專利名稱：純化人乳頭瘤病毒樣顆粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備和純化乳頭瘤病毒(HPV)樣顆粒(VLP)的方法，該病毒樣顆?？捎米饕呙绯煞帧?br> 乳頭瘤病毒可以根據(jù)它們所感染的宿主而分類為不同種群。人乳頭瘤病毒(HPV)根據(jù)DNA序列同源性進(jìn)一步分為70多個(gè)型(綜述，參見乳頭瘤病毒與人類癌癥，H.Pfister(編輯)，CRC Press，Inc.，1990)。乳頭瘤病毒各型可能是型特異性免疫原，因?yàn)橐环N類型的乳頭瘤病毒感染的中和免疫不能免疫另一種類型的乳頭瘤病毒。
乳頭瘤病毒是無(wú)包膜二十面體小(50-60nm)DNA病毒，它編碼最多達(dá)8個(gè)早期基因和2個(gè)晚期基因。該病毒基因組可讀框(ORF)稱為E1-E7以及L1和L2，其中“E”表示早期基因而“L”表示晚期基因。L1和L2編碼病毒衣殼蛋白。早期基因(E)與其功能有關(guān)，如與病毒的復(fù)制以及細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)。
L1蛋白是主要衣殼蛋白，分子量為55-60kDa。L2蛋白是次要衣殼蛋白，按聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定，其預(yù)期分子量為55-60kDa，表觀分子量為75-100kDa。免疫學(xué)資料提示大部分L2蛋白在L1蛋白內(nèi)側(cè)。L2蛋白在不同乳頭瘤病毒之間是高度保守的，特別是C-末端的10個(gè)堿性氨基酸。L1可讀框在不同乳頭瘤病毒之間是高度保守的。
已用各種宿主制備重組L1蛋白，而且在適當(dāng)?shù)臈l件下重組L1蛋白單獨(dú)或與L2蛋白一起自我組裝成病毒樣顆粒(VLP)。VLP可作為商業(yè)疫苗的候選者。然而，為了用作人類疫苗，VLP必須是高度純化的而且不含宿主細(xì)胞污染物。過(guò)去應(yīng)用滲濾方式中的交叉流超濾去除污染的生物分子。但是，這種方法導(dǎo)致HPV L1的蛋白水解降解。因此需要一種可以獲得高純度、無(wú)降解產(chǎn)品的L1蛋白純化方法。
該純化方法可用于基本上由L1蛋白組成的VLP，也可用于包含L1和L2蛋白的VLP。除此之外，還可用于嵌合型VLP，嵌合型VLP包含L1蛋白和L2融合蛋白。通常優(yōu)選僅含L1蛋白的VLP用于疫苗。
該方法事實(shí)上適用于任何乳頭瘤病毒株VLP。但是優(yōu)選用于人乳頭瘤病毒(HPV)。優(yōu)選HPV株是已知能引起多種嚴(yán)重疾病和病癥的HPV株，包括6a型HPV、6b型HPV、11型HPV、16型HPV、18型HPV、31型HPV、33型HPV以及45型HPV。
一般來(lái)說(shuō)，用編碼L1或L1和L2蛋白、或L1和L2融合蛋白的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
在整個(gè)說(shuō)明書和權(quán)利要求書使用的術(shù)語(yǔ)“L2融合蛋白”意指編碼L2蛋白的DNA與另一個(gè)編碼所需蛋白的DNA有效連接在一起，而且另一種所需蛋白最好為HPV蛋白質(zhì)如E1、E2、E3、E4、E5、E6或E7。該融合蛋白的L2部分可以是完整長(zhǎng)度，或可以具有缺失和/或截?cái)?。可在同時(shí)申請(qǐng)的同時(shí)待審的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)S.N.60/096,638(Attorney Docket Number 20276PV，通過(guò)引用結(jié)合到本文中)中找到實(shí)例。
宿主細(xì)胞可以是本領(lǐng)域已知的任何容易培養(yǎng)的宿主細(xì)胞，包括酵母(啤酒酵母)、昆蟲細(xì)胞、細(xì)菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。特別優(yōu)選酵母細(xì)胞。
所述載體也可以包含本領(lǐng)域已知的其它元件，如轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件和/或標(biāo)記基因。表達(dá)的L1、L1和L2、或L1和L2融合蛋白自動(dòng)組裝成VLP。常規(guī)溶解宿主細(xì)胞，然后部分純化細(xì)胞溶解物。
部分純化步驟可以包括常規(guī)使用的純化步驟，在本發(fā)明中卻不是關(guān)鍵步驟。例如，可將細(xì)胞溶解物進(jìn)行微濾程序，并且至少進(jìn)行一個(gè)層析步驟如陽(yáng)離子-交換層析。
依照本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，層析步驟從部分純化的細(xì)胞溶物中去除大量污染物，所述層析步驟是應(yīng)用羥磷灰石作為柱子的介質(zhì)，然后用含磷酸根陰離子的溶液洗脫。準(zhǔn)確地說(shuō)，發(fā)現(xiàn)大部分污染的生物分子(包括DNA、脂類和蛋白質(zhì))已從溶胞產(chǎn)物中去除。
依照本發(fā)明，按SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定，最終純化的VLP制品一般至少為75％純度，優(yōu)選為至少80％純度，更好優(yōu)選為至少90％純度。
事實(shí)上，本發(fā)明可使用任何市售羥磷灰石柱子填料。最好使用粒子大小約為20-50μm且孔徑約為800的陶瓷羥磷灰石。BioRad所售的“II型陶瓷羥磷灰石”就是這樣一種市售羥磷灰石。然而，同樣可用其它羥磷灰石。
在準(zhǔn)備純化程序的層析步驟中，建議使用pH6-8、最好約7的緩沖液對(duì)柱子進(jìn)樣。優(yōu)選緩沖液是50mM MOPS[3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸]，pH7.0且含有1.25M NaCl。
也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的的其它緩沖系統(tǒng)，包括MES[2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸]；BIS-TRIS[二-(2-羥乙基)-氨基]三-(羥甲基)甲烷]；ADA[N-2-乙酰氨基亞氨基二乙酸，一鈉鹽]；ACES[N-2-乙酰氨基-2-氨基乙烷磺酸]；PIPES[哌嗪-N，N′-二-(2-乙烷-磺酸)]；MOPSO[(3-N-嗎啉代)-2-羥基丙烷-磺酸]；BIS-TRIS PROPANE[1，3-二[三(羥甲基)甲基-氨基]丙烷]；BES[N，N-二(2-羥乙基)-2-氨基-乙烷磺酸]；TES[N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷-磺酸和2-2([2-羥基-1，1-二(羥甲基)乙基)氨基]乙烷磺酸]；HEPES[N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙烷-磺酸]；DIPSO[3-(N，N-二(2-羥乙基)氨基)-2-羥基-丙烷磺酸)]；TAPSO[3-N-三(羥甲基)甲基氨基]-2-羥基-丙烷磺酸]；TRIS[三-(羥甲基)-氨基甲烷]；HEPPSO[N-(2-羥乙基)-哌嗪-N′-(2-羥基-丙烷磺酸)]；POPSO[(哌嗪-N，N′-二[2-羥基丙烷磺酸)]；EPPS[N-[2-羥乙基]-哌嗪-N′-[3-丙烷磺酸和HEPPS]；TEA[三乙醇胺]；TRICINE[N[三-(羥甲基)甲基]甘氨酸]；BICINE[N，N-二-(2-羥乙基)-甘氨酸]；TAPS[3-{[三-(羥甲基)甲基]氨基}-丙烷磺酸]；咪唑；HEPPS[N-2-羥乙基哌嗪-N′-3-丙烷-磺酸]；甘氨酰胺；鹽酸鹽；雙甘氨肽；枸櫞酸鹽；乙酸鹽；以及琥珀酸鹽緩沖液。
在VLP可以與羥磷灰石結(jié)合的條件下，使在緩沖液中的部分純化的VLP與羥磷灰石介質(zhì)接觸。這些條件包括溫度范圍寬；優(yōu)選室溫。流速可以大幅度地變化，優(yōu)選范圍大約是90厘米/小時(shí)。
在VLP與羥磷灰石結(jié)合后，下一步是用洗脫緩沖液從羥磷灰石上回收純化的VLP。優(yōu)選的洗脫緩沖液包含磷酸根陰離子，如磷酸鈉或磷酸鉀溶液。優(yōu)選的摩爾濃度范圍是從大約0.05M到1M，大約0.2M最佳。洗脫緩沖液的pH范圍大約pH6-8，優(yōu)選pH約7。
本發(fā)明方法的其它優(yōu)點(diǎn)包括(a)無(wú)需特殊的層析裝置和技術(shù)；(b)本方法快速，無(wú)需更換緩沖液；以及(c)本方法提供高產(chǎn)量的HPV L1。
提供下列非限制性實(shí)例更好地闡明本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1部分純化溶胞產(chǎn)物的制備收獲轉(zhuǎn)化表達(dá)VLP的酵母細(xì)胞并冷凍保存于-70℃。取出冷凍保存的酵母細(xì)胞懸浮液，在室溫下解凍大約3小時(shí)，跟著在4℃解凍大約18個(gè)小時(shí)。將BENZONASE(Nycomed Pharma A/S，Copenhagen，Denmark)(2.8×105單位/毫升，0.21毫克蛋白/毫升)加入細(xì)胞懸浮液至最終濃度為每克細(xì)胞濕重750單位，在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中減少至每克細(xì)胞濕重335單位。攪拌細(xì)胞15分鐘，然后兩次經(jīng)過(guò)潔凈APV Gaulin 30CD勻漿器在14,500至16,000磅的操作壓力下破碎細(xì)胞，使95％細(xì)胞破碎。剩余溶胞產(chǎn)物在4℃下輕輕攪拌18個(gè)小時(shí)。
微濾澄清 如下通過(guò)滲濾方式中的交叉流微濾澄清細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。將溶胞產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至一個(gè)帶有一英寸直徑的進(jìn)口和出口的無(wú)菌操作槽(process tank)中。微濾器是置于A/G TechnologiesFlexStandBenchtop Pilot中空纖維系統(tǒng)中的5平方英尺表面積、0.65微米孔徑大小的中空纖維濾管。滯留物用3個(gè)體積的滲濾緩沖液(見下文)滲濾產(chǎn)生澄清的溶胞產(chǎn)物。滲濾緩沖液是0.2M(Na+)MOPS，pH7.0+0.4M NaCl。
澄清溶胞產(chǎn)物的層析 應(yīng)用POROS50 HS強(qiáng)陽(yáng)離子-交換層析樹脂(PerSeptive Biosystems，F(xiàn)ramingham，MA)填充層析柱，經(jīng)柱層析分級(jí)分離澄清溶胞產(chǎn)物。該柱在使用前用0.5N NaOH清潔消毒。在室溫下用HPV滲濾緩沖液
平衡層析柱。將冷的(4℃)澄清的溶胞產(chǎn)物以125毫升/分鐘的速度泵上柱，用8個(gè)柱體積HPV室溫柱緩沖液A
以125毫升/分鐘、100％HPV柱緩沖液A到100％HPV柱緩沖液B
的線性梯度洗脫層析柱?？偟木€性梯度是10個(gè)柱體積，收集10個(gè)等體積的流分。梯度洗脫后，用2個(gè)柱體積室溫HPV柱緩沖液B以125毫升/分鐘沖洗柱，收集2份額外流分。用2升無(wú)菌塑料瓶收集各流分，并將其貯藏在4℃下。將在梯度中包含最后紫外吸收峰(A280nm和A230nm)的各流分合并，用MILLIPAK-200一次性過(guò)濾器(Millipore，Bedford，MA)過(guò)濾并保存在4℃下。
實(shí)施例2羥磷灰石層析所有步驟均在室溫下進(jìn)行。用II型陶瓷羥磷灰石(BioRadCat.#7320081，Hercules，CA)填充層析柱(13mm ID×36mm)后，將其在50mM MOPS，pH7.0+1.25M NaCl中預(yù)平衡。將實(shí)施例1的部分純化HPV溶液以90厘米/小時(shí)的線性流速上柱。上樣完成后用8個(gè)柱體積預(yù)平衡緩沖液沖洗柱子直至柱子流出物的光密度值接近零為止。HPV疫苗產(chǎn)物用0％到100％線性梯度洗脫緩沖液(0.2M磷酸鈉，pH7.0+1.25M NaCl)洗脫，同樣為90厘米/小時(shí)線性流速。梯度的總體積是4個(gè)柱體積。通過(guò)放射免疫測(cè)定和Bradford蛋白測(cè)定來(lái)鑒定含有疫苗產(chǎn)物的流分。疫苗產(chǎn)物的的蛋白濃度是100μg/mL。
分析用牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Coomassie PlusAssay Reagent(Pierce，Rockford，IL)進(jìn)行Bradford蛋白測(cè)定。用BSA作為校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)Lowry等1951 J.Biol.Chem.193265-270的方法進(jìn)行Lowry蛋白質(zhì)測(cè)定。用識(shí)別VLP構(gòu)象表位的單克隆抗體通過(guò)多層酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)來(lái)測(cè)定抗原。用多克隆山羊抗HPV VLP抗體包被微量滴定板。標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品用1％(w/v)BSA、0.1％TWEEN-20和0.1％疊氮化鈉的PBS稀釋并且加入各孔中，在各孔中由結(jié)合在微量滴板上的抗體捕獲抗原。將抗-HPV L1 VLP單克隆抗體(Chemicon，Temecula，CA)加入到各孔中，以結(jié)合包被板抗體捕獲的抗原。用結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶的抗小鼠IgG抗體檢測(cè)抗-HPV VLP單克隆抗體。加入辣根過(guò)氧化物酶的顯色底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(Pierce)，在450nm處的吸光度與樣品中的L1 VLP濃度成正比。
用于疫苗產(chǎn)物的柱動(dòng)態(tài)容量(dynamic capacity)按Bradford測(cè)定是每毫升樹脂2.9毫克，按放射免疫測(cè)定是每毫升樹脂4.6毫克。當(dāng)柱以100％裝載容量填充時(shí)，通過(guò)這一步驟的回收率用Bradford蛋白測(cè)定是90％，而按放射免疫測(cè)定是82％。當(dāng)柱子以8％裝載容量填充時(shí)，按Bradford測(cè)定的回收率下降至63％，而以放射免疫測(cè)定下降至50％。
實(shí)施例3其它生物分子的去除用基于PCR的檢測(cè)方法測(cè)定在基本上按實(shí)施例1和2所述制備的HPV 11 L1樣品中存在的DNA量。列于下表的結(jié)果表明，這一層析方法能高效去除最終產(chǎn)品中的雜質(zhì)DNA。
實(shí)施例4嵌合型VLP的純化16型HPV L1/L2mini/E2嵌合型VLP的純化L2修飾基因的構(gòu)建YP3載體(基本型L2)這一載體保有HPV16 L2的氨基末端69個(gè)氨基酸和羧基-末端84個(gè)氨基酸(aa)的編碼序列，它通過(guò)合成多接頭按讀框融合，引入一個(gè)NotI，SacI以及XhoI限制酶切位點(diǎn)，導(dǎo)致插入一個(gè)谷氨酸殘基和一個(gè)絲氨酸殘基突變?yōu)楣劝彼岬摹?br> 設(shè)計(jì)PCR引物(Midland Certified Reagents)從pGal110 HPV16 L1+L2載體包含的原L2基因擴(kuò)增L2序列。
引物I(5′-CTT CCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC-3′；SEQ.ID.NO.1)和C(5′-CTC GAG CTC GCG GCC GCC TGT ACC CGACCC-3′；SEQ.ID.NO.2)擴(kuò)增編碼氨基末端69個(gè)氨基酸的265bp序列和包括一個(gè)Sma I限制酶切位點(diǎn)的23bp上游非翻譯序列。引物C修飾并延伸L2氨基末端編碼區(qū)，而且在L2編碼序列下游添加Not I、Sac I以及Xho I限制酶切位點(diǎn)。
引物A (5′-GCG GCC GCG AGC TCG AGG GTT ATA TTC CTGCAA ATA CAA-3′；SEQ.ID.NO.3)、C和D(5′-CCC TCC AGA TCT CTAGGC AGC CAA AGA GAC ATC TG-3′；SEQ.ID.NO.4)擴(kuò)增編碼L2羧基末端84個(gè)氨基酸的285bp序列和加入一個(gè)Bgl II限制酶切位點(diǎn)的6個(gè)bp。引物A還加入包含L2編碼序列上游的Not I、Sac I以及Xho I位點(diǎn)的17bp序列。
通過(guò)引物A和C加入的互補(bǔ)序列組裝基本型L2表達(dá)載體。在包含作為擴(kuò)增引物的I和D寡聚物的PCR反應(yīng)中同時(shí)使用從上述I/C和A/D擴(kuò)增反應(yīng)中分離的DNA產(chǎn)物。為促進(jìn)通過(guò)其17bp互補(bǔ)序列的連接所述片段，以37℃退火溫度進(jìn)行三個(gè)PCR循環(huán)，然后在57℃下進(jìn)行15個(gè)PCR循環(huán)。將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物平端連接入pcrScript(Stratagene，LaJolla)且轉(zhuǎn)化入XL-1 Blue MRF’細(xì)胞(Stratagene，La Jolla)。用引物I和D經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性克隆，并經(jīng)限制性消化分析確證陽(yáng)性克隆。然后通過(guò)自動(dòng)序列分析(Perkin Elmer，Inc.，F(xiàn)osterCity，CA)驗(yàn)證所述構(gòu)建物。
然后用Sma I和Bgl II消化得自合適分離物的質(zhì)粒DNA；大約0.5kb的片段經(jīng)凝膠純化并與14kb SmaI和BglII pGAL110 HPV16 L1載體片段連接。用此連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5大腸桿菌細(xì)胞(GibcoBRL，Rockville，MD)，在LB氨芐青霉素平板(Remel，Lenexa，KS)上選擇轉(zhuǎn)化子。通過(guò)其中應(yīng)用引物D和I擴(kuò)增L2的部分的PCR初步篩選克??；然后經(jīng)限制性消化分析確證適當(dāng)?shù)目寺　Ｍㄟ^(guò)上述序列分析驗(yàn)證了候選克隆YP3#1。
然后將YP3#1用作編碼HPV16 E1、E2或E7可讀框的基因插入其中的主要構(gòu)建物。HPV E蛋白編碼基因的插入編碼HPV16 E2基因是通過(guò)PCR擴(kuò)增HPV16陽(yáng)性臨床樣品獲得的，然后將其直接插入亞克隆載體pCRII(Stratagene，La Jolla，CA)且如上所述進(jìn)行序列驗(yàn)證。然后根據(jù)下列方法修飾E2基因序列1)將含Xho I、Nae I、Not I的DNA序列按讀框加入到E2的氨基末端部分。另外，將含有Not I、Nae I和Xho I的序列加入到E2的羧基-末端部分，有助于在Not I、Xho I位點(diǎn)插入E2內(nèi)。
2)通過(guò)PCR誘變殘基谷氨酸39和異亮氨酸73編碼丙氨酸殘基編碼來(lái)改變DNA序列。這樣是打算使E2蛋白功能失活。
用Not I、Xho I酶切上述修飾的HPV16 E2基因，并將其與用同樣消化的YP3#1載體連接。經(jīng)PCR選擇含正確插入E2序列的轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行序列檢驗(yàn)。
同樣的策略可用于編碼HPV16 E1和HPV16 E7的基因。對(duì)于E1，甘氨酸482改變?yōu)樘於彼?；?duì)于E7，半胱氨酸24和谷氨酸26均轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼釓亩沟玫鞍坠δ苁Щ?。然后將獲得的構(gòu)建物用于轉(zhuǎn)化酵母以進(jìn)行表達(dá)分析。
實(shí)施例5表達(dá)嵌合型VLP酵母的識(shí)別和培養(yǎng)用YP3#1和上述衍生物的質(zhì)粒DNA通過(guò)原生質(zhì)球方法(Hinnen等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751929-1933)轉(zhuǎn)化啤酒酵母(MATa，leu2-04，prb1∷HIS3，mnn9∷URA3，cir°)。將轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)球平板接種在選擇性(亮氨酸缺陷型)培養(yǎng)基(Remel，Lenexa，KS)上。通過(guò)兩個(gè)周期單菌落選擇分離出克隆。少量液體培養(yǎng)的候選克隆在含有半乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)成高細(xì)胞密度。用玻璃珠巨烈振蕩，然后離心來(lái)制備粗提物。用單克隆抗體或單特異性多克隆抗血清通過(guò)各種方法(包括SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、ELISA、免疫印跡以及EIA)分析澄清提取物中的L1、L2組分和VLP表達(dá)，所述抗體識(shí)別L1或L2、或L2的氨基或羧基末端、或L1 VLP、或E1、或E2、或E7、或與修飾L2融合的任何其它蛋白質(zhì)或肽VLP。選擇表達(dá)L2組分并形成VLP的克隆以進(jìn)一步進(jìn)行特征鑒定。在含有半乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1升或16升選擇克隆培養(yǎng)物以大規(guī)模制備嵌合型VLP。
細(xì)胞沉淀物冷凍貯存在-70℃。將冷凍細(xì)胞(濕重＝148克)解凍并重新懸浮在740毫升“破碎緩沖液”(200mM MOPS，pH7，1mM氯化鈣)中，獲得約20％(w/v)細(xì)胞淤漿。加入核酸酶BENZONASE(Nycomed Pharma)至750單位/克細(xì)胞濕重。用M110-Y Microfluidizer(Microfluidics Corp.，Newton，MA)以大約19,000磅壓力下重復(fù)5次破碎細(xì)胞細(xì)胞淤漿。在破碎期間細(xì)胞淤漿在冰上收集并保存。細(xì)胞比容測(cè)定表明80％以上細(xì)胞破碎。
應(yīng)用以滲濾方式運(yùn)行的切向流微濾儀，通過(guò)一個(gè)0.65微米孔徑中空纖維管(A/G Technologies)微濾澄清老化細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。用3體積的0.25M枸櫞酸鈉、0.2M MOPS，pH7.0滲濾溶胞產(chǎn)物。使抗原通過(guò)膜并且收集滲透液。
將滲透的0.65mm滲透部分(3.9L)上樣到325mL POROS50HS樹脂(Perseptive Biosystems，Cambridge，MA)柱(11.2cm ID×3.3cm)上，所述柱用200mM MOPS，pH7，250mM枸櫞酸鈉平衡。該柱用8體積50mM MOPS，0.5M NaCl，5mM磷酸鈉，pH7沖洗，用10體積的0.5到1.5M NaCl的線形梯度的相同緩沖液洗脫。洗脫過(guò)程中成批收集直流出物和沖洗部分同時(shí)以1體積收集流分。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡和利用膠體考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)的SDS-PAGE分析柱流分。合并主要含p55蛋白的流分。
通過(guò)BCA測(cè)定(Pierce)分析50 HS合并物中的總蛋白質(zhì)量。根據(jù)總蛋白量(168mg)澆注(poure)II型陶瓷羥磷灰石(HA)柱(Bio-Rad)，獲得1mL樹脂/2mg蛋白。該柱是2.6cm ID×15.7cm。該柱用50mMMOPS，pH7，1.25M NaCl，5mM磷酸鈉平衡。經(jīng)0.22mm過(guò)濾50HS合并物并以113cm/hr的流速上樣到HA柱。大量收集直流出物(Flow-thru)。用5體積平衡緩沖液沖洗HA柱，用8體積的從5到200mM磷酸鈉，pH7的1.25M NaCl的線形梯度洗脫。通過(guò)白質(zhì)印跡和利用膠體考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)的SDS-PGAE分析洗脫收集的流分。合并純度相當(dāng)并富含L1蛋白的流分。合并流分經(jīng)0.22mm膜過(guò)濾除菌并保存在4℃。
對(duì)過(guò)程保留物(process retains)和產(chǎn)物用特異性酶聯(lián)免疫測(cè)定分析HPV 16 L1、用BCA測(cè)定蛋白質(zhì)。最終純化產(chǎn)物產(chǎn)量為27mg蛋白質(zhì)，比活為1.00mg L1/mg蛋白質(zhì)。電子顯微鏡證實(shí)存在平均直徑為32nm的完整VLP顆粒。為了進(jìn)行SDS-PAGE純度分析，經(jīng)TCA沉淀濃縮等份終產(chǎn)物并且通過(guò)蛋白質(zhì)印跡和利用膠體考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。用2.5mg載荷量定量L1，而以20.0mg載荷量定量酵母雜質(zhì)。光密度分析法證實(shí)L1蛋白的純度大于94％。過(guò)程流分(process fractions)的特異性免疫印跡分析證實(shí)共純化的L1和L2mini/E2。
權(quán)利要求
1.純化重組乳頭瘤病毒樣顆粒(VLP)的方法，包括(a)在VLP可與羥磷灰石介質(zhì)結(jié)合的條件下，使含部分純化VLP的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物與層析柱中的羥磷灰石介質(zhì)接觸；(b)用含磷酸根陰離子的溶液洗脫結(jié)合的VLP；和(c)回收洗脫的VLP。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述VLP主要由L1蛋白組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述VLP是人乳頭瘤病毒(HPV)VLP。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述VLP選自6a型HPV、6b型HPV、11型HPV、16型HPV、18型HPV、31型HPV、33型HPV以及45型HPV。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述洗脫VLP的純度至少為75％。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述洗脫VLP的純度至少為90％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述VLP包含L1蛋白和L2融合蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述L2融合蛋白含有小于總長(zhǎng)度的一個(gè)L2部分。
9.制備純化的人乳頭瘤病毒VLP產(chǎn)物的方法，所述產(chǎn)物適用于人類疫苗，該方法包括(a)部分純化細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，其中所述細(xì)胞溶胞產(chǎn)物得自轉(zhuǎn)化表達(dá)HPV L1 VLP的酵母細(xì)胞；(b)在VLP可與羥磷灰石介質(zhì)結(jié)合的條件下，將含部分純化VLP的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物與層析柱中的羥磷灰石介質(zhì)接觸；(c)用含磷酸根陰離子的溶液洗脫結(jié)合的VLP；和(d)回收洗脫的VLP。
全文摘要
純化乳頭瘤病毒樣顆粒(VLP)的方法包括將含部分純化的VLP溶液通過(guò)羥磷灰石層析柱的步驟。然后用含磷酸陰離子的緩沖液洗脫VLP。本方法的優(yōu)點(diǎn)在于回收得到高產(chǎn)量的完整VLP。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1354787SQ99811968
公開日2002年6月19日 申請(qǐng)日期1999年8月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月14日
發(fā)明者J·C·庫(kù)克三世 申請(qǐng)人:麥克公司