維素或醋酸纖維素組成的。
在此實驗中，取1.0ml兩個部分純化(一個＞90％純化，另一個大約70％純化)的rhUG細(xì)胞裂解物的等分試樣，不加緩沖附加物，用1000ml無緩沖的50mM乙酸銨透析，使用三種尺寸的透析袋3.5Kda,8.0Kda和14.0Kda(Spectra/Por；Thmas Scientific)。在48小時內(nèi)，每種樣品有4次緩沖變化，所有這些均在室溫(約25-27℃)下進(jìn)行。每個透析樣品都是從清澈的黃色變成清澈無色的液體。在透析開始和結(jié)束時，要檢查透析袋是否漏液，主要是對透析袋直接施以壓力(壓擠)，觀察是否有漏液，在這兒沒有發(fā)現(xiàn)漏液。透析袋兩端要雙結(jié)扎，進(jìn)而確保不漏液。
圖7顯示出對這些結(jié)果的SDS-PAGE分析。90％純化的預(yù)透析樣品示于7和8道，下面3個后透析樣品位于1、2和3道。在代表用8.OKda MWCO膜透析過的樣品的泳道上，沒有出現(xiàn)UG二聚體。以后不同批次的部分純化的UG制備樣品也證實了這些結(jié)果。實施例14:hUG結(jié)合蛋白與腫瘤細(xì)胞的親和交聯(lián)以往的研究表明，在許多類型的腫瘤細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)，同源二聚體的、完全氧化的rhUG可結(jié)合到一190Kda的結(jié)合蛋白上(Leyton etal,1994；Kundu et al,1996)。目前的實施例表明，還原型rhUG(后來顯示為單體)不僅與190Kda的結(jié)合蛋白結(jié)合，還與49Kda和約32Kda的蛋白結(jié)合。結(jié)果還表明，這些UG結(jié)合蛋白的出現(xiàn)與外源rhUG介導(dǎo)這些腫瘤細(xì)胞(NIH 3T3，小鼠乳瘤，肉瘤和淋巴瘤)非侵染表型的能力有關(guān)。這些UG結(jié)合蛋白的缺失則與外源rhUG(纖維肉瘤)出現(xiàn)時，侵染表型的存在相關(guān)。下面的表格提供了新的數(shù)據(jù)，以演示以前所述的(Kundu et al,1996)在ECM侵染檢驗中出現(xiàn)的這種表型。肌紅蛋白，作為非相關(guān)蛋白對照，用于顯示對rhUG特異的作用。
簡單的說，用胰蛋白酶和EDTA收集匯合的細(xì)胞(NIH 3T3、小鼠乳瘤、肉瘤、淋巴瘤和纖維肉瘤)，然后離心，得到的細(xì)胞重新懸浮于DMEM/BSA中。侵染室的下部格子中填滿了作為化學(xué)引誘物的成纖維細(xì)胞條件性培養(yǎng)基(FCM)。用Matrigel基底膜基質(zhì)包被過的PET膜鋪在下部格子上。在還原的rhUG存在或確失情況下，將細(xì)胞(1.6×105/孔)接種在侵染室的上部格子中，侵染室已用預(yù)水合的Matrigel所包被，在濕潤的培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)24小時。浸入到Matrigel并接觸到濾器下表面的細(xì)胞用Giemsa染色。濾器的上表面用濕棉花藥簽擦拭，以除去Matrigel和沒有遷移的細(xì)胞。侵染室用水沖洗，遷移細(xì)胞在倒置顯微鏡下計數(shù)，并用Zeiss攝影顯微鏡Axiovert405M拍攝顯微照片。
總之，還原的rhUG能夠在許多類型的腫瘤細(xì)胞中介導(dǎo)一種反應(yīng)，使侵染型轉(zhuǎn)變?yōu)榉乔秩拘?。結(jié)合試驗為闡明子宮珠蛋白介導(dǎo)非侵染型細(xì)胞的作用機(jī)理，對放射標(biāo)記的rhUG特異結(jié)合的這些細(xì)胞進(jìn)行了檢測。用鈉[125I]碘化物(2mCi；無載體的IODO-BEADS)對rhUG(20ug)進(jìn)行放射性碘化，反應(yīng)在PH7.4的150μlPBS中于25℃進(jìn)行10分鐘，并通過SepHadex G-25離心柱層析(1200×g，4分鐘)純化125I-rhUG。純化得到的無載體的125I-rhUG，其特異活性為25μCi/μg。置于12孔板的細(xì)胞匯合(NIH 3T3、小鼠乳瘤、肉瘤、淋巴瘤和纖維肉瘤)用PH7.4的PBS沖洗一遍，然后與各種濃度的還原的125I-UG室溫下孵育2小時，125I-UG是溶于PH7.6的Hank1s平衡鹽溶液的，其中含有0.5％BSA，缺乏或存在過量為標(biāo)記的還原的hUG。UG在10mM DTT存在的條件下于37℃還原反應(yīng)15分鐘。通過快速去除未結(jié)合的125I-UG使反應(yīng)停止，然后用PH7.4的PBS沖洗三遍，在1N NaOH中促溶，接著加入等體積的1N HCl，用計數(shù)效率約為80％的γ計數(shù)器(ICN Biomedicals，型號+10/600)測量放射性。特異性結(jié)合是從總的結(jié)合中減去非特異性結(jié)合得到的。使用LIGAND計算機(jī)程序，運用斯卡查德分析所得的結(jié)合數(shù)據(jù)，結(jié)果列于圖8中。
125I-rhUG(還原的)穩(wěn)態(tài)結(jié)合的斯卡查德分析表明，用NIH 3T3細(xì)胞只出現(xiàn)一種類型且解離常數(shù)為(Kd)20nM的特異結(jié)合。比較125I-rhUG(還原的)與NIH 3T3、小鼠乳瘤、肉瘤、淋巴瘤和纖維肉瘤結(jié)合的解離常數(shù)，其數(shù)值范圍為20-25nM。我們也檢測了非還原的同源二聚體的125I-rhUG與這些細(xì)胞的結(jié)合，乳瘤、肉瘤和淋巴瘤細(xì)胞的Kd值為30-35nM，沒有使用纖維肉瘤細(xì)胞檢測還原的或非還原的125I-rhUG的結(jié)合。親和交聯(lián)試驗為進(jìn)一步描述這些細(xì)胞中的UG結(jié)合位點，在未標(biāo)記的還原的rhUG存在或缺乏的條件下，用125I-rhUG(還原的)與二琥珀酰亞胺基辛二酸(DSS)進(jìn)行了親和交聯(lián)研究。DSS交聯(lián)劑與彼此緊密靠近的蛋白分子共價交聯(lián)。當(dāng)加入未標(biāo)記的蛋白，它與標(biāo)記蛋白競爭結(jié)合位點，表現(xiàn)出只有子宮珠蛋白才具有的結(jié)合特異性。
在六孔板上生長的細(xì)胞匯合(NIH 3T3、小鼠乳瘤、肉瘤、淋巴瘤和纖維肉瘤)，用PH7.4的PBS沖洗，在PH7.6的HBSS中，與還原的125I-rhUG(3.0nM)于室溫下孵育2小時，HBSS中含有0.1％BSA，缺乏或存在未標(biāo)記的還原的UG(1μM)。用PBS沖洗后，細(xì)胞在2mlPH7.6的HBSS中，與0.2mM DSS進(jìn)一步孵育0分鐘。加入50mM pH7.5的Tris-HCl緩沖液以終止反應(yīng)，刮下細(xì)胞，10000×g離心15分鐘收集細(xì)胞，在含有1mM PMSF,20μg/ml亮抑酶肽和20mM EDTA的60μl 1％Triton X-100溶液中分散細(xì)胞，10000×g離心15分鐘，所得到的上清液懸浮于含有5％β巰基乙醇的樣品緩沖液中，沸水浴5分鐘后，在4-20％的十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺梯度凝膠上電泳(Bio-Rad)，接著用考馬斯亮藍(lán)對凝膠做短暫染色，然后在Bio-Rad凝膠干燥器上干燥，最后用Kodak X-Omat Ar X射線膠片放射自顯影。
hUG結(jié)合蛋白在NIH 3T3(泳道1-3)細(xì)胞，乳瘤(泳道4-5)細(xì)胞，肉瘤(泳道6-7)細(xì)胞和淋巴瘤(泳道8-9)細(xì)胞中的親和交聯(lián)結(jié)果列于圖9中(泳道1:(-)DSS；泳道2:(+)DSS；泳道3:(+)未標(biāo)記的hUG,(+)DSS；泳道4:(+)DSS；泳道5:(+)未標(biāo)記的hUG,(+)DSS；泳道6:(+)DSS；泳道7:(+)未標(biāo)記的還原的hUG,(+)DSS；泳道8:(+)DSS和泳道9:(+)未標(biāo)記的還原的hUG,(+)DSS)。當(dāng)把非放射性但還原的hUG加入到反應(yīng)混合液中作競爭物時，記下出現(xiàn)的49Kda的蛋白條帶及190Kda的蛋白帶和兩條帶降低的強(qiáng)度。
簡要的說，rhUG(還原的)在一定的腫瘤細(xì)胞系中介導(dǎo)非侵襲表型的喪失。對這種rhUG介導(dǎo)的行為變化敏感的腫瘤細(xì)胞擁有單一類型rhUG結(jié)合特性，其較低的解離常數(shù)約為20-30nM。rhUG的這種結(jié)合活性與分子量近于190Kda和49Kda的特異蛋白有關(guān)。缺乏rhUG結(jié)合活性的纖維肉瘤細(xì)胞，其侵染性不受rhUG的影響?？傊@些數(shù)據(jù)表明，在具有子宮珠蛋白受體的腫瘤細(xì)胞中，外源rhUG(還原的或非還原的)介導(dǎo)這些腫瘤細(xì)胞侵染型的喪失。實施例15．通過子宮珠蛋白親和層析純化子宮珠蛋白受體為純化子宮珠蛋白受體，通過126I-rhUG結(jié)合實驗分析了此受體在幾種牛組織中的分布。在此過程中，首先在組織和細(xì)胞的膜碎片中發(fā)現(xiàn)了UG結(jié)合活性，表明子宮珠蛋白受體定位于細(xì)胞膜上。
從牛心、脾、氣管、肺、肝臟和主動脈中制備膜。發(fā)現(xiàn)牛脾中富含UG，并將其作為進(jìn)一步純化用。將牛脾于10mM pH8.0的NaHCO3緩沖液中攪勻，勻漿液于4℃ 600×g離心10分鐘。上清液24000×g再離心60分鐘。所得沉淀于4℃攪拌6小時，溶于50mM PH7.4的Tris-HCl緩沖液中，該緩沖液中含有1％Triton X-100,10μg/ml亮抑酶肽，2mM EDTA和0.4mM PMSF。然后，24000×g離90分鐘收集上清液，并加入到GNBr活化的瓊脂糖4B偶聯(lián)的UG親和柱中。該親和柱的制備按照制造商(Pharmacia)的指示進(jìn)行。用0.1M pH3.0的甘氨酸-HCl緩沖液洗脫UG受體蛋白，并立即用2M PH8.0的Tris-HCl中和，甘氨酸-HCl緩沖液中含有1％Triton X-100,10μg/ml亮抑酶肽，2mM EDTA和0.4mM PMSF。含有UG結(jié)合蛋白的部分通過125I-UG結(jié)合及親和交聯(lián)檢測進(jìn)行鑒定。通過SDS-PAGE及隨之的銀染色(Bio-Rad)檢測純化受體的純一性。
結(jié)果列于圖10中。分別記下兩條清晰可見的分子量為180Kda和40Kda的蛋白條帶。此外，也可觀察到第三條微弱的分子量為320Kda的蛋白帶。這樣，體外介導(dǎo)抑制腫瘤細(xì)胞侵染性的子宮珠蛋白受體就已通過子宮珠蛋白親和層析得到純化。實施例16．細(xì)胞因子對子宮珠蛋白受體表達(dá)的調(diào)控為了更好的理解子宮珠蛋白受體在炎癥和免疫調(diào)節(jié)中的潛在作用，我們觀測了子宮珠蛋白受體在NIH 3T3細(xì)胞中對炎癥的幾種介質(zhì)作出反應(yīng)時的表達(dá)情況。前人的研究表明，子宮珠蛋白介導(dǎo)人巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞對一定細(xì)胞因子的反應(yīng)(Ddirynck et al.,1995；1996)，這意味著子宮珠蛋白是作為免疫抑制子起作用的。hUG的作用是抑制IL-2調(diào)控的轉(zhuǎn)錄活性和IFN-τ及IFN-α的從頭合成。胞內(nèi)調(diào)節(jié)過程的如此交替源于胞外hUG及其受體必須參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。因此，在免疫和炎癥反應(yīng)中，通過操縱UG受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，有可能在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中產(chǎn)生有益的變化。
如所述的那樣培養(yǎng)NIH 3T3細(xì)胞，并加入帶有和沒有rhUG的免疫調(diào)節(jié)因子。UG受體的量是通過125I-UG結(jié)合，親和交聯(lián)和SDS-PAGE分析確定的。結(jié)果列于圖11。與對照相比，代表UG結(jié)合蛋白的放射性條帶，其強(qiáng)度有相當(dāng)?shù)脑鰪?qiáng)，所用細(xì)胞分別經(jīng)LPS和IL-6處理。但是，當(dāng)這些細(xì)胞PMA、PDGF、TNFα和IFNr處理時，這種差異就不明顯了。這些結(jié)果初步證實了，UG受體是對細(xì)胞因子(IL-6)和炎癥前調(diào)節(jié)因子(LPS)的出現(xiàn)起反應(yīng)的。實施例17．UG可抑制的腫瘤細(xì)胞系自分泌和旁分泌環(huán)路的證明為確定UG在癌細(xì)胞胞外基質(zhì)(ECM)侵染中的可能作用，研究了人的四個細(xì)胞系，其中之一來自于子宮腺癌和前列腺癌。之所以選擇這些細(xì)胞是因為這些器官中正常的上皮細(xì)胞以相對較高的水平組成性表達(dá)UG基因。初步期望，分別通過RT-PCR、免疫沉淀及Western印跡確定癌細(xì)胞是否表達(dá)UG mRNA和UG蛋白。人UG真核表達(dá)載體的構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和G418抗性克隆的選擇用EcoRⅠ水解克隆在Pgem 4Z中的hUG cDNA(G.Mantile,L.Miele,E.Cordella-Miele,A.B.Mukherjee,J.Biol.Chem.268,20343(1993))。將一個全長的hUG-cDNA片斷切斷并亞克隆在TA載體(離體基因)的EcoRⅠ位點。hUG-cDNA片斷的定位通過DNA測序核實。該片段通過HindⅢ和Xgal水解從TA載體上切下，然后連接到pRC/RSV表達(dá)載體上(離體基因)，該載體已預(yù)先用HindⅢ和Xgal水解并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到純化。
在37℃和5％CO2條件下，將人的肺腺癌細(xì)胞系(HTB-174)培養(yǎng)在RPMI培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有5％熱滅活的胎牛血清，而其余來自于子宮腺癌(HEC-1A)和前列腺癌(HTB-81)的人腫瘤細(xì)胞系，在37℃和5％CO2條件下，保存于補(bǔ)充有1％FBS的McCoy’s 5A培養(yǎng)基中。這些腫瘤細(xì)胞系用pRC/RSV-hUG構(gòu)成物或pRC/RSV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，以電穿孔處理的作為對照。24小時后，將G418加入培養(yǎng)基，其終濃度為400μg/ml。將單個G418抗性克隆分離并保存于含有200 ug/ml G418的培養(yǎng)基中，作進(jìn)一步實驗。RT-PCR檢測UG-mRNA用RNAzol的方法從不同的細(xì)胞系中分離總RNAs(TEL-TEST,Inc)。本研究中使用的引物同Peri et al.1993描述的那樣。簡要的說，通過hUG-cDNA的特異引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，hUGr(5’T A C A C A GT G A G C T T T G G G C-3’)。RT-PCR產(chǎn)物用于進(jìn)一步擴(kuò)增，引物為hUGI(5’A T G A A A C T C G C T G T C A C C C-3’)和hUGr。然后將PCR產(chǎn)物印跡并進(jìn)行雜交檢測，所使用的hUG特異的寡核甘酸探針為hUGp(5’-T G A A G A A G C T G G T G G A C A C C-3’)。用于GAPDH mRNA檢測的引物和探針如下hGAPDH-r:(5’-C A A A G T T G T C A T G G A T G A C C-3’)，hGAPDH-I:(5’C C A T G G A G A A G G C T G G G G-3’)和hGAPDH-p:(5’-T C C T G C A C C A C C A A C T G C T T-3’)。免疫沉淀和Western印跡分析UG cDNA轉(zhuǎn)染的人子宮腺癌(HEC-1A)和前列腺癌(HTB-81)的細(xì)胞裂解物，按照G.Mantile et al.[J.Biol.Chem.268,20343(1993)]描述的方法進(jìn)行免疫沉淀。簡要的說，在細(xì)胞裂解緩沖液中清洗這些細(xì)胞，裂解后離心，所得上清液與hUG的兔抗體孵育1小時，然后與A-瓊脂糖于4℃孵育過夜。結(jié)合生成的絡(luò)合物通過離心，在沸浴的SDS樣品緩沖液中沖洗和洗滌后收集。樣品經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電印跡至硝酸纖維素膜上。為進(jìn)行Western Blot分析，將含有UG的膜置于封閉液中封閉，沖洗后與羊抗UG的抗體(1∶250稀釋)孵育，然后沖洗膜，與HRP結(jié)合的兔抗羊IgG(1∶2000稀釋)進(jìn)一步孵育，按照制造商(Amersham)的說明，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光的方法(ECL)進(jìn)行檢測。
總RNA的RT-PCR分析是從pRC/RSV轉(zhuǎn)染的和野生型的子宮腺癌(HEC-1A)和前列腺癌(HTB-81)細(xì)胞中推斷的。將PCR產(chǎn)物印跡后，用hUG特異的寡核甘酸探針雜交進(jìn)行檢測。人GAPDH基因的擴(kuò)增產(chǎn)物用作RNA特性的內(nèi)部對照，同時用于消除移液誤差。
結(jié)果表明，這些細(xì)胞既不能表達(dá)可檢測到的UG-mRNA水平也不能表達(dá)可檢測到的UG蛋白水平(圖12a&12b)。然后用人UG(hUG)-cDNA構(gòu)成物，pRC-RSV-hUG轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。非轉(zhuǎn)染的和模擬轉(zhuǎn)染的(只有載體)細(xì)胞作為對照。結(jié)果顯示，在對照細(xì)胞中不能檢測到UG-mRNA和UG蛋白，而在UG-cDNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中不僅高量表達(dá)UG-mRNA，而且高量表達(dá)UG蛋白，從而證實了目前所用的體系。實施例18．腫瘤細(xì)胞表型為確定這些腺癌細(xì)胞系中UG的增強(qiáng)表達(dá)，是否影響無貼壁依賴性生長和侵染ECM的能力這兩種癌細(xì)胞最重要的特性，分別對它們在軟瓊脂上的生長和Matrigel(ECM)侵染進(jìn)行檢驗。如圖13所示，UG的增強(qiáng)表達(dá)導(dǎo)致在軟瓊脂上的無貼壁依賴性生長(圖13.a)和ECM侵染(圖13.b)的明顯抑制，這是由用pRC-RSV-hUG轉(zhuǎn)染的HEC-1A細(xì)胞引起的，而不是由對照或模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞引起的。在HEC-1A細(xì)胞中，由pRC/RSV/hUG轉(zhuǎn)染引起的ECM侵染的抑制，與非轉(zhuǎn)染對照相比，其抑制百分比約為79％。來自于肺腺癌、乳腺癌和前列腺癌的其它細(xì)胞系，對軟瓊脂上的無貼壁依賴性生長或ECM侵染沒有顯示出任何抑制現(xiàn)象(數(shù)據(jù)未列出)。
為檢驗用純化的hUG處理過的腺癌細(xì)胞系能否抑制軟瓊脂上的無貼壁依賴性生長和ECM侵染，同樣的檢測方法運用于以上提到的全部四個細(xì)胞系，不管是非轉(zhuǎn)染的還是模擬轉(zhuǎn)染的。結(jié)果顯示，用純化的重組的hUG預(yù)處理過的這些細(xì)胞明顯抑制非轉(zhuǎn)染的HEC-1A細(xì)胞在軟瓊脂上的無貼壁依賴性生長和ECM侵染。此ECM侵染的抑制百分比與檢測pRC-RSV-hUG轉(zhuǎn)染的HEC-1A細(xì)胞時的數(shù)據(jù)非常相似(圖14)。以上結(jié)果引導(dǎo)我們進(jìn)一步研究hUG介導(dǎo)的無貼壁依賴性生長的抑制機(jī)理和pRC-RSV-hUG轉(zhuǎn)染的HEC-1A細(xì)胞的侵染機(jī)理。
將軟瓊脂檢定法運用于非轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞系和pRC/RSV-UG構(gòu)建體或pRC/RSV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的子宮(HEC-1A)、前列腺(HTB-81)和肺(HTB-174)腫瘤細(xì)胞系中。細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后接種在60mm的接種盤中，作為接種層的底層是含有相同培養(yǎng)基的5ml 0.5％的瓊脂，上層是含有相同培養(yǎng)基的2m1 0.3％的精制瓊脂。含有200ug/ml G418的頂層瓊脂/培養(yǎng)基用于培養(yǎng)pRC/RSV-UG構(gòu)建體或pRC/RSV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。培養(yǎng)盤于37℃和5％CO2條件下孵育12-14天。用中性紅染色菌落并人工計數(shù)。
體外Matrigel侵染檢驗按照Kundu等1996所述的那樣進(jìn)行。簡單的說，當(dāng)細(xì)胞生長至匯合80％時，經(jīng)胰蛋白酶消化后，用含有0.1％BSA的PBS沖洗兩遍。將細(xì)胞重新懸浮于含有0.1％BSA的DMEM中，并放入Matrigel侵染室的上層空間。侵染室的下層填滿了成成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基(FCM)，該培養(yǎng)基是一種細(xì)胞侵染用的化學(xué)引誘物，是在NIH 3T3成纖維細(xì)胞孵育24小時后，從其增殖培養(yǎng)物的上清液中制備而得的。于37℃孵育36小時后，用Giemsa對這些細(xì)胞進(jìn)行染色，并立即用無水乙醇沖洗兩遍，每次5分鐘。用溫棉簽將非侵染細(xì)胞和Matrigel從濾器上表面刮去，并用水將侵染室沖洗三遍保留在濾器上的侵染細(xì)胞置于倒置顯微鏡下計數(shù)，通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的受侵染細(xì)胞數(shù)與對照細(xì)胞中的受侵染細(xì)胞數(shù)相比，計算細(xì)胞侵染的百分比。
在軟瓊脂上生長的對照細(xì)胞(pRC/RSV單獨轉(zhuǎn)染的子宮腺癌細(xì)胞)的形態(tài)顯示于圖14(a)HEC-1A，而在軟瓊脂上用hUG表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的形態(tài)顯示于圖14(b)HEC-1A/UG。在rhUG存在時出現(xiàn)的較小菌落表明子宮珠蛋白不僅抑制人腫瘤細(xì)胞的侵染性，而且還抑制腫瘤細(xì)胞的生長。實施例19．UG受體結(jié)合的證實實施125I-hUG結(jié)合及親和交聯(lián)驗定法，確定hUG是否通過它的受體介導(dǎo)途徑發(fā)揮這種作用。125I-hUG結(jié)合分析UG的放射性碘化物和結(jié)合實驗按照Kundu等1996所述的那樣進(jìn)行。簡要的說，用125I鈉碘化物(2mCi；無載體)和IODOBEADS對UG(20ug)進(jìn)行放射性碘化。125I-UG通過葡聚糖凝膠G-25離心柱層析(1200×g,4分鐘)進(jìn)行純化。純化得到的125I-UG的特異活性是20UCi/μg。用pH7.4的PBS沖洗12孔盤中非轉(zhuǎn)染的和人pRSV/hUG轉(zhuǎn)染的匯合的HEC-1A細(xì)胞，在1ml pH7.6的Hanks平衡鹽溶液(HBSS)中與還原的125I-UG(1.5nM)于室溫下孵育2小時，HBSS中含有0.1％的BSA，未標(biāo)記的還原的重組hUG缺乏或以濃度遞增(1pM-1μM)的形式存在。用pH7.6的PBS沖洗這些細(xì)胞，并溶于1N NaOH中，隨之加入等體積的1N HCl。其放射性用γ-計數(shù)器測量。特異性結(jié)合是通過從總的結(jié)合中減去非特異性結(jié)合得到的。運用LIGAND計算機(jī)程序進(jìn)行數(shù)據(jù)的斯卡查德分析。所得的這些結(jié)果與圖8中顯示的那些一致，表明這就是前面描述過的同一個UG受體。親和交聯(lián)實驗非轉(zhuǎn)染的和pRC/RSV/hUG轉(zhuǎn)染的腺癌細(xì)胞在6孔盤中生長至匯合。用pH7.6的PBS沖洗，在2ml pH7.6的HBSS中與還原的重組人125I-UG(3nM)于室溫下孵育2小時，HBSS中含有0.1％的BSA，存在或缺乏未標(biāo)記的還原的hUG(250nM)。孵育后，沖洗細(xì)胞并在2mlpH7.6的HBSS中與0.2mM DSS進(jìn)一步孵育20分鐘。刮下細(xì)胞，離心(10000×g)15分鐘收集細(xì)胞，然后溶于按40∶1配制的細(xì)胞溶解緩沖液(1％Triton X-100中含有1mM PMSF，亮抑酶肽(20μg/ml)和2mM EDTA)。上清液重新懸浮于含有5％β-巰基乙醇的樣品緩沖液。通過SDS-PAGE和放射自顯影分離樣品。
本實驗的結(jié)果表明125I-hUG只與HEC-1A細(xì)胞高度親和且特異性結(jié)合(圖15a&15b)，而其它腺癌細(xì)胞系沒有這種結(jié)合(數(shù)據(jù)未列出)。UG受體被鑒定在HEC-1A(應(yīng)答器)細(xì)胞上，而不是HTB-81(非應(yīng)答器)細(xì)胞上。125I-hUG與其結(jié)合蛋白的親和交聯(lián)分別在非轉(zhuǎn)染的和pRSV/hUG轉(zhuǎn)染的HEC-1A細(xì)胞及HTB-81細(xì)胞中進(jìn)行。在未標(biāo)記的還原的hUG缺失和存在條件下，這些細(xì)胞與還原的125I-hUG孵育結(jié)合，然后與DSS交聯(lián)(泳道1:(-)DSS；泳道2:(+)DSS和泳道3:(+)hUG+DSS)。用125I-hUG進(jìn)行的親和交聯(lián)結(jié)果表明，在HEC-1A細(xì)胞(圖15b)中出現(xiàn)了190Kda和49 Kda的UG結(jié)合蛋白，但在受試的其它三個腺癌細(xì)胞系中卻沒有出現(xiàn)蛋白。如此，增強(qiáng)的UG表達(dá)或純化的hUG對這些細(xì)胞的處理抑制了只表達(dá)hUG結(jié)合蛋白的那些細(xì)胞的FCM侵染。實施例20:UG缺陷小鼠的腫瘤發(fā)生迄今為止，總數(shù)為16的UG-/-小鼠(患有后天發(fā)生疾病)，自出生存活一年以上后，不僅表現(xiàn)出了腎損傷，而且還患有腫瘤。也就是說，全部16只(100％)衰老的UG缺陷小鼠，至今，全都患上了腫瘤。這些腫瘤源于各種組織，代表了目前仍在鑒定中的各種類型的腫瘤。然而，這些結(jié)果不僅表現(xiàn)了UG缺陷在癌癥發(fā)生中的意義，而且暗示了rhUG在治療和/或預(yù)防癌癥中的潛在作用。實施例21:UG作為HCG相關(guān)因子(HAF)的鑒定最近的一篇報道描述了一種HCG(人絨毛膜促性腺激素)相關(guān)因子，稱之為HAF，是在妊娠早期婦女的尿中發(fā)現(xiàn)的，(1)能阻遏腫瘤發(fā)生和卡波濟(jì)氏肉瘤的轉(zhuǎn)移；(2)能阻遏HIV感染和(3)刺激血細(xì)胞生成(Lunardi-Iskandar et al,1995；1998)。HAF可從人尿中與HCG同步純化并可與HCG形成復(fù)合物。人UG在妊娠早期婦女的尿中含量升高。UG和HAF都是低分子量蛋白(15-30KDa)并都能夠抑制腫瘤細(xì)胞的侵染。初步的體外實驗顯示，125I-rhUG和HCG(由AyerstLabs,Inc.提供)事實上的確形成了一緊密結(jié)合的復(fù)合物，由此推測子宮珠蛋白和HAF是同一種蛋白。
在描述本發(fā)明時，聯(lián)系到什么是目前認(rèn)為最實用和最優(yōu)選的實施方案，需要理解的是，本發(fā)明不局限于已公布的該實施方案，而是相反，意在涵蓋各種修改方案及包含于所附的權(quán)利要求精神和范圍內(nèi)的等同方案。
參考文獻(xiàn)1．Levin,S.W.et al.，生命科學(xué)(Life Sci.)38:1813-1819(1986)；2．Singh G.et al.，生物化學(xué)和生物物理雜志(Biochem.Biophys.Acta.)1039:348-355(1990)；3．Mantile,G.et al.，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)268:20343-20351(1993)；4．Singh G.et al.，組織化學(xué)雜志(J.Histochem.)36:73-80(1987)；5．Bernard,A.et al.，臨床化學(xué)(Clin.Chem.)38:434-435(1992)；6．Dhanireddy,R.et al.，兒科學(xué)研究(Pediatric Res.)23:463A(1988)；7．Dhanireddy,R.et al.，兒科學(xué)研究(Pediatric Res.)33:323A(1993)；8．Piomelli,D.，細(xì)胞生物學(xué)評論(Op.In Cell Biol.)5:274-280(1993)；9．Krishnan,R.S.et al.，科學(xué)(Science)158:490-492(1967)；10．Beier,H.Verhandl Deut.Zool.Ges.Heidelberg(1968)；11．Umland,T.C.et al.，自然-結(jié)構(gòu)生物學(xué)(Nature.Struct.Biol.)1:538-545(1994)；12．Hard,T.et al.，自然-結(jié)構(gòu)生物學(xué)(Nature.Struct.Biol.)2:938-989(1995)；13．Umland,T.C.et al.，自然-結(jié)構(gòu)生物學(xué)(Nature.Struct.Biol.)2:919-922(1995)；14．Stripp,B.R.et al.，美國生理學(xué)雜志(Am.T.Physio.)27115)(肺分子和細(xì)胞生物學(xué))L656-L664(1996)；15．Lesur,O.et al.,Am.T.Respir.Crit.Care Med.152:290-297(1995)16．Glaser,K.B.，藥理學(xué)進(jìn)展(Adv.Pharmacol.)32:31-66(1995)；17．Tykka,H.T.et al.，斯勘得那維亞胃腸病學(xué)雜志(Scand.J.Gastroenterol.20:5-12(1985)；18．Sheuer,W.,Klin.Wochenschr.67:153-159(1989)；19．Barnes,H.J.et al.，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.),Feb.23,1996；20．Aoki,A.et al.，分子人類生殖學(xué)(Mol.Hum.Reprod.)2:419-497(1996)；21．Anderson and Kurkland，微生物學(xué)評論(MicrobiolgicalReviews)54:198-210(1990)；22．Miele,L.et al.，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)265:6427-6435(1990)；23．Coal son,J.J.et al.，實驗分子病理學(xué)(Exp.Mol.Pathol.)37:355-360(1982)；24．Nagy,A.et al.，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)90:8424(1993)；25．Capecchi,M.R.，科學(xué)(Science),244:1288(1989)；26．Harlow,E.和Lane D.抗體；實驗手冊，第1版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1988；27．Mantile,G.et al.，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)267:20343(1993)；28．Ruoslahti,E.生物化學(xué)年鑒(Ann Rev.Biochem.)57:375(1988)；29．R.O.Hynes,Fibronectins,New York:Springer-Verlag(1990)；30．Chernousor,M.A.et al.，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)266:10857(1991)；31．Zhang,Q.et al.，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol.)127:1447(1994)；32．Wu,C.et al.，細(xì)胞(Cell)83:715(1995)；33．Zhang,Q.et al.，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)271:33284(1996)；34．Border,W.A.et al.，臨床研究雜志(J.Clin.Invest).90:1(1992)；35．Peri,A.,et al.，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)92:2099(1993)；36．Peri,A.,et al.，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)96:343(1995)；37．Oh,E.et al.，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)(USA)78:3218(1981)；38．Mosher,D.F.et al.，現(xiàn)代生物學(xué)(Curr,Biol.)4:810(1992)；39．R.S.Krishnan,J.C.Daniel Jr.，科學(xué)(Science)158,490(1967).
40．H.M.Beier，生物化學(xué)和生物物理雜志(BiochimBiophys.Acta)950,329(1988).
41．A.Peri,E.Cordell-Miele,L.Miele,A.B.Mukherjee，臨床研究雜志(J.Clin Invest)92,2099(1993).
42．G.Singh et al.生物化學(xué)和生物物理雜志(BiochimBiophys.Acta)950,329(1988).
43．J.Jackson,R.Turner,J.N.Keen,R.A.Brooksbank andE.H.Cooper，色譜學(xué)雜志(J.Chromatogr).452,359(1989).
44．M.J.Beato，甾類生物化學(xué)(Steroid Biochem.)7,327(1976)；M.Gillener et al.甾類生物化學(xué)雜志(J.SteroidBiochem.)31,27(1988).
45．K.Diaz Gonzalez和A.Nieto，歐洲生物科學(xué)聯(lián)合會通訊(FEBS Lett.)361,255(1995).
46．M.A.Watson and T.P.Fleming，癌癥研究(Cancer Res.)56,860(1996).
47．M.A.Watson,C.Darrow,D.B.Zimonjic,N.C.Popescu,T.P.Fleming，癌基因(oncogene)16(2),817(1998).
48．L.Miele,E.Coedella-Miele,A.B.Mukherjee內(nèi)分泌綜述(Endocrine Reviews),8,474(1987).
49．L.Miele,E.Coedella-Miele,G.Mantile,A.Peri,A.B.Mukherjee內(nèi)分泌學(xué)研究雜志(J.Endocrinol.Invest).,17,679(1994).
50．L.Miele,E.Coedella-Miele,A.Facchiano,A.B.Mukherjee，自然(Nature)335,726(1988).
51．L.Miele,E.Coedella-Miele，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)265:6427(1990)；52．G.Camussi,C.Tetta,F.Bussolino,C.Baglioni，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)171,913(1990).
53．S.Lloret,J.J.Moreno，生物化學(xué)和藥理學(xué)(Biochem.Pharm.)50(3),347(1995).
54．G.Mantile,L.Miele,E.Coedella-Miele,G.Singh,S.L.Katyal,A.B.Mukherjee，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)268:20343(1993)；55．G.Vasanthakumar,R.Manjunath,A.B.Mukherjee,H.Warabi,E.Schiffman，生物化學(xué)和藥理學(xué)(Biochem,Pharmacol).37(3),389(1988).
56．R.Manjunath,R.et al.Biochem.Pharmacol.36(5),741(1987).
57．J.G.Vostal,A.B.Mukherjee,L.Miele,N.R.Shulman，生物化學(xué)和生物物理研究通信(Biochem.Biophys.Res.Commun).165(1),27(1989).
58．A.Melchiori et al.Anticancer Res.10(1),37(1990).
59．G.C.Kundu,G.Mantile,E.Coedella-Miele,A.B.Mukherjee，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA).93:2915(1996).
60．K.Diaz Gonzalez,A.Nieto，歐洲生物科學(xué)聯(lián)合會通訊(FEBSLett).361,255(1995).
61．Z.Zhang.et al.,DNA和細(xì)胞生物學(xué)(DNACell.Biol).16(1),73(1997).
62．B.C.Misra,E.S.Srivatan，美國人類遺傳學(xué)雜志(AmJ.Hum.Genet).455,65(1989).
63．G.A.Lammie et al.，癌基因(Oncogene)6,439(1991).
64．G.A.Lammie,G.Peters，癌細(xì)胞Vol.3(11),413(1991)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約。
65．S.Brookes,et al.，基因，染色體和癌癥(GenesChromosomes&Cancer)4,290(1992).
66．R.A.Jesudasan,et al.，抗癌研究(AnticancerRes).14,LI727(1994)；67．G.M.Hampton,et al.，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA).91:6953(1994).
68．R.A.J esudasan,et al.，美國人類遺傳學(xué)雜志(AmJ.Hum.Genet).56,705(1995).
69．P.J.Saxon,E.S.Srivatan,E.J.Stanbridge，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBO J).5,3461(1986).
70．M.Koi,et al.，分子癌癥發(fā)生(Mol.Carcinogenesis)2,12(1989).
71．I.Linnoila et al.，美國臨床病理學(xué)雜志(Am J.ClinPath).97,235(1992).
72．J.L.Broers et al.，實驗室和研究(Lab.Invest).66,337(1992).
73．A.Sandmoller et al.，細(xì)胞生長和分化(Cell GrowthDiffer).6,97(1995).
74．F.J.DeMayo et al.，美國生理學(xué)雜志(Am J.Physiol.)261,L70(1991).
75．A.Weerartna et al.，臨床癌癥研究(Clin.CancerRes).3,2295(1997).
76．A.B.Mukherjee,L.Murty,J.Y.Chou，分子細(xì)胞內(nèi)分泌學(xué)(Mol.Cell.Endocrinol).94,R15(1993).
權(quán)利要求
1．一種預(yù)防或治療原發(fā)癌細(xì)胞生長的方法，該方法包括給需要此預(yù)防或治療的患者施用腫瘤抑制有效量的重組的人子宮珠蛋白(rhUG)或其片段或其衍生物。
2．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括通過施用腫瘤抑制有效量的rhUG以靶向子宮珠蛋白的受體。
3．一種藥物組合物，包括腫瘤抑制有效量的rhUG和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
4．權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所說的rhUG的純度為大約75％～大約100％。
5．權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所說的rhUG的純度為大約90％～大約100％。
6．權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所說的rhUG的純度為至少95％。
7．權(quán)利要求3的藥物組合物，其中rhUG是還原的和單體的rhUG。
8．一種通過抑制纖連蛋白聚集和/或沉淀而預(yù)防或治療腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，包括給需要如此預(yù)防或治療的患者施用抑制纖連蛋白有效量的rhUG或其片段或其衍生物。
9．權(quán)利要求8的方法，進(jìn)一步包括通過施用上述纖連蛋白抑制有效量的rhUG以靶向子宮珠蛋白受體。
10．一種刺激血細(xì)胞生成的方法，包括給需要如此刺激的患者施用刺激血細(xì)胞生成有效量的rhUG或其片段或其衍生物。
11．權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包括通過施用刺激血細(xì)胞生成有效量的rhUG以靶向子宮珠蛋白受體。
12．一種藥物組合物，包括刺激血細(xì)胞生成有效量的rhUG或其片段或其衍生物和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
13．權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所說rhUG的純度為大約75％到大約100％。
14．權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所說rhUG的純度為大約90％到大約100％。
15．權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所說rhUG的純度為至少95％。
16．一種從包含一或多種化合物，肽和/或蛋白質(zhì)的樣品中篩選子宮珠蛋白結(jié)構(gòu)類似物和/或UG-受體配體的方法，該方法包括(a)用純化的子宮珠蛋白受體接觸所述的樣品；和(b)檢測在所述的受體和樣品之間的結(jié)合相互作用，存在結(jié)合相互作用則表明，在所述的樣品中存在子宮珠蛋白結(jié)構(gòu)類似物和/或UG受體的配體。
17．一種篩選子宮珠蛋白結(jié)構(gòu)類似物和/或UG受體的配基的試劑盒，包括純化的子宮珠蛋白受體。
18．一種從樣品中純化子宮珠蛋白受體的方法，包括(a)用結(jié)合到固相支持物上的rhUG接觸所述的樣品；和(b)從固相支持物上洗脫純化的子宮珠蛋白受體。
19．一種制備還原rhUG的方法，該方法包括用一種還原劑在一定時間和溫度下接觸氧化型rhUG，以充分還原rhUG。
20．權(quán)利要求19的方法，其中還原的rhUG是單體的。
21．一種產(chǎn)生抗子宮珠蛋白受體的抗體的方法，包括用純化的子宮珠蛋白受體免疫動物，然后分離該受體的抗體。
全文摘要
本發(fā)明描述和要求了用于治療原發(fā)癌細(xì)胞生長和腫瘤轉(zhuǎn)移的組合物和方法,以及刺激造血生成的組合物和方法。本發(fā)明還涉及通過用重組人子宮珠蛋白(rhUG)靶向子宮珠蛋白受體來治療癌癥和子宮珠蛋白受體相關(guān)疾病的方法。本發(fā)明還公開和要求了純化子宮珠蛋白學(xué)體的方法和應(yīng)用所說受體鑒定子宮珠蛋白結(jié)構(gòu)類似物和UG受體配基的方法。
文檔編號A61P27/00GK1323216SQ99811164
公開日2001年11月21日 申請日期1999年7月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月21日
發(fā)明者A·皮隆, A·B·慕克吉, Z·張 申請人:克拉拉根有限公司, 國家健康學(xué)會