專利名稱：尿酸氧化酶的制作方法
本申請(qǐng)要求1998年8月6日提交的、美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/095,489號(hào)的權(quán)利，通過(guò)引用將該申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容結(jié)合到本文中。
用由國(guó)立衛(wèi)生研究院給予的、撥款號(hào)為DK48529的美國(guó)政府資助，創(chuàng)造了在此公開(kāi)的本發(fā)明，在本發(fā)明中，美國(guó)政府有某些權(quán)利。
概括地說(shuō)，本發(fā)明涉及尿酸氧化酶(尿酸酶)蛋白和編碼它們的核酸分子。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及例如作為中間體而特別有用的尿酸酶蛋白，所述中間體用于制造免疫源性降低及生物利用度增加的、改進(jìn)的、修飾的尿酸酶。本發(fā)明優(yōu)選的、修飾的尿酸酶包括共價(jià)結(jié)合聚乙二醇或聚環(huán)氧乙烷的尿酸酶蛋白。因此，本發(fā)明提供尿酸酶蛋白、與這些蛋白特異性結(jié)合的抗體、編碼所述尿酸酶蛋白的核酸分子及其有用片段、包含所述核酸分子的載體、含有所述載體的宿主細(xì)胞以及使用和制造所述尿酸酶蛋白與核酸分子的方法。
背景在年齡超過(guò)40歲的男人中，痛風(fēng)是最普通的炎性關(guān)節(jié)疾病(Roubenoff 1990)。當(dāng)提高的血液尿酸水平(高尿酸血癥)導(dǎo)致在關(guān)節(jié)中發(fā)作形成尿酸單鈉一水合物的微晶體時(shí)，就發(fā)生痛苦的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。在時(shí)間方面，慢性高尿酸血癥也能在關(guān)節(jié)周圍、在軟組織中以及在某些器官里產(chǎn)生破壞性的結(jié)晶尿酸沉積物(痛風(fēng)石)(Hershfield 1996)。尿酸在尿中的溶解度有限，且如果過(guò)量排泄(高尿酸尿)，尿酸可引起腎結(jié)石(尿酸結(jié)石)。在患有某些惡性腫瘤、特別是白血病和淋巴瘤的患者中，顯著的高尿酸血癥和高尿酸尿(由于在化療期間增強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)換(turnover)和分解)造成急性阻塞性腎衰竭嚴(yán)重的危險(xiǎn)(Sandberg等，1956；Gold和Fritz1957；Cohen等，1980；Jones等，1990)。嚴(yán)重的高尿酸血癥和痛風(fēng)與出于不同起因的腎功能障礙有關(guān)，包括為了防止器官同種移植排斥的環(huán)孢菌素治療(West等，1987；Venkataseshan等，1990；Ahn等，1992；Delaney等，1992；George和Mandell1995)。
高尿酸血癥既可由尿酸生產(chǎn)過(guò)多而產(chǎn)生，又可由尿酸分泌不足而產(chǎn)生(Hershfield和Seegmiller1976；Kelley等，1989；Becker和Roessler1995)。如果高尿酸血癥是輕度的，則可以用飲食控制它；但當(dāng)宣告了高尿酸血癥且其與嚴(yán)重的臨床后果相關(guān)時(shí)，則需要用藥物治療它；或者用促進(jìn)尿酸排泄的促尿酸尿劑(如果腎功能降低則無(wú)效)，或者用阻斷尿酸鹽形成的黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇治療。在患有痛風(fēng)石性痛風(fēng)、腎功能不全、白血病和某些遺傳病的患者患者方面，別嘌呤醇是主要的治療依靠藥物。對(duì)高尿酸血癥的治療一般是有效且耐受性良好；然而，對(duì)于所有的常規(guī)療法，某些患有毀損外形、使人殘廢的痛風(fēng)石痛風(fēng)的患者是難治的(Becker1988；Fam1990；Rosenthal和Ryan1995)。此外，用別嘌呤醇治療的～2％的患者產(chǎn)生過(guò)敏性反應(yīng)，并且在～0.4％的患者中出現(xiàn)嚴(yán)重的超敏反應(yīng)綜合征(Singer和Wallace1986；Arellano和Sacristan1993)。這種常常威脅生命的綜合征可引起急性腎衰竭和肝衰竭、以及嚴(yán)重的皮膚損傷(毒性表皮壞死松解、剝脫性皮炎、多形紅斑、斯蒂文斯-約翰遜(Stevens-Johnson)綜合征)。而且，別嘌呤醇干擾用于治療白血病的藥物和用于防止器官同種移植排斥的藥物硫唑嘌呤和6-巰基嘌呤的代謝，在上述病癥中產(chǎn)生顯著高尿酸血癥并且可能引起嚴(yán)重的痛風(fēng)或威脅腎功能。
根本地，高尿酸血癥是在進(jìn)化過(guò)程中尿酸氧化酶(尿酸酶)的人基因突變失活的結(jié)果(Wu等，1989；Wu等，1992)。在非人類靈長(zhǎng)目動(dòng)物和其它哺乳動(dòng)物的肝過(guò)氧化物酶體中的活性尿酸酶將尿酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚰宜?+CO2和H2O2)；尿囊素的可溶性超過(guò)尿酸可溶性的80-100倍；并且由腎更有效地處理。在法國(guó)和意大利，已用從黃曲霉(Aspergillus flavus)制備的非腸道尿酸酶(Uricozyme,Clin-Mily,巴黎)治療與白血病化療有關(guān)的嚴(yán)重高尿酸血癥達(dá)20年以上(London和Hudson1957；Kissel等，1968；Brogard等，1972；Kissel等，1972；Potaux等，1975；Zittoun等，1976；Brogard等，1978；Masera等，1982)；并且在美國(guó)，已在近來(lái)的臨床試驗(yàn)中將所述尿酸酶運(yùn)用于白血病患者(Pui等，1997)。尿酸酶比別嘌呤醇具有更快的作用開(kāi)始(Masera等，1982；Pui等，1997)。在痛風(fēng)患者方面，尿酸酶輸注可以阻斷急性發(fā)作并減小痛風(fēng)石的體積(Kissel等，1968；Potaux等，1975；Brogard等，1978)。
雖然黃曲霉尿酸酶對(duì)在短暫的化療過(guò)程期間治療急性高尿酸血癥有效，但對(duì)于治療復(fù)發(fā)性痛風(fēng)或痛風(fēng)石性痛風(fēng)，每日輸注黃曲霉尿酸酶會(huì)是須認(rèn)真對(duì)待的缺點(diǎn)。另外，在產(chǎn)生抗尿酸酶抗體的患者體內(nèi)，黃曲霉尿酸酶的功效迅速減小(Kissel等，1968；Brogard等，1978；Escudier等，1984；Mourad等，1984；Sibony等，1984)；已發(fā)生了包括過(guò)敏性反應(yīng)的嚴(yán)重變應(yīng)性反應(yīng)(Donadio等，1981；Montagnac和Schillinger 1990；Pui等，1997)。對(duì)于長(zhǎng)期治療，顯然需要較長(zhǎng)效的、免疫源性較低的尿酸酶制劑。
用于使外源酶與蛋白酶以及免疫系統(tǒng)分離的一種方法包含將惰性且無(wú)毒的聚合物單甲氧基聚乙二醇(PEG)共價(jià)連接到蛋白的表面上(Harris和Zalipsky 1997)。首先顯示出在動(dòng)物中使用Mr～1,000至大于10,000的不同PEG，延長(zhǎng)了幾種外來(lái)蛋白的循環(huán)壽命，并減少了這幾種外來(lái)蛋白的免疫源性(Abuchowski等，1977a；Abuchowski等，1977b；Davis等，1981a；Abuchowski等，1984；Davis等，1991)。為了治療因ADA缺陷引起的重癥聯(lián)合免疫缺陷病(Hershfield等，1987)，在1990年，用Mr5000的PEG修飾的牛腺苷脫氨酶(ADA)(PEG-ADA,ADAGEN，由Enzon,Inc制造)成為第一種經(jīng)美國(guó)食品及藥品管理局批準(zhǔn)的PEG基團(tuán)化的(PEGylated)蛋白。在過(guò)去12年期間的經(jīng)驗(yàn)已顯示在用PEG-ADA長(zhǎng)期治療期間，于大多數(shù)患者中，通過(guò)靈敏的ELISA，可檢測(cè)到抗ADA的抗體；但沒(méi)有了變應(yīng)性反應(yīng)或超敏反應(yīng)；在少數(shù)產(chǎn)生抗ADA抗體的患者體中，出現(xiàn)了加速清除PEG-ADA，但這常常是短暫的效應(yīng)(Chaffee等，1992；Hershfield 1997)。應(yīng)該意識(shí)到患有ADA缺陷的患者的免疫功能在用PEG-ADA治療期間通常不變得正常(Hershfield 1995；Hershfield和Mitchell1995)。因而，發(fā)展用于長(zhǎng)期治療具有正常免疫功能的患者的PEG基團(tuán)化酶方面，免疫源性可能是一個(gè)更重要的問(wèn)題。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，免疫源性與通過(guò)注射抗原制劑(例如PEG修飾的蛋白或未修飾的蛋白)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答有關(guān)；而抗原性指的是抗原和先前存在的抗體的反應(yīng)?？偲饋?lái)說(shuō)，把抗原性和免疫源性稱為免疫反應(yīng)性。在先前的PEG-尿酸酶研究中，用各種各樣的方法評(píng)價(jià)了免疫反應(yīng)性；所述方法包括體外PEG-尿酸酶和使用的抗體的反應(yīng)，測(cè)定誘導(dǎo)的抗體合成，以及在重復(fù)注射后的加速清除率。
已表明PEG基團(tuán)化在動(dòng)物中減少真菌和豬的尿酸酶的免疫源性，并延長(zhǎng)這兩種尿酸酶的循環(huán)壽命(Chen等，1981；Savoca等，1984；Tsuji等，1985；Veronese等，1997)。在5個(gè)血尿酸正常的志愿人員中，PEG修飾的念珠菌屬(Candida)尿酸酶迅速將血清尿酸降低到不可探測(cè)的水平(Davis等，1981b)。使用由Enzon,Inc.生產(chǎn)的PEG基團(tuán)化的節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)尿酸酶，在同情的基礎(chǔ)上治療一位對(duì)別嘌呤醇過(guò)敏的患有淋巴瘤的患者，該患者表現(xiàn)出腎衰竭和顯著的高尿酸血癥(Chua等，1988；Greenberg和Hershfield 1989)。在大約兩周期間給予四次肌內(nèi)注射，在這短暫的期間，控制了高尿酸血癥，且通過(guò)ELISA在該患者的血漿中沒(méi)能檢測(cè)到抗尿酸酶的抗體。沒(méi)繼續(xù)進(jìn)行該制劑的進(jìn)一步應(yīng)用和臨床發(fā)展。
到此為止，還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出具有適當(dāng)長(zhǎng)的循環(huán)壽命和為了在長(zhǎng)期治療中安全及可靠的使用而充分減少了免疫源性的尿酸酶類型或PEG-尿酸酶類型。本發(fā)明的目的是提供一種改進(jìn)的尿酸酶類型，這種改進(jìn)的尿酸酶類型與PEG基團(tuán)結(jié)合能滿足這些要求。本發(fā)明是唯一的起源于哺乳動(dòng)物的重組尿酸酶，通過(guò)以一種方式突變已修飾了該尿酸酶；所述方式即已被證明增強(qiáng)PEG基團(tuán)化遮蔽潛在免疫源性表位的能力。
發(fā)明概述本發(fā)明總的目的是提供新的尿酸酶蛋白和編碼它們的核酸序列。
本發(fā)明的另一目的是提供純化重組產(chǎn)生的尿酸酶蛋白的方法，例如在本文中描述的那些。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種方法；即通過(guò)給予哺乳動(dòng)物包含本發(fā)明的尿酸酶蛋白的組合物，從而減少哺乳動(dòng)物體液中尿酸量的方法。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供針對(duì)本文描述的尿酸酶蛋白的抗體。
本發(fā)明的另一目的是提供包含本文描述的核酸序列的載體和宿主細(xì)胞，并提供運(yùn)用它們產(chǎn)生由所述核酸序列編碼的所述尿酸酶蛋白的方法。
本發(fā)明提供尿酸酶蛋白，可用所述尿酸酶蛋白生產(chǎn)基本上無(wú)免疫源性的PEG-尿酸酶；該P(yáng)EG-尿酸酶保留未修飾尿酸酶的全部或幾乎全部的尿酸分解活性。在本文以每毫克蛋白的國(guó)際單位(IU)表示尿酸分解活性，其中，把尿酸分解活性的一個(gè)國(guó)際單位定義為每分鐘消耗一個(gè)毫摩爾尿酸的酶量。
本發(fā)明提供已修飾的插入一個(gè)或更多個(gè)賴氨酸殘基的、哺乳動(dòng)物種的重組尿酸酶蛋白。當(dāng)用于本文時(shí)，重組蛋白指的是任一人工制造的蛋白，并且不同于天然產(chǎn)生的蛋白(即在僅僅具有特定的關(guān)注蛋白的天然基因之動(dòng)物的組織中產(chǎn)生的蛋白)。蛋白包括肽和氨基酸序列。本發(fā)明的重組尿酸酶蛋白可以是兩種或多種哺乳動(dòng)物蛋白、肽或氨基酸序列的嵌合體或雜種。在一個(gè)實(shí)施方案中，可用本發(fā)明制造一種哺乳動(dòng)物種的重組尿酸酶蛋白，該蛋白已被修飾，以將賴氨酸數(shù)目增加至這樣一種程度，使得在該重組尿酸酶蛋白的PEG基團(tuán)化后，PEG基團(tuán)化尿酸酶產(chǎn)物基本上有和未修飾的尿酸酶一樣的酶活性，并且該P(yáng)EG基團(tuán)化尿酸酶產(chǎn)物的免疫源性不是不可接受的。也設(shè)想了其中尿酸酶的氨基和/或羧基末端可能不存在的本發(fā)明尿酸酶的截短形式。最好是，不截短該尿酸酶到除去賴氨酸的程度。
普通技術(shù)人員將懂得綴合的尿酸酶-載體復(fù)合物不必包含如此多的鍵以致大大地減少所述尿酸酶的酶活性、或者幾乎沒(méi)什么鍵以致保持不可接受的免疫源性。最好是，與未修飾的尿酸酶蛋白相比，在綴合物更穩(wěn)定的同時(shí)，該綴合物能保留未修飾尿酸酶蛋白的至少約70％至約90％的尿酸分解活性，以致它在哺乳動(dòng)物血漿和/或血清中貯藏時(shí)，于生理溫度下保持其酶活性。保留至少約80％至約85％的尿酸分解活性倒是可接受的。此外，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述綴合物提供比未修飾尿酸酶蛋白大大減少的免疫源性和/或免疫反應(yīng)性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本文描述的尿酸酶蛋白，所述尿酸酶蛋白可通過(guò)將一無(wú)毒且無(wú)免疫源性的藥學(xué)上可接受的載體例如PEG經(jīng)共價(jià)鍵連接到至少一個(gè)包含于尿酸酶蛋白中的賴氨酸上而被修飾?？蛇x擇地，通過(guò)將尿酸酶蛋白經(jīng)由其氨基酸序列的、少于約10個(gè)的賴氨酸共價(jià)連接到一載體上，修飾該尿酸酶蛋白。設(shè)想了連接到2、3、4、5、6、7、8或9個(gè)賴氨酸的任一類為作可選擇實(shí)施方案。
本發(fā)明的尿酸酶蛋白是包括豬和狒狒肝尿酸酶蛋白的多個(gè)區(qū)段的重組分子。而且提供了一種修飾的狒狒序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種嵌合的豬-狒狒尿酸酶(PBC尿酸酶(SEQ ID NO:2))，所述嵌合的豬-狒狒尿酸酶包括豬尿酸酶(SEQ ID NO:7)的第1-225號(hào)氨基酸(aa)和狒狒尿酸酶(SEQ ID NO:6)的第226-304號(hào)氨基酸(也參見(jiàn)在圖5中的序列)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種嵌合的豬-狒狒尿酸酶(PKS尿酸酶)，所述嵌合的豬-狒狒尿酸酶包括豬尿酸酶的第1-288號(hào)氨基酸和狒狒尿酸酶的第289-304號(hào)氨基酸(SEQ ID NO:4)。也仔細(xì)考慮了PBC和PKS的截短的衍生物。優(yōu)選的截短形式是截短缺失掉6個(gè)氨基末端氨基酸或3個(gè)羧基末端氨基酸、或者其兩者的PBC和PKS；在SEQ ID NO:8(截短氨基端的PBC)、9(截短羧基端的PBC)、10(截短氨基端的PKS)和11(截短羧基端的PKS)中給出了代表性的序列。PBC尿酸酶、PKS尿酸酶以及它們的截短形式中每一種，具有比在已克隆的其它哺乳動(dòng)物尿酸酶中發(fā)現(xiàn)的賴氨酸多一至四個(gè)的賴氨酸。
本發(fā)明提供核酸(DNA和RNA)分子(序列)，包括分離形式、純化形式和/或克隆形式的核酸分子，它們編碼本文描述的尿酸酶蛋白和截短的蛋白。在SEQ ID NO:1(PBC尿酸酶)和SEQ ID NO:3(PKS尿酸酶)顯示了優(yōu)選的實(shí)施方案。
(表達(dá)和克隆)載體包括同樣由本發(fā)明提供的這些核酸分子。
此外，本發(fā)明提供含有這些載體的宿主細(xì)胞。
也提供特異性地結(jié)合到本發(fā)明尿酸酶的抗體。在檢測(cè)PBC或其它類似的嵌合蛋白方面，如果聯(lián)合使用針對(duì)豬尿酸酶氨基端部分的抗體和針對(duì)狒狒尿酸酶羧基端部分的抗體，則應(yīng)該是有用的。優(yōu)選地是，針對(duì)嵌合尿酸酶氨基端部分的抗體將不識(shí)別狒狒尿酸酶氨基端部分，并且類似地，針對(duì)嵌合尿酸酶羧基端部分的抗體將不識(shí)別豬尿酸酶羧基端部分。更優(yōu)選的是，提供特異性地結(jié)合PBC或PKS、但不結(jié)合天然蛋白的抗體，所述天然蛋白例如豬尿酸酶和/或狒狒尿酸酶。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可用本發(fā)明制備用于減少例如尿和/或血清或血漿的體液中尿酸量的藥用組合物；所述組合物至少包含一種本文描述的尿酸酶蛋白或尿酸酶綴合物以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
在用于減少哺乳動(dòng)物體液中的尿酸量的方法方面，也可以使用本發(fā)明。該方法包括將降低尿酸有效量的組合物給予哺乳動(dòng)物；該組合物包含本發(fā)明尿酸酶蛋白或尿酸酶綴合物以及載體、稀釋劑或賦形劑，所述載體、稀釋劑或賦形劑最好是藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。待治療的哺乳動(dòng)物最好是人。
所述給予步驟例如可以是通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)途徑的注射。升高的尿酸水平可以存在于血或尿中，并可與痛風(fēng)、痛風(fēng)石、腎功能不全、器官移植或惡性疾病有關(guān)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于從尿酸酶溶液中分離和或純化尿酸酶的方法，所述尿酸酶溶液包含來(lái)自例如一重組生產(chǎn)過(guò)程的、例如細(xì)胞和亞細(xì)胞的碎片。最好是，該純化方法利用哺乳動(dòng)物尿酸酶在低pH下的有限溶解性(Conley等，1979)；在大約pH7至大約pH8.5時(shí)，通過(guò)洗滌粗制重組體的提取物，除去大多數(shù)在這低pH范圍中溶解的蛋白；此后在緩沖液中溶解有活性的尿酸酶，優(yōu)選碳酸鈉緩沖液，在大約pH10-11的范圍，優(yōu)選約pH10.2。然后可以將溶解的活性尿酸酶上陰離子交換柱，所述柱例如Q瓊脂糖凝膠柱；用在大約pH8.5的緩沖液中的、從低到高的鹽梯度洗滌該柱，在這之后，通過(guò)用溶于大約pH10至pH11的且優(yōu)選大約pH10.2的碳酸鈉緩沖液中的氯化鈉梯度進(jìn)行洗脫，獲得純化的尿酸酶。在約pH10至大約pH11下，通過(guò)凝膠過(guò)濾層析，可以進(jìn)一步純化該酶。在該階段，通過(guò)降低pH至大約8.5或更低，從而選擇性地沉淀尿酸酶而不沉淀溶解性更強(qiáng)的污染物，可進(jìn)一步地純化該酶。接著，在低pH(7-8)洗滌后，在大約pH10.2下溶解該尿酸酶。然后，可用藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域已知的方法分析所述的尿酸酶制劑，所述方法例如高效液相層析(HPLC)、其它層析方法、光散射、離心和/或凝膠電泳中的任何一種。
附圖簡(jiǎn)述

圖1SDS-巰基乙醇聚丙烯酰胺凝膠電泳(12％的凝膠)分析。
圖2天然尿酸酶和PEG基團(tuán)化的PBC尿酸酶的循環(huán)壽命。
圖3血清尿酸酶活性與血清和尿的尿酸濃度的關(guān)系。
圖4在屢次注射后，運(yùn)行的尿酸酶活性水平(用血清測(cè)定的)的保持。
圖5顯示豬-狒狒嵌合尿酸酶(PBC尿酸酶)的推斷的氨基酸序列和包含突變R291K與突變T301S的豬尿酸酶(PKS尿酸酶)的推斷的氨基酸序列，且將它們與豬和狒狒的序列相比較。
圖6PKS和豬尿酸酶氨基酸序列的比較。
圖7PBC和PKS氨基酸序列的比較。
圖8PBC和豬尿酸酶氨基酸序列的比較。
圖9豬尿酸酶和D3H氨基酸序列的比較。
圖10PBC和D3H氨基酸序列的比較。
圖11-1和11-2:PKS cDNA編碼序列和豬尿酸酶cDNA編碼序列的Bestfit(GCG軟件)比較。
圖12-1和12-2:PKS cDNA編碼序列和狒狒尿酸酶cDNA編碼序列的Bestfit(GCG軟件)比較。
圖13-1和13-2:PBC cDNA編碼序列和豬尿酸酶cDNA編碼序列的Bestfit)(GCG軟件)比較。
圖14-1和14-2:PBC cDNA編碼序列和狒狒尿酸酶cDNA編碼序列的最符合(Bestfit(GCG軟件)比較。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供尿酸酶蛋白，對(duì)于水溶性聚合物與尿酸酶的改進(jìn)的尿酸酶綴合物，所述尿酸酶蛋白是有用的中間體；所述聚合物優(yōu)選聚乙二醇或聚環(huán)氧乙烷。當(dāng)用于本文時(shí)，如果不另外指出，則尿酸酶包括單獨(dú)的亞基以及天然的四聚體。
雖然人們沒(méi)獲得有活性的酶，但已從人肝臟RNA擴(kuò)增了尿酸酶mRNA轉(zhuǎn)錄物(Wu等，1992)。理論上，翻譯某些顯示人尿酸酶轉(zhuǎn)錄物是可能的，即使肽產(chǎn)物不是全長(zhǎng)的產(chǎn)物或者是不穩(wěn)定的；所述肽產(chǎn)物可以被呈遞抗原細(xì)胞加工，并且在測(cè)定對(duì)用于治療的外源尿酸酶的免疫學(xué)反應(yīng)方面，它們能起作用。在理論上，通過(guò)消除兩個(gè)已知的無(wú)義突變而重構(gòu)建和表達(dá)人尿酸酶cDNA是可能的。然而，自從引入第一個(gè)無(wú)義突變以來(lái)，在缺乏選擇壓力的情況下，很可能地有害的錯(cuò)義突變?cè)跀?shù)百萬(wàn)年間已積聚在人類的基因中(Wu等，1989；Wu等，1992)。識(shí)別并“改正”所有的突變從而獲得最大的催化活性和蛋白穩(wěn)定性會(huì)是非常困難的。
本發(fā)明人已意識(shí)到在推斷的人尿酸酶氨基酸序列與推斷的豬尿酸酶氨基酸序列之間(86％)、以及在推斷的人尿酸酶氨基酸序列與推斷的狒狒尿酸酶氨基酸序列之間(92％)，有著高度的同源性(相似性)(參見(jiàn)例如圖6至圖14的相似性的測(cè)定)；而人尿酸酶與黃曲霉尿酸酶之間的同源性(相似性)小于40％(Lee等，1988；Reddy等，1988；Wu等，1989；Legoux等，1992；Wu等，1992)。本發(fā)明提供重組產(chǎn)生的、來(lái)自兩種不同哺乳動(dòng)物的嵌合尿酸酶蛋白；與關(guān)系更遠(yuǎn)的真菌酶或細(xì)菌酶相比，所述嵌合尿酸酶蛋白被設(shè)計(jì)得對(duì)人存在較少的免疫反應(yīng)性。預(yù)期哺乳動(dòng)物尿酸酶衍生物的使用對(duì)于患者和其醫(yī)生是更可以接受的。
經(jīng)驗(yàn)表明活化的各種PEG，例如已用來(lái)制造PEG-ADA和用來(lái)修飾其它蛋白的活化的各種PEG，經(jīng)由氨基末端殘基的伯氨基(當(dāng)存在且未被封閉時(shí))和賴氨酸的ε-氨基與蛋白連接。這種策略是有用的，既因?yàn)榭梢杂脺睾偷姆磻?yīng)條件，又因?yàn)閹д姷馁嚢彼嶷呄蛴诙ㄎ辉诘鞍椎谋砻嫔?。上述的后者是重要的，因?yàn)閷?duì)于任一治療蛋白而言，PEG基團(tuán)化的所需效應(yīng)將部分依賴于PEG聚合物的特性(例如質(zhì)量、分支結(jié)構(gòu)或未分支結(jié)構(gòu)等等)以及與表位和結(jié)構(gòu)元件有關(guān)的蛋白的PEG連接位點(diǎn)的數(shù)目和分布；所述表位和結(jié)構(gòu)元件決定該蛋白的功能與清除。已想出了一種策略，即通過(guò)半選擇性地引進(jìn)新的、適合于可能的PEG添加的賴氨酸殘基，來(lái)增強(qiáng)PEG基團(tuán)化“遮蔽”表位并降低免疫源性的能力(Hershfield等，1991)。這種策略使用誘變，用賴氨酸密碼子取代選定的精氨酸的密碼子；這種取代保持帶正電，并且對(duì)表面可能性和抗原性的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)指標(biāo)具有最小影響(僅僅在已知氨基酸序列時(shí)有用)。
作為這種策略的一個(gè)實(shí)驗(yàn)性試驗(yàn)，使用了重組的大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶(EPNP)(Hershfield等，1991)。在3個(gè)位點(diǎn)引入從精氨酸到賴氨酸的取代，將每個(gè)亞基的賴氨酸數(shù)從14增加到17，而不改變催化活性。在用過(guò)量的二琥珀酰-PEG5000修飾了～70％可及NH2基團(tuán)后，純化的三重突變體保留了全部活性。
在PEG基團(tuán)化前與后的反應(yīng)性氨基的滴定暗示該三重突變體比野生型酶可以每個(gè)亞基多接受一條PEG鏈。在小鼠中，PEG基團(tuán)化既增長(zhǎng)野生型EPNP酶的循環(huán)壽命，又增長(zhǎng)突變型EPNP酶的循環(huán)壽命，從～4小時(shí)增加到大于6天。在以每周/每?jī)芍艿拈g隔進(jìn)行了一系列腹膜內(nèi)注射后，不但用未修飾的EPNP處理的所有小鼠，而且用PEG基團(tuán)化的野生型EPNP注射的16只小鼠中的10只小鼠(60％)，都產(chǎn)生了高水平的抗EPNP抗體，且使所述酶的循環(huán)壽命顯現(xiàn)出顯著的下降。比較起來(lái)，在用突變的PEG-EPNP處理的12只小鼠中，僅有2只小鼠(17％)產(chǎn)生快速清除；在這些小鼠中的低水平的抗體與該酶的循環(huán)壽命無(wú)關(guān)。因而在大量地降低免疫源性方面，這種策略是成功的；雖然在用活化的PEG處理后，僅僅修飾了3個(gè)新賴氨酸中的一個(gè)。
所述狒狒的尿酸酶亞基和豬的尿酸酶亞基各包括304號(hào)氨基酸，其中29個(gè)(即在大約10個(gè)殘基中有一個(gè))是賴氨酸。最初嘗試將兩個(gè)從精氨酸到賴氨酸的取代引進(jìn)到克隆的狒狒尿酸酶cDNA中，并在位置208對(duì)谷氨酸密碼子同樣地進(jìn)行賴氨酸的取代；已知在人尿酸酶基因中位置208為賴氨酸，這種嘗試導(dǎo)致表達(dá)出一種突變的狒狒蛋白，該蛋白的尿酸酶催化活性大大降低。從這實(shí)驗(yàn)中顯而易見(jiàn)的是在哺乳動(dòng)物DNA序列的精氨酸突變?yōu)橘嚢彼岷?，保持尿酸酶酶活性的能力是不可預(yù)言的。
隨后知道了狒狒尿酸酶中的第291號(hào)氨基酸殘基為賴氨酸，而豬中的相應(yīng)殘基是精氨酸。利用存在于兩種cDNA中的ApaⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)構(gòu)建一種嵌合尿酸酶，在該嵌合尿酸酶中，前225個(gè)氨基酸起源自豬cDNA，而羧基末端的79個(gè)起源自狒狒cDNA。所產(chǎn)生的豬-狒狒嵌合(PBC)尿酸酶(SEQ ID NO:2)具有30個(gè)賴氨酸，比任一“親代”酶還多一個(gè)賴氨酸。PBC尿酸酶另外的一個(gè)特征是其“狒狒”部分在79個(gè)氨基酸殘基中的4個(gè)不同于人尿酸酶；而在同一區(qū)域中，豬尿酸酶與人尿酸酶在10個(gè)氨基酸殘基上不一致。隨后構(gòu)建了一種修飾形式的PBC，該修飾形式保留了在第291號(hào)位置的外加賴氨酸，并且在其它方面僅僅由于在第301個(gè)殘基上絲氨酸對(duì)蘇氨酸的取代而不同于豬尿酸酶(“pigKS”尿酸酶(SEQ ID NO:4))。由于在前段描述的結(jié)果中，賴氨酸的幾種其它插入對(duì)活性是有害的；因而想不到是，當(dāng)與未突變的天然豬尿酸酶相比時(shí)，PBC和PKS嵌合尿酸酶是完全同樣有活性的，并且所述嵌合尿酸酶比未突變的天然狒狒尿酸酶的活性高大約四倍。
本發(fā)明提供一種重組的豬-狒狒嵌合尿酸酶，該酶由部分豬的肝尿酸酶序列和部分狒狒肝尿酸酶序列組成。這樣的嵌合尿酸酶的一個(gè)實(shí)例包含來(lái)自豬尿酸酶序列(SEQ ID NO:7)的前225個(gè)氨基酸和來(lái)自狒狒尿酸酶序列(SEQ ID NO:6)的最后79個(gè)氨基酸(豬-狒狒尿酸酶，或PBC尿酸酶；圖6和SEQ ID NO:2)。這樣的嵌合尿酸酶的另一個(gè)實(shí)例包含來(lái)自豬序列(SEQ ID NO:7)的前288個(gè)氨基酸和來(lái)自狒狒序列(SEQ ID NO:6)的最后16個(gè)氨基酸。因?yàn)樗龅暮笠恍蛄袃H僅在兩個(gè)位置不同于所述豬序列，即在第291號(hào)殘基上有賴氨酸(K)代替精氨酸且在第301號(hào)殘基上有絲氨酸(S)代替蘇氨酸，所以把這種突變體稱為pig-K-S或PKS尿酸酶。
也提供包含編碼本發(fā)明蛋白的核酸分子的(表達(dá)和克隆)載體。優(yōu)選的載體包括本文舉例說(shuō)明的那些載體。普通技術(shù)人員將意識(shí)到可以以合適的方向和適合于表達(dá)的正確讀框，將核酸分子插入到例如質(zhì)粒的表達(dá)載體中。如有必要，可以將所述核酸(DNA)連接到所需宿主識(shí)別的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)核苷酸序列上；盡管這樣的控制元件通常可用于本技術(shù)領(lǐng)域運(yùn)用且已知的表達(dá)載體中。然后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，可將該載體引入到宿主細(xì)胞中。通常，不是全部的宿主細(xì)胞都將被載體轉(zhuǎn)化。因此，挑選轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可能是必需的。本技術(shù)領(lǐng)域已知的一種這樣的選擇方法涉及將具有一些必需控制元件的、編碼一選擇標(biāo)記特征(例如抗生素抗性)的DNA序列摻入到表達(dá)載體中?？蛇x擇地，這樣的選擇特征的基因可以在另一個(gè)用來(lái)共轉(zhuǎn)化所需宿主細(xì)胞的載體中。所述載體也可以包含一適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，例如一種能夠在以此轉(zhuǎn)化的細(xì)菌宿主細(xì)胞例如大腸桿菌中表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和翻譯)DNA的原核啟動(dòng)子。許多表達(dá)系統(tǒng)在本技術(shù)領(lǐng)域中是可用的，且是已知的；它們包括細(xì)菌(例如大腸桿菌和枯草桿菌)、酵母(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、絲狀真菌(例如曲霉屬(Aspergillus))、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞。
合適的載體可包含諸如ColE1 ori之類的原核復(fù)制子，用于在例如一種原核生物中增殖。典型的原核載體質(zhì)粒是從Biorad Laboratories(Richmond CA)可得到的pUC18、pUC19、pUC322和pBR329以及從Pharmacia(Piscataway,NJ)可得到的pTcr99A和pKK223-3。一種典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞載體質(zhì)粒是可從Pharmacia(Piscataway,NJ)得到的pSVL。這載體使用SV40的晚期啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)克隆基因的表達(dá)，在產(chǎn)生T抗原的細(xì)胞例如COS-1細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)最高水平的表達(dá)。一種誘導(dǎo)型哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的實(shí)例是pMSG，同樣可得自Pharmacia。這種載體使用小鼠乳腺瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)克隆基因的表達(dá)。有用的酵母質(zhì)粒載體是pSR403-406和pSR413-416，且通常是可以從Stratagene Cloning Systems(LaJolla,CA)得到的。質(zhì)粒pSR403、pSR404、pSR405和pSR406為酵母整合型質(zhì)粒(Yip)，且摻入了酵母選擇標(biāo)記HIS3、TRP1,LEU2和URA3。質(zhì)粒pSR413-416是酵母著絲粒質(zhì)粒(Ycp)。
此外，本發(fā)明提供包含這些載體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括本文舉例說(shuō)明和描述的那些細(xì)胞。
可以經(jīng)由一生物學(xué)穩(wěn)定的、無(wú)毒的共價(jià)鍵，將本發(fā)明的尿酸酶蛋白與數(shù)量相對(duì)少的PEG鏈結(jié)合，來(lái)改進(jìn)所述蛋白的生物學(xué)半衰期和溶解性，并減少其免疫源性。這樣的鍵可包括氨基甲酸乙酯(氨基甲酸酯)鍵、仲胺鍵和酰胺鍵。適合于這樣結(jié)合的各種各樣的活化PEG可從Shearwater Polymers,Huntsville,AL購(gòu)買得到的。
同樣可以用本發(fā)明制備作為綴合物的尿酸酶蛋白的藥用組合物。這些綴合物基本上無(wú)免疫源性，并至少保留未修飾酶尿酸分解活性的70％，優(yōu)選80％且更優(yōu)選至少大約90％或更多。適合于用于本發(fā)明的水溶性聚合物包括直鏈和分支的聚乙二醇或聚環(huán)氧乙烷，通常將它們?nèi)糠Q為PEG。分支PEG的一個(gè)實(shí)例是美國(guó)專利5,643,575的主題。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)尿酸酶亞基中插入的賴氨酸的平均數(shù)在1和10之間。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，每個(gè)尿酸酶亞基中附加的賴氨酸數(shù)在2和8之間。正在了解的是附加的賴氨酸數(shù)不應(yīng)該如此之多以致成為對(duì)尿酸酶催化活性的一種損害。優(yōu)選通過(guò)尿酸酶蛋白的賴氨酸，連接這種綴合物的PEG分子；更優(yōu)選通過(guò)已引入到所設(shè)計(jì)蛋白的一部分中的一個(gè)或多個(gè)非天然賴氨酸，連接這種結(jié)合的PEG分子；天然情況下，所述的一部分在所述引入位置不含有賴氨酸。
本發(fā)明提供在尿酸酶蛋白上增加可用的、無(wú)害的PEG連接位點(diǎn)的方法，其中，以這樣一種方式將天然尿酸酶蛋白突變，使得在天然尿酸酶蛋白中至少引入一個(gè)賴氨酸殘基；最好是，該方法包括用賴氨酸取代精氨酸。
對(duì)于降低最好是人的哺乳動(dòng)物的血和/或尿中尿酸水平(即減少尿酸的量)，利用本發(fā)明的PEG-尿酸酶綴合物是有效的；因而，可以使用所述的PEG-尿酸酶綴合物對(duì)與疾病有關(guān)的升高的尿酸水平進(jìn)行治療，所述疾病包括痛風(fēng)、痛風(fēng)石、腎功能不全、器官移植和惡性疾病。
可以通過(guò)許多途徑中的任一種將PEG-尿酸酶綴合物引入到具有過(guò)高尿酸水平的哺乳動(dòng)物中，所述途徑包括口服、用灌腸劑或栓劑、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)和腹膜內(nèi)的途徑。Patton,JS,等，(1992)Adv.DrugDelivery Rev 8:179-228。
PEG-尿酸酶的有效劑量將取決于個(gè)體的尿酸水平和身材。在本發(fā)明這方面的一個(gè)實(shí)施方案中，按照變動(dòng)范圍從10μg到大約1g的劑量，給予藥學(xué)可接受的賦形劑或稀釋劑中的PEG-尿酸酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，給藥量大約在100μg和500mg之間。更優(yōu)選地，以在1mg和100mg之間的劑量，例如5mg、20mg或50mg，給予所述綴合尿酸酶。對(duì)于所述實(shí)施方案的劑量而表示出的質(zhì)量，指的是該綴合物中的蛋白量。
用常規(guī)技術(shù)可制備包含PEG-尿酸酶的藥物制劑，所述常規(guī)技術(shù)例如在Remington的Pharmaceutical Sciences,(1985)Easton,PA:MackPublishing Co.中描述的技術(shù)。用于制備注射溶液的合適賦形劑包括例如磷酸緩沖鹽溶液、含乳酸的林格氏(Ringer’s)溶液、水、多元醇和甘油。用于非腸道注射的藥用組合物包括藥學(xué)上可接受的無(wú)菌水性或非水液體、分散體、懸浮液、或乳液，以及用于恰好在使用前重新組成為無(wú)菌注射溶液或分散體的無(wú)菌粉劑。這些制劑可包含附加的成分，例如防腐劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、緩沖劑、抗氧化劑和稀釋劑。
也可以以控釋組合物的形式，提供用于植入到個(gè)體中的PEG-尿酸酶，以連續(xù)地控制血和尿中升高的尿酸水平?？梢院蜕飳W(xué)上的活性成分一起配制的、會(huì)被生物腐蝕的或可生物降解的材料包括例如聚乳酸、聚乙醇酸、再生膠原、聚-L-賴氨酸、藻酸鈉、吉蘭糖膠、脫乙酰幾丁質(zhì)、瓊脂糖、多層脂質(zhì)體和許多其它的常規(guī)緩釋型制劑。如果植入或注射這些材料，則這些材料逐漸地分解并釋放該活性物料到周圍組織中。例如，一種將PEG-尿酸酶包膠凝的方法包括公開(kāi)于美國(guó)專利第5,653,974號(hào)中方法，通過(guò)引用將其結(jié)合到本文中。在本發(fā)明中，明確地設(shè)想了會(huì)被生物腐蝕的制劑、可生物降解的制劑和其它緩釋型制劑的應(yīng)用。用于傳送PEG-尿酸酶的輸注泵的運(yùn)用和基質(zhì)包載系統(tǒng)的使用也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。也可以便利地把PEG-尿酸酶封入膠束或脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體封裝技術(shù)在本技術(shù)領(lǐng)域是眾所周知的；參見(jiàn)例如Lasic,D等，(Eds.)(1995)StelthLiposomes,Boca Raton,FL:CRC Press。
在冒著尿酸誘發(fā)的腎衰竭的高度危險(xiǎn)的患者(例如器官移植的接受者)中(參見(jiàn)Venkataseshan,VS等，(1990)Nephron 56:317-321)，以及在患有某些惡性疾病的患者中，本文描述的PEG-尿酸酶藥用組合物將減少對(duì)血液透析的需要。在大量積聚的結(jié)晶尿酸鹽(痛風(fēng)石)的患者中，與目前可利用的治療相比，這樣的藥用組合物將更快地改進(jìn)生活質(zhì)量。
下面的實(shí)施例闡明上面描述的不同方面；這些實(shí)施例無(wú)論如何不應(yīng)被認(rèn)作是限制本發(fā)明。實(shí)施例1A PBC尿酸酶cDNA、PKS尿酸酶cDNA和相關(guān)尿酸酶cDNA的構(gòu)建使用標(biāo)準(zhǔn)方法和由試劑制造商提供的合適的說(shuō)明，來(lái)制備細(xì)胞總RNA,PCR擴(kuò)增(美國(guó)專利第4,683,195號(hào)和第4,683,202號(hào)、第4,965,188號(hào)和第5,075,216號(hào))尿酸氧化酶cDNA，以及對(duì)這些cDNA克隆和測(cè)序(Erlich 1989；Sambrook等，1989；Ausubel1998)?；诎l(fā)表的編碼序列(Wu等，1989)，并運(yùn)用PRIME軟件程序(Genetics Computer Group,Inc.)，設(shè)計(jì)了用于豬和狒狒尿酸氧化酶的PCR引物(表1)。
表1用于尿酸氧化酶cDNA的PCR擴(kuò)增的引物
在所述引物的末端引入的限制性內(nèi)切酶序列(小寫(xiě)字母)為有義引物(豬和狒狒)，EcoRⅠ和NcoⅠ；反義引物(豬)，NcoⅠ、HindⅢ、XbaⅠ；反義引物(狒狒)，NcoⅠ。就狒狒有義引物來(lái)說(shuō)，用CAC(組氨酸)取代了出現(xiàn)于狒狒尿酸氧化酶中的第三個(gè)密碼子GAC(天冬氨酸)(Wu等，1992)；所述CAC即在人尿酸氧化酶假基因的編碼序列中該位置上存在的密碼子(Wu等，1992)。為此，已給由于使用這些引物而產(chǎn)生的重組狒狒尿酸氧化酶命名為D3H狒狒尿酸氧化酶。
用第一條鏈試劑盒(Pharmacia Biotech Inc.Piscataway,NJ)，逆轉(zhuǎn)錄來(lái)自豬和狒狒的肝臟的細(xì)胞總RNA。在一循環(huán)變溫加熱器中(Ericomp.SanDiego,CA)，用程序[95℃、30秒；55℃、30秒；70℃、60秒]，循環(huán)20次；繼之以[95℃、30秒；70℃、60秒]循環(huán)10次，來(lái)完成使用Taq DNA聚合酶(GibcoBRL,Life Technologies,Gaithersburg,MD)的PCR擴(kuò)增。用EcoRⅠ和HindⅢ消化所述尿酸氧化酶的PCR產(chǎn)物，并克隆到pUC18中(豬)；且也用TA克隆系統(tǒng)(Invitrogen,Carlsbad,CA)直接克隆所述尿酸氧化酶的PCR產(chǎn)物(豬和D3H狒狒)。將cDNA克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株XL1-Blue(Stratagene,La Jolla,CA)中。制備包含克隆的尿酸酶cDNA的質(zhì)粒DNA，并用標(biāo)準(zhǔn)的雙脫氧技術(shù)分析該cDNA插入片段序列。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法學(xué)，構(gòu)建了具有發(fā)表的尿酸氧化酶DNA編碼序列(除了在表Ⅰ里描述的狒狒尿酸氧化酶中的D3H取代外)的克隆，并在一系列的隨后步驟中檢驗(yàn)了所述克隆。
將包含全長(zhǎng)編碼序列的所述豬和D3H狒狒的cDNA如下地引入到pET表達(dá)載體(Novagen,Madison,WI)中。用NcoⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶從TA質(zhì)粒上切割下D3H狒狒尿酸酶cDNA，然后亞克隆到表達(dá)質(zhì)粒pET3d和pET9d的NcoⅠ和BamHⅠ克隆位點(diǎn)中。用EcoRⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶從一pUC質(zhì)?？寺∏懈钕氯L(zhǎng)的豬尿酸酶cDNA，并將其亞克隆到pET28b的EcoRⅠ和HindⅢ位點(diǎn)中。在從pET28b的NcoⅠ和BlpⅠ位點(diǎn)切下后，同樣把所述豬cDNA編碼序列引入到表達(dá)質(zhì)粒pET9d的NcoⅠ和BlpⅠ位點(diǎn)中。
通過(guò)從pET3d-D3H-狒狒克隆切除D3H狒狒尿酸酶cDNA的624bp的NcoⅠ-ApaⅠ限制性片段，然后用豬cDNA對(duì)應(yīng)的624bp的NcoⅠ-ApaⅠ限制性片段取代這D3H狒狒部分；構(gòu)建豬-狒狒嵌合(PBC)cDNA。所產(chǎn)生的PBC尿酸氧化酶cDNA包括與狒狒尿酸氧化酶密碼子226-304符合讀框的豬尿酸氧化酶密碼子1-225。
通過(guò)從pET3d-D3H-狒狒克隆切除D3H狒狒尿酸酶cDNA的864bp的NcoⅠ-NdeⅠ限制性片段，然后用豬cDNA對(duì)應(yīng)的864bp的NcoⅠ-ApaⅠ限制性片段取代這D3H狒狒部分；構(gòu)建豬-KS尿酸氧化酶(PigKS)cDNA。所產(chǎn)生的PKS尿酸氧化酶cDNA包括與狒狒尿酸氧化酶密碼子289-304符合讀框的豬尿酸氧化酶密碼子1-288。
在圖5和序列表中顯示了D3H狒狒尿酸氧化酶、豬尿酸氧化酶、PBC尿酸氧化酶和PKS尿酸氧化酶的氨基酸序列。運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備這些轉(zhuǎn)化子的各自的15％甘油貯存物，并將這些貯存物貯藏在-70℃。當(dāng)表達(dá)這些種中的每一種并分離重組酶時(shí)(表2)，所述豬尿酸酶、PBC嵌合尿酸酶和PigKS尿酸酶具有非常相似的比活，所述比活比重組狒狒尿酸酶的比活大約高4-5倍。在幾個(gè)其它的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)了這種等級(jí)。用幾種不同的方法制備的PBC尿酸酶的比活在2-2.5倍的范圍內(nèi)變化。
表2表達(dá)的哺乳動(dòng)物重組尿酸酶的比較
*用Lowry法測(cè)定蛋白。用分光光度法測(cè)定尿酸酶活性(Priest和Pitts1972)，在一1cm的含有11ml反應(yīng)混合物(0.1M四硼酸鈉，pH8.6,0.1mM尿酸)的石英比色杯中，于23-25℃進(jìn)行分析。根據(jù)在292nm的吸光度的減小來(lái)監(jiān)測(cè)尿酸的消失。尿酸酶的一個(gè)國(guó)際單位(IU)每分鐘催化1μmol的尿酸消失。
按照pET系統(tǒng)指南(Novagen,Madison WI)中所指導(dǎo)的，將在表2中顯示的4種尿酸酶cDNA-pET構(gòu)成物的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS轉(zhuǎn)化子接種于含有選擇性抗生素的LB瓊脂平板上(對(duì)于pET3d(PigKS)為羧芐青霉素和氯霉素；對(duì)于pET9d(PBC、豬、狒狒)為卡那霉素和氯霉素)。用單個(gè)的轉(zhuǎn)化子菌落接種5ml培養(yǎng)(LB加抗生素)，并將其在37℃培養(yǎng)3小時(shí)。然后，將各0.1ml的等分試樣轉(zhuǎn)移到100ml含有選擇性抗生素和0.1％乳糖(誘導(dǎo)尿酸酶表達(dá))的LB培養(yǎng)基中。在37℃生長(zhǎng)過(guò)夜后，將來(lái)自各培養(yǎng)基的各個(gè)0.5ml等分試樣的各細(xì)菌細(xì)胞提取到SDS-PAGE加樣緩沖液中；并通過(guò)SDS-巰基乙醇聚丙烯酰胺凝膠電泳分析它們；這證實(shí)在4種培養(yǎng)物的每一種中已表達(dá)了可比較水平的尿酸酶蛋白(結(jié)果未示出)。通過(guò)離心，收集來(lái)自每種100ml培養(yǎng)物的、剩下的細(xì)胞；并用PBS洗滌它們。接著，將所述細(xì)胞重新懸浮于25ml含有1mM AEBSF蛋白酶抑制劑(Carbiochem.San Diego,CA)的、pH7.4的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中；然后，在一細(xì)菌細(xì)胞破裂器(Microfluidics,Boston MA)中于冰上裂解所述的細(xì)胞。通過(guò)離心(20,190xg、4℃、15分鐘)，沉淀不溶物(包括尿酸酶)。用10ml PBS洗滌沉淀物兩次，然后用2ml pH10.2的1MNa2CO3于4℃將其提取過(guò)夜。用水將這提取物稀釋到10ml，然后離心(20,190xg、4℃、15分鐘)。接著測(cè)定尿酸酶活性和蛋白濃度。實(shí)施例2重組PBC尿酸酶的表達(dá)和分離(用4升的發(fā)酵罐制備)按照Novagen pET系統(tǒng)指南中所指導(dǎo)的，將來(lái)自甘油貯存物的pET3d-PBC尿酸酶轉(zhuǎn)化子接種于含有羧芐青霉素和氯霉素的LB瓊脂平板上。使用pET系統(tǒng)指南中推薦的方法，在一旋轉(zhuǎn)搖床上(250rpm)于37℃用LB-抗生素液體培養(yǎng)基制備從一單個(gè)菌落開(kāi)始的200ml接種物，以最大限度地保留pET質(zhì)粒。在OD525為2.4時(shí)，通過(guò)離心收集來(lái)自這200ml培養(yǎng)物的細(xì)胞，然后將細(xì)胞重新懸浮于50ml新鮮培養(yǎng)基中。把這懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有4升包含羧芐青霉素和氯霉素的SLBH培養(yǎng)基(在(Sadler等，1974)中描述了SLBH培養(yǎng)基的組成、以及發(fā)酵罐的設(shè)計(jì)和操作)的、高密度的發(fā)酵罐中。在O2下于32℃培養(yǎng)20小時(shí)后(OD525=19)，添加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至0.4mM，以誘導(dǎo)產(chǎn)生尿酸酶。在附加的6個(gè)小時(shí)之后(OD525=37)，通過(guò)離心(10,410xg、4℃、10分鐘)收集細(xì)菌細(xì)胞，用PBS將其洗滌一次，然后就在-20℃把它們冰凍貯藏。
在200ml PBS中重新懸浮所述細(xì)菌細(xì)胞(189克)；在用冰/鹽浴冷卻細(xì)菌細(xì)胞的同時(shí)，通過(guò)超聲處理(熱系統(tǒng)超聲處理器XL(Heat SystemsSonicator XL),CL型探頭，F(xiàn)armingdale,NY)裂解它們，即以100％的強(qiáng)度處理4次，每次突發(fā)聲波40秒，在兩次突發(fā)之間有1分鐘的休息。通過(guò)離心(10,410xg、4℃、10分鐘)，沉淀不溶于PBS的物質(zhì)(這物質(zhì)包括尿酸酶)；然后用200ml PBS洗滌沉淀物5次。將不溶于PBS的沉淀物中的尿酸酶提取到80ml pH10.2的、含有1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)和130μg/ml抑肽酶的1M Na2CO3中。通過(guò)離心(20,190xg、4℃、2小時(shí))除去不溶的碎片。在4℃進(jìn)行所有進(jìn)一步的純化步驟(在表3中概括了結(jié)果)。
用1mM PMSF稀釋所述pH10.2的提取物至1800ml(減少Na2CO3到0.075M)。將這稀釋液上樣于新鮮Q-瓊脂糖凝膠柱(2.6×9cm)(Pharmacia Biotech,Inc.,Piscataway,NJ)，該柱已用pH10.2的0.075MNa2CO3平衡。在加樣后，接連地用下述溶液洗滌該柱，所述溶液為1)pH10.2的0.075M Na2CO3，洗得直到流出物的A280吸光度達(dá)到本底為止；2)pH8.5的10mM NaHCO3，洗得直到流出物的pH下降到8.5為止；3)50ml的10mM NaHCO3(pH8.5)、0.15M NaCl；4)100ml的在10mM NaHCO3(pH8.5)中的、0.15M NaCl至1.5M NaCl的梯度；5)150ml的10mM NaHCO3(pH8.5)、1.5M NaCl；6)10mM NaHCO3,pH8.5；7)pH11的0.1M Na2CO3，洗得直到使流出物的pH升高到11為止。最后，用500ml在pH11的0.1M Na2CO3中的、從0至0.6M的NaCl梯度，洗脫尿酸酶。洗脫兩個(gè)A280吸收峰的活性，分開(kāi)合并所述兩個(gè)峰的活性物質(zhì)(級(jí)分A和級(jí)分B、表3)。然后，通過(guò)慢慢加入1M的乙酸，降低該pH到7.1，繼之以離心(7000xg、10分鐘)；來(lái)沉淀這些合并物里的每一種級(jí)分中的尿酸酶。將所產(chǎn)生的沉淀物溶解于50ml pH10.2的1M Na2CO3中，然后把它貯藏于4℃。
表3重組的豬-狒狒嵌合(PBC)尿酸酶的純化IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞糊狀物=189.6克
*在從該柱洗脫后，存在于級(jí)分A中的尿酸酶開(kāi)始自發(fā)地沉淀；因此，在純化的這階段測(cè)定的活性是低估的。實(shí)施例3重組PBC尿酸酶的小規(guī)模制備和PEG基團(tuán)化這個(gè)實(shí)施例表明可用純化的重組PBC尿酸酶制造PEG基團(tuán)化的尿酸酶。在這反應(yīng)中，所有的尿酸酶亞基都被修飾(圖1、第7道)，且保留了大約60％的催化活性(表4)。A．小規(guī)模PBC尿酸酶的表達(dá)和分離(表4、圖1)在一旋轉(zhuǎn)搖床上(250rpm)，于37℃培養(yǎng)4升用pET3d-PBC cDNA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS的培養(yǎng)物。在OD525為0.7時(shí)，用IPTG(0.4mM、6小時(shí))誘導(dǎo)該培養(yǎng)物。收獲細(xì)胞，然后于-20℃將其冰凍。通過(guò)凍融，使所述細(xì)胞(15.3克)破裂；然后用pH10.2的1M Na2CO3、1mMPMSF提取它們。離心(12,000xg、4℃、10分鐘)后，用水1:10地稀釋上清液(85ml)，然后，按照與實(shí)施例1中描述的方式相似的一種方式，將其上Q-瓊脂糖凝膠柱層析。通過(guò)使用PM30膜(Amicon,Beverly,MA)的加壓超濾，濃縮從這步驟合并的尿酸酶活性。在平衡了的SephacrylS-200柱(2.5×100cm)(Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)上層析該濃縮物，且用pH10.2的0.1M Na2CO3洗脫該濃縮物。如上述地合并含有尿酸酶活性的級(jí)分，然后通過(guò)加壓超濾將其濃縮。B．PEG基團(tuán)化讓在pH10.2的0.1M Na2CO3中的100mg濃縮的Sephacryl S-200PBC尿酸酶(5mg/ml,2.9μmol酶，84.1μmol賴氨酸)與2倍過(guò)量(PEG的摩爾數(shù)尿酸酶賴氨酸的摩爾數(shù))的PEG的活化形式于4℃反應(yīng)60分鐘；通過(guò)切向流滲濾，將PEG基團(tuán)化的尿酸酶與某些未反應(yīng)的PEG或水解的PEG分離。在這步驟中，用pH10.2的0.1M Na2CO31:10地稀釋該反應(yīng)物，并對(duì)3.5體積的pH10.2的0.1M Na2CO3滲濾，然后，對(duì)3.5體積的pH7.2的0.05M磷酸鈉、0.15M NaCl滲濾。這種過(guò)濾除菌的酶在4℃至少穩(wěn)定一個(gè)月。
表4重組豬-狒狒嵌合(PBC)尿酸酶的純化和PEG基團(tuán)化的概要
圖1顯示在重組豬-狒狒嵌合(PBC)尿酸酶的純化和PEG基團(tuán)化期間所得到的各級(jí)分的SDS-巰基乙醇聚丙烯酰胺凝膠電泳(12％的凝膠)分析。泳道1=分子量標(biāo)準(zhǔn)；2=未誘導(dǎo)的、用pET3d-PBC cDNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(大腸桿菌BL21(DE3)pLysS)的SDS提取物；3=IPTG誘導(dǎo)的、用pET-PBC cDNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的SDS提取物；4=粗制提取物(參見(jiàn)表5)；5=濃縮的Q-瓊脂糖凝膠尿酸酶合并物；6=濃縮的Sephacryl S-200尿酸酶合并物；7=PEG基團(tuán)化的Sephacryl S-200重組PBC尿酸酶。
表4中顯示的結(jié)果表明可以修飾純化的PBC尿酸酶，同時(shí)保留大約60％的催化活性。在這PEG基團(tuán)化反應(yīng)中，全部的尿酸酶亞基都被修飾(圖1泳道7)。在沒(méi)有展示的研究中，所述PEG基團(tuán)化的酶與未修飾的PBC尿酸酶具有類似的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(KM10-20μM)。重要地是，在生理pH下，所述修飾的酶比未修飾的酶的溶解性大得多(在PBS中大于5mg/ml對(duì)＜1mg/ml)。也可以凍干PEG基團(tuán)化的酶，然后，在pH7.2的PBS中重建，其活性損失最小。在其它的實(shí)驗(yàn)中，我們比較了PEG-PBC尿酸酶的這種制劑和黃曲霉尿酸酶臨床制劑的活性。在pH8.6的硼酸鹽緩沖液中，所述黃曲霉的酶的Vmax高10-14倍和KM高2倍。然而，在pH7.2的PBS中，所述PEG-PBC酶和未修飾的真菌酶在尿酸酶活性方面有小于2倍的差別。實(shí)施例4未修飾的尿酸酶和PEG基團(tuán)化的PBC尿酸酶在小鼠中的循環(huán)壽命圖2顯示天然的尿酸酶和PEG基團(tuán)化的PBC尿酸酶的循環(huán)壽命。用1個(gè)單位的天然尿酸酶(圓形)或PEG修飾的重組PBC尿酸酶(在實(shí)施例3中描述的制劑)(正方形)，腹膜內(nèi)注射各組小鼠(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只)。在指示的時(shí)候，從三只小鼠一組的各組小鼠中獲得血液，用于測(cè)定血清尿酸酶活性。與所述未修飾酶小于2小時(shí)的循環(huán)壽命比較，所述PEG基團(tuán)化的尿酸酶(描述于實(shí)施例3中)具有大約48小時(shí)的循環(huán)壽命(圖2)。實(shí)施例5本發(fā)明PEG基團(tuán)化的尿酸酶的功效圖3顯示了血清尿酸酶活性與血清及尿中的尿酸濃度的關(guān)系。在這實(shí)驗(yàn)中，一只純合的、尿酸酶缺陷的基因剔除小鼠(Wu等，1994)，在0小時(shí)和72小時(shí)，兩次接受0.4IU的、已PEG基團(tuán)化的重組PBC尿酸酶的注射。因?yàn)檫@些基因剔除小鼠和具有尿酸酶的正常小鼠不同，這些基因剔除小鼠如同人，在其血液和體液中具有高水平的尿酸，且在其尿中排泄出高水平的尿酸，所以在這實(shí)驗(yàn)中使用所述尿酸酶缺陷的基因剔除小鼠。這些高水平的尿酸對(duì)這些小鼠的腎臟引起嚴(yán)重的損害，這種損害常常是致命的(Wu等，1994)。
顯示于圖3的該實(shí)驗(yàn)證實(shí)腹膜內(nèi)注射重組PBC尿酸酶的PEG基團(tuán)化的制劑，導(dǎo)致血清中尿酸酶活性的增加，在有尿酸酶缺陷的小鼠中，這伴隨有血清尿酸濃度和尿的尿酸濃度的顯著下降。實(shí)施例6構(gòu)成物-載體復(fù)合物的無(wú)免疫源性將PEG基團(tuán)化的重組PBC尿酸酶重復(fù)地注射到純合的尿酸酶缺陷的小鼠中，卻沒(méi)有誘發(fā)加速清除；這與缺乏有意義的免疫源性相一致。通過(guò)ELISA證實(shí)了這一點(diǎn)。圖4顯示了重復(fù)注射后保持尿酸酶活性的循環(huán)水平(用血清測(cè)定的)。通過(guò)以6-10天的間隔腹膜內(nèi)注射，給予PEG基團(tuán)化的PBC尿酸酶。在每次注射后24小時(shí)，測(cè)定血清尿酸酶活性。實(shí)施例7突變引入的賴氨酸的共價(jià)鍵合純化的重組PBC尿酸酶的PEG基團(tuán)化應(yīng)導(dǎo)致PEG連接到新的賴氨酸(殘基291)上。在這實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)PEG基團(tuán)化可以修飾一種PBC尿酸酶的制劑。用本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法，可以確定是否已通過(guò)PEG基團(tuán)化修飾了包含所述新的賴氨酸(殘基291)的肽。
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* * * * * * *將在上面引用的所有文獻(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。
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KELLY,SUSAN J.<120>尿酸氧化酶<130>1579-267<140><141><160>11<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>915<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(915)<220><223>人工序列的描述PBC嵌合體<400>1atg gct cat tac cgt aat gac cac aaa aag aac gat gag gta gag ttt 49Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe1 5 10 15gtc cga act ggc tat ggg aag gat atg ata aaa gtc ccc cat att cag 96Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln20 25 30cga gat gga aaa tat cac agc att aaa gag gtg gca act tca gtg caa 144Arg Asp Gly Lys Tyr His Sar Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln35 40 45ctg act ttg agc tcc aaa aaa gat tac ctg cat gga gac aat tca gat 192Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp50 55 60gtc atc cct aca gac acc atc aag aac aca gtt aat gtc ctg gcg aag 240Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys65 70 75 80ttc aaa ggc atc aaa agc ata gaa act ttt gcc gtg act atc tgt gag 288Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu85 90 95cat ttc ctt tct tcc ttc aag cat gtc atc aga gct caa gtc tat gtg 336His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val100 105 110gaa gaa gtt cct tgg aag cgt ttt gaa aag aat gga gtt aag cat gtc 384Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys Mis Val115 120 125cat gca ttt att tat act cct act gga acg cac ttc tgt gag gtt gaa 432His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140cag ata agg aat gga cct cca gtc att cat tct gga atc aaa gac cta 480Gln Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile Mis Ser Gly Ile Lys Asp Leu145 150 155 160aaa gtc ttg aaa aca acc cag tct ggc ttt gaa gga ttc atc aag gac 528Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp165 170 175cag ttc acc acc ccc cct gag gtg aag gac cgg tgc ttt gcc acc caa 576Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln180 l85 190gtg tac tgc aaa tgg cgc tac cac cag ggc aga gat gtg gac ttt gag 624Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu195 200 205gcc acc tgg gac act gtt agg agc att gtc ctg cag aaa ttt gct ggg 672Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly210 215 220ccc tat gac aaa ggc gag tac tca ccc ccc gcg cag aag acc ctc tat 720Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr225 230 235 240gat atc cag gtg ccc ccc ccg agc cga gtt cct gag ata gaa gat atg 768Asp Ile Gln Val Lau Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met245 250 255gaa atc agc ctg cca aac att cac cac ccc aat ata gac atg tcc aaa 816Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Sar Lys260 265 270atg ggt ctg atc aac aag gaa gag gtc ttg ctg cca tta gac aat cca 864Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro275 280 285tat gga aaa att act ggt aca gtc aag agg aag ttg tct tca aga ctg 912Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu290 295 300tga 915305<210>2<21l>304<212>PRT<213>人工序列<400>2Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe1 5 10 15Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln20 25 30Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln35 40 45Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys65 70 75 80Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu85 90 95His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val100 l05 ll0Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val115 120 125His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu130 135 140Gln Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu145150 155 160Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp165 170 175Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln180 185 190Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu195 200 205Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gla Lys Phe Ala Gly210 215 220Pro Tyr Asp Lys GLy Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr225 230 235 240Asp Ile Gln Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met245 250 255Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys260 265 270Met Gly Leu Ile Asn Lys 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Gln Lys Thr Leu Tyr225 230 235 240Asp Ile Gln Val Leu Thr Leu Gly Gln Val Pro Glu Ile Glu Asp Met245 250 255Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys260 265 270Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro275 280 285Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu290 295 300<210>5<211>304<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述狒狒D3H<400>5Met Ala His Tyr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Leu Glu Phe1 5 10 15Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Lau His Ile Gln20 25 30Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln35 40 45Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp50 55 60Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys65 70 75 80Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu85 90 95Tyr Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val100 105 110Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val115 120 125His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr 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權(quán)利要求
1．一類蛋白，所述蛋白包括已修飾插入了一個(gè)或更多個(gè)賴氨酸殘基的、哺乳動(dòng)物物種的重組尿酸酶蛋白。
2．按照權(quán)利要求1的蛋白，其中所述重組蛋白是兩種或更多種哺乳動(dòng)物氨基酸序列的嵌合蛋白。
3．權(quán)利要求2的蛋白，其中所述重組尿酸酶嵌合蛋白由304個(gè)氨基酸組成，所述304個(gè)氨基酸的前225個(gè)氨基酸N-端部分是豬尿酸酶的第1-225號(hào)氨基酸，且所述304個(gè)氨基酸的剩下的79個(gè)氨基酸是狒狒尿酸酶的第226-304號(hào)氨基酸。
4．權(quán)利要求2的蛋白，其中所述重組尿酸酶嵌合蛋白由304個(gè)氨基酸組成，所述304個(gè)氨基酸的前288個(gè)氨基酸N-端部分是豬尿酸酶的第1-288號(hào)氨基酸，且所述304個(gè)氨基酸的剩下的16個(gè)氨基酸是狒狒尿酸酶的第289-304號(hào)氨基酸。
5．重組尿酸酶蛋白，所述重組尿酸酶蛋白選自SEQ ID NO:2、4、8、9、10和11。
6．編碼權(quán)利要求1的重組尿酸酶的、分離且純化的核酸分子。
7．編碼權(quán)利要求3的重組尿酸酶的、分離且純化的核酸分子。
8．編碼權(quán)利要求4的重組尿酸酶的、分離且純化的核酸分子。
9．編碼權(quán)利要求5的重組尿酸酶的、分離且純化的核酸分子。
10．具有SEQ ID NO:1的堿基序列的、權(quán)利要求9的、分離且純化的核酸分子。
11．具有SEQ ID NO:3的堿基序列的、權(quán)利要求9的、分離且純化的核酸分子。
12．包括權(quán)利要求1的核酸分子的載體。
13．包括權(quán)利要求9的核酸分子的載體。
14．包含按照權(quán)利要求12的載體的宿主細(xì)胞。
15．包含按照權(quán)利要求13的載體的宿主細(xì)胞。
16．給尿酸酶蛋白增加可用的、無(wú)害的PEG連接位點(diǎn)的方法，所述方法包括使尿酸酶突變，藉此在尿酸酶中至少引入一個(gè)賴氨酸殘基。
17．給尿酸酶蛋白增加可用的、無(wú)害的PEG連接位點(diǎn)的方法，所述方法包括使尿酸酶突變，藉此在尿酸酶中至少引入一個(gè)賴氨酸殘基來(lái)取代精氨酸。
全文摘要
概括地說(shuō),本發(fā)明涉及尿酸氧化酶(尿酸酶)蛋白和編碼它們的核酸分子。具體地說(shuō),本發(fā)明涉及特別有用的尿酸酶蛋白,例如作為中間體而特別有用的尿酸酶蛋白;所述中間體用于制造改進(jìn)的、修飾的、具免疫源性降低且增加生物利用度的尿酸酶蛋白。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1322243SQ99811738
公開(kāi)日2001年11月14日 申請(qǐng)日期1999年8月5日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月6日
發(fā)明者M·赫爾斯菲爾德, S·J·凱利 申請(qǐng)人:杜克大學(xué)