專利名稱：血小板衍生生長(zhǎng)因子c、其編碼dna及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)締組織細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠原細(xì)胞的生長(zhǎng)因子和/或內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，尤其涉及新的血小板衍生生長(zhǎng)因子/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子，編碼這種因子的多核苷酸序列，以及利用或衍生自這種因子的藥物和診斷組合物和方法。
背景技術(shù)：
在發(fā)育的胚胎中，初生血管網(wǎng)的形成是通過(guò)中胚層細(xì)胞原位分化實(shí)現(xiàn)的，這個(gè)過(guò)程稱為血管發(fā)生。隨后的所有涉及胚胎中新生血管的產(chǎn)生或者成體中新血管的生成的過(guò)程，都由已形成的脈管系統(tǒng)中的毛細(xì)血管的出芽或者分裂過(guò)程決定，這個(gè)過(guò)程稱為血管生成(Pepper et al.，Enzyme & Protein，1996 49 138-162；Breier et al.，Dev.Dyn.1995 204 228-239；Risau，Nature，1997 386 671-674)。血管生成過(guò)程不僅與胚胎發(fā)育和正常組織的生長(zhǎng)、修復(fù)和再生相關(guān)，而且涉及雌性生物的生殖周期、妊娠的形成和保持和外傷與骨折的恢復(fù)過(guò)程。血管生成不僅在正常個(gè)體中發(fā)生，還與大量的病理過(guò)程相關(guān)，尤其與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)，還與其它一些與血管增殖，尤其是微血管系統(tǒng)增殖的病理過(guò)程相關(guān)，例如糖尿病引發(fā)的視網(wǎng)膜病、牛皮癬和關(guān)節(jié)炎。那么，抑制血管生成就有助于預(yù)防疾病的發(fā)生或者減輕疾病的癥狀。
另一方面，在一些需要進(jìn)行血管化或者需要促進(jìn)血管化的場(chǎng)合，例如在組織或者器官移植后，或者常見(jiàn)于冠心病、閉塞性血管炎中需要在創(chuàng)傷組織或者狹窄的動(dòng)脈旁建立分支時(shí)，促進(jìn)血管的生成過(guò)程又是希望進(jìn)行的。
血管生成過(guò)程高度復(fù)雜，包括維持內(nèi)皮細(xì)胞處于細(xì)胞周期，降解細(xì)胞外的基質(zhì)，遷入并插入周圍的組織，最后形成管道。血管生成過(guò)程復(fù)雜的分子機(jī)制還遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出人們現(xiàn)在對(duì)它的認(rèn)識(shí)。
由于血管生成在許多生理和病理過(guò)程中的重要作用，人們已經(jīng)對(duì)與控制血管生成相關(guān)的因子進(jìn)行了細(xì)致的研究。許多生長(zhǎng)因子被證明可以調(diào)控血管生成過(guò)程。這些生長(zhǎng)因子包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFs)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子α(TGFα)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。見(jiàn)Folkman et al.，J.Biol.Chem.，1992267 10931-10934(review)。
有人認(rèn)為，內(nèi)皮細(xì)胞特異性的生長(zhǎng)因子家族中的特殊的一類，即血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGFs)，VEGFs以及它們所對(duì)應(yīng)的受體與刺激內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，從而分化成為具有特定功能細(xì)胞的過(guò)程直接相關(guān)。這些因子都屬于PDGF家族，并且主要都是通過(guò)內(nèi)皮受體酪氨酸激酶(RTKs)實(shí)現(xiàn)功能。
PDGF家族中的九種不同的蛋白質(zhì)已經(jīng)被確定，分別命名為PDGF-A、PDGF-B、VEGF，剩余的六個(gè)蛋白質(zhì)和VEGF十分相近，分別是VEGF-B，可見(jiàn)國(guó)際專利PCT/US96/02957(WO 96/26736)和美國(guó)專利5,840,693和5,607,918(Ludwig癌癥研究院和Helsinki大學(xué))；VEGF-C，可見(jiàn)Joukov et al.，EMBO J.，1996 15 290-298和Lee etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996 93 1988-1992；VEGF-D，可見(jiàn)國(guó)際專利PCT/US97/14696(WO 98/07832)和Achen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998 95 548-553；胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(P1GF)，可見(jiàn)Maglione et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991 88 9267-9271；VEGF2，可見(jiàn)可見(jiàn)國(guó)際專利PCT/US94/05291(WO 95/24473)(HumanGenome Sciences，Inc.)和VEGF3，可見(jiàn)可見(jiàn)國(guó)際專利PCT/US95/07283(WO 96/39421)(Human Genome Sciences，Inc.)。VEGF家族中的成員與VEGF相比較，氨基酸序列都有30％-45％是相同的。VEGF家族的成員都含有一個(gè)VEGF的同源結(jié)構(gòu)域，由六個(gè)半胱氨酸殘基構(gòu)成的半胱氨酸結(jié)。VEGF家族的功能包括改變內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的程度、引起血管滲透性、血管生成和淋巴管性質(zhì)的變化。
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是同源二聚糖蛋白，可以從多種來(lái)源中分離。VEGF可以高度特異的使內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生有絲分裂活動(dòng)。在胚胎血管發(fā)生過(guò)程中形成新的血管或者在成體的血管生成過(guò)程中，VEGF都起著非常重要的調(diào)控作用(Carmeliet et al.，Nature，1996380 435-439；Ferrara et al.，Nature 1996 380 439-442；Freeara，Davis-Smyth，Endocrine Rev.，1997 18 4-25)。如果使一個(gè)VEGF的等位基因失活，胚胎就會(huì)因?yàn)槊}管系統(tǒng)無(wú)法發(fā)育而致死，可見(jiàn)VEGF所執(zhí)行功能的重要性(Carmeliet et al.，Nature，1996 380 435-439；Ferrara etal.，Nature 1996 380 439-442)。此外，VEGF對(duì)單核細(xì)胞還具有很強(qiáng)的化學(xué)誘導(dǎo)作用，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生血纖維蛋白溶酶原激活劑和血纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑，還可以促使微血管產(chǎn)生通透性。由于可以促使微血管產(chǎn)生通透性，所以常常也被稱為血管滲透因子(VPF)。VEGF的分離方法和性質(zhì)可以參見(jiàn)Ferrara et al.，J.Cellular Biochem.，1991 47 211.218和Connolly et al.，J.CellularBiochem..1991 47 219-223。VEGF基因在mRNA水平上的截短產(chǎn)生了五種VEGF的異構(gòu)體。
VEGF-B和VEGF相比，具有相似的血管生成和其它性質(zhì)，但是表達(dá)VEGF-B的組織和表達(dá)VEGF的不同。VEGF-B在心臟中大量表達(dá)，而在肺中很少，而VEGF恰恰相反。這表明，雖然VEGF-B和VEGF在許多組織中都同時(shí)被表達(dá)，但是可能行使的功能有差異。
VEGF-B是通過(guò)酵母共雜交相互作用捕獲篩選技術(shù)進(jìn)行分離的。篩選可以和I型細(xì)胞樹(shù)脂狀酸性結(jié)合蛋白(CRABP-I)發(fā)生相互作用的細(xì)胞蛋白。具體的分離過(guò)程及其性質(zhì)可見(jiàn)專利PCT/US96/02957和Olofsson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996 932576-2581。
VEGF-C是從培養(yǎng)PC-3前列腺癌細(xì)胞系(CRL1435)的培養(yǎng)基中，根據(jù)是否可以對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞上特異的受體酪氨酸激酶VEGFR-3(Flt4)進(jìn)行酪氨酸磷酸化這一現(xiàn)象進(jìn)行篩選得到的。其中，VEGFR-3由轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系表達(dá)。再利用連有重組VEGFR-3的親和層析柱對(duì)VEGF-C進(jìn)行純化，再將其從PC-3 cDNA文庫(kù)中克隆出來(lái)。具體的分離過(guò)程和它的有關(guān)性質(zhì)可見(jiàn)Joukov et al.，EMBO J.，1996 15 290-298。
VEGF-D可以從人類乳腺cDNA文庫(kù)中分離得到，這個(gè)文庫(kù)可以從Clontech直接購(gòu)買。以人cDNA文庫(kù)中的“Soares Breast3NbHBst”(Achen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998 95 548-553)這一EST作為雜交探針進(jìn)行篩選。具體的分離過(guò)程和它的有關(guān)性質(zhì)可見(jiàn)國(guó)際專利PCT/US97/14696(WO98/07832)。
VEGF-D基因在成人體內(nèi)廣泛表達(dá)，但當(dāng)然也不是到處都表達(dá)。VEGF-D在心臟、肺和骨骼肌中大量表達(dá)。VEGF-D的中間體在脾、卵巢、小腸和結(jié)腸也有表達(dá)，在腎臟、胰腺、胸腺、前列腺和睪丸中的表達(dá)程度降低。而在腦、胎盤(pán)、肝或者外周白細(xì)胞中檢測(cè)不到VEGF-D的mRNA。
PlGF可以從足月的胎盤(pán)cDNA文庫(kù)中分離得到。具體的分離過(guò)程和它的有關(guān)性質(zhì)可見(jiàn)Maglione et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991 88 9267-9271。其具體的生物學(xué)功能目前尚不清楚。
VEGF 2可以從不依賴雌激素的人類乳腺癌細(xì)胞系中分離得到。VEGF 2和PDGF具有22％的同源性，與VEGF具有30％的同源性。現(xiàn)在還沒(méi)有方法可以分離編碼VEGF2的基因，也沒(méi)有VEGF 2生物學(xué)活性的有關(guān)數(shù)據(jù)。
VEGF 3可以從來(lái)源于結(jié)腸組織的cDNA文庫(kù)中分離得到。VEGF3與VEGF相比，有36％的部分是相同的，66％的部分是相似的?，F(xiàn)在還沒(méi)有方法可以分離編碼VEGF3的基因，也沒(méi)有VEGF 3生物學(xué)活性的有關(guān)數(shù)據(jù)。
兩個(gè)蛋白的相似程度是通過(guò)比較氨基酸序列和兩個(gè)蛋白質(zhì)之間保守氨基酸的變化決定的，而比較兩個(gè)蛋白質(zhì)的相同程度只是比較氨基酸序列，而不比較兩個(gè)蛋白質(zhì)之間保守氨基酸的變化。
PDGF/VEGF家族成員可以和酪氨酸激酶受體結(jié)合?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有五種內(nèi)皮細(xì)胞特有的酪氨酸激酶受體，分別命名為VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)、VEGFR-3(Flt-4)、Tie和Tek/Tie-2。它們?nèi)季哂行盘?hào)傳導(dǎo)必須的酪氨酸激酶活性。在血管發(fā)生和血管生成中VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、Tie和Tek/Tie-2起著非常關(guān)鍵和特異的作用，這已經(jīng)通過(guò)在小鼠胚胎中通過(guò)定點(diǎn)突變使這些受體失活的試驗(yàn)得以證明。
現(xiàn)在所知的能和VEGFs結(jié)合的酪氨酸激酶受體為VEGFR-1VEGFR-2和VEGFR-3。VEGFR-1和VEGFR-2可以高特異的和VEGF結(jié)合，同時(shí)VEGFR-1還可以和VEGF-B和PlGF結(jié)合。VEGF-C是VEGFR-3的配體，同時(shí)也可以激活VEGFR-2(Joukov et al.，TheEMBO Journal，1996 15 290-298)。VEGF-D和VEGFR-2和VEGFR-3都可以結(jié)合。關(guān)于Tek/Tie-2的配體可以參見(jiàn)國(guó)際專利No.PCT/US95/12935(WO 96/11269)(Regeneron Pharmaceuticals，Inc.)。Tie的配體至今仍然沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。
最近，一種新的VEGF異型體的特異受體已經(jīng)被純化并克隆，大小為130-135Kda(Soker et al.，Cell，1998 92 735-745)。這個(gè)VEGF受體可以通過(guò)外元7編碼的序列非常特異的和VEGF165結(jié)合，但是它和肝素只有較弱的結(jié)合能力(Soker et al.，Cell，1998 92 735-745)。令人驚訝的是，這個(gè)受體與人類NP-1是相同的，NP-1是涉及神經(jīng)早期發(fā)生的一個(gè)受體。PlGF-2也可以和NP-1發(fā)生作用(Migdal et al.，J Biol.Chem.，1998 273 22272-22278)。
VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3都由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。VEGFR-1和VEGFR-2由血管內(nèi)皮表達(dá)(Oelrichs et al.，Oncogene，1992 8 11-18；Kaipainen et al.，J.Exp.Med.，1993 178 2077-2088；Dumont et al.，Dev.Dyn.，1995 203 80-92；Fong et al.，Dev.Dyn.，1996 207 1-10)。VEGFR-3由成體組織的淋巴內(nèi)皮表達(dá)(Kaipanen et al.，Proc.Natl.Acad.Sic.USA，1995 9 3566-3570)。VEGFR-3同時(shí)也可以由圍繞腫瘤的血管表達(dá)。
去除VEGFR基因會(huì)導(dǎo)致血管系統(tǒng)發(fā)育異常，使得在妊娠中期胚胎死亡。通過(guò)對(duì)帶有完全失活VEGFR-1基因的胚胎的分析顯示這個(gè)受體在內(nèi)皮功能性組織過(guò)程中是必須的(Fong et al.，Nature 1995376 66-70)。但是，僅僅缺失了編碼VEGFR-1的胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域部分的基因卻產(chǎn)生可以存活的具有正常血管系統(tǒng)的小鼠(Hiratsukaet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998 95 9349-9354)。上述差異的原因仍然有待解釋，但是可以由此推測(cè)通過(guò)酪氨酸激酶進(jìn)行的受體信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于VEGFR-1的正常功能的實(shí)現(xiàn)并不是必須的。通過(guò)對(duì)具有失活的VEGFR-2基因的純合體小鼠的研究表明，這個(gè)受體對(duì)于細(xì)胞增殖、血細(xì)胞生成和血管系統(tǒng)的生成是必須的(Shalaby et al.，Nature，1995 376 62-66；Shalaby et al.，Cell，1997 89 981-990)。VEGFR-3的失活會(huì)造成心血管系統(tǒng)的錯(cuò)誤，因?yàn)檫@會(huì)使得大血管異常重組(Dumont et al.，Science，1998 282 946-949)。
雖然VEGFR-1主要在發(fā)育過(guò)程中在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，但是在胚胎發(fā)生早期在生血前體細(xì)胞中也產(chǎn)生(Fong et al.，Nature 1995 37666-70)。在成體中，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也表達(dá)這種受體(Barleon etal.，Blood，1996 87 3336-3343)。在胚胎中，VEGFR-1被絕大多數(shù)，但不是全部血管表達(dá)(Breier et al.，Dev.Dyn.，1995 204 228-239；Fong et al.，Dev.Dyn.，1996 207 1-10)。
受體VEGFR-3在胚胎發(fā)育早期在內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，但是隨著胚胎發(fā)生的進(jìn)程，它在靜脈內(nèi)皮和淋巴內(nèi)皮中的表達(dá)量是有限的(Kaipainen et al.，Cancer Res.，1994 54 6571-6577；Kaipainen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995 92 3566-3570)。VEGFR-3在成體組織的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中被表達(dá)。這個(gè)受體在胚胎發(fā)生過(guò)程中對(duì)于血管發(fā)育是非常關(guān)鍵的。把小鼠的VEGFR-3基因進(jìn)行定向的失活，由于帶有缺陷腔體的大血管發(fā)生異常自組，會(huì)導(dǎo)致有缺陷的血管的形成，從而使得液體在心包腔中滯留，在性交后9.5天心血管系統(tǒng)發(fā)生功能障礙。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，可以推測(cè)VEGFR-3在從初級(jí)血管網(wǎng)向更大的血管發(fā)育過(guò)程中是必須的。但是，VEGFR-3在淋巴管發(fā)育中的功能現(xiàn)在無(wú)法研究，因?yàn)樯鲜龅男∈笈咛ピ诹馨拖到y(tǒng)形成之前已經(jīng)死亡。科學(xué)家們推測(cè)VEGFR-3在淋巴發(fā)生和成體中的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中有一定的表達(dá)，從而對(duì)淋巴管發(fā)育和淋巴發(fā)生起作作用。這是根據(jù)在轉(zhuǎn)基因小鼠的皮膚中發(fā)現(xiàn)VEGF-C的異位表達(dá)現(xiàn)象而作出的推測(cè)，得到的是一種VEGFR-3的配基，它的產(chǎn)生是由于真皮中淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管的增大。這個(gè)發(fā)現(xiàn)還進(jìn)一步的顯示，VEGF-C也許最基本的功能是它在淋巴內(nèi)皮中的作用，另外輔助功能是與VEGF共同行使在血管生成中的作用，并且對(duì)血管滲透壓進(jìn)行調(diào)控(Joukov et al.，EMBO J.，1996 15 290-298)。
由于具有抗腫瘤組織血管發(fā)生的機(jī)制，一些VEGF和VEGF受體系統(tǒng)的抑制劑可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)?？梢?jiàn)Kim et al.，Nature，1993362 841-844；Saleh et al.，Cancer Res.，1996 56 393-401。
由上述提及的內(nèi)容，生長(zhǎng)因子的VEGF家族都是PDGF家族的成員。PDGF在結(jié)締組織細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)方面均具有重要的作用(Heldin et al.，“Structure of platelet-derived growth factorImplications for functionalproperties”，Growth Factor，1993 8 245-252)。在成體中，PDGF可以促進(jìn)創(chuàng)傷組織的愈合(Robson et al.，Lancet，1992 339 23-25)。結(jié)構(gòu)上，PDGF是由二硫鍵連接的同源多肽鏈A或者B組成的同源二聚體(PDGF-AA或者PDGF-BB)或者異源二聚體(PDGF-AB)。
PDGF及其異構(gòu)體是通過(guò)與靶細(xì)胞上兩個(gè)結(jié)構(gòu)相聯(lián)系的受體酪氨酸激酶(RTKs)結(jié)合而實(shí)現(xiàn)其功能的。受體α和PDGF的A鏈、B鏈都能結(jié)合，而受體β只能和B鏈結(jié)合。這兩種受體可以被許多體外培養(yǎng)的細(xì)胞系表達(dá)，但主要由體內(nèi)的間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。PDGFs可以在體外調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活和對(duì)細(xì)胞的趨化性(可見(jiàn)綜述Heldin et al.，Biochim Biophys Acta.，1998 1378 F79-113)。在體內(nèi)，由于PDGFs在上皮細(xì)胞(PDGF-A)或者內(nèi)皮細(xì)胞(PDGF-B)中表達(dá)，接近PDGFR表達(dá)的間質(zhì)，所以PDGF可以以較快的方式發(fā)揮功效。在腫瘤細(xì)胞或者體外培養(yǎng)的細(xì)胞系中，PDGFs和PDGF受體的共表達(dá)會(huì)產(chǎn)生信號(hào)的自動(dòng)傳遞環(huán)，這對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)型非常重要(Betsholtz et al.，Cell，1984 39 447-57；Keating et al.，J.R.Coll SurgEdinb.，1990 35 172-4)。PDGFs的過(guò)度表達(dá)在一些病理情況下被發(fā)現(xiàn)，包括惡性腫瘤、動(dòng)脈硬化和纖維增殖病(Heldinet al.，TheMolecular and Cellular Biology of Wound Repair，New YorkPlenumPress，1996，249-273)。
作為細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活調(diào)控子的PDGFs的重要性在最近進(jìn)行的小鼠相關(guān)基因的定向研究中被認(rèn)識(shí)到，試驗(yàn)顯示了除了不同的PDGFRs的配基之間會(huì)發(fā)生一些重疊之外，PDGFs和它們的受體在生理過(guò)程中所發(fā)揮的特有作用。具有兩個(gè)無(wú)效突變的PDGF配基或者其受體的純合體是無(wú)法存活的。大約50％的PDGF-A缺陷的純合體小鼠具有早期致死表現(xiàn)型，而剩余的存活的小鼠具有復(fù)雜的產(chǎn)后表現(xiàn)型，具體狀況為由于缺少肺泡肌成纖維細(xì)胞而導(dǎo)致肺泡隔膜的異常形成，從而患有肺氣腫(Bostrom et al.，Cell，1996 85 863-873)。另外，PDGF-A缺陷的小鼠還會(huì)具有表皮缺陷的表現(xiàn)型，特征為真皮組織較薄、畸形的毛囊和稀疏的毛發(fā)(Karlsson et al.，Development，1999 126 2611-2)。在少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成的過(guò)程中也需要PDGF-A(Fruttiger et al.，Development，1999126 457-67)。PDGFR-α缺陷的表現(xiàn)型更容易發(fā)生早期胚胎死亡、頭部非完全閉合、神經(jīng)冠發(fā)育異常、心血管系統(tǒng)缺陷和骨骼缺陷(Soriano et al.，Development，1997 124 2691-70)。PDGF-B和PDGFR-β缺陷的小鼠也具有與上述相似的表現(xiàn)型，特征常常為腎、血液和心血管系統(tǒng)的異常(Leveen et al.，Genes Dev.，1994 8 1875-1887；Soriano et al.，Genes Dev.，1994 8 1888-96；Lindahi et al.，Science，1997277 242-5；Lindahi，Development，1998 125 3313-2)。其中腎和心血管系統(tǒng)的異常至少部分上與缺乏壁細(xì)胞(心血管平滑肌細(xì)胞、外膜細(xì)胞或者腎小球膜細(xì)胞)的正確重組到血管相關(guān)(Leveen et al.，GenesDev.，1994 8 1875-1887；Lindahl et al.，Science，1997 277 242-5；Lindahlet al.，Development，1998 125 3313-2)。
本發(fā)明概述本發(fā)明揭示了一種具有刺激和/或增強(qiáng)可以表達(dá)PDGF-C受體的細(xì)胞增殖或分化和/或生長(zhǎng)和/或運(yùn)動(dòng)性功能的新的生長(zhǎng)因子，這些細(xì)胞包括，但不僅僅限于，內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。另外，由多核苷酸序列表達(dá)出的新的生長(zhǎng)因子和用于治療和診斷的藥物組合物配方都屬于本發(fā)明的范疇。
第一，本發(fā)明揭示了一種分離的并且經(jīng)過(guò)純化的多核苷酸分子，這種多核苷酸分子包括的核苷酸序列至少與

圖1所示的核苷酸序列(SEQ ID NO2)的37至1071位、圖3所示的核苷酸序列(SEQ IDNO3)的6至956位或者圖5所示的核苷酸序列(SEQ ID NO6)的196至1233位至少85％相同，有90％相同更好，最好是95％相同。圖1所示的核苷酸序列(SEQ ID NO2)的37至1071位、圖3所示的核苷酸序列(SEQ ID NO3)的6至956位或者圖5所示的核苷酸序列(SEQ ID NO6)的196至1233位編碼一個(gè)初生多肽，命名為為PDGF-C(原先命名為“VEGF-F”)，它在結(jié)構(gòu)上與PDGF-A、PDGF-B、VEGF、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D是同源的。在提出的具體實(shí)例中，核酸分子是含有圖1所示的核苷酸序列(SEQ ID NO2)的37至1071位、圖3所示的核苷酸序列(SEQ IDNO3)的6至956位或者圖5所示的核苷酸序列(SEQ ID NO6)的196至1233位的cDNA分子。同時(shí)，本發(fā)明還包括這樣的核酸分子，它可以和圖1所示的核苷酸序列(SEQ ID NO2)的37至1071位、圖3所示的核苷酸序列(SEQ ID NO3)的6至956位或者圖5所示的核苷酸序列(SEQ ID NO6)的196至1233位或者它們的片段在嚴(yán)格條件下雜交。
第二，本發(fā)明的多肽分子具有刺激和/或增強(qiáng)可以表達(dá)PDGF-C受體的細(xì)胞增殖或分化和/或生長(zhǎng)和/或運(yùn)動(dòng)性的功能，這些細(xì)胞包括，但不僅僅限于，內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。它的氨基酸序列如圖2(SEQ ID NO3)、圖4(SEQIDNO5)、圖6(SEQ ID NO7)或者它們的片段和具有刺激和/或增強(qiáng)可以表達(dá)PDGF-C受體的細(xì)胞增殖或分化和/或生長(zhǎng)和/或運(yùn)動(dòng)性的功能的類似物，這些細(xì)胞包括，但不僅僅限于，內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)、肌成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。多肽的氨基酸序列應(yīng)該和圖2(SEQ ID NO3)、圖4(SEQ ID NO5)、圖6(SEQ ID NO7)、它們的片段或者具有PDGF-C生物學(xué)活性的類似物的氨基酸序列有85％的部分是相同的，更好是90％相同，最好是95％的部分相同。在本發(fā)明的具體實(shí)例中，多肽分子是包含有PDGF-C中的PDGF/VEGF同源域(PVHD)部分的PDGF-C截短體。這個(gè)域是從氨基酸殘基230位至345位。但是，這個(gè)區(qū)域可以向N端延伸直達(dá)殘基164位。在這里，PVHD被定義為PDGF-C的截短體。PDGF-C的截短體是PDGF-C的一種活性形式。
在本發(fā)明中，序列相同程度的比較是通過(guò)Lasergene軟件包(DNASTAR，Ltd.Abacus House，Manor Road，West Ealing，LondonW130AS United Kingdom)中的比較工具“MEGALIGN”進(jìn)行的。比較過(guò)程經(jīng)過(guò)人為精化。相同程度的比例根據(jù)比較中的序列計(jì)算。
這些多肽或者由多核苷酸表達(dá)的多肽應(yīng)該具有刺激和/或增強(qiáng)可以表達(dá)PDGF-C受體的細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動(dòng)性、存活或心血管的滲透性的功能，這些細(xì)胞包括，但不僅僅限于，心血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞(例如成纖維細(xì)胞)、肌成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。另外，還應(yīng)該可以促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。PDGF-C還具有血管生成效應(yīng)，這是PDGF-C的活性之一。這些性質(zhì)在下文中統(tǒng)稱為“PDGF-C的生物學(xué)活性”，可以通過(guò)本領(lǐng)域中常見(jiàn)的方法進(jìn)行鑒定。
在這里，“PDGF-C”指圖2(SEQ ID NO3)、圖4(SEQ ID NO5)、圖6(SEQ ID NO7)的多肽分子和它們的片段或者具有上述PDGF-C生物學(xué)活性的類似物。也可以指編碼PDGF-C或者其片段或者具有PDGF-C生物學(xué)活性的類似物的多核苷酸。這種多核苷酸可以是天然的，也可以是存在于一個(gè)載體中或者脂質(zhì)體中。
另一方面，本發(fā)明揭示了一種具有以下氨基酸序列的多肽PXCLLVXRCGGXCXCC(SEQ ID NO1)。這些序列僅僅在PDGF-C中存在，從而可以和生長(zhǎng)因子PDGF/VEGF家族中的其它成員相區(qū)別，區(qū)別在于在第三和第四個(gè)半胱氨酸(見(jiàn)圖9，SEQ ID NO8-17)之間插入了三個(gè)氨基酸殘基(NCA)。
將多肽進(jìn)行保守的替換、插入或者缺失突變，但是仍然保持PDGF-C的生物學(xué)活性，這樣的突變的多肽分子顯然也屬于本發(fā)明的范疇。本領(lǐng)域內(nèi)的工作者應(yīng)該了解可以得到上述多肽的方法，例如使用定點(diǎn)突變技術(shù)、特異的酶切處理和連接。另外，將這種多肽組成的復(fù)合物中的氨基酸殘基用非天然的氨基酸或者氨基酸類似物進(jìn)行替代，也有可能得到仍然具有PDGF-C活性的蛋白質(zhì)復(fù)合物?？梢杂帽绢I(lǐng)域內(nèi)常見(jiàn)的方法制備和鑒定這些復(fù)合物。顯然，這些多肽復(fù)合物也屬于本發(fā)明的范疇。
另外，由于選擇性截短(VEGF和VEGF-B就是由于選擇性截短產(chǎn)生)和編碼PDGF-C的核酸序列自然產(chǎn)生的等位變體現(xiàn)象而產(chǎn)生的PDGF-C多肽分子的可能的變體也屬于本發(fā)明的范疇。等位變體是本領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)，是指一段核酸序列在一個(gè)或者幾個(gè)核苷酸的位置上發(fā)生了替代、缺失或者插入的突變，但是這些變化并不影響其表達(dá)的多肽的功能。
這樣的PDGF-C變體可以通過(guò)對(duì)PDGF-C多肽的非必須區(qū)域進(jìn)行修飾而得到。這些非必須區(qū)應(yīng)該在如圖9(SEQ ID NO8—17)所指出的高度保守的區(qū)域之外。特別是，生長(zhǎng)因子PDGF家族，包括VEGF，為二聚體，并且VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-A和PDGF-B在N端都具有完全保守的8個(gè)半胱氨酸區(qū)域，例如類似于PDGF/VEGF的區(qū)域(Olofsson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996 93 2576-2581；Joukov et al.，EMBO J.，1996 15290-298)。這些半胱氨酸可能與分子間和分子內(nèi)的二硫鍵的形成相關(guān)。此外，在C端區(qū)域具有高度保守，但不是完全保守的半胱氨酸殘基。分子內(nèi)二硫鍵形成了每個(gè)亞基內(nèi)的環(huán)1、2和3，這些位點(diǎn)和生長(zhǎng)因子PDGF/VEGF家族的受體結(jié)合相關(guān)(Andersson et al.，GrowthFactors.1995 12 159-164)。
本領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)人員應(yīng)該了解在那些具有活性的變體中這些半胱氨酸殘基應(yīng)該是保守的，環(huán)1、2和3中的活性位點(diǎn)的氨基酸也應(yīng)該是保守的。而分子中的其它區(qū)域，在生物學(xué)功能上就不顯得那么重要，可以進(jìn)行一定的修飾。這些經(jīng)過(guò)修飾的多肽也應(yīng)該可以通過(guò)常規(guī)的活性檢測(cè)方法對(duì)PDGF-C活性進(jìn)行鑒定，例如使用實(shí)例6中的成纖維細(xì)胞增殖分析方法。
一些經(jīng)過(guò)修飾的PDGF-C多肽具有和細(xì)胞上的PDGF-C受體結(jié)合的能力，這些細(xì)胞包括，但不僅僅限于，內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和/或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，但是卻不能刺激細(xì)胞增殖、分化、遷移、運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)和存活，或者誘導(dǎo)血管增殖、結(jié)締組織發(fā)育、創(chuàng)傷愈合。這些修飾的多肽可以作為PDGF-C多肽和PDGF/VEGF家族的生長(zhǎng)因子的競(jìng)爭(zhēng)性或者非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以用于需要抑制或者降低PDGF-C多肽和PDGF/VEGF家族的生長(zhǎng)因子作用的場(chǎng)合。這些具有結(jié)合能力，但是不能誘導(dǎo)有絲分裂、不誘導(dǎo)分化、不誘導(dǎo)遷移、不增強(qiáng)移動(dòng)性、不提高存活率、不促進(jìn)血管增殖和創(chuàng)傷愈合的PDGF-C多肽變體也屬于本發(fā)明的范疇。在這里稱為“可與受體結(jié)合但不具有其它活性的變體”。為了激活其唯一的受體，PDGF-C形成一個(gè)二聚體。但是如果二聚體由上述的可與受體結(jié)合但不具有其它活性的變體單體和另一個(gè)野生型的PDGF-C或者野生型的PDGF/VEGF家族的生長(zhǎng)因子單體組成，這樣的二聚體應(yīng)該可以與受體結(jié)合，但是無(wú)法引發(fā)下游的信號(hào)傳遞。
同時(shí)，還存在其它的修飾的PDGF-C多肽可以防止野生型的PDGF-C多肽和PDGF/VEGF家族的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞上相應(yīng)的受體結(jié)合的能力，這些細(xì)胞包括，但不僅僅限于，內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)、肌成纖維細(xì)胞和/或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。這樣，這種二聚體將無(wú)法刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化、遷移和存活率增加，也無(wú)法刺激結(jié)締組織細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和/或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化和運(yùn)動(dòng)性的增強(qiáng)。這些修飾的多肽可以作為PDGF-C多肽和PDGF/VEGF家族的生長(zhǎng)因子的競(jìng)爭(zhēng)性或者非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以用于需要抑制或者降低PDGF-C多肽和PDGF/VEGF家族的生長(zhǎng)因子作用的場(chǎng)合。這些場(chǎng)合包括當(dāng)初級(jí)或者遷移型的腫瘤細(xì)胞侵入正常細(xì)胞群落時(shí)發(fā)生的組織改型過(guò)程。這些和PDGF-C受體和生長(zhǎng)因子PDGF/VEGF家族受體具有結(jié)合能力，但是不能誘導(dǎo)有絲分裂、不誘導(dǎo)分化、不誘導(dǎo)遷移、不增強(qiáng)移動(dòng)性、不提高存活率、不促進(jìn)血管增殖和創(chuàng)傷愈合的PDGF-C生長(zhǎng)因子變體也屬于本發(fā)明的范疇。在這里稱為“可以形成PDGF-C生長(zhǎng)因子二聚體但不具有其它活性的變體或中間體”。
一個(gè)可以形成PDGF-C生長(zhǎng)因子二聚體但不具有其它活性的變體或中間體的例子是一種突變了的PDGF-C，這種突變可以防止蛋白酶對(duì)CUB結(jié)構(gòu)域的切割?？梢孕纬蒔DGF-C生長(zhǎng)因子二聚體但不具有其它活性的變體或中間體可以由具有活性的單體，例如VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-C、PDGF-A、PDGF-B或者PlGF，連接以突變了的可以耐受蛋白酶切的CUB結(jié)構(gòu)域而形成。由上述可以形成PDGF-C生長(zhǎng)因子二聚體但不具有其它活性的變體或中間體和連接有突變了的CUB結(jié)構(gòu)域的單體構(gòu)成的二聚體應(yīng)該不能和它們相應(yīng)的受體結(jié)合。
上述二聚體的一種變體是在由具有活性的單體，例如VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-C、PDGF-A、PDGF-B或者PlGF和突變了的CUB結(jié)構(gòu)域之間，再插入一個(gè)蛋白酶切位點(diǎn)。插入的這個(gè)蛋白酶切位點(diǎn)可以切開(kāi)CUB結(jié)構(gòu)域和活性單體的連接，釋放出可以和相應(yīng)受體結(jié)合的活性體。通過(guò)這種方式，可以制備出可控制活性單體釋放的二聚體。
第三，本發(fā)明揭示了一種編碼上述多肽或者多肽片段的核酸分子。核酸分子可以是DNA、基因組DNA、cDNA或者RNA，可以是單鏈，也可以是雙鏈的。核酸的來(lái)源可以從細(xì)胞或組織中抽提得到，也可以重組得到，或者直接合成的。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，所以可以表達(dá)具有圖2(SEQ ID NO3)、圖4(SEO ID NO5)、圖6(SEQ ID NO7)所示的多肽分子、它們的片段、具有相應(yīng)的生物學(xué)活性的類似物、可與受體結(jié)合但不具有其它活性的變體或者可以形成PDGF-C生長(zhǎng)因子二聚體但不具有其它活性的變體或中間體的氨基酸序列的核酸分子種類應(yīng)該有許多種。
第四，本發(fā)明揭示了帶有cDNA分子或者如第三方面所述的核酸分子的載體，以及可以被載體或者核酸分子轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。它們可以來(lái)源于真核，也可以來(lái)源于原核。宿主細(xì)胞應(yīng)該適于表達(dá)本發(fā)明所述的多肽分子，包括昆蟲(chóng)細(xì)胞如Sf9細(xì)胞，可從美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏組織(ATCC SRL-171)得到，可以用桿狀病毒載體轉(zhuǎn)染；或者人胚胎腎細(xì)胞系293-EBNA，可以被合適的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。本發(fā)明首選的載體是由上述的核酸序列連接一個(gè)或者幾個(gè)合適的啟動(dòng)子或者其它調(diào)控序列而成的表達(dá)載體，再將這可以表達(dá)本發(fā)明所述的多肽分子的載體轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。其它推薦的載體還有那些適于轉(zhuǎn)染不如動(dòng)物細(xì)胞，或者可用于基因治療的載體，例如腺病毒、牛痘病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒載體或者脂質(zhì)體。
本發(fā)明同時(shí)揭示了一種制備可以由其帶有核酸分子表達(dá)出多肽的載體的方法，包括的步驟為在載體中，將核酸分子與一個(gè)或者幾個(gè)合適的啟動(dòng)子或者調(diào)控序列相連。
本發(fā)明同時(shí)揭示了一種制備本發(fā)明所述的多肽分子的方法，包括的步驟為在宿主細(xì)胞中將核酸分子或者載體進(jìn)行表達(dá)，再?gòu)乃拗骷?xì)胞或者培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離出所表達(dá)的多肽分子。
第五，本發(fā)明得到了一種可以和本發(fā)明所述的多肽分子或者其片段進(jìn)行特異反應(yīng)的抗體分子。這種抗體可以識(shí)別PDGF-C的變體、具有免疫活性的片段、類似物和重組體。這樣的抗體可以作為PDGF-C的抑制劑或者激動(dòng)劑，可以對(duì)PDGF-C進(jìn)行檢測(cè)和定量?？贵w可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體?？梢允褂眠@樣的單克隆或者多克隆抗體收集本發(fā)明所述的多肽分子及其它們的變體、片段和類似物。可以在多肽序列上連接一個(gè)表位標(biāo)記，例如FLAG八肽(Sigma，St.Louis，MO)，以便于進(jìn)行親和層析富集。在某些場(chǎng)合，例如在臨床上需要使用單克隆抗體抑制PDGF-C活性時(shí)，應(yīng)該使用人源的單克隆抗體。這些抗體中可以進(jìn)一步加入細(xì)胞毒性或者細(xì)胞抑制試劑。制備上述物質(zhì)，包括重組DNA的方法都是本領(lǐng)域內(nèi)常見(jiàn)的技術(shù)。
同時(shí)，可以特異的識(shí)別PDGF-C，并且自身帶有標(biāo)記的抗體也屬于本發(fā)明的范疇。
為了便于檢測(cè)，本發(fā)明所述的多肽分子或者抗體可以帶有可檢測(cè)的標(biāo)記物。這樣，帶標(biāo)記的多肽分子就可以原位檢測(cè)其相應(yīng)的受體。多肽分子抗體可以共價(jià)的，也可以非共價(jià)的與超磁物質(zhì)、順磁物質(zhì)、電子密度物質(zhì)或者放射性物質(zhì)連接，以便于檢測(cè)。如果用于診斷分析，可以使用放射性的或者非放射性的標(biāo)記。放射性標(biāo)記包括放射性同位素，例如125I或者32P。非放射性標(biāo)記包括酶標(biāo)試劑，如辣根過(guò)氧化物酶和熒光試劑，如FITC。標(biāo)記可以是直接標(biāo)記，也可以是間接標(biāo)記，可以是共價(jià)標(biāo)記，也可以是非共價(jià)標(biāo)記。
本發(fā)明在臨床上的應(yīng)用包括加速移植的組織或者器官的血管發(fā)生過(guò)程、刺激創(chuàng)傷組織的愈合、刺激結(jié)締組織的發(fā)育、建立損傷組織和動(dòng)脈堵塞(例如冠心病)的旁路連接、抑制腫瘤組織或者糖尿病視網(wǎng)膜癥中的血管生成過(guò)程和抑制初級(jí)或者遷移性腫瘤細(xì)胞侵入正常細(xì)胞群落過(guò)程中發(fā)生的組織轉(zhuǎn)型。另外，在腫瘤活檢中，對(duì)PDGF-C的量進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于判斷腫瘤轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)性非常有幫助。
此外，PDGF-C和許多肺的生理現(xiàn)象相關(guān)。PDGF-C的檢測(cè)可以用于許多肺病的診斷中。PDGF-C同時(shí)可以用于許多肺病的治療當(dāng)中，以增強(qiáng)肺部血管流通，提高肺部空氣和血的交換。相似的，對(duì)于心臟病缺陷患者，PDGF-C還可以用于增強(qiáng)心臟的血管流通和氧氣的滲透性。同樣，對(duì)于慢性氣管堵塞癥患者，PDGF-C還可以增強(qiáng)血液和氣體交換。
本發(fā)明揭示了一種可以刺激哺乳動(dòng)物血管生成、淋巴管生成、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)生成、結(jié)締組織發(fā)育和創(chuàng)傷愈合的方法，包括的步驟為對(duì)哺乳動(dòng)物施加有效劑量的PDGF-C、其片段或者具有PDGF-C生物學(xué)活性的類似物。可以將PDGF-C、其片段或者類似物與以下一種或者幾種VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-A、PDGF-B、FGF和/或肝素同時(shí)施加給試驗(yàn)動(dòng)物。
PDGF-C激動(dòng)劑(例如抗體或者可以競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合PDGF-C形成二聚體并且和受體結(jié)合的抑制劑)可以用以處理例如心臟充血障礙的情況，通過(guò)在別的器官，例如肺中增加血管的滲透性，以造成液體的積累，從而抵消心臟中的血管滲透性的問(wèn)題。PDGF-C同時(shí)還可以處理可在肺、腎和肝中發(fā)現(xiàn)的纖維變性的狀況。在腸道中施加PDGF-C，可以治療消化不良癥，但同時(shí)肝、腎的血液流通和血管滲透性都增強(qiáng)了。
本發(fā)明還揭示了一種可以抑制哺乳動(dòng)物血管生成、淋巴管生成、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)生成、結(jié)締組織發(fā)育和創(chuàng)傷愈合的方法，包括的步驟為對(duì)哺乳動(dòng)物施加有效劑量的PDGF-C激動(dòng)劑。激動(dòng)劑可以是任何能夠抑制PDGF-C活性的物質(zhì)，機(jī)制可以是抑制PDGF-C與細(xì)胞上相應(yīng)的受體結(jié)合，也可以是抑制受體的激活，例如通過(guò)使用“可與受體結(jié)合但不具有其它活性的變體”。激動(dòng)劑包括，但不僅僅限于，抗PDGF-C的抗體，可以競(jìng)爭(zhēng)性的或者非競(jìng)爭(zhēng)性的抑制PDGF-C及其受體結(jié)合的抑制劑，例如上述的“可以形成PDGF-C生長(zhǎng)因子二聚體但不具有其它活性的變體或中間體”，可以結(jié)合PDGF-C并且修飾PDGF-C以使其失去活性的復(fù)合物，還有上述多核苷酸序列的反義核酸分子。
本發(fā)明還提供了一種確定與PDGF-C的活性片段結(jié)合的試劑的方法，步驟為將PDGF-C的活性片段和檢測(cè)試劑混合，使用適當(dāng)?shù)姆椒ūO(jiān)測(cè)結(jié)合的程度。試劑可以包含復(fù)合物和其它蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提出了一個(gè)尋找可以和PDGF-C的活性片段結(jié)合的篩選系統(tǒng)。先制備PDGF-C的活性片段，將其與待檢測(cè)的試劑混合，再使用適當(dāng)?shù)姆椒ǘ繙y(cè)定待檢測(cè)的試劑與PDGF-C的活性片段的結(jié)合程度。這個(gè)篩選系統(tǒng)也可以用于確定可以抑制對(duì)全長(zhǎng)PDGF-C的蛋白酶切的物質(zhì)，這樣可以防止釋放出具有活性的PDGF-C的活性片段。當(dāng)然，必須先準(zhǔn)備好全長(zhǎng)的PDGF-C。
使用這套篩選系統(tǒng)可以尋找那些可能改變PDGF-C生物學(xué)活性的化合物。這種篩選方法可以改造成類似于PANDEX(Baxter-DadeDiagnostics)系統(tǒng)的大規(guī)模、自動(dòng)化裝置，以適應(yīng)對(duì)可能的藥物進(jìn)行有效的高通量的篩選。
在這個(gè)篩選系統(tǒng)中，PDGF-C的活性片段或者全長(zhǎng)的PDGF-C要事先制備，最好采用重組DNA技術(shù)。檢測(cè)試劑，例如復(fù)合物和蛋白質(zhì)，被引入包含有PDGF-C的活性片段或者全長(zhǎng)的PDGF-C的反應(yīng)容器。檢測(cè)試劑和PDGF-C的活性片段或者全長(zhǎng)的PDGF-C的結(jié)合可以使用適當(dāng)?shù)姆椒ù_定，這些方法包括，但不僅僅限于，將檢測(cè)試劑使用放射性同位素或者化學(xué)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。其它檢測(cè)試劑與PDGF-C的活性片段或者全長(zhǎng)的PDGF-C的結(jié)合程度的方法還可參見(jiàn)美國(guó)專利公開(kāi)5,585,277，它是通過(guò)監(jiān)測(cè)折疊了的和未折疊的蛋白質(zhì)的比例確定檢測(cè)試劑和PDGF-C的活性片段或者全長(zhǎng)的PDGF-C的結(jié)合程度。這樣的檢測(cè)蛋白質(zhì)折疊的例子包括，但不僅僅限于，監(jiān)測(cè)PDGF-C的活性片段或者全長(zhǎng)的PDGF-C對(duì)特異的蛋白酶的耐受程度，或者檢測(cè)蛋白質(zhì)和可以特異結(jié)合蛋白質(zhì)折疊態(tài)的抗體的結(jié)合程度。
本領(lǐng)域內(nèi)的工作者都應(yīng)該了解IC50值的大小和所選擇的檢測(cè)試劑相關(guān)。例如，IC50值小于10nM的檢測(cè)試劑非常適用于藥物治療情況。但是，其實(shí)特異性更高而結(jié)合強(qiáng)度更低的試劑更使用于這一情況。本領(lǐng)域內(nèi)的工作者應(yīng)該認(rèn)識(shí)到關(guān)于試劑的結(jié)合能力、抑制活性和特異選擇性的信息對(duì)于研究相應(yīng)的藥物非常有用。
當(dāng)在治療中使用PDGF-C或者PDGF-C激動(dòng)劑時(shí)，使用的劑量和方式將由被施加的個(gè)體和具體的待處理的情況決定，由醫(yī)師和獸醫(yī)根據(jù)判斷自行決定。給藥的方式包括口服、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、靜脈注射、植入、局部使用和不經(jīng)過(guò)消化系統(tǒng)的使用方式等等。局部使用PDGF-C的方法和使用VEGF的方法相似。例如在促進(jìn)創(chuàng)傷愈合時(shí)，或者其它需要增強(qiáng)血管生成效應(yīng)的場(chǎng)合，可以將PDGF-C直接施加到需要的組織或者器官上，有效的劑量按照給藥量/體重的比值在0.1至1000μg/Kg之間。
PDGF-C或者PDGF-C激動(dòng)劑可以結(jié)合適當(dāng)?shù)乃幬镙d體使用。最后的組成為，具有藥效的適當(dāng)量的PDGF-C或者PDGF-C激動(dòng)劑，生物相容的無(wú)毒的鹽類以及生物相容的固體或者液體的載體或者佐劑。這樣的載體或者佐劑的例子包括，但不僅僅限于，堿鹽、緩沖堿鹽、Ringer溶液、礦物油、滑石、淀粉、明膠、乳糖、蔗糖、微晶纖維素、高嶺土、甘露糖醇、磷酸二鈣、氯化鈉、葡萄糖、水、甘油、乙醇、增稠劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑或者上述物質(zhì)的組合。它們可以制成溶液、懸濁液、片劑、膠囊、軟膏、西也劑、糖漿、糯米紙囊劑、油膏或者其它的形式。藥物的形式應(yīng)該根據(jù)給藥的方式?jīng)Q定。在這里，含有PDGF-C的成分也可以換成一種或者幾種下列的物質(zhì)PDGF-A、PDGF-B、VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF和/或肝素。藥物中含有的活性物質(zhì)PDGF-C的重量比在0.1％至90％之間，一般在10％至30％之間。
對(duì)于肌內(nèi)制劑，應(yīng)該是無(wú)菌的形式，PDGF-C的活性片段以可溶性鹽例如鹽酸鹽的形式存在，溶解在藥物稀釋劑中，例如不含致熱源的蒸餾水、生理鹽水或者5％的葡萄糖溶液。對(duì)于不溶的化合物可以制備成懸濁的水溶液，或者使其懸浮在生物相容性的油堿中，例如含有長(zhǎng)鏈脂肪酸的酯中，例如乙基油酸酯。
本發(fā)明的發(fā)明思想還可以用作制造診斷/疾病預(yù)測(cè)設(shè)備，例如以檢測(cè)試劑盒的形式。在本發(fā)明的一個(gè)具體的試劑盒的實(shí)例中，試劑盒包括抗PDGF-C的抗體，以及一種檢測(cè)，更確切的說(shuō)，測(cè)量估計(jì)PDGF-C及其抗體之間結(jié)合狀況的方法。在另一個(gè)具體實(shí)例中，上述的抗PDGF-C抗體稱為一抗，其上除了能與PDGF-C結(jié)合的位點(diǎn)外，還具有某種動(dòng)物的抗原，另外試劑盒還提構(gòu)了一種二抗抗體分子，抗一抗上具有的動(dòng)物抗原。二抗上具有可檢測(cè)的標(biāo)記物，PDGF-C或者未標(biāo)記的一抗結(jié)合在基底的表面，這樣PDGF-C和一抗的相互作用程度可以根據(jù)基底上相應(yīng)的標(biāo)記物的數(shù)量決定，這種標(biāo)記物是通過(guò)使二抗和結(jié)合了PDGF-C的一抗結(jié)合而引入的。在一個(gè)具體實(shí)例中，本發(fā)明所述的診斷/疾病預(yù)測(cè)設(shè)備就是以酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒的形式給出的。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)例中，這種診斷/疾病預(yù)測(cè)設(shè)備也可以包含聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法，以擴(kuò)增出待檢測(cè)的個(gè)體，并將其序列結(jié)構(gòu)與本發(fā)明公布的序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，以檢測(cè)有無(wú)異常，判定PDGF-C表達(dá)的異常是否與某些疾病的特定階段相關(guān)。
另外，本發(fā)明的具體實(shí)例中，還可以使用限制性長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析方法，使用限制性內(nèi)切酶切割待測(cè)樣品的基因組DNA，電泳，產(chǎn)生特異性的DNA條帶。再將這些條帶與本分明中公布的序列條帶進(jìn)行比較，以檢測(cè)有無(wú)異常，判定PDGF-C表達(dá)的異常是否與某些疾病的特定階段相關(guān)。
本發(fā)明包括一種可以檢測(cè)可能與疾病階段相關(guān)的待檢測(cè)樣品的PDGF-C基因是否發(fā)生異常的方法。這種方法的步驟為從樣品中得到DNA或者RNA樣品，加入特異的引物，通過(guò)PCR的方法，選擇性的擴(kuò)增出PDGF-C相關(guān)的基因，將從樣品中擴(kuò)增出的核酸序列和圖1(SEQ ID NO2)或者圖3(SEQ ID NO5)中的序列進(jìn)行比較。那些包含有能夠特異的結(jié)合樣品的PDGF-C基因的引物，和可以將PDGF-C基因從DNA樣品中擴(kuò)增出來(lái)的聚合酶的試劑盒也屬于本發(fā)明的范疇。
本發(fā)明給出了一種在生物樣品中檢測(cè)PDGF-C的方法。具體步驟為將能夠和PDGF-C結(jié)合的試劑與樣品混合反應(yīng)，再檢測(cè)結(jié)合程度。其中可以結(jié)合PDGF-C的部分最好是抗PDGF-C的抗體，最好是單克隆抗PDGF-C抗體。在一個(gè)具體實(shí)例中，結(jié)合程度是通過(guò)可檢測(cè)的標(biāo)記物實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的，適用的標(biāo)記物上文已經(jīng)討論。
本發(fā)明涉及到有PDGF-C構(gòu)成的蛋白二聚體，特別是由二硫鍵連接的蛋白二聚體。二聚體可以是由兩條PDGF-C多肽組成的同源二聚體，也可以是由一條PDGF-C多肽和一條VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-A或者PDGF-B組成的異源二聚體。
本發(fā)明還給出了分離PDGF-C的方法，包括的步驟為將表達(dá)PDGF-C的細(xì)胞用肝素處理，以使得細(xì)胞釋放PDGF-C，再將釋放出的PDGF-C進(jìn)行純化。
本發(fā)明還給出了一種包含反義核酸序列的載體。其中的反義核酸序列至少與編碼PDGF-C、PDGF-C片段或者具有PDGF-C生物學(xué)活性的類似物的DNA序列部分互補(bǔ)?；蛘?，反義核酸序列也可以和PDGF-C基因的啟動(dòng)子區(qū)域作用，或者和基因的其它非編碼區(qū)相互作用，從而達(dá)到抑制，至少是降低PDGF-C的表達(dá)程度。
根據(jù)上文所述，這樣包含反義核酸序列的載體可以用以抑制，至少是降低PDGF-C的表達(dá)程度。在那些PDGF-C表達(dá)與疾病相關(guān)的場(chǎng)合中，使用這種可以抑制PDGF-C表達(dá)的載體是相當(dāng)有效的，這些場(chǎng)合例如，腫瘤產(chǎn)生PDGF-C以促進(jìn)血管生成，或者組織重建，該過(guò)程發(fā)生在初級(jí)的或遷移的腫瘤細(xì)胞侵入正常細(xì)胞群體時(shí)。用攜帶有反義核酸序列的載體轉(zhuǎn)化該腫瘤細(xì)胞將抑制或阻礙腫瘤的生長(zhǎng)或組織重建。
發(fā)明的另一方面與發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)PDGF-C蛋白可能是潛在的生長(zhǎng)因子有關(guān)。該生長(zhǎng)因子需要通過(guò)蛋白水解釋放具有活性的PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域而被激活。已知的蛋白水解位點(diǎn)位于全長(zhǎng)蛋白的殘基231—234，即殘基-RKSR-。這是二元基序。該位點(diǎn)在鼠PDGF-C中結(jié)構(gòu)保守。在PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D中也發(fā)現(xiàn)已知的-RKSR-蛋白水解位點(diǎn)。在這四種蛋白中，在PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域的最小結(jié)構(gòu)域的前方序列中也發(fā)現(xiàn)了已知的蛋白水解位點(diǎn)。所有這些事實(shí)都表明-RKSR-是蛋白水解的位點(diǎn)。
優(yōu)選的蛋白酶包括，但不僅僅限于，纖維蛋白溶酶、因子X(jué)和腸激酶。N-端CUB結(jié)構(gòu)域可能作為抑制結(jié)構(gòu)域起作用，該結(jié)構(gòu)域可能用于保持PDGF-C以潛在的形式存在一些細(xì)胞外室中，當(dāng)需要PDGF-C時(shí)該結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)特定的蛋白水解除去。
該發(fā)明提供了一種產(chǎn)生活化的截短形式的PDGF-C或調(diào)節(jié)PDGF-C的受體結(jié)合的特異性的方法。這些方法包括表達(dá)含有可編碼具有PDGF-C生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸的表達(dá)載體，和支持至少一種酶的水解以用于處理表達(dá)的多肽產(chǎn)生有活性的PDGF-C的截短體。
本發(fā)明同時(shí)也提供了一種選擇性激活具有生長(zhǎng)因子活性的多肽的方法。該方法包括表達(dá)可編碼具有生長(zhǎng)因子活性和CUB結(jié)構(gòu)域的多肽的多核苷酸的表達(dá)載體，在該多肽中，CUB結(jié)構(gòu)域和具有活性的多肽片段之間含有一個(gè)蛋白水解位點(diǎn)，該方法支持至少一種酶的水解以用于處理表達(dá)的多肽產(chǎn)生激活的具有生長(zhǎng)因子活性的多肽。
另外，本分明還包括分離編碼具有PDGF-C生物學(xué)活性的多肽的核酸分子，和分離編碼內(nèi)部含有氨基酸序列為RKSR的蛋白水解位點(diǎn)或者內(nèi)部含有結(jié)構(gòu)保守的氨基酸序列的多肽的核酸分子的方法。
這個(gè)方面也包括一種分離的二聚體，此二聚體由具有活性的PDGF-C的單體和激活的連有CUB結(jié)構(gòu)域的VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-C、PDGF-A、PDGF-B和PlGF的單體構(gòu)成，或者反過(guò)來(lái)，由激活的VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-C、PDGF-A、PDGF-B和PlGF的單體和具有活性的的連有CUB結(jié)構(gòu)域的PDGF-C的單體構(gòu)成。該種二聚體可能包括也可能不包括位于激活的單體和CUB結(jié)構(gòu)域連接處的蛋白水解位點(diǎn)。
如上所述的多核苷酸，這些多核苷酸的片段，以及與可以與這樣的多核苷酸或者多核苷酸片段在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交的非編碼的多核苷酸鏈具有充分相似性的多核苷酸的變體，它們均可用于識(shí)別、純化、分離編碼其它的非人源的哺乳類的PDGF-C的多核苷酸。因此這些多核苷酸片段和變體用于發(fā)明方面。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件的例子如下雜交溫度42℃，5X SSC，20 mM Na3PO4，pH6.8，50％甲酰胺；清洗條件42℃，0.2X SSC。本領(lǐng)域的人員應(yīng)該了解需要根據(jù)要進(jìn)行雜交的核酸序列的長(zhǎng)度和GC堿基對(duì)的含量改變具體的條件。具體實(shí)例見(jiàn)“分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”，第二版，頁(yè)9.47-9.51，冷泉港，紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1989)。
另外，純化和分離的可編碼其它、非人源的、哺乳類的PDGF-C的多核苷酸也屬于本發(fā)明的范疇，正如純化和分離由此編碼的多肽和可與非人源PDGF-C變體進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)的抗體。因此，這項(xiàng)發(fā)明包括純化和分離哺乳類PDGF-C多肽，也包括純化和分離編碼多肽的多核苷酸。
顯而易見(jiàn)，這項(xiàng)發(fā)明中的核酸和多肽可以通過(guò)合成或者重組的方法得到，也可以從天然物質(zhì)中提取、純化。
在這里，當(dāng)舉具體的實(shí)例時(shí)，“包括”的意思是“包含，但不僅僅限于”。
附圖簡(jiǎn)述圖1(SEQ ID NO2)顯示編碼人PDGF-C(hPDGF-C)(2108bp)的cDNA的完整的核酸序列；圖2(SEQ ID NO3)顯示推測(cè)的含有345個(gè)氨基酸殘基的全長(zhǎng)hPDGF-C的一維序列(cDNA的翻譯部分對(duì)應(yīng)于圖1中的核苷酸37到1071)；圖3(SEQ ID NO4)顯示編碼人PDGF-C(bPDGF-C)(1536bp)的片段的cDNA序列；圖4(SEQ ID NO5)顯示hPDGF-C的片段的氨基酸序列(即圖3中的第3位到第956位的核苷酸序列的翻譯)；圖5(SEQ ID NO6)顯示鼠PDGF-C(mPDGF-C)的cDNA的核苷酸序列；圖6(SEQ ID NO7)顯示鼠PDGF-C的片段的氨基酸序列(由圖5中的第196位到1233位核苷酸的cDNA翻譯而成)；圖7顯示圖2中的人PDGF-C的氨基酸序列和鼠PDGF-C的氨基酸序列的比較；圖8顯示鼠PDGF-C的圖解結(jié)構(gòu)，由信號(hào)肽(用斜線框表示)，N端Clr/Cls/胚胎sea urchin蛋白Uegf/骨形態(tài)發(fā)生蛋白1(CUB)結(jié)構(gòu)域，和C端PDGF/VEGF-同源結(jié)構(gòu)域(用空白框表示)；圖9顯示人和鼠的PDGF-C的PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域的序列比較，并和生長(zhǎng)因子的VEGF/PDGF家族的其他成員相比較(SEQ IDNO8-17)；圖10顯示幾種屬于VEGF/PDGF家族的生長(zhǎng)因子的進(jìn)化樹(shù)；圖11提供存在于人和鼠的PDGF-Cs的CUB結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的比較(SEQ ID NO18和19)和其他的存在于人骨發(fā)生蛋白-1(hBMP-1，3個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域CUB1-3)(SEQ ID NO20-22)和人NP-1(2個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域)(SEQ ID NO23和24)的CUB結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；圖12顯示幾種人組織中PDGF-C表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物的Northern雜交的分析；圖13顯示由低氧誘導(dǎo)的PDGF-C的mRNA的表達(dá)水平的變化；圖14顯示人腫瘤細(xì)胞系中的PDGF-C的表達(dá)；圖15顯示在轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞中通過(guò)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)全長(zhǎng)的人源PDGF-C的結(jié)果；圖16顯示全長(zhǎng)PDGF-C的分離過(guò)程和部分特征；圖17顯示只含有PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域的人源PDGF-C的截短體的分離和部分特征；圖18為標(biāo)記的PDGF-BB同源二聚體結(jié)合到表達(dá)PDGF α-受體的PAE-1細(xì)胞上而得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖19提供代表抑制標(biāo)記的PDGF-BB結(jié)合到表達(dá)PDGF α-受體的PAE-1細(xì)胞上的圖形，該抑制可通過(guò)增加大量的純化的全長(zhǎng)和截短的PDGF-CC蛋白；圖20顯示全長(zhǎng)和截短的PDGF-CC同源二聚體對(duì)PDGF-α-受體的磷酸化的影響；圖21顯示全長(zhǎng)和截短的PDGF-CC同源二聚體對(duì)成纖維細(xì)胞的致有絲分裂活性；圖22顯示截短的PDGF-CC結(jié)合到PDGF受體上的鑒定結(jié)果；圖23顯示未消化的全長(zhǎng)PDGF-C蛋白和纖維蛋白溶酶發(fā)生的26-28kDa的蛋白片段的免疫雜交；圖24表示全長(zhǎng)PDGF-C和截短的PDGF-C的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到PDGER-α受體的鑒定結(jié)果；圖25顯示在還原和非還原條件下通過(guò)SDS-PAGE對(duì)人PDGF-C CUB結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析的結(jié)果；圖26A-26V顯示正在發(fā)育的小鼠胚胎中的PDGF-C的表達(dá)狀況；圖27A-27F顯示正在發(fā)育的的腎中PDGF-C，PDGF-A和PDGFR-α的表達(dá)狀況；
圖28A-28F顯示從野生型(圖28A和28c)，PDGFR-α-/-(圖28B和28F)，PDGF-A-/-(圖28D)和PDGF-A/PDGF-B double-/-(圖28E)腎而來(lái)的E 16.5腎的組織學(xué)。
優(yōu)選實(shí)施例的具體描述圖1(SEQ ID NO2)顯示完整的編碼人PDGF-C(hPDGF-C)(2108bp)的cDNA的核酸序列，該hPDGF-C是VEGF/PDGF家族的新成員。比較編碼hPDGF-C的克隆#4(見(jiàn)圖3和圖4-SEQ ID NO4和5)與鼠蛋白(相對(duì)應(yīng)的27個(gè)氨基酸)得知克隆#4不是全長(zhǎng)序列，缺乏了大約80個(gè)堿基對(duì)的編碼序列。從人胎兒肺cDNA文庫(kù)中分離出的另外的cDNA克隆包括上述缺失序列的插入片段?？寺?10比克隆#4有更長(zhǎng)的插入?？寺?10的插入從5’區(qū)域開(kāi)始，并含有缺失的序列?？寺?0#包括人PDGF-C的全序列。圖1(SEQID NO2)中列出一些5’-未翻譯的序列，一些已翻譯的編碼人PDGF-C的cDNA的序列和一些3’-未翻譯的核酸序列。終止密碼子位于起始ATG上游21bp處(圖1中起始ATG下端劃線)。
通過(guò)對(duì)NCBI的EST數(shù)據(jù)庫(kù)和dbEST的搜索，尋找到一個(gè)人的EST序列(W21436)，該序列編碼鼠PDGF-C中與人同源的部分。由此，可以開(kāi)始進(jìn)行分離未發(fā)現(xiàn)的人PDGF/VEGF的工作。根據(jù)所得的人EST序列，兩個(gè)寡核苷酸鏈設(shè)計(jì)如下5’-GAA GTT GAG GAA CCC AGT G-3’5’端引物(SEQID NO25)5’-CTT GCC AAG AAG TTG CCA AG-3’3’端引物(SEQID NO26)使用上述的寡核苷酸引物可以通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出人胎兒肺5’-STRETCH PLUSλgt10 cDNA文庫(kù)中的長(zhǎng)度為348bp的多核苷酸。再將PCR產(chǎn)物克隆到TA克隆試劑盒的PCR 2.1-載體上(Invitrogen)。隨后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，長(zhǎng)度為348bp的PCR產(chǎn)物克隆可用于構(gòu)建hPDGF-C探針。
人胎兒肺5’-STRETCH PLUS gt10 cDNA文庫(kù)(Clontech)中的106種λ-克隆可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法用hPDGF-C探針進(jìn)行篩選。在幾個(gè)陽(yáng)性克隆中，重點(diǎn)分析克隆#4，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法，使用內(nèi)部的和載體寡核苷酸確定其上插入的核苷酸序列?？寺?4的插入片段含有編碼全長(zhǎng)的人PDGF-C(hPDGF-C)的cDNA的部分核苷酸序列。圖3(SEQ ID NO4)顯示了克隆#4插入的核苷酸序列(1536bp)。此cDNA翻譯的部分包括核苷酸第6位到第956位。圖4(SEQ ID NO5)顯示了推測(cè)可能是插入序列的翻譯部分的氨基酸序列。該氨基酸序列構(gòu)成的多肽缺乏全長(zhǎng)hPDGF-C多肽的最初28個(gè)氨基酸殘基，但是該多肽包括可以充分激活PDGF α受體的蛋白水解片段。應(yīng)該注意到SEQ ID NO為5的第一個(gè)甘氨酸(Gly)并沒(méi)有在全長(zhǎng)hPDGF-C中發(fā)現(xiàn)。
在通過(guò)對(duì)NCBI的dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索，找到一個(gè)小鼠EST序列(AI020581)，該序列編碼部分一個(gè)新的小鼠PDGF、PDGF-C的一部分。絕大多數(shù)的小鼠cDNA是通過(guò)使用來(lái)源于小鼠胚胎λgt10cDNA文庫(kù)中的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增而得到的。為了擴(kuò)增cDNA的3’端，需要使用根據(jù)小鼠EST序列得到的有意義鏈引物(該引物的序列是5’-CTT CAG TAC CTT GGA AGA G，引物1(SEQ ID NO27))，為了擴(kuò)增cDNA的5’端，需要使用根據(jù)小鼠EST序列得到的無(wú)意義鏈引物(該引物的序列是5’-CGC TTGACC AGG AGA CAA C，引物2(SEQ ID NO28))。λgt10載體引物是有意義鏈引物5’-ACG TGA ATT CGA CAA GTT CAG CCTGGT TAA(引物3(SEQ ID NO29))和無(wú)意義鏈引物5’-ACG TGGATC CTG AGT ATT TCT TCC AGG GTA(引物4(SEQ ID NO30))。載體引物和源自小鼠EST的內(nèi)部引物被用于標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)。被PCR擴(kuò)增出的片段的大小分別大約是750bp(3′片段)和800bp(5’片段)。這些片段克隆入PCR2.1載體并使用載體引物和內(nèi)部引物進(jìn)行核酸序列分析。這些片段不含有mPDF-C的全長(zhǎng)序列，鼠肝ZAP cDNA文庫(kù)用標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行篩選。構(gòu)建一段32P標(biāo)記的261bp的PCR片段作為探針，利用引物1和引物2并使用源于鼠胚胎λgt10文庫(kù)的DNA作為模板(見(jiàn)上)。將陽(yáng)性的噬菌斑純化，再通過(guò)亞克隆獲得插入的核苷酸序列。載體特異性引物和內(nèi)部引物被使用。通過(guò)分析產(chǎn)生的PCR克隆和分離出的克隆的核苷酸序列信息，可以推斷出mPDGF-C的全長(zhǎng)的氨基酸序列(見(jiàn)圖6)(SEQ ID NO7)。
圖7顯示了鼠和人的PDGF-C的氨基酸序列的比較情況(SEQIDNO分別是6和2)。該比較表明人和鼠的PDGF-Cs有大約87％的相同性，在蛋白全長(zhǎng)的345個(gè)氨基酸殘基中有45個(gè)氨基酸被替換。幾乎所有觀察到的氨基酸的替換本質(zhì)上是保守的。預(yù)測(cè)的mPDGF-C中信號(hào)肽酶水解的位點(diǎn)位于殘基G19和T20之間。這一點(diǎn)會(huì)產(chǎn)生鼠類的可分泌的由326殘基構(gòu)成的多肽。
圖8提供了帶有信號(hào)序列(用斜線框表示)、N-端CUB結(jié)構(gòu)域和C-端PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域(用空白框表示)的鼠PDGF-C的圖解的結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。劃線顯示的氨基酸序列與CUB結(jié)構(gòu)域或與VEGF-同源結(jié)構(gòu)域沒(méi)有明顯的相似性。
高度的序列相同性表明人和鼠的PDGF-C有幾乎相同的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。氨基酸序列的比較顯示鼠和人的PDGF-C均有一個(gè)新的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。除了位于兩種蛋白質(zhì)(殘基164到345)的C-端區(qū)域的PDGF/VEGF-同源結(jié)構(gòu)域之外，在兩種PDGF-Cs的N-端區(qū)域均有一個(gè)結(jié)構(gòu)域可歸于CUB結(jié)構(gòu)域(Bork and Beckmann，J.Mol.Biol.，1993231，539-545)。該大約110氨基酸的結(jié)構(gòu)域最初從補(bǔ)體因子Clr/Cls中被鑒別出，但是最近又在其它幾種細(xì)胞外蛋白中發(fā)現(xiàn)，包括，信號(hào)分子，例如骨發(fā)生蛋白1(BMP-1)(Wozney et al.，Science，1988 242，1528-1534)，受體分子，例如NP-1(Soker et al.，Cell，1998 92 735-745)。盡管CUB結(jié)構(gòu)域的功能不清楚，但是它有可能參與蛋白-蛋白相互作用或者參與與蛋白聚糖硫酸肝素之類的碳水化合物相互作用。
圖9顯示人和鼠的PDGF-Cs的C-端PDGF/VEGF-同源結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的比較以及與PDGF/VEGF家族成員如VEGF165、PLGF-2、VEGF-B167、Pox Orf VEGF、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-A和PDGF-B的C-端PDGF/VEGF-同源結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的比較(SEQ ID NO8-17)。在這張圖中VEGF-C和VEGF-D的N-端和C-端區(qū)域的一些氨基酸序列被略去了。間隙被引入以優(yōu)化比較。該比較用J.Hein的方法(Methods Enzymol.，1990 183 626-45)和PAM250殘基權(quán)重表得到。用方框表示的殘基顯示的是與位于兩個(gè)遠(yuǎn)距離單元內(nèi)部的PDGF-Cs相匹配的氨基酸。
該比較顯示PDGF-C有預(yù)料中由半胱氨酸殘基構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，除了一個(gè)例外。在半胱氨酸3和4之間，通常由2個(gè)殘基隔開(kāi)，有三個(gè)氨基酸(NCA)的插入。PDGF-C中這種序列的特點(diǎn)是出乎意料的。
根據(jù)圖9中的氨基酸序列比較，可以構(gòu)建出圖10顯示的進(jìn)化樹(shù)。數(shù)據(jù)表明PDGF-C同源結(jié)構(gòu)域與VEGF-C和VEGF-D的PDGF/VEGF-同源結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)。
正如圖11所示，將來(lái)源于幾種含CUB的蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示人和鼠PDGF-C的簡(jiǎn)單CUB結(jié)構(gòu)域有顯著的相同性，同大多數(shù)相近的CUB結(jié)構(gòu)域相比也有同樣的結(jié)果。來(lái)源于人BMP-1，具有3個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO20-22)的序列和具有2個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域(CUB1-2)(SEQ ID NO分別是23和24)的人NP-1的序列圖中也有顯示。間隙被引入以優(yōu)化比較。該比較用J.Hein的方法(Methods Enzymol.，1990 183 626-45)和PAM250殘基權(quán)重表而得到。
圖12顯示了在幾種人的組織中的PDGF-C轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)產(chǎn)物的Northen雜交的分析結(jié)果。該分析表明PDGF-C由一個(gè)主要的大約為3.8-3.9kb的轉(zhuǎn)錄物和一個(gè)次要的2.8kb的轉(zhuǎn)錄物編碼所得。右邊的數(shù)目指的是mRNA(用kb表示)的大小。PDGF-C的組織表達(dá)由已經(jīng)商業(yè)化的MTN技術(shù)檢測(cè)(Clontech)。該雜交檢測(cè)可根據(jù)供應(yīng)商的指導(dǎo)進(jìn)行，在68℃使用ExpressHyb溶液溫育一個(gè)小時(shí)(高度嚴(yán)格條件)，用來(lái)源于如上所述篩選出的胎兒肺cDNA文庫(kù)的353bp的hPDGF-C EST探針進(jìn)行檢測(cè)。該雜交隨后在含有0.05％SDS的50℃ 2X SSC清洗30分鐘，然后再在含有0.1％的SDS的50℃ 0.1X SSC溶液中清洗40分鐘。然后將該雜交轉(zhuǎn)到膜上，在-70℃曝光。雜交結(jié)果顯示PDGF-C轉(zhuǎn)錄物在心臟，肝，腎，胰腺和卵巢中最豐富，而在其它的組織中，諸如胎盤(pán)，骨骼肌，前列腺，其含量水平很低。而在脾臟，結(jié)腸，外周血液白細(xì)胞中PDGF-C含量低于可檢測(cè)的水平。
圖13顯示由低氧引起的PDGF-C mRNA的表達(dá)的調(diào)節(jié)狀況。Marker(用kb表示)位于下面的面版的左邊。估計(jì)的PDGF-C mRNAs大小顯示于上面面板的左邊(分別為2.7和3.5kbs)。為了調(diào)查PDGF-C是否受低氧誘導(dǎo)，將培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞暴露于低氧條件下分別為0，4，8，24小時(shí)。使用寡聚-dT纖維素親和層析純化法將Poly(A)＋mRNA從細(xì)胞中分離出來(lái)。分離出的mRNA在12％的瓊脂糖中電泳，每道上樣4μg mRNA，然后進(jìn)行Northern雜交，即和PDGF-C的探針雜交。這兩條帶的大小一方面由將同樣的濾膜和hVEGF、hVEGF-B和hVEGF-C探針的混合物雜交而決定(Enholmet al.Oncogene，1997 14 2475-2483)，另一方面依據(jù)已知的mRNA的大小的插值而決定。圖13中顯示的結(jié)果表明PDGF-C在人皮膚成纖維細(xì)胞中不受低氧的調(diào)節(jié)。
圖14顯示人腫瘤細(xì)胞系中的PDGF-C mRNA的表達(dá)。為了調(diào)查是否PDGF-C在人腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)，從幾種已知的腫瘤細(xì)胞系中分離出Poly(A)＋mRNA，然后進(jìn)行12％的瓊脂糖電泳，再通過(guò)和PDGF-C探針雜交的Northem雜交方法進(jìn)行分析。圖14的顯示的結(jié)果表明PDGF-C mRNA在幾種類型的人腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)，諸如JEG3(人絨毛膜癌，ATCC #HTB-36)，G401(Wilms氏腫瘤，ATCC#CRL-1441)，DAMI(成巨核細(xì)胞白血病)，A549(人肺癌，ATCC #CCL-185)和HEL(人紅白血病，ATCC #TID-180)。應(yīng)該注意到可以通過(guò)抑制PDGF-C而抑制這些PDGF-C表達(dá)的腫瘤的進(jìn)一步生長(zhǎng)。同樣，也可檢測(cè)PDGF-C的表達(dá)作為一種鑒定特異的腫瘤類型的方法。
實(shí)施例1針對(duì)人PDGF-C的特異性抗肽抗體的產(chǎn)生兩條合成的肽段被用于產(chǎn)生針對(duì)人PDGF-C的抗體。第一條合成肽對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)PDGF-C的N-端的29-48殘基，其中包括N-端和C-端的額外的半胱氨酸殘基CKFQFSSNKEQNGVQDPQHERC(SEQID NO31)。第二條合成肽對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)PDGF-C內(nèi)部區(qū)域的殘基230-250，其中包括位于C-端的額外的半胱氨酸殘基GRKSRVVDLNLLTEEVRLYSC(SEQ ID NO32)。根據(jù)供應(yīng)商的指導(dǎo)這兩個(gè)合成肽通過(guò)使用N-琥珀酰亞氨基-1-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Pharmacia Inc.)而彼此連接到載體蛋白即拴孔糾纏血藍(lán)蛋白(KLH，Calbiochem)上，在磷酸緩沖鹽(PBS)中200-300毫克連接產(chǎn)物分別在弗氏完全佐劑中乳化并在兔的多位點(diǎn)進(jìn)行皮下注射。每隔兩周對(duì)兔用同樣量的在弗氏完全佐劑中乳化的連接產(chǎn)物進(jìn)行皮下注射。抽出收集兔血并用已知的標(biāo)準(zhǔn)方法制備血清。
實(shí)施例2哺乳動(dòng)物細(xì)胞中全長(zhǎng)的人PDGF-C的表達(dá)將編碼人PDGF-C的全長(zhǎng)cDNA克隆入具有SV40啟動(dòng)子的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，即pSG5(Stratagene，La Jolla，CA)。使用DEAE-葡聚糖將由此載體轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞收集，用沒(méi)有插入cDNA的pSG5載體來(lái)作陰性對(duì)照。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后向轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞中加入無(wú)血清培養(yǎng)基，在加入培養(yǎng)基24小時(shí)后收集含有分泌的蛋白質(zhì)的液體。這些液體在冰浴的三氯乙酸中作用30分鐘后易于產(chǎn)生聚沉，再用丙酮洗滌沉淀。該聚沉的蛋白在還原條件下溶解于SDS上樣緩沖液中并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用SDS-PAGE膠將蛋白分開(kāi)。分開(kāi)的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到Hybond濾膜上再用針對(duì)全長(zhǎng)PDGF-C的兔抗血清進(jìn)行免疫雜交，兔抗血清的制備如上所述。結(jié)合的抗體可用增強(qiáng)的化學(xué)熒光(ECL，Amersham Inc.)方法檢測(cè)出來(lái)。圖15顯示該免疫雜交的結(jié)果。樣品只是部分還原，人PDGF-C的單體為大小為55kDa(下面的帶)，而二聚體大小為100kDa(上面的帶)。該結(jié)果表明蛋白質(zhì)以完整的形式分泌并且在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的分泌的過(guò)程中沒(méi)有主要的蛋白水解過(guò)程。
實(shí)施例3在桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞中的全長(zhǎng)和截短的人PDGF-C的表達(dá)人PDGF-C的cDNA的(970bp)的全長(zhǎng)編碼部分可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的條件和程序使用Deep Vent DNA聚合酶(Biolabs)通過(guò)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。全長(zhǎng)PDGF-C擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性1分鐘，56℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘。5’端引物是5’CGGGATCCCGAATCCAACCTGAGTAG3’(SEQ ID NO33)，該引物包括一個(gè)BamHI位點(diǎn)(用下劃線表示)用于進(jìn)行克隆。3’端引物是5′GGAATTCCTAATGGTGATGGTGATGATGTTTGTCATCGTCATCTCCTCCTGTGCTCCCTCT3′(SEQ ID NO34)。該引物包括一個(gè)EcoRI位點(diǎn)(用下劃線表示)和由腸激酶位點(diǎn)產(chǎn)生的C-端6XHis tag的序列。另外，人PDGF-C的PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域(PVHD)的殘基230-345可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的條件和方法使用Deep VentDNA聚合酶(Biolabs)通過(guò)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。PDGF-C的PVHD的殘基230-345擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性1分鐘，56℃退火4分鐘，72℃延伸4分鐘。5’端引物是5’CGGATCCCG.GAAGAAAATCCAGAGTGGTG3′(SEQ ID NO35)該引物包括一個(gè)BamHI位點(diǎn)(下劃線)用于克隆。3’端引物是5′GGAATTCCTAATGGTGATGGTGATGATGTTTGTCATCGTCATCTCCTCCTGTGCTCCCTCT-3′(SEQ ID NO36)，該引物包括一個(gè)EcoRI位點(diǎn)(下劃線)和編碼由腸激酶位點(diǎn)產(chǎn)生的C-端6X His tag的序列。PCR產(chǎn)物用BamHI和EcoRI消化，然后克隆入桿狀病毒表達(dá)載體即pAcGP67A。證實(shí)PCR產(chǎn)物的正確序列克隆入載體可通過(guò)核酸測(cè)序得到驗(yàn)證。然后根據(jù)手冊(cè)(Pharminogen)將線性化的桿狀病毒DNA的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9。根據(jù)手冊(cè)(Pharminogen)在開(kāi)始大規(guī)模蛋白生產(chǎn)和純化之前先將重組桿狀病毒擴(kuò)增數(shù)次。
用重組桿狀病毒感染用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞(multiplicity of infection～7)。感染4天之后，收集含有重組蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，將其和Ni-NTA-瓊脂糖珠體(Qiagen)溫育。將珠體收集到柱中，使用高強(qiáng)度的洗脫條件50mM磷酸鈉緩沖液，pH8，含有300mM NaCl(洗脫緩沖液)，結(jié)合的蛋白質(zhì)可通過(guò)增加洗脫緩沖液中咪唑的濃度(從100mM到500mM)洗脫下來(lái)。洗脫的蛋白質(zhì)在還原和非還原的條件下通過(guò)12.5％的聚丙酰胺膠的SDS-PAGE進(jìn)行分析。在進(jìn)行免疫雜交的分析時(shí)，蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到Hybond濾膜，轉(zhuǎn)移時(shí)間45分鐘。
圖16A-C顯示全長(zhǎng)人的PDGF-C蛋白的分離過(guò)程及其部分特征。在圖16A中，通過(guò)使用針對(duì)N-端肽的抗肽抗體進(jìn)行雜交(如上述)，可以看見(jiàn)重組的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)。在圖16B中，通過(guò)使用針對(duì)內(nèi)部肽的抗肽抗體進(jìn)行雜交(如上述)，可以顯現(xiàn)出重組的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的條帶。通過(guò)使用考馬斯亮藍(lán)染色的方法可以看見(jiàn)分離得到的蛋白質(zhì)帶。通過(guò)使用考馬斯亮藍(lán)染色的方法可以看見(jiàn)分離得到的蛋白質(zhì)(圖16C)。圖16A-C底部的數(shù)字指的是用于將蛋白質(zhì)從Ni-NTA柱上洗脫下來(lái)的咪唑的濃度，以摩爾表示。圖16A-C顯示全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)在非還原條件下以99kDa的大小遷移，在還原條件下以55kDa的大小遷移。這一點(diǎn)表明全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)是二硫鍵交聯(lián)的二聚體。
圖17A-C顯示只含有PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域的人PDGF-C的截短形式的分離過(guò)程和部分特征的分析。在圖17A中，從Ni-瓊脂糖柱洗脫下來(lái)的片段的免疫雜交的分析表明蛋白質(zhì)可以根據(jù)咪唑的濃度變化洗脫下來(lái)(范圍100-500mM)。洗脫下的片段在非還原條件下分析，通過(guò)使用針對(duì)內(nèi)部肽的抗肽抗體進(jìn)行雜交(如上述)，可以看見(jiàn)截短后的人PDGF-C。圖17B顯示和圖17A中考馬斯亮藍(lán)染色的相同的片段。這一點(diǎn)表明該過(guò)程產(chǎn)生了高度純化的物質(zhì)以36kDa的大小進(jìn)行遷移。圖17C顯示還原條件和非還原條件下的截短的人PDGF-C蛋白質(zhì)以考馬斯亮藍(lán)染色后的條帶。數(shù)據(jù)表明蛋白質(zhì)是由二硫鍵連接的可分泌的二聚體，單體以24kDa的大小遷移。
實(shí)施例4全長(zhǎng)和截短的PDGF-C的受體結(jié)合性質(zhì)通過(guò)考察全長(zhǎng)的和截短的PDGF-C與可溶的Ig-融合蛋白的結(jié)合能力(其中該Ig-融合蛋白包括VEGF-1、VEGF-2或者VEGF-3的胞外結(jié)構(gòu)域)，從而可以了解全長(zhǎng)的和截短的PDGF-C與VEGF受體的相互作用狀況(Olofsson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998 9511709-11714)。這里融合蛋白是指VEGFR-1-Ig、VEGFR-2-Ig或者VEGFR-3-Ig，它們?cè)谌?93EBNA細(xì)胞中表達(dá)。所有的Ig融合蛋白都是人源VEGFRs。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞保溫24小時(shí)，用含0.2％的牛血清白蛋白的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)清洗，再繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。加入蛋白A-Sepharose珠體，可以使得融合蛋白從培養(yǎng)基中聚沉下來(lái)。這些珠體與100μl的10X結(jié)合緩沖液(5％牛血清白蛋白，0.2％Tween 20和10μg/ml的肝素)及900μl用以培養(yǎng)293個(gè)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基聯(lián)合使用，這293個(gè)細(xì)胞已經(jīng)用編碼含有全長(zhǎng)或截短的PDGF-C的哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)?；蛴脤?duì)照載體轉(zhuǎn)染過(guò)，然后通過(guò)代謝用35S-半胱氨酸和甲硫氨酸作標(biāo)記4-6小時(shí)。2.5小時(shí)以后，室溫下，用4℃下的曾含有磷酸緩沖鹽的結(jié)合緩沖液洗滌Sepharose珠體3次并在SDS-PAGE緩沖液中煮沸。結(jié)合到Ig-融合蛋白質(zhì)的標(biāo)記蛋白質(zhì)可以通過(guò)還原條件下的SDS-PAGE來(lái)分析。用磷光分析儀可以檢測(cè)出帶有放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)。在所有的這些分析中，放射性標(biāo)記的PDGF-C沒(méi)有顯示出與任何VEGF受體有相互作用。
下一步，通過(guò)分析他們與PDGF-BB競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到PDGF受體上的能力，以檢測(cè)全長(zhǎng)的和截短的PDGF-C結(jié)合到人PDGF-C受體α和β的能力。結(jié)合實(shí)驗(yàn)以可以穩(wěn)定表達(dá)人PDGF-C受體α和β的豬主動(dòng)脈內(nèi)皮-1細(xì)胞為對(duì)象(Erikson et al.，EMBO J，1992，11，543-550)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)的具體過(guò)程參照Heldin et al.，EMBO J，1988，71387-1393。不同濃度的全長(zhǎng)和截短人PDGF-C或人PDGF-BB與5ng/ml的125I-PDGF-BB在結(jié)合緩沖液(含有1mg/ml牛血清白蛋白的PBS)中混合。液體和放置于24孔培養(yǎng)板中的可以表達(dá)受體的PAE-1細(xì)胞冰浴90分鐘。在用結(jié)合緩沖液洗滌三遍以后，通過(guò)在20mM Tris-HCl，pH 7.5，10％甘油，1％Triton X-100中裂解細(xì)胞以抽提附著于細(xì)胞上的125I-PDGF-BB。細(xì)胞帶有的放射性用β計(jì)數(shù)器檢測(cè)。圖18顯示了125I標(biāo)記的PDGF-BB同源二聚體結(jié)合到表達(dá)PDGFα-受體的PAE-1細(xì)胞上的標(biāo)準(zhǔn)曲線。加入到保溫體系中的未標(biāo)記的過(guò)量的蛋白質(zhì)將有效的和放射性標(biāo)記的示蹤物的細(xì)胞結(jié)合相競(jìng)爭(zhēng)。
圖19顯示截短的PDGF-C有效的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到PDGF α-受體上，而全長(zhǎng)的PDGF則不然。全長(zhǎng)和截短的蛋白質(zhì)均不能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到PDGF β-受體上。
實(shí)施例5PDGF α-受體磷酸化為了驗(yàn)證是否PDGF-C引起了PDGF α-受體的磷酸化的增加，檢測(cè)了全長(zhǎng)和截短的PDGF-C結(jié)合到PDGF α-受體上和刺激磷酸化增加的能力。無(wú)血清培養(yǎng)的可以穩(wěn)定表達(dá)人PDGF α-受體的豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞與PBS在置于冰上90分鐘，該P(yáng)BS添加有1mg/ml BSA和10ng/ml PDGF-AA，100ng/ml全長(zhǎng)人PDGF-CC同源二聚體(flPDGF-CC)，100ng/ml的截短PDGF-CC同源二聚體(cPDGF-CC)，10ng/ml PDGF-AA和100ng/ml的截短PDGF-CC的混合物。全長(zhǎng)和截短PDGF-CC同源二聚體按上述方法制備。在加入多肽后60分鐘，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞(20mM tris-HCl，pH7.5，0.5％Triton-X100，0.5％脫氧膽酸，10mM EDTA，1mM orthvanadate，1mM PMSF，1％Trasylol)。PDGF α-受體可從澄清的溶胞產(chǎn)物中用針對(duì)人PDGF α-受體的兔抗血清進(jìn)行免疫聚沉(Eriksson et al.，EMBO J，1992 11 543-550)。聚沉的受體進(jìn)行SDS-PAGE。經(jīng)過(guò)SDS膠電泳之后，聚沉的受體轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，該膜用抗磷酸化酪氨酸抗體PY-20檢測(cè)(Transduction Laboratories)。然后該膜與連有辣根過(guò)氧化物酶的抗鼠抗體溫育。用增強(qiáng)的化學(xué)熒光法檢測(cè)結(jié)合的抗體(ECL，Amersham Inc.)。然后洗去膜上的物質(zhì)，再用PDGF α-受體兔抗血清進(jìn)行檢查，受體的量通過(guò)和連有辣根過(guò)氧化物酶的抗兔抗體溫育，再進(jìn)行檢測(cè)來(lái)決定。用增強(qiáng)的化學(xué)熒光法檢測(cè)結(jié)合的抗體(ECL，Amersham Inc.)。通過(guò)對(duì)膜上PDGF α-受體抗體的檢測(cè)顯示所有的泳道均含有等量的受體。實(shí)驗(yàn)中以PDGF-AA作為對(duì)照。圖20顯示的是截短的而不是全長(zhǎng)的PDGF-CC，它能夠有效的誘導(dǎo)PDGF α-受體酪氨酸磷酸化。這一點(diǎn)表明截短的PDGF-CC是潛在的PDGF α-受體的激動(dòng)劑。
實(shí)施例6PDGF-C對(duì)成纖維細(xì)胞的致有絲分裂作用圖21顯示截短和全長(zhǎng)的PDGF-CC對(duì)成纖維細(xì)胞的致有絲分裂活性。測(cè)活方法見(jiàn)Moil et al.，J.Biol.Chem.，1991 266 21158-21164。無(wú)血清培養(yǎng)的人包皮成纖維細(xì)胞與1ml無(wú)血清培養(yǎng)基溫育24小時(shí)，該培養(yǎng)基中含有0.2umCi[3H]的胸腺嘧啶核苷，又添加了1mg/mlBSA和3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml全長(zhǎng)PDGF-CC(flPDGF-CC)，截短的PDGF-CC(cPDGF-CC)或者PDGF-AA。在三氯乙酸聚沉后，[3H]胸腺嘧啶核苷滲入DNA的程度由β-計(jì)數(shù)器決定。結(jié)果表明，不是全長(zhǎng)的PDGF-CC，而是截短的PDGF-CC才是潛在的促成纖維細(xì)胞分裂劑。實(shí)驗(yàn)中以PDGF-AA作為對(duì)照。
PDGF-C不與任何已知的VEGF受體結(jié)合。PDGF-C是目前所知的唯一的能夠結(jié)合PDGF α-受體，并增加其磷酸化的VEGF家族成員。PDGF-C也是目前所知唯一的潛在的促成纖維細(xì)胞分裂的VEGF家族成員。這些特征表明PDGF-C的截短形式可能不是VEGF家族成員，而是一種新的PDGF。另外，全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)可能是潛在的生長(zhǎng)因子，需要經(jīng)過(guò)蛋白水解釋放出活性的PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域，它才被激活。已知的蛋白水解位點(diǎn)位于全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的殘基231-234(-R-K-S-R-)處的二元基序。通過(guò)比較鼠和人的PDGF-Cs，顯示該位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)是保守的(圖7)。優(yōu)選的蛋白酶包括因子X(jué)和腸激酶，當(dāng)然并不僅限于此。N-端CUB結(jié)構(gòu)域可以作為抑制結(jié)構(gòu)域，可用于在某些細(xì)胞外室定位潛在的生長(zhǎng)因子(例如細(xì)胞外骨架)，需要的話它可以通過(guò)特定的蛋白水解除去，例如在胚胎發(fā)育過(guò)程中、組織再生期間和組織重建過(guò)程，包括骨重建，活性血管生成，腫瘤惡化，腫瘤侵入，轉(zhuǎn)移形成和/或傷口愈合。
實(shí)施例7結(jié)合有截短的PDGF-C的PDGF受體通過(guò)檢測(cè)截短了的PDGF-C與分別表達(dá)PDGF α或β受體的豬主動(dòng)脈內(nèi)皮-1(PAE-1)細(xì)胞結(jié)合的能力，以評(píng)估截短了的PDGF-C和PDGFα和β受體之間的相互作用(Eriksson et al.，EMBO J，1992，11，543-550)。實(shí)驗(yàn)中具體的結(jié)合步驟可參見(jiàn)Heldin et al.，EMBOJ，1988，7 1687-1393。在10μl硼酸鈉緩沖液中，用Bolton-Hunter試劑(Amersham)對(duì)截短了的PDGF-C蛋白(5μg)進(jìn)行放射性標(biāo)記，使其放射活性達(dá)到4x105cpm/ng。將含有不同濃度的帶放射性標(biāo)記的截短的PDGF-C的結(jié)合緩沖液(1mg/ml牛血清白蛋白PBS)，加入24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)板每孔中均含有可表達(dá)受體的細(xì)胞PAE-1，置于冰上90分鐘，或加入未標(biāo)記的蛋白，置于冰上90分鐘。使用結(jié)合緩沖液洗滌三次，用裂解液(20mM Tris-HCl，pH7.5，10％甘油，1％Triton-100)裂解細(xì)胞以抽提結(jié)合在細(xì)胞上的125I-標(biāo)記的PDGF-C。細(xì)胞結(jié)合的放射性劑量由γ-計(jì)數(shù)器測(cè)定。在某些實(shí)驗(yàn)中加入了過(guò)量100倍的截短了的PDGF-C，并未檢測(cè)到非特異性的結(jié)合。所有的結(jié)合數(shù)據(jù)為三次實(shí)驗(yàn)的平均值，實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)的誤差在10-15％。如圖22所示，截短的PDGF-C僅僅與表達(dá)PDGF α受體的細(xì)胞結(jié)合，而不與表達(dá)PDGF β受體的細(xì)胞結(jié)合。當(dāng)用過(guò)量100倍的未標(biāo)記蛋白定量的替換帶放射性標(biāo)記的PDGF-C，結(jié)果顯示結(jié)合是特異性的。
實(shí)施例8蛋白水解酶對(duì)全長(zhǎng)PDGF-C影響為了證明全長(zhǎng)PDGF-C是否可以被特定的蛋白水解作用激活并從CUB結(jié)構(gòu)域釋放出和PDGF/VEGF同源的結(jié)構(gòu)域，使用不同的蛋白酶處理全長(zhǎng)蛋白。例如，在含有1mM CaCl2、1mM MgCl2和0.01％Tween 20的20mM Tris-HCl(PH7.5)中，使用濃度為每毫升2-3單位的纖維蛋白溶酶(Sigma)處理全長(zhǎng)PDGF-C，37攝氏度溫育1.5-4.5小時(shí)。釋放出的結(jié)構(gòu)域與上述在轉(zhuǎn)染細(xì)胞里產(chǎn)生的截短的PDGF-C在大小上基本是相同的。纖維蛋白溶酶消化的PDGF-C和未被消化的全長(zhǎng)PDGF-C在還原狀態(tài)下進(jìn)行SDS-PAGE膠。SDS-PAGE凝膠電泳后，分開(kāi)的蛋白被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，濾膜用兔抗多肽抗血清探針標(biāo)記，標(biāo)記位置在全長(zhǎng)蛋白的230—250位殘基處(殘基GRKSRVVDLNLLTEEVRLYSC(SEQ ID NO37)正好位于PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域的N-末端)。用增強(qiáng)的化學(xué)熒光法(ECL，Amersham Inc)可以檢測(cè)抗體的結(jié)合。圖23顯示了用55kDa未消化的全長(zhǎng)蛋白和纖維蛋白溶酶消化的全長(zhǎng)蛋白后的26-28kDa蛋白免疫雜交的結(jié)果。
實(shí)施例9PDGF α受體結(jié)合纖維蛋白溶酶消化的PDGF-C為了確定PDGF α受體與纖維蛋白溶酶消化的PDGF-C的相互作用，用纖維蛋白溶酶消化的PDGF-C結(jié)合豬主動(dòng)脈內(nèi)皮-1細(xì)胞表達(dá)的PDGF α受體，以檢測(cè)其結(jié)合能力(Eriksson et al.，EMBO J，1992，11 543-550)。受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)按例7步驟操作，用30ng/ml I125標(biāo)記的切斷的PDGF-C作為示蹤劑。如圖24所示，增加纖維蛋白溶酶消化的PDGF-C濃度，可以比未消化的全長(zhǎng)PDGF-C更有效地與PDGF α受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。這些實(shí)驗(yàn)顯示了全長(zhǎng)PDGF-C是一個(gè)潛在的生長(zhǎng)因子，不能與PDGF α受體相互作用，而受限于蛋白水解作用，使其釋放C-末端的PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域，這對(duì)于產(chǎn)生一個(gè)有活性的PDGF α受體的配體/激動(dòng)劑是必需的。
實(shí)施例10克隆并表達(dá)人PDGF-C CUB結(jié)構(gòu)域人PDGF-C基因中有430個(gè)堿基的cDNA片段編碼CUB結(jié)構(gòu)域(在全長(zhǎng)PDGF-C的第23-159位氨基酸殘基)，可以利用Deep VentDNA聚合酶(Biolabs)在標(biāo)準(zhǔn)條件和步驟下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該編碼序列5’端引物用5’cgggatcccgaatccaacctgagtag3’(SEQ ID NO38)。這個(gè)引物包含一個(gè)BamHI位點(diǎn)(下劃線)用以克隆。該編碼序列3’端引物用5’ccggaattcctaatggtgatggtgatgatgtttgtcatcgtcgtcgacaatgttgtagtg3’(SEQ ID NO39)。這條引物包含一個(gè)EcoRI位點(diǎn)(下劃線)，并且此序列C末端編碼一個(gè)由腸激酶位點(diǎn)連接的6x組氨酸標(biāo)記。擴(kuò)增后的PCR片段隨后被克隆到pACgp67A轉(zhuǎn)化載體上。CUB-pACgp67A表達(dá)框的正確序列由自動(dòng)核酸測(cè)序儀驗(yàn)證。然后依照制備的流程(Pharmingen)，表達(dá)載體與Baculogold線性化的桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)化到昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9中。重組的桿狀病毒在大規(guī)模蛋白生產(chǎn)之前被擴(kuò)增若干次，蛋白純化步驟根據(jù)手冊(cè)進(jìn)行(Pharmingen)。
用重組桿狀病毒感染用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞(multiplicity of infection～7)。感染72小時(shí)之后，收集含有重組蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，將其和Ni-NTA-瓊脂糖珠體(Qiagen)溫育。將珠體收集到柱中，使用高強(qiáng)度的洗脫條件50mM磷酸鈉緩沖液，pH8，含有300mM NaCl(洗脫緩沖液)，結(jié)合的蛋白質(zhì)可通過(guò)增加洗脫緩沖液中咪唑的濃度(從100mM到500mM)洗脫下來(lái)。洗脫的蛋白質(zhì)在還原和非還原的條件下通過(guò)聚丙酰胺膠的SDS-PAGE進(jìn)行分析。
圖25顯示了考馬斯亮藍(lán)染色凝膠后的結(jié)果。人PDGF-CUB結(jié)構(gòu)域是一個(gè)二硫鍵連接的同源二聚體，分子量在非還原狀態(tài)下約為55kD，而兩個(gè)約25和30kD的單體分別在還原狀態(tài)下存在。造成這種差異的原因可能是在CUB結(jié)構(gòu)域25和55位氨基酸這兩個(gè)葡糖酰胺化位點(diǎn)進(jìn)行了不同的N-連接的葡糖酰胺化反應(yīng)。圖左側(cè)是加有標(biāo)準(zhǔn)蛋白的泳道。
實(shí)施例11PDGF-C轉(zhuǎn)錄子在發(fā)育的小鼠胚胎中的定位為了更多了解PDGF-C的生物學(xué)功能，在小鼠胚胎的頭部(圖26A-26S)和尿生殖道(圖26T-26V)區(qū)域通過(guò)非放射性組織切片原位雜交技術(shù)觀測(cè)PDGF-C的表達(dá)狀況。非放射性組織切片原位雜交使用步驟和PDGF-A及PDGFR-α探針可參見(jiàn)Bostrom et al.，Cell，1996 85 863-873。PDGF-C探針源于小鼠PDGF-C cDNA。圖26A-26V所示的雜交模型是胚胎E16.5，但在E14.5、E-15.5、E-17.5也可見(jiàn)到相類似的模型。檢測(cè)探針作為對(duì)照，在雜交區(qū)段沒(méi)有顯示同樣的模型。
圖26A所示的是齒基(t)通過(guò)口腔的額部區(qū)段。箭頭所指的是口部外胚層PDGF-C表達(dá)的位點(diǎn)。同時(shí)標(biāo)明了舌(to)。圖26B-26D顯示了PDGF-C在發(fā)育齒管的上皮細(xì)胞中的表達(dá)。與發(fā)育中的腭外胚層一樣(圖26C右箭頭)，個(gè)別細(xì)胞在這個(gè)區(qū)域顯示出很強(qiáng)的標(biāo)記(圖26D箭頭)。圖26E顯示了通過(guò)眼部的額部區(qū)段，這里發(fā)現(xiàn)PDGF-C在毛囊(雙箭頭)和發(fā)育中的眼瞼處表達(dá)。同時(shí)標(biāo)明了視網(wǎng)膜(r)。在圖26F和26G中，PDGF-C的表達(dá)在發(fā)育中的毛囊根鞘外側(cè)上皮被發(fā)現(xiàn)。圖26H中，PDGF-C在發(fā)育的眼瞼中的表達(dá)被顯示。在發(fā)育開(kāi)口有個(gè)別帶有很強(qiáng)標(biāo)記信號(hào)的PDGF-C陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)。同時(shí)標(biāo)明了晶狀體(1)。圖26I，PDGF-C在發(fā)育淚腺中的表達(dá)用箭頭指出。圖26J，PDGF-C在發(fā)育中的外耳表達(dá)。表達(dá)見(jiàn)于外部聽(tīng)覺(jué)道(左箭頭)和表皮裂口處的早期耳廓(e)。圖26K和26L是PDGF-C在耳蝸的表達(dá)。表達(dá)見(jiàn)于半環(huán)狀管(26K箭頭處)。臨近發(fā)育中毛細(xì)胞的上皮細(xì)胞存在PDGF-C mRNA的極化分布(圖26L箭頭)。圖26M和26N是PDGF-C在口腔的表達(dá)。水平切片展示了頰上皮(圖26M箭頭)和形成中低唇頰與齒齦上皮(圖26N箭頭)間裂口中PDGF-C的表達(dá)。齒原基(t)和舌(to)同時(shí)被顯示出來(lái)。圖26O和26P顯示了水平切片上PDGF-C在發(fā)育鼻孔中的表達(dá)，。PDGF-C表達(dá)最強(qiáng)出現(xiàn)在上皮分層和正常管道形成之前(圖26O和26P箭頭)。發(fā)育中的鼻孔也被注明(n)。圖26Q-26S顯示了PDGF-C在發(fā)育唾液腺管中的表達(dá)。圖26Q是舌下腺。圖26R和26S顯示了上頜腺、唾液腺(sg)和唾液管(sd)。圖26T-26V顯示了PDGF-C在尿生殖道的表達(dá)。圖26T顯示了PDGF-C在發(fā)育中腎的后腎中胚層的表達(dá)。圖26U顯示了PDGF-C在尿道(ua)和發(fā)育中陰莖的上皮周圍的表達(dá)。圖26V顯示了PDGF-C在發(fā)育中輸尿管(u)的表達(dá)。
實(shí)施例12PDGF-C、PDGF-A和PDGFR-α在發(fā)育中腎的表達(dá)PDGF-C表達(dá)的最強(qiáng)處點(diǎn)之一在發(fā)育的腎中，因此PDGF-C、PDGF-A和PDGFR-α的表達(dá)也見(jiàn)于發(fā)育的腎中。圖27A-27F顯示了非放射性原位雜交的結(jié)果，(在未染的背景下用DIC光學(xué)檢測(cè)所染的藍(lán)色)顯示了E16.5時(shí)它們mRNA在腎中的表達(dá)，PDGF-C(圖27A和27B)、PDGF-A(圖27C和27D)及PDGFR-α(圖27E和27F)。在圖27B、27D和27F中的白色虛線描繪出了皮層邊界的輪廓。圖27A、27C和27E中短線表示250μM，圖27B、27D和27F中代表50μM。
PDGF-C表達(dá)見(jiàn)于后腎間質(zhì)(圖27Amm)，在稠合間質(zhì)中(圖27B箭頭)表達(dá)水平增強(qiáng)，稠合間質(zhì)可以經(jīng)過(guò)上皮轉(zhuǎn)化進(jìn)一步進(jìn)行管狀發(fā)育，位于輸尿管芽(ub)的兩側(cè)。PDGF-C在早期腎單位上皮聚集處(B箭頭處)保持較低水平的表達(dá)，在成熟腎小球(gl)到管結(jié)構(gòu)沒(méi)有表達(dá)。
PDGF-A表達(dá)沒(méi)有在這些早期聚集體中發(fā)現(xiàn)，但在管發(fā)育的較晚階段強(qiáng)烈表達(dá)(圖24C和24D)。PDGF-A在早期腎單位的上皮聚集體中表達(dá)(圖27D箭頭處)，但一旦腎單位進(jìn)一步發(fā)育，PDGF-A表達(dá)變得對(duì)發(fā)育的細(xì)尿管絆(圖27D箭頭)有限制性。在發(fā)育骨髓的細(xì)尿管絆(圖27C箭頭)中可見(jiàn)表達(dá)最為強(qiáng)烈。在分支輸尿管(u)和輸尿管芽(ub)中不見(jiàn)PDGF-A。
因此，PDGF-C和PDGF-A表達(dá)模式在發(fā)育腎單位中具有空間的和時(shí)間的差異。在腎單位發(fā)育的最早階段(間質(zhì)聚集體)表達(dá)PDGF-C，而在最晚階段(細(xì)尿管絆)表達(dá)PDGF-A。
PDGFR-α表達(dá)貫穿于發(fā)育中腎的間質(zhì)(圖27E和27F)，因此可以成為PDGF-C和PDGF-A的靶標(biāo)。在發(fā)育的腎中也表達(dá)PDGF-B，但僅發(fā)生在血管內(nèi)皮細(xì)胞里。PDGFR-β表達(dá)發(fā)生在周圍血管間質(zhì)，PDGF-B激活PDGFR-β這一過(guò)程是腎小球中的腎小球細(xì)胞重組的必須條件。
這些結(jié)果證明了PDGF-C表達(dá)發(fā)生在PDGFR-α表達(dá)位點(diǎn)附近，但不在PDGF-A或PDGF-B的表達(dá)位點(diǎn)附近。這顯示了PDGF-C可能在體內(nèi)通過(guò)PDGFR-α發(fā)揮作用，且不需要PDGF-A或PDGF-B的幫助。
既然在發(fā)育的腎中PDGF-C獨(dú)一無(wú)二的表達(dá)模式顯示其行使PDGFR-α激動(dòng)劑的功能，并且與PDGF-A和PDGF-B不相關(guān)，我們將胚胎16.5天的腎在組織學(xué)水平做了一個(gè)比較比較PDGFR-α敲除小鼠(圖28B和28F)和野生型小鼠的腎(圖28A和28C)，以及PDGF-A敲除小鼠(圖28D)和PDGF-A/PDGF-B全部敲除小鼠(圖28E)的腎。短線在圖28A和28B中表示250mm，在圖28C-F中表示50μm。
使用PDGF-A、PDGF-B和PDGFR-α雜合突變體(Bostron et al.，Cell，1996 85 863-873；Leveen et al.，Genes Dev.，1994 8 1875-1887；Soriano et al.，Development，1997 124 2691-70)構(gòu)建C57B16/129sv雜交系，再進(jìn)行雜交以產(chǎn)生純合突變胚胎。PDGF-A/PDGF-B雜合突變體被雜交來(lái)產(chǎn)生PDGF-A/PDGF-B敲除胚胎。由于PDGF-A-/-在E10前的高度致死性(Bostron et al.，Cell，1996 85 863-873)，雙基因敲除的E16.5胚胎所占比例在雜交系中少于1/40。除了PDGF-A/PDGF-B雙基因敲除的胚胎只獲得了一例外，其余純合的腎表現(xiàn)型胚胎每種基因型至少被驗(yàn)證了兩例。
有趣的是在PDGFR-α-/-的腎皮層中(圖28A箭頭和圖28F星號(hào))缺少間隙充質(zhì)，而在所有其它基因型中間隙充質(zhì)都存在(圖28C-E星號(hào))。分支輸尿管(u)和后腎間質(zhì)(mm)及它的上皮衍生物在所有突變體都表現(xiàn)正常。在PDGF-A/PDGF-B雙敲除胚胎中反常的腎小球反映出由于缺少PDGF-B導(dǎo)致腎小球中腎小球細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行重組。
這些結(jié)果顯示了PDGFR-α敲除中有一種腎的表現(xiàn)型沒(méi)有在PDGF-A或PDGF-A/PDGF-B敲除的個(gè)體中出現(xiàn)，因此反映了潛在的源于PDGF-C的信號(hào)缺失。表現(xiàn)型由發(fā)育中腎皮層標(biāo)記的間隙充質(zhì)缺失組成。在PDGFR-α-/-的腎中，這些細(xì)胞的缺失正是由于正常PDGFR-α陽(yáng)性細(xì)胞相鄰于PDGF-C的表達(dá)位點(diǎn)。
檢驗(yàn)PDGF-C功能的生物分析方法實(shí)驗(yàn)的實(shí)施是為了評(píng)估PDGF-C是否與PDGF-A、PDGF-B、VEGF、VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D有相似的可以影響結(jié)締組織細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)性，改變內(nèi)皮細(xì)胞功能，調(diào)節(jié)血管生成，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的作用。依據(jù)受體結(jié)合分布的研究，可以進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。I.對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞PDGF-C致有絲分裂為了檢測(cè)PDGF-C對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞致有絲分裂能力，PDGF-C多肽被引入含5％血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中，應(yīng)用含10％血清的培養(yǎng)基繁殖牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEs)。BAEs先被接種在24孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔中細(xì)胞密度在加PDGF-C前一天達(dá)到10,000。加入多肽3天以后用胰蛋白酶分離并計(jì)數(shù)。純化的VEGF在此實(shí)驗(yàn)中作為陽(yáng)性對(duì)照。
II.內(nèi)皮細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)A)內(nèi)皮細(xì)胞增殖內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)采用眾所周知的技術(shù)方法如Ferrara和Henzel，Nature，1989 380 439-443，Gospodarowics et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989 86 7311-7315，及Claffey et al.，Biochem.Biophys.Acts，1995 1246 1-9。
B)細(xì)胞附著實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PDGF-C對(duì)于多形核粒細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞的影響。
C)趨化性用標(biāo)準(zhǔn)Boyden腔趨化性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PDGF-C對(duì)趨化性的影響。
D)纖維蛋白溶酶原活化實(shí)驗(yàn)內(nèi)皮細(xì)胞被用來(lái)檢測(cè)PDGF-C對(duì)纖維蛋白溶酶原活性抑制生成的影響，采用Pepper et al.，Biochem.Biophy.Res.Commun.，1991 181902-906的方法。
E)內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)PDGF-C刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移并形成管狀的能力在如下實(shí)驗(yàn)中描述Montesano et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986 83 7297-7301。或者，三維膠原凝膠實(shí)驗(yàn)Joukov et al.，EMBO J.，1996 15 290-298中有所記述，或者可以在修飾的Boyden腔里用凝膠化膜(Glaser et al.，Nature，1980 288 483-484)。
III.血管生成實(shí)驗(yàn)PDGF-C在絨毛尿囊膜上誘導(dǎo)血管生成響應(yīng)的能力在下面實(shí)驗(yàn)記述Leung et al.，Science，1989 246 1306-1309?；蛘卟捎么笫蠼悄?shí)驗(yàn)Rastinejad et al.，Cell，1989 56 345-355；這是一個(gè)體內(nèi)血管生成實(shí)驗(yàn)可接受的方法，其結(jié)果能容易的轉(zhuǎn)化到其它體內(nèi)系統(tǒng)。
IV.傷口愈合PDGF-C刺激傷口愈合的能力可以用大多數(shù)臨床相關(guān)的可見(jiàn)模型檢測(cè)，如Schilling et al.，Surgery，1995 46 702-710中記述的或利用Hunt et al.，Surgery，1967 114 302-307。
V.促紅細(xì)胞生成系統(tǒng)使用促紅細(xì)胞生成素系統(tǒng)的特殊細(xì)胞群體進(jìn)行各種體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)。在小鼠體外干細(xì)胞分析的實(shí)驗(yàn)中，使用熒光細(xì)胞分選儀來(lái)純化細(xì)胞，結(jié)果比較令人滿意。
A)重新植入干細(xì)胞這些細(xì)胞能夠重新植入經(jīng)過(guò)致死照射的小鼠的骨髓，并有Lin-，Rhhl，Ly-6A/E+，c-kit+幾種表現(xiàn)型。在這些細(xì)胞中，單獨(dú)加入PDGF-C，或者將PDGF-C與其它因子一起加入細(xì)胞，隨后通過(guò)摻入的3H-胸腺嘧啶核苷測(cè)量細(xì)胞的增值。
B)晚期干細(xì)胞這些細(xì)胞有相對(duì)很小的骨髓再移植能力，但是能產(chǎn)生D13 CFU-S。這些細(xì)胞也有Lin-，Rhhl，Ly-6A/E+，c-kit+幾種表現(xiàn)型。在這些細(xì)胞中加入PDGF-C，然后注射到經(jīng)過(guò)致死照射的接受體中，對(duì)D13脾臟菌落計(jì)數(shù)。
C)祖代富集(Progenitor-Enriched)細(xì)胞這些細(xì)胞在體外對(duì)單一生長(zhǎng)因子的刺激有響應(yīng)，并具有Lin-，Rhhl，Ly-6A/E+，c-kit+幾種表現(xiàn)型。此實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑轵?yàn)證是否PDGF-C能直接作用于促紅細(xì)胞生成素的祖代細(xì)胞。在瓊脂培養(yǎng)基上，將PDGF-C與這些細(xì)胞溫育，7-14天后將存活的菌落計(jì)數(shù)。
VI.動(dòng)脈粥樣硬化平滑肌細(xì)胞在發(fā)育或動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生中扮演了重要的角色，需要它們的表現(xiàn)型從收縮狀態(tài)變成合成的狀態(tài)。通過(guò)影響平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和表現(xiàn)型的變化，巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和血小板都在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中起一定作用。用修飾的Rose腔，其中不同細(xì)胞類型被接種到對(duì)面，一個(gè)體外實(shí)驗(yàn)可以動(dòng)態(tài)測(cè)量增殖率和平滑肌細(xì)胞在多細(xì)胞環(huán)境下表現(xiàn)型的適應(yīng)性，由此它被用來(lái)檢測(cè)PDGF-C對(duì)平滑肌細(xì)胞的影響。
VII.轉(zhuǎn)移用Lewis的肺癌模型作PDGF-C抑制轉(zhuǎn)移能力的實(shí)驗(yàn)，例如用Cao et al.，J.Exp.Med.，1995 182 2069-2077的方法。
VIII.平滑肌細(xì)胞的遷移PDGF-C對(duì)平滑肌細(xì)胞和其它細(xì)胞類型遷移的影響可以用Koyama et al.，J.Biol.Chem.，1992 267 22806-22812記述的方法驗(yàn)證。
IX趨化性PDGF-C對(duì)成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞及其它細(xì)胞的影響可用Siegbahn et al.，J.Clin.Invest.，1990 85 916-920記述的方法驗(yàn)證。
X.在其它細(xì)胞類型中的PDGF-C
PDGF-C對(duì)增殖、分化和其它細(xì)胞類型功能的影響，例如肝細(xì)胞、心肌及其它細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞和成骨細(xì)胞等，可以用已知的技術(shù)方法驗(yàn)證，譬如通過(guò)體外培養(yǎng)基中攝取3H-胸腺嘧啶核苷。PDGF-C在這些和其它組織中的表達(dá)能被Northern斑點(diǎn)雜交或原位雜交技術(shù)測(cè)量。
XI.PDGF-C變異體和類似物的構(gòu)建PDGF-C是PDGF生長(zhǎng)因子家族的一員，它和PDGF-C家族其它成員保持高度相同的同源性。PDGF-C包含8個(gè)保守的半胱氨酸殘基，這是這個(gè)生長(zhǎng)因子家族的特點(diǎn)。這些保守的半胱氨酸殘基形成了鏈內(nèi)二硫鍵，產(chǎn)生了半胱氨酸結(jié)結(jié)構(gòu)，而內(nèi)鏈二硫鍵形成的蛋白二聚體也是PDGF生長(zhǎng)因子家族成員的特點(diǎn)。PDGF-C和酪氨酸蛋白激酶生長(zhǎng)因子受體相互作用。
對(duì)此蛋白結(jié)構(gòu)和與受體結(jié)合必須的活性位點(diǎn)及其相關(guān)聯(lián)的活力所知甚少，根據(jù)許多已知的PDGF家族生長(zhǎng)因子成員中活性位點(diǎn)和重要氨基酸殘基，設(shè)計(jì)PDGF-C活力突變體可以大大推進(jìn)人們?cè)谶@方面的認(rèn)識(shí)。
已發(fā)表的闡明PDGF生長(zhǎng)因子家族成員結(jié)構(gòu)和活力關(guān)系的文章有許多，其中關(guān)于PDGF內(nèi)容的有Oestman et al.，J.Biol.Chem.，1991266 10073-10077；Andersson et al.，J.Biol.Chem.，1992 267 11260-11266；Oefner et al.，EMBO J.，1992 11 3921-3926；Flemming et al.，Molecular and Cell Biol.，1993 13 4066-4076和Anderson et al.，GrowthFactors，1995 12 159-164；關(guān)于VEGF的包括Kim et al.，GrowthFactors，1992 7 53-64；Potgens et al.，J.Biol.Chem.，1994 269 32879-328885和Claffey et al.，Biochem.Biophys.Acta，1995 1246 1-9。這些文章中顯示，由于8個(gè)保守半胱氨酸殘基，PDGF生長(zhǎng)因子家組成員都展示了特征結(jié)狀折疊結(jié)構(gòu)和二聚作用，以至于在二聚體分子的每個(gè)末端都形成了三個(gè)暴露的環(huán)形區(qū)，預(yù)計(jì)活性受體結(jié)合位點(diǎn)就定位在這里。
基于以上信息，可以利用現(xiàn)有的生物技術(shù)人工設(shè)計(jì)PDGF-C突變體，即保留8個(gè)半胱氨酸殘基以形成結(jié)狀的折疊排列和二聚體，從而可能高度保存PDGF-C活力，同時(shí)僅僅通過(guò)保留或置換保守氨基酸殘基，檢測(cè)在蛋白結(jié)構(gòu)的環(huán)1、環(huán)2和環(huán)3區(qū)上可能的受體序列。
在蛋白結(jié)構(gòu)上形成特異靶位點(diǎn)的突變，是蛋白化學(xué)家研究方法中的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Kunkel et al.，Methods in Enzymol.，1987 154 367-382)。這些位點(diǎn)直接誘變?cè)赩EGF上的范例可見(jiàn)Potgens et al.，J.Biol.Chem.，1994 269 32879-32885和Claffey et al.，Biochem.Biophys.Acta，1995 1246 1-9。其實(shí)，位點(diǎn)直接突變是極其普通的，商業(yè)化的試劑盒很容易實(shí)現(xiàn)這些步驟(例如Promega 1994-1995商品目錄142—145頁(yè))。
對(duì)于PDGF-C突變體來(lái)說(shuō)，測(cè)試其對(duì)結(jié)締組織細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)及能動(dòng)活性，內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性，血管生成活性及創(chuàng)傷愈合的作用，可以用已建立好的篩選步驟迅速驗(yàn)證。例如對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂實(shí)驗(yàn)的類似步驟Claffey等已有描述(Biochem.Biophys.Acta，1995 1246 1-9)，可以直接使用。相似的，PDGF-C對(duì)其它細(xì)胞類型增殖、細(xì)胞分化和人新陳代謝方面的影響可以用人們現(xiàn)有的技術(shù)檢測(cè)。
上述對(duì)本發(fā)明的描述和所列舉的具體實(shí)例只起著解釋和說(shuō)明的作用，不起限制的作用，即不意味著本發(fā)明僅僅包含上述的內(nèi)容。本領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)人員可以在本發(fā)明的基本發(fā)明思想的基礎(chǔ)上，根據(jù)自己的需要，進(jìn)行一定的改變和修飾，所以，權(quán)利要求中涉及的源自于本發(fā)明的擴(kuò)展也屬于本發(fā)明的范疇。
序列表<110>烏爾夫·埃里克松卡琳·奧瑟李旭日安尼卡·蓬滕馬爾科·于特拉卡里·阿利塔洛阿恩·厄斯特曼卡爾—亨里克·黑爾丁克里斯特·貝茨霍爾茨<120>血小板衍生生長(zhǎng)因子C、其編碼DNA及其應(yīng)用<130>序列表<140>60/102，461<141>1998-09-30<150>60/108，109<151>1998-11-12<150>60/110，749<151>1998-12-03<150>60/113，002<151>1998-12-18<150>60/135，426<151>1999-05-21<150>60/144，022<151>1999-07-15<160>39<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Pro Xaa Cys Leu Leu Val Xaa Arg Cys Gly Gly Xaa Cys Xaa Cys Cys1 5 10 15<210>2<211>2108<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2ccccgccgtg agtgagctct caccccagtc agccaaatga gcctcttcgg gcttctcctg 60gtgacatctg ccctggccgg ccagagacga gggactcagg cggaatccaa cctgagtagt 120aaattccagt tttccagcaa caaggaacag aacggagtac aagatcctca gcatgagaga 180attattactg tgtctactaa tggaagtatt cacagcccaa ggtttcctca tacttatcca 240agaaatacgg tcttggtatg gagattagta gcagtagagg aaaatgtatg gatacaactt 300acgtttgatg aaagatttgg gcttgaagac ccagaagatg acatatgcaa gtatgatttt 360gtagaagttg aggaacccag tgatggaact atattagggc gctggtgtgg ttctggtact 420gtaccaggaa aacagatttc taaaggaaat caaattagga taagatttgt atctgatgaa 480tattttcctt ctgaaccagg gttctgcatc cactacaaca ttgtcatgcc acaattcaca 540gaagctgtga gtccttcagt gctaccccct tcagctttgc cactggacct gcttaataat 600gctataactg cctttagtac cttggaagac cttattcgat atcttgaacc agagagatgg 660cagttggact tagaagatct atataggcca acttggcaac ttcttggcaa ggcttttgtt 720tttggaagaa aatccagagt ggtggatctg aaccttctaa cagaggaggt aagattatac 780agctgcacac ctcgtaactt ctcagtgtcc ataagggaag aactaaagag aaccgatacc 840attttctggc caggttgtct cctggttaaa cgctgtggtg ggaactgtgc ctgttgtctc 900cacaattgca atgaatgtca atgtgtccca agcaaagtta ctaaaaaata ccacgaggtc 960cttcagttga gaccaaagac cggtgtcagg ggattgcaca aatcactcac cgacgtggcc 1020ctggagcacc atgaggagtg tgactgtgtg tgcagaggga gcacaggagg atagccgcat 1080caccaccagc agctcttgcc cagagctgtg cagtgcagtg gctgattcta ttagagaacg 1140tatgcgttat ctccatcctt aatctcagtt gtttgcttca aggacctttc atcttcagga 1200tttacagtgc attctgaaag aggagacatc aaacagaatt aggagttgtg caacagctct 1260tttgagagga ggcctaaagg acaggagaaa aggtcttcaa tcgtggaaag aaaattaaat 1320gttgtattaa atagatcacc agctagtttc agagttacca tgtacgtatt ccactagctg 1380ggttctgtat ttcagttctt tcgatacggc ttagggtaat gtcagtacag gaaaaaaact 1440gtgcaagtga gcacctgatt ccgttgcctt gcttaactct aaagctccat gtcctgggcc 1500taaaatcgta taaaatctgg attttttttt ttttttttgc tcatattcac atatgtaaac 1560cagaacattc tatgtactac aaacctggtt tttaaaaagg aactatgttg ctatgaatta 1620aacttgtgtc rtgctgatag gacagactgg atttttcata tttcttatta aaatttctgc 1680catttagaag aagagaacta cattcatggt ttggaagaga taaacctgaa aagaagagtg 1740gccttatctt cactttatcg ataagtcagt ttatttgttt cattgtgtac atttttatat 1800tctccttttg acattataac tgttggcttt tctaatcttg ttaaatatat ctatttttac 1860caaaggtatt taatattctt ttttatgaca acttagatca actattttta gcttggtaaa 1920tttttctaaa cacaattgtt atagccagag gaacaaagat ggatataaaa atattgttgc 1980cctggacaaa aatacatgta tntccatccc ggaatggtgc3tagagttgga ttaaacctgc 2040attttaaaaa acctgaattg ggaanggaan ttggtaaggt tggccaaanc ttttttgaaa 2100ataattaa 2108<210>3<211>345<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Met Ser Leu Phe Gly Leu Leu Leu Val Thr Ser Ala Leu Ala Gly Gln1 5 10 15Arg Arg Gly Thr Gln Ala Glu Ser Asn Leu Ser Set Lys Phe Gln Phe20 25 30Ser Ser Asn Lys Glu Gln Asn Gly Val Gln Asp Pro Gln His Glu Arg35 40 45Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn Gly Ser Ile His Ser Pro Arg Phe Pro50 55 60His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr Val Leu Val Trp Arg Leu Val Ala Val65 70 75 80Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu85 90 95Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu100 105 110Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr115 120 125Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile Arg Phe130 135 140Val Ser Asp Glu Tyr Phe Pro Set Glu Pro Gly Phe Cys Ile His Tyr145 150 155 160Asn Ile Val Met Pro Gln Phe Thr Glu Ala Val Ser Pro Ser Val Leu165 170 175Pro Pro Ser Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Asn Asn Ala Ile Thr Ala180 185 190Phe Ser Thr Leu Glu Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Glu Pro Glu Arg Trp195 200 205Gln Leu Asp Leu Glu Asp Leu Tyr Arg Pro Thr Trp Gln Leu Leu Gly210 215 220Lys Ala Phe Val Phe Gly Arg Lys Ser Arg Val Val Asp Leu Asn Leu225 230 235 240Leu Thr Glu Glu Val Arg Leu Tyr Ser Cys Thr Pro Arg Asn Phe Ser
245 250 255Val Ser Ile Arg Glu Glu Leu Lys Arg Thr Asp Thr Ile Phe Trp Pro260 265 270Gly Cys Leu Leu Val Lys Arg Cys Gly Gly Asn Cys Ala Cys Cys Leu275 280 285His Asn Cys Ash Glu Cys Gln Cys Val Pro Ser Lys Val Thr Lys Lys290 295 300Tyr His Glu Val Leu Gln Leu Arg Pro Lys Thr Gly Val Arg Gly Leu305 310 315 320His Lys Ser Leu Thr Asp Val Ala Leu Glu His His Glu Glu Cys Asp325 330 335Cys Val Cys Arg Gly Ser Thr Gly Gly340 345<210>4<211>1536<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4cgggtaaatt ccagttttcc agcaacaagg aacagaacgg agtacaagat cctcagcatg 60agagaattat tactgtgtct actaatggaa gtattcacag cccaaggttt cctcatactt 120atccaagaaa tacggtcttg gtatggagat tagtagcagt agaggaaaat gtatggatac 180aacttacgtt tgatgaaaga tttgggcttg aagacccaga agatgacata tgcaagtatg 240attttgtaga agttgaggaa cccagtgatg gaactatatt agggcgctgg tgtggttctg 300gtactgtacc aggaaaacag atttctaaag gaaatcaaat taggataaga tttgtatctg 360atgaatattt tccttctgaa ccagggttct gcatccacta caacattgtc atgccacaat 420tcacagaagc tgtgagtcct tcagtgctac ccccttcagc 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1320aaactgtgca agtgagcacc tgattccgtt gccttgctta actctaaagc tccatgtcct 1380gggcctaaaa tcgtataaaa tctggatttt tttttttttt tttgctcata ttcacatatg 1440taaaccagaa cattctatgt actacaaacc tggtttttaa aaaggaacta tgttgctatg 1500aattaaactt gtgtcatgct gataggacag actgga 1536<210>5<211>318<212>PRT<213>Homo sapiens<400>5Gly Lys Phe Gln Phe Ser Ser Asn Lys Glu Gln Asn Gly Val Gln Asp1 5 10 15Pro Gln His Glu Arg Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn Gly Ser Ile His20 25 30Ser Pro Arg Phe Pro His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr Val Leu Val Trp35 40 45Arg Leu Val Ala Val Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln Leu Thr Phe Asp50 55 60Glu Arg Phe Gly Leu Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile Cys Lys Tyr Asp65 70 75 80Phe Val Glu Val Glu Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile Leu Gly Arg Trp85 90 95Cys Gly Ser Gly Thr Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser Lys Gly Asn Gln100 105 110Ile Arg Ile Arg Phe Val Ser Asp Glu Tyr Phe Pro Ser Glu Pro Gly115 120 125Phe Cys Ile His Tyr Asn Ile Val Met Pro Gln Phe Thr Glu Ala Val130 135 140Ser Pro Ser Val Leu Pro Pro Ser Ala Leu Pro 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site<400>39ccggaattcc taatggtgat ggtgatgatg tttgtcatcg tcgtcgacaa tgttgtagtg 60
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，包含具有與圖1、圖3或者圖5(分別為SEQ ID NO2、4和6)的序列至少85％相同性的多核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中序列的相同性是至少90％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中序列的相同性是至少95％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核酸是cDNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核酸是哺乳動(dòng)物的多核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其中所述核酸是鼠類的多核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的核酸分子，包含圖5的序列(SEQ ID NO6)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其中所述核酸是人類的多核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離的核酸分子，其中所述核酸包含圖1或者圖3的序列(分別為SEQID NO2和4)。
10.一種分離的核酸分子，它編碼一種多肽分子或其具有PDGF-C生物學(xué)活性的類似物或片段，該多肽分子的氨基酸序列與圖2(SEQ ID NO3)、圖4(SEQ ID NO5)中的氨基酸序列至少具有85％相同性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的分離的核酸分子，其中的氨基酸序列的相同性是至少90％。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的分離的核酸分子，其中的氨基酸序列的相同性是至少95％。
13.一種分離的核酸分子，它編碼的多肽分子的氨基酸序列包括以下的氨基酸序列PXCXXVXRCGGXXXCC(SEQID NO1)。
14.一種載體，包括權(quán)利要求1所述的核酸，該核酸與一段啟動(dòng)子序列可操縱相連。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的載體，其為真核載體。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的載體，其為原核載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的載體，其為質(zhì)粒。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的載體，其為桿狀病毒載體。
19.一種構(gòu)建表達(dá)多肽或多肽的具有PDGF-C生物學(xué)活性的類似物或片段的載體的方法，其中所述多肽的氨基酸序列與圖2(SEQID NO3)或圖6(SEQ ID NO7)的氨基酸序列至少有85％相同性，所述方法包括將權(quán)利要求1、10或者13所述的分離的核酸以與啟動(dòng)子可操縱相連的方式插入所述的載體中。
20.用權(quán)利要求14的載體轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染的一種宿主細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的宿主細(xì)胞，其為真核細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的宿主細(xì)胞，其為COS細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的宿主細(xì)胞，其為原核細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的宿主細(xì)胞，其為293EBNA細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求20所述的宿主細(xì)胞，其為昆蟲(chóng)細(xì)胞。
26.一種用載體轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，所述載體包含與一啟動(dòng)子可操縱相連的權(quán)利要求1所述核酸序列，從而所述的宿主細(xì)胞表達(dá)一種多肽或其具有PDGF-C生物學(xué)活性的類似物或片段，該多肽的氨基酸序列與圖2(SEQ ID NO3)或圖6(SEQ ID NO7)中的氨基酸序列具有至少85％的相同性。
27.一種分離的多肽或其具有PDGF-C生物學(xué)活性的類似物或片段，該多肽具有與圖2(SEQ ID NO3)或圖6(SEQ ID NO7)的氨基酸序列至少85％相同性的氨基酸序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的分離的多肽，其為鼠多肽。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的分離的多肽，其為人類多肽。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的分離的多肽，其具有刺激和/或增強(qiáng)表達(dá)PDGF-C受體的細(xì)胞的增殖和/或分化和/或生長(zhǎng)和/或運(yùn)動(dòng)的能力。
31.一種由一種多核苷酸表達(dá)產(chǎn)生的分離的多肽，所述多核苷酸包含與圖1、圖3或者圖5(SEQ ID NO2、4或6)的序列具有至少85％相同性的多核苷酸序列，或者所述多核苷酸是在嚴(yán)格條件下與上述的至少一條DNA序列雜交的多核苷酸。
32.一種分離的多肽，包括以下的特征性序列PXCXXVXRCGGXXXCC(SEQ ID NO1)。
33.一種分離的多肽二聚體，包含權(quán)利要求27所述的多肽。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的多肽二聚體，其為所述多肽的同二聚體。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的多肽二聚體，其為所述多肽與VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-A、PDGF-B或者PlGF形成的異二聚體。
36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的多肽二聚體，其為二硫鍵連接的二聚體。
37.一種藥物組合物，包含促進(jìn)細(xì)胞增殖有效量的 27、31或者32所述的多肽，以及選自VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-A、PDGF-B或PlGF中的至少一種其它生長(zhǎng)因子。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的藥物組合物，還包含肝素。
39.一種藥物組合物，包含促進(jìn)細(xì)胞增殖有效量的 27、31或者32所述的分離的多肽，以及至少一種藥物載體或者稀釋劑。
40.一種藥物組合物，包含刺激PDGF受體量的的 27、31或者32所述的分離的多肽，以及至少一種藥物載體或者稀釋劑。
41.一種藥物組合物，包含刺激結(jié)締組織或者創(chuàng)傷愈合有效量的權(quán)利要求27、31或者32所述的分離的多肽，以及至少一種藥物載體或者稀釋劑。
42.一種在測(cè)試樣品中擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的多核苷酸的裝置，所述裝置包含與權(quán)利要求1所述的核酸互補(bǔ)的至少一對(duì)引物。
43.一種在測(cè)試樣品中擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的多核苷酸的裝置，所述裝置包含一種聚合酶和與權(quán)利要求1所述的核酸互補(bǔ)的至少一對(duì)引物，用于通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增多核苷酸以便于將該多核苷酸與權(quán)利要求1所述的核酸進(jìn)行比較。
44.一種和權(quán)利要求27、31或32所述的多肽特異反應(yīng)的抗體。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的抗體，其是多克隆抗體。
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的抗體，其是單克隆抗體，或者F(ab’)2、F(ab’)、F(ab)片段或嵌合抗體。
47.根據(jù)權(quán)利要求45或46所述的抗體，其用可檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的抗體，其中所述可檢測(cè)的標(biāo)記是放射性同位素。
49.一種制備權(quán)利要求27、31或者32所述的多肽的方法，該方法包括以下步驟培養(yǎng)用載體轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，所述載體包含與啟動(dòng)子序列可操縱相連的編碼所述多肽的多核苷酸，從而編碼所述多肽的該核酸序列被表達(dá)；從所述宿主細(xì)胞中或者培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離所述多肽。
50.一種刺激哺乳動(dòng)物的結(jié)締組織生長(zhǎng)或者創(chuàng)傷愈合的方法，包括給予哺乳動(dòng)物有效量的權(quán)利要求27、31或者32所述的多肽。
51.一種產(chǎn)生有活性的PDGF-C截短形式的方法，包括表達(dá)權(quán)利要求69所述的包含編碼多肽的多核苷酸的表達(dá)載體的步驟。
52.一種調(diào)節(jié)PDGF-C的受體結(jié)合特異性的方法，包括如下步驟表達(dá)包含編碼如權(quán)利要求27、31和32所述多肽的多核苷酸的表達(dá)載體；并提供蛋白酶解量的至少一種酶，用以對(duì)表達(dá)的多肽進(jìn)行處理，得到PDGF-C的活性截短形式。
53.一種選擇性激活具有生長(zhǎng)因子活性的多肽的方法，包括如下步驟表達(dá)一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含一種多核苷酸，該多核苷酸編碼具有生長(zhǎng)因子活性的多肽、CUB結(jié)構(gòu)域和多肽與CUB結(jié)構(gòu)域之間的蛋白酶切位點(diǎn)；并提供蛋白酶解量的至少一種酶，用以對(duì)表達(dá)的多肽進(jìn)行處理，得到具有生長(zhǎng)因子活性的活性多肽。
54.根據(jù)權(quán)利要求27、31和32所述的分離的多肽，其包含具有氨基酸序列RKSR或者其結(jié)構(gòu)保守氨基酸序列的蛋白酶切位點(diǎn)。
55.根據(jù)權(quán)利要求10所述的核酸分子，該核酸分子編碼的多肽包含氨基酸序列為RKSR或者其結(jié)構(gòu)保守氨基酸序列的蛋白酶切位點(diǎn)。
56.一種分離的異二聚體，其包含VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-C、PDGF-A、PDGF-B或者PlGF的活性單體和與一個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域相連的PDGF-C活性單體。
57.一種分離的異二聚體，其包含PDGF-C活性單體和與一個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域相連的VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-C、PDGF-A、PDGF-B或者PlGF的活性單體。
58.根據(jù)權(quán)利要求56所述的異二聚體，進(jìn)一步包含在活性單體與CUB結(jié)構(gòu)域之間的蛋白酶切位點(diǎn)。
59.根據(jù)權(quán)利要求57所述的異二聚體，進(jìn)一步包含在活性單體與CUB結(jié)構(gòu)域之間的蛋白酶切位點(diǎn)。
60.一種分離的多核苷酸，其包含與圖1、圖3或圖5(SEQ IDNO2、4或6)的序列至少有85％相同性的多核苷酸序列，或者與至少一種所述DNA序列在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸。
61.一種增強(qiáng)哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞有絲分裂的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用促進(jìn)哺乳動(dòng)物的有絲分裂有效量的如權(quán)利要求27、31或32所述的多肽。
62.一種誘導(dǎo)PDGF-α受體活化的方法，包括加入刺激PDGF-α受體的量的如權(quán)利要求27、31或32所述的多肽。
63.一種抑制哺乳動(dòng)物中表達(dá)PDGF-C的腫瘤的腫瘤生長(zhǎng)的方法，包括對(duì)所述的哺乳動(dòng)物施用抑制PDGF-C的量的PDGF-C拮抗劑。
64.一種鑒定人類腫瘤特定類型的的方法，包括獲取腫瘤樣品，以及檢測(cè)其PDGF-C表達(dá)的步驟。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中特定的腫瘤類型為絨毛膜癌、維爾姆斯氏瘤、巨核細(xì)胞白血病、肺癌和紅白血病。
66.一種鑒定PDGF-C拮抗劑的方法，包括如下步驟將基本純化的PDGF-C活化截短形式制備物與檢測(cè)試劑混合；和利用任何適當(dāng)?shù)姆绞奖O(jiān)測(cè)對(duì)PDGF-C生物學(xué)活性的抑制。
67.一種鑒定PDGF-C拮抗劑的方法，包括如下步驟將基本純化的全長(zhǎng)PDGF-C制備物與檢測(cè)試劑混合；和利用任何適當(dāng)?shù)姆绞奖O(jiān)測(cè)對(duì)CUB結(jié)構(gòu)域從PDGF-C中的裂解的抑制。
68.根據(jù)權(quán)利要求27所述的分離的多肽，其中所述的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞或者神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
69.一種構(gòu)建載體的方法，該載體表達(dá)一種多肽，該多肽包含與圖2(SEQ ID NO3)或圖6(SEQ ID NO7)的第230至345位氨基酸殘基有至少85％相同性的氨基酸序列，所述方法包括將編碼所述氨基酸殘基的分離的核酸分子以與啟動(dòng)子可操縱相連的方式插入所述載體。
70.根據(jù)權(quán)利要求46所述的抗體，其中所述的單克隆抗體是人源抗體。
71.一種制備PDGF-C的活化截短形式的方法，該方法包括將包含編碼如權(quán)利要求27、31和32所述多肽的多核苷酸的表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)；并提供蛋白酶解量的至少一種酶，用以對(duì)表達(dá)的多肽進(jìn)行處理，得到PDGF-C的活化截短形式。
72.一種在腫瘤細(xì)胞侵襲正常細(xì)胞群體過(guò)程中抑制組織轉(zhuǎn)型的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用抑制PDGF-C的量的PDGF-C拮抗劑。
73.一種治療哺乳動(dòng)物纖維變性癥狀的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用抑制PDGF-C的量的PDGF-C拮抗劑。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述的纖維變性癥狀在肺、腎或者肝中發(fā)現(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及生長(zhǎng)因子PDGF/VEGF家族的一個(gè)新成員,PDGF－C,還涉及其編碼核苷酸序列,其生產(chǎn)方法,其抗體或其他拮抗劑,表達(dá)其的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞,含有其的藥物組合物,及其在醫(yī)藥和診斷方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P17/00GK1330664SQ99811565
公開(kāi)日2002年1月9日 申請(qǐng)日期1999年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月30日
發(fā)明者烏爾夫·埃里克松, 卡琳·奧瑟, 李旭日, 安尼卡·蓬滕, 馬爾科·于特拉, 卡里·阿利塔洛, 阿恩·厄斯特曼, 卡爾－亨里克·黑爾丁, 克里斯特·貝茨霍爾茨 申請(qǐng)人:路德維格癌癥研究所, 萊森希亞有限公司