專利名稱：粘膜炎莫拉氏菌basb034多肽及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多核苷酸(這里指“BASB034多核苷酸”)，由其編碼的多肽(此處指“BASB034”或“BASB034多肽”)，用于這些產(chǎn)物的重組材料及方法。另一方面，本發(fā)明涉及應(yīng)用這些多肽及多核苷酸的方法，包括抗細(xì)菌感染的疫苗。進(jìn)一方面，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)特定病原感染的診斷分析。
中耳炎對(duì)于兒童期講，無(wú)論從病例數(shù)量還是其發(fā)病潛勢(shì)上看，都是一種重要病變。在美國(guó)據(jù)報(bào)道每年該病例超過350萬(wàn)，并估計(jì)80％的兒童在3歲前會(huì)經(jīng)歷至少一次耳炎(Klein，JO(1994)Clin.Inf.Dis19823)。不處理或變成慢性，該病可導(dǎo)致暫時(shí)性(假如流體在中耳積聚)或永久性(如果聽神經(jīng)損傷)聽力喪失。在嬰兒中這樣的聽力喪失可導(dǎo)致語(yǔ)言學(xué)習(xí)的推遲。
從患有中耳炎的兒童中分離得到了3個(gè)主要細(xì)菌品種肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，非典型的流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenza)(NTHi)及粘膜炎莫拉氏菌(M.catarrhalis)。在60-90％病例中它們都存在。近期研究的一篇綜述顯示在中耳炎病例中，肺炎鏈球菌及HTHi占了其中的30％，粘膜炎莫拉氏菌占了其中的約15％(Murphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60267)。其它細(xì)菌也可從中耳中分離得到(乙型流感嗜血桿菌，釀膿鏈球菌(S.pyogenes)等)，但只占較小頻率(此病例的2％或更少)。
流行病資料顯示，對(duì)于在中耳中發(fā)現(xiàn)的病原菌，在上呼吸道建群是形成耳炎的絕對(duì)的先決條件；然而也需要其它條件導(dǎo)致疾病發(fā)生(Dickinson，DP等(1988)J.Infect.Dis.158205，F(xiàn)aden，HL等(1991)Ann.Otorhinol.Laryngol.100612)。這些對(duì)引起細(xì)菌通過咽鼓管遷移進(jìn)入中耳是重要的，并隨之啟動(dòng)炎癥過程。這些因素現(xiàn)在是已知的。例如，假定一短暫的伴隨病毒感染的免疫系統(tǒng)不正常，能引起呼吸道生殖菌群控制的失常(Faden，HL等(1994)J.Infect.Dis.1691312)。另一個(gè)解釋為暴露于環(huán)境因素允許一些兒童更重要的菌群建群，他們因?yàn)橹卸≡某掷^存在隨之變成對(duì)形成中耳炎易感(Murphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60267)。
對(duì)粘膜炎莫拉氏菌的免疫反應(yīng)的特征描述不足，對(duì)從0到2歲嬰兒鼻咽中連續(xù)分離到的菌株的分析表明，他們時(shí)常地獲得及去除新菌株。這指示一種對(duì)該細(xì)菌的有效免疫反應(yīng)被菌群建的兒童所運(yùn)用(Faden，HL等(1994)J.Infect.Dis.1691312)。
在許多被檢測(cè)的成人中，已鑒定出了一些殺菌抗體(Chapman，AJ等(1985)J.Infect.Dis.15878)。粘膜炎莫拉氏菌菌株在它們的能力范圍內(nèi)以各種變異存在以抵抗血清活性一般來講，從有病個(gè)體中分離到的病菌比僅簡(jiǎn)單建群中分離到的病菌抵抗力更強(qiáng)(Hol，C等(1993)Lancet 3411281，Jordan，KL等(1990)Am.J.Med.88(suppl.5A)28S)。因此，血清抗性可被認(rèn)作該細(xì)菌的一種毒力因素。在從中耳炎恢復(fù)過來的兒童的血清中還觀察到一種受調(diào)理的活性。
被這些人中不同免疫反應(yīng)定位的抗原沒有被鑒定，除了OMP B1，一種表達(dá)受鐵調(diào)控的84kDa蛋白質(zhì)外，并且它是通過肺炎病人的血清鑒定出的(Sethi，S，等(1995)，Infect.Immun.631516)及UspAl，UspA2除外(Chen D.等(1999)，Infect.Immun.671310)。
一些存在于粘膜炎莫拉氏菌表面的其它膜蛋白的已用生化方法或因?yàn)樗鼈冊(cè)谡T導(dǎo)保護(hù)免疫反應(yīng)(見綜述，Murphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60267)中的潛在的運(yùn)用而定性。在小鼠肺炎模型中，對(duì)它們(UspA，CopB)中的一些，產(chǎn)生了抗體，還會(huì)導(dǎo)致肺部感染更快的清除。另一多肽(OMP CD)在粘膜炎莫拉氏菌株中是高度保守的，并與銅綠假單孢菌屬(Pseudomonasaeruginosa)的一種膜孔蛋白的(porin)存在同源性，該膜孔蛋白已經(jīng)在動(dòng)物模型中被證明對(duì)此細(xì)菌是有效的。
在過去的幾十年中，粘膜炎莫拉氏菌感染率顯著升高。這是由于多藥抗性細(xì)菌株系的出現(xiàn)及弱免疫系統(tǒng)的人群的增加。分離對(duì)一些或全部標(biāo)準(zhǔn)抗生素具有抗性的粘膜炎莫拉氏菌株已經(jīng)是很平常的事了。這一現(xiàn)象使醫(yī)療需求得不到滿足，并導(dǎo)致需要得到針對(duì)該微生物的新的抗菌劑、疫苗、藥物篩選方法和診斷測(cè)試。
通過閱讀下面的說明書和本公開的其它部分，在本發(fā)明所公開的精神和范圍之內(nèi)的各種變化和修飾對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。
(c)一種由分離的多核苷酸編碼的多肽，它含有一多核苷酸序列，其所編碼的多肽與SEQ ID NO2，4，6或8的氨基酸序列至少85％一致，優(yōu)選至少90％一致，更優(yōu)選至少95％一致，更優(yōu)選至少97-99％一致或完全一致。
SEQ ID NO2，4，6或8中的BASB034多肽是來源于粘膜炎莫拉氏菌菌株Mc2931(ATCC 43617)，Mc2913及Mc2969的BASB034多肽。
本發(fā)明也提供一種BASB034多肽免疫原性片段，即，一個(gè)連續(xù)的BASB034多肽部分，它具有與含有SEQ ID NO2，4，6或8中氨基酸序列的多肽一致或基本上一致的免疫原性活性，也就是說，該片段(如果必要，可與載體偶聯(lián))能夠提高識(shí)別BASB034多肽的免疫反應(yīng)。這樣一種免疫原性片段可包括，例如，缺少N-端導(dǎo)肽序列和/或跨膜區(qū)和/或C-端錨定結(jié)構(gòu)域的BASB034多肽。在一優(yōu)選的方面，本發(fā)明的BASB034免疫原性片段包括該多肽的全部胞外結(jié)構(gòu)域，該多肽就全長(zhǎng)來說與SEQ ID NO2，4，6或8至少85％一致，優(yōu)選至少90％一致，更優(yōu)選至少95％一致，最優(yōu)選至少97-99％一致。
片段是指具有與本發(fā)明中任何一多肽部分但不是任何氨基酸序列的全部完全一致的氨基酸序列。如對(duì)于BASB034多肽，片段可以是“自由存在的”(“free-standig”)，或包含在一較大多肽內(nèi)，在多肽中，片段形成一部分或區(qū)域，最優(yōu)選地為在單一較大多肽內(nèi)作為單一的連續(xù)的區(qū)域。
優(yōu)選的片段包括，例如，截短的多肽，它們具有SEQ ID NO2，4，6或8中氨基酸或其變體的一部分，例如包括氨基和/或羧基末端氨基酸序列的一種連續(xù)系列殘基。由宿主細(xì)胞或在宿主細(xì)胞內(nèi)形成的本發(fā)明中的多肽的降解形式，也是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是通過結(jié)構(gòu)及功能屬性定性的片段，如片段含有α-螺旋及α-螺旋形成區(qū)域，β-片層及β-片層形成區(qū)域，轉(zhuǎn)角及轉(zhuǎn)角形成區(qū)域，卷曲及卷曲形成區(qū)域，親水區(qū)域，疏水區(qū)域，α-兩性區(qū)域，β-兩性區(qū)域，柔性區(qū)域，表面形成區(qū)域，底物結(jié)合區(qū)域，高抗原指數(shù)區(qū)域(high antigenic indexregions)。
更進(jìn)一步優(yōu)選的片段包括一種分離的多肽，它包括具有SEQ IDNO2，4，6或8的氨基酸序列中至少15，20，30，40，50或100個(gè)連續(xù)的氨基酸的氨基酸序列；或一種分離的多肽，它包括具有SEQ IDNO2，4，6或8的氨基酸序列截短或缺失的序列中至少15，20，30，40，50或100個(gè)連續(xù)的氨基酸的序列。
本發(fā)明的多肽片段通過肽的合成可用于產(chǎn)生相應(yīng)全長(zhǎng)的多肽；因此，這些片段可用作產(chǎn)生本發(fā)明中全長(zhǎng)多肽的中間物。
尤其優(yōu)選的是變體，其中幾個(gè)，5-10個(gè)，1-5個(gè)，1-3個(gè)，1-2個(gè)或1個(gè)氨基酸被替換，缺失或加入，可以任意組合。
本發(fā)明中的多肽，或免疫原性片段，可以是“成熟”蛋白形式或可以是較大蛋白的一部分，如前體或融合蛋白。包括一種額外的氨基酸序列，它含有分泌或?qū)щ男蛄?，原序?pro-sequences)，幫助純化，如多組氨酸殘基的序列，或一種在重組體制作過程中起穩(wěn)定作用的序列是經(jīng)常有用的。而且，外源多肽添加物或脂類尾巴或多核苷酸序列用以增加最終分子的免疫力也是被考慮的。
一方面，本發(fā)明涉及通過遺傳工程產(chǎn)生可溶性融合蛋白，該蛋白包括本發(fā)明的多肽，或其片段，及各種亞類(IgG，IgM，IgA，IgE)免疫球蛋白的重鏈或輕鏈恒定區(qū)域的各個(gè)部分。優(yōu)選的作為免疫球蛋白的是人IgG重鏈恒定區(qū)部分，尤其是IgG1，其中融合發(fā)生在鉸鏈區(qū)。在一具體的實(shí)施方案中，F(xiàn)C部分可以通過摻入切割序列簡(jiǎn)便地移去，該切割序列可被摻入凝血因子Xa。
此外，本發(fā)明涉及通過遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，以及在藥物篩選，診斷和治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一方面也涉及編碼這些融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白的技術(shù)的實(shí)例可在國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O94/29458及WO94/22914中查到。
蛋白可以是化學(xué)綴合(conjugated)，或作為重組融合蛋白表達(dá)以允許與非融合蛋白相比，在表達(dá)體系中產(chǎn)生高水平的表達(dá)產(chǎn)物。該融合配對(duì)體(partner)可幫助提供T輔助表位(免疫融合配對(duì)體)，優(yōu)選地被人識(shí)別的T輔助表位，或幫助該蛋白比天然重組蛋白提高表達(dá)產(chǎn)量(表達(dá)增強(qiáng))。優(yōu)選地，該融合配對(duì)體將是免疫融合配對(duì)體及表達(dá)增強(qiáng)配對(duì)體。
融合配對(duì)體包括源于嗜血流感桿菌的蛋白D及源于流感病毒，NS1(血凝素)的非結(jié)構(gòu)蛋白。另一融合配對(duì)體是已知的LytA蛋白。優(yōu)選地使用分子的C-末端部分。LytA由肺炎鏈球菌得來，該菌合成一種N-乙?；?L-丙氨酸酰胺酶，酰胺酶LytA(由LytA基因{Gene，43(1986)，265-272}編碼)，一種特異降解肽聚糖骨架特定鍵的自溶素(autolysin)。LytA蛋白的C-末端結(jié)構(gòu)域?qū)τ谀憠A或如DEAE等一些膽堿類似物的親合力方面有重要作用。該特性已被用來開發(fā)融合蛋白表達(dá)有用的大腸桿菌C-LytA表達(dá)質(zhì)粒。在其N-末端含有C-LytA片段的雜合蛋白的純化已被描述(Biotehnology10，(1992)795-798)。利用LytA分子的重復(fù)部分是可能的，這些重復(fù)部分發(fā)現(xiàn)于C-末端始于殘基178位處，如殘基188-305。
本發(fā)明還包括前述多肽的變體，即通過保守氨基酸替換的上述多肽，由此一個(gè)殘基被另一個(gè)相似特性殘基替換。典型的這樣替換發(fā)生在Ala，Val，Leu及Ile間；Ser及Thr間；酸性殘基Asp及Glu間；Asn及Gln間；以及堿性殘基Lys及Arg間；或芳香殘基Phe及Tyr間。
本發(fā)明的多肽可以以任何恰當(dāng)?shù)姆绞街苽?。這樣的多肽包括分離天然存在的多肽，重組制備的多肽，合成的多肽或通過這些方法的聯(lián)用產(chǎn)生的多肽。制備這樣多肽的方法為本領(lǐng)域所熟知。
最優(yōu)選本發(fā)明的多肽來源于粘膜炎莫拉氏菌，然而，優(yōu)選地也可以從分類上相同的其它生物體得來。例如，本發(fā)明的多肽也可以從分類上相同的科或目的生物體中獲得。多核苷酸本發(fā)明的目的之一是提供編碼BASB034多肽的多核苷酸，特別地是本文稱為BASB034的多核苷酸。
在本發(fā)明的一個(gè)具體優(yōu)選的實(shí)施方案中，多核苷酸包括編碼BASB034多肽的區(qū)域，它包含括SEQ ID NO1，3，5或7的包括全長(zhǎng)基因的序列，或其變體。
SEQ ID NO1，3，5或7中提供的BASB034多核苷酸是來源于粘膜炎莫拉氏菌株Mc2931(ATCC 43617)，Mc2908，Mc2913及Mc2969的BASB034多核苷酸。
作為本發(fā)明的更進(jìn)一個(gè)方面，提供分離的核酸分子，它編碼和/或表達(dá)BASB034多肽和多核苷酸，尤其粘膜炎莫拉氏菌BASB034多肽和多核苷酸，包括，如未加工的RNAs，mRNAs，cDNAs，基因組DNAs，B-及Z-DNAs。本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施方案包括生物學(xué)，診斷學(xué)，預(yù)防性地，臨床或治療上有用的多核苷酸及多肽，及其變體，及含有上述成分的組合物。
本發(fā)明的另一方面涉及分離的多核苷酸，包括至少一種全長(zhǎng)基因，它編碼具有SEQ ID NO2，4，6或8中的推測(cè)的氨基酸序列及與此緊密相關(guān)的多核苷酸，以及其變體。
在本發(fā)明另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，有一種來源于粘膜炎莫拉氏菌的BASB034多肽，它包括SEQ ID NO2，4，6或8的氨基酸序列或者其變體，或者由其組成。
使用本文提供的信息，例如SEQ ID NO1，3，5或7中的多核苷酸序列，本發(fā)明編碼BASB034多肽的多核苷酸可用標(biāo)準(zhǔn)的克隆及篩選方法獲得，例如那些用粘膜炎莫拉氏菌Catlin細(xì)胞作為起始材料來從細(xì)菌中克隆及測(cè)序染色體片段，隨之獲得一個(gè)全長(zhǎng)克隆。例如，為獲得本發(fā)明的多核苷酸序列，如在SEQ ID NO1，3，5或7中給出的多核苷酸序列，典型地，用來源于部分序列的放射性標(biāo)記寡核苷酸作為探針，優(yōu)選地17-聚體或更長(zhǎng)去探測(cè)在大腸桿菌或一些其它適宜宿主中的粘膜炎莫拉氏菌Catlin染色體DNA克隆文庫(kù)。攜帶與上述探針一致DNA序列的克隆可以隨后用嚴(yán)格的雜交條件鑒定。通過測(cè)序雜交確定的獨(dú)立克隆，用從原始多肽或多核苷酸序列設(shè)計(jì)的測(cè)序列物，隨后向兩方向延長(zhǎng)多核苷酸序列以確定全長(zhǎng)基因序列是可能的。方便地，這樣的測(cè)序可被完成，例如，用變性從質(zhì)?？寺≈苽涞碾p鏈DNA。適宜的技術(shù)由Maniatis T.，F(xiàn)ritsch，E.F.及Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，第2版；Cold Spring HarborLaboratory出版；Cold Spring Harbor，New York(1989)。(尤其見1.90通過雜交篩選及13.70測(cè)序變性雙鏈DNA模板)。用直接的基因組DNA測(cè)序也可以獲得全長(zhǎng)基因序列。對(duì)于本發(fā)明，SEQ ID NO1，3，5或7中列出的每一多核苷酸是從來源于粘膜炎莫拉氏菌的DNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的。
而且，SEQ ID NO1，3，5或7中列出的每一DNA序列都含有一開放閱讀框架(ORF)，它編碼的蛋白質(zhì)具有約SEQ ID NO2，4，6或8中列出的數(shù)目的氨基酸殘基，其推斷的分子量能用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的氨基酸殘基分子量值計(jì)算。
SEQ ID NO1中的多核苷酸，在起始密碼即1位核苷酸及SEQ IDNO1中1327位核苷酸的終止密碼之間的序列，編碼SEQ ID NO2中的多肽。
SEQ ID NO3中的多核苷酸，在起始密碼即1位核苷酸及SEQ IDNO3中1327位核苷酸的終止密碼之間的序列，編碼SEQ ID NO4中的多肽。
SEQ ID NO5中的多核苷酸，在起始密碼即1位核苷酸及SEQ IDNO5中1327位核苷酸的終止密碼之間的序列，編碼SEQ ID NO6中的多肽。
SEQ IDNO7中的多核苷酸，在起始密碼即1位核苷酸及SEQ IDNO7中1327位核苷酸的終止密碼之間的序列，編碼SEQ ID NO8中的多肽。
在進(jìn)一方面，本發(fā)明提供分離的多核苷酸，它包含或由以下所述序列組成(a)一種多核苷酸序列，它就全長(zhǎng)來說分別與SEQ ID NO1，3，5或7的序列至少85％一致，優(yōu)選至少90％一致，更優(yōu)選至少95％一致，更進(jìn)一步優(yōu)選至少97-99％一致或完全一致；或者(b)一種編碼多肽的多核苷酸序列，該多肽就全長(zhǎng)來說分別與SEQID NO2，4，6或8的氨基酸序列至少85％一致，優(yōu)選至少90％一致，更優(yōu)選至少95％一致，更進(jìn)一步優(yōu)選至少97-99％一致或100％一致。
編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸，包括來源于非粘膜炎莫拉氏菌品系的同系物和直向同源物(orthologs)，可通過一定方法獲得，這方法包括在嚴(yán)格雜交條件下(例如，用45-65℃溫度及0.1-1％的SDS)用一標(biāo)記或可檢測(cè)到的探針篩選適宜的文庫(kù)，該探針包括或由SEQ IDNO1，3，5或7中或其中的片段組成；以及分離全長(zhǎng)的含有所說多核苷酸序列的基因和/或基因組克隆。
本發(fā)明提供了就全長(zhǎng)來說與ESQ ID NO1，3，5或7中的編碼序列(開放閱讀框架ORF)一致的多核苷酸序列。本發(fā)明還提供一種成熟肽或其片段的編碼序列自身以及在閱讀框內(nèi)有其它編碼序列的成熟肽或其片段的編碼序列，其它編碼序列有例如，編碼導(dǎo)肽或分泌信號(hào)序列的序列，一種前-或原-，或前原-蛋白序列。本發(fā)明的多肽也可含有至少一種非編碼序列，包括如，但不限于至少一個(gè)非編碼的5′及3′序列，例如，轉(zhuǎn)錄但不翻譯序列，終止信號(hào)(如rho-依賴及rho-非依賴終止信號(hào))，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，Kozak序列，穩(wěn)定mRNA的序列，內(nèi)含子及聚腺苷酸化信號(hào)。多核苷酸序列也可以包含編碼額外氨基酸的額外編碼序列。例如，一種可以使被編碼的融合多肽容易純化的標(biāo)記序列。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，標(biāo)記序列為一種pQE載體提供的六組氨酸肽(Qiagen公司)及在Gentz等Proc.Natl.Acad.Sci.，USA86821-824(1989)中描述的標(biāo)記，或一種HA肽標(biāo)記(Wilson等；Cell 37767(1984)，兩者在對(duì)與其融合的多肽序列純化中都很有用。本發(fā)明之多核苷酸也包括，但不限于，含有一結(jié)構(gòu)基因及控制基因表達(dá)的天然序列的多核苷酸。
編碼SEQ ID NO2，4，6或8中BASB034多肽的核酸序列可以是與分別含有SEQ ID NO1，3，5或7中1到1326核苷酸的多肽編碼序列一致的?？蛇x擇地，它可以是一種序列，它作為一種遺傳密碼冗余(簡(jiǎn)并性)的結(jié)果，也編碼SEQ ID NO2，4，6或8中的多肽。
這里用術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”包含含有編碼本發(fā)明多肽序列的多核苷酸，尤其是細(xì)菌多肽，更尤其是具有SEQ ID NO2，4，6或8中列出的氨基酸序列的粘膜炎莫拉氏菌多肽。該術(shù)語(yǔ)也包含含有與附加區(qū)域一起的單獨(dú)連續(xù)區(qū)域或編碼多肽的不連續(xù)區(qū)域(例如多核苷酸被整合噬菌體，一種整合插入序列，一種整合載體序列，一種整合轉(zhuǎn)座子序列或RNA編輯，或者基因組DNA重組所打斷)的多核苷酸，也可含有編碼和/或非編碼序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及這里所述的多核苷酸的變體，它編碼具有SEQID NO2，4，6或8中的推斷氨基酸序列的多肽變體。本發(fā)明中的多核苷酸片段也可用于，如，合成本發(fā)明的全長(zhǎng)多核苷酸。
進(jìn)一步特別優(yōu)選的實(shí)施方案為編碼BASB034變體的多核苷酸，該變體具有SEQ ID NO2，4，6或8中BASB034多肽氨基酸序列，其中有一些，幾個(gè)，5到10，1到5，1到3，2個(gè)或1個(gè)或沒有氨基酸殘基被替代，修飾，缺失和/或增加，可以任意組合。這些中特別優(yōu)選的是沉默替換，增加及缺失，它們不改變BASB034多肽的性質(zhì)及活性。
本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案為與編碼具有SEQ ID NO2，4，6或8中列出的氨基酸序列的BASB034多肽的多核苷酸至少就全長(zhǎng)來說有85％一致的多核苷酸，以及與這些多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸?？蛇x擇地，最優(yōu)選的是，多核苷酸含有一區(qū)域，其全長(zhǎng)至少有90％與編碼BASB034多肽的多核苷酸一致或與此互補(bǔ)。在這方面，就全長(zhǎng)來說至少有95％與其上述多核苷酸一致的多核苷酸是特別優(yōu)選的。而且，在至少95％一致中，至少97％一致的那些多核苷酸是更優(yōu)選的，這些中至少98％及至少99％一致是特別優(yōu)選的，至少99％一致是更優(yōu)選的。
優(yōu)選的實(shí)施方案為編碼多肽的多核苷酸，該多肽與SEQ ID NO1，3，5或7的DNA編碼的成熟多肽相比，基本上保持了一致生物學(xué)功能或活性。
根據(jù)本發(fā)明的特定優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了多核苷酸，它可以，特別在嚴(yán)格條件下，與BASB034多核苷酸序列，例如在SEQ ID NO1，3，5或7中列出的那些多核苷酸序列雜交。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及與這里提供的多核苷酸序列雜交的多核苷酸。在這方面，本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與這里描述的多核苷酸雜交的多核苷酸。如這里所用的，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”及“嚴(yán)格雜交條件”指雜交僅為序列間至少95％及優(yōu)選地至少97％一致才可發(fā)生。嚴(yán)格雜交條件的一個(gè)具體例子是在42℃下，在含有下述試劑的溶液中過夜孵育，溶液中含有50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5×Denhardt′s濃液，10％硫酸葡聚糖及20mg/ml的變性剪切的鮭精DNA，隨之在65℃，0.1×SSC中洗滌雜交膜。雜交及洗滌條件是廣為人知的并在Sambrook等，MolecularCloningA Labortory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，特別是其中的第11章也進(jìn)行了示例。溶液雜交也可用于本發(fā)明提供的多核苷酸序列。
本發(fā)明也提供一種由下述的多核苷酸序列組成或包括下述多核苷酸序列的多核苷酸，這個(gè)多核苷酸通過在嚴(yán)格條件下，用具有SEQ IDNO1，3，5或7中列出的多核苷酸或其中的片段作為探針，篩選適宜的含有SEQ ID NO1，3，5或7中列出的多核苷酸的完整基因的文庫(kù)而獲得；并分離所說的多核苷酸序列。用于獲得這樣一種多核苷酸的片段包括，如，探針及引物這里到處都進(jìn)行完整描述。
如這里隨處討論的關(guān)于發(fā)明中多核苷酸分析方法，例如，本發(fā)明中的多核苷酸，可被用作雜交探針而與RNA，cDNA及基因組DNA雜交以分離全長(zhǎng)cDNAs及編碼BASB034的基因組克隆，分離與BASB034基因有高度同源性，尤其高的序列一致性的其它基因的cDNA及基因組克隆。這樣的探針一般將包含至少15個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)。優(yōu)選地，這樣的探針將具有至少30個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)并也可以具有至少50個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)。特別優(yōu)選的探針將具有至少20個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)并將具有少于30個(gè)的核苷酸殘基或堿基對(duì)。
BASB034的編碼區(qū)可用SEQ ID NO1，3，5或7中提供的一種DNA序列合成寡核苷酸探針通過篩選而分離。與本發(fā)明之相關(guān)基因具有互補(bǔ)序列的標(biāo)記寡核苷酸隨后用于篩選cDNA文庫(kù)，基因組DNA或mRNA以確定探針與文庫(kù)中的哪一個(gè)成員雜交。
有許多可以得到并為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的方法用以獲得全長(zhǎng)DNAs或延伸短DNAs，例如那些基于快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)的方法(見，如，F(xiàn)rohman，等PNAS，USA858998-9002，1988)。近期對(duì)該技術(shù)的修飾，例如由MarathonTMtechnology(ClontechLaboratories Inc.)示例，已明顯減化了對(duì)較長(zhǎng)cDNAs的搜索。在MarathonTM技術(shù)中，cDNA從選出的組織中提取的mRNA來制備，并且在每一末端連接一個(gè)“接頭”(adaptor)序列。然后用核酸擴(kuò)增(PCR)技術(shù)，以一種基因特異的和接頭特異的寡核苷酸引物的組合擴(kuò)增5′端“丟失”(missing)的DNA。然后用“巢式”引物，即引物設(shè)計(jì)為與擴(kuò)增的產(chǎn)物退火(典型地一種進(jìn)一步與接頭序列3′端退火的接頭特異引物及進(jìn)一步與選擇的基因序列到5′端退火的一種基因特異性引物)重復(fù)以上PCR反應(yīng)。隨后用DNA測(cè)序分析這一反應(yīng)產(chǎn)物，并且或者通過直接接合PCR產(chǎn)物與存在的DNA以給出一完整序列，或者用新的序列信息設(shè)計(jì)5′引物完成全長(zhǎng)基因的PCR來構(gòu)建一條全長(zhǎng)的DNA。
本發(fā)明中的多核苷酸及多肽可以被用作，例如，作為研究試劑或材料用以對(duì)疾病進(jìn)行治療及診斷，特別是人類疾病，如進(jìn)一步在此討論的與多核苷酸分析相關(guān)的內(nèi)容。
本發(fā)明中的多核苷酸為從SEQ ID NOS1-8中的序列得來的寡核苷酸，它可用于下述的方法中，但優(yōu)選地用于PCR，以確定是否在此鑒定的全長(zhǎng)或部分多核苷酸在被細(xì)菌感染的組織中進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄。已認(rèn)識(shí)到，這樣的序列在病原已達(dá)到了感染階段及感染類型的診斷中也將是很有用的。
本發(fā)明也提供編碼一種成熟蛋白加額外氨基酸或羧基末端氨基酸，或成熟氨基酸內(nèi)部的氨基酸(例如，當(dāng)成熟形式有不止一條的多肽鏈時(shí))的多核苷酸。這樣的序列可能在蛋白質(zhì)從前體到成熟形式的加工過程中在起重要作用，可允許蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，可加長(zhǎng)或縮短半壽期或可使用于分析或生產(chǎn)的蛋白容易操作，或其它事情中起作用。一般地是在體內(nèi)的情況，額外的氨基酸可被細(xì)胞內(nèi)的酶從成熟蛋白末端中剪切除去。
對(duì)于每一個(gè)及任何本發(fā)明中的多核苷酸，提供了與之互補(bǔ)的一種多核苷酸。這些互補(bǔ)的多核苷酸對(duì)與它們互補(bǔ)的每一個(gè)多核苷酸是完全互補(bǔ)的，這種情況是優(yōu)選的。
一種前體蛋白，具有融合一或多個(gè)原序列(prosequenes)多肽的成熟形式可以是該多肽的鈍化形式。當(dāng)原序列去除后，這樣鈍化了前體通常被激活。一些或全部的原序列可在激活前除去。通常地，這樣的前體被稱為原蛋白。
除了標(biāo)準(zhǔn)的A，G，C，T/U代表核苷酸外，術(shù)語(yǔ)“N”也可在本發(fā)明中用于描述一定的多核苷酸。“N”指四種DNA或RNA核苷酸中的任一種，可出現(xiàn)在DNA或RNA序列中指定的位置，優(yōu)選地，除了當(dāng)與臨近的核苷酸位置結(jié)合時(shí)，N不是一種核酸。當(dāng)以正確框架讀碼時(shí)，將在這樣的讀框中具有產(chǎn)生過早終止密碼的結(jié)果。概括起來，本發(fā)明中的多核苷酸可編碼成熟蛋白，成熟蛋白加導(dǎo)肽序列(它可表示為原蛋白)，具有一或多個(gè)不是蛋白導(dǎo)肽序列的前序列(prosequences)的成熟蛋白前體，或者前原蛋白(preproprotein)，它是蛋白的前體，具有導(dǎo)肽序列及一或多個(gè)前序列，導(dǎo)肽及前序列通常在產(chǎn)生活性及成熟形式多肽的加工步驟中被除去。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了本發(fā)明中的多核苷酸在治療或預(yù)防，尤其在遺傳免疫上的應(yīng)用。
本發(fā)明的多核苷酸在遺傳免疫中的應(yīng)用，優(yōu)選地使用適宜的運(yùn)送方法，例如直接將質(zhì)粒DNA注射進(jìn)入肌肉(Wolff等，Hum Mol Genet(1993)1363，Manthorpe等，Hum.Gene Ther(1983)4419)，運(yùn)送用特異蛋白的載體復(fù)合的DNA(Wu等，J Biol Chem(1989)26416985)，用磷酸鈣共沉淀DNA(Benvenisty & Reshef，PNAS USA(1986)839551)，用各種形式的脂質(zhì)體包裹DNA(Kaneda等，Science(1989)243375)，微彈轟擊(Tang等，Nature(1992)356152，Eisenbraun等，DNA Cell Biol(1993)12791)及用克隆的逆病毒載體在活體內(nèi)感染(Seeger等，PNAS USA(1984)815849)。載體，縮主細(xì)胞，表達(dá)體系本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的一或多個(gè)多核苷酸的載體，用該載體進(jìn)行遺傳工程改造的宿主細(xì)胞及通過重組技術(shù)產(chǎn)生的本發(fā)明中的多肽產(chǎn)物。也可使用無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)以用從本發(fā)明的DNA構(gòu)建物中得來的RNAs產(chǎn)生這樣的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中的重組多肽可通過本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所熟知的遺傳工程改造含有表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞的方法制備。相應(yīng)地，在進(jìn)一方面中，本發(fā)明涉及表達(dá)系統(tǒng)，它包括本發(fā)明中的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸，還涉及宿主細(xì)胞，它是用這樣的表達(dá)系統(tǒng)通過遺傳工程改造過的，以及涉及通過重組技術(shù)產(chǎn)生的發(fā)明的多肽產(chǎn)物。
對(duì)于本發(fā)明的多肽重組產(chǎn)物，宿主細(xì)胞能被通過遺傳工程改造以摻入表達(dá)系統(tǒng)或其部分或本發(fā)明的多核苷酸。向宿主細(xì)胞中引入多核苷酸能通過在許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)所述的方法實(shí)現(xiàn)，例如，Davis等，BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986)及Sambrook等，MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Sprin Harbor，N.Y.(1989)，例如，磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的感染，轉(zhuǎn)位，顯微注射，陽(yáng)離子脂介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔，轉(zhuǎn)導(dǎo)，Scrape loading，生物打靶(bauistic)導(dǎo)入及感染。
適宜宿主的代表實(shí)例包括細(xì)菌細(xì)胞，如鏈球菌(streptococci)，葡萄球菌(staphylococci)，鏈霉菌(streptomyces)，腸道球菌(enterococci)，大腸桿菌(E.coci)，藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)及粘膜炎莫拉氏菌；真菌細(xì)胞，例如，一種酵母細(xì)胞，克魯維酵母菌屬(kluveromyces)，糖酵母菌屬(Saccharomyces)，擔(dān)子菌(basidiomycete)，白色念球菌(candida albicans)及曲霉屬(Aspergillus)；昆蟲細(xì)胞，例如果蠅屬S2(Drosophila S2)及草地夜蛾Sf9；動(dòng)物細(xì)胞如CHO，COS，Hela，C127，3T3，293，CV-1及布氏黑色素瘤細(xì)胞；及植物細(xì)胞如裸子植物及被子植物細(xì)胞。
一系列表達(dá)系統(tǒng)可用來制備發(fā)明中的多肽。這樣的載體包括，染色體的附加體及病毒得來的染色體，除次之外還有其他。例如，從細(xì)菌質(zhì)粒來源的載體，從細(xì)菌噬菌體，轉(zhuǎn)座元，酵母附加體(episoes)，插入元件，酵母染色體元件，病毒如桿狀病毒，乳多空病毒，例如SV40，牛痘病毒，腺病毒，家禽水痘病毒，假性狂犬病病毒，微小RNA病毒，反轉(zhuǎn)錄病毒及α-病毒及來源于其中聯(lián)合形式的載體，如來源于質(zhì)粒及細(xì)菌噬菌體遺傳成分，粘粒及噬粒的載體。表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建物可含有控制區(qū)域，它調(diào)節(jié)同時(shí)也產(chǎn)生表達(dá)。通常，任何在宿主細(xì)胞中適于維持，繁殖或表達(dá)多核苷酸和/或表達(dá)一種多肽的系統(tǒng)或載體，在這一方面，都可用于表達(dá)。適宜的DNA序列可通過任何一系列已知及常規(guī)技術(shù)插入表達(dá)系統(tǒng)中，例如，在Sambrook等，Molecular Cloniag，ALaboratory Manual，(上文)中所指出的技術(shù)。
在真核生物重組表達(dá)系統(tǒng)中，對(duì)于一種翻譯的蛋白分泌進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔，進(jìn)入周質(zhì)腔，或進(jìn)入胞外環(huán)境中，正確的分泌信號(hào)可摻入表達(dá)的多肽中。這些信號(hào)可以是對(duì)多肽來講內(nèi)源的，也可以是異源信號(hào)。
本發(fā)明中的多肽可以從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中重組及純化，重組及純化方法是廣為人知的，包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸抽提，陰或陽(yáng)離子交換層析法，磷酸纖維素(phosphocellose)層析法，疏水互作層析法，親和層析法，羥基磷灰石層析法，及凝集素層析法。最優(yōu)選地，離子金屬親和層析(INAC)用于純化過程中。廣為人知的蛋白質(zhì)再折疊技術(shù)，當(dāng)多肽在細(xì)胞內(nèi)合成，分離和/或純化時(shí)變性，可被用于再生活性構(gòu)象形式。
表達(dá)系統(tǒng)也可是重組活的微生物，如病毒或細(xì)菌。目標(biāo)基因能被插入到活的重組細(xì)菌或病毒的基因組中。用這種活的載體接種及體內(nèi)感染將導(dǎo)致抗原的體內(nèi)表達(dá)并誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。用于該目的細(xì)胞或病毒如痘病毒(例如，牛痘，家禽水痘，金絲小痘(canarypox)，α-病毒(辛德比斯病毒，Semliki Forest病毒，委內(nèi)瑞拉馬腦膜炎病毒)，腺病毒，腺相關(guān)病毒，微小RNA病毒(脊髓灰質(zhì)炎病毒，(rhinovirus))，皰病病毒(帶狀皰診病毒等)，李斯特菌屬，沙門低菌屬，志賀菌屬，BCG。這些病毒或細(xì)菌可以是有毒力的，或者以各種方式減毒以便獲得活的疫苗。這樣的活疫苗也形成本發(fā)明的部分。診斷，預(yù)防，血清分型及突變分析本發(fā)明也涉及使用BASB034多肽及發(fā)明的多肽作診斷試劑。在真核生物中，尤其在哺乳動(dòng)物中，特別是人中檢測(cè)BASB034多核苷酸和/或多肽，將提供一種對(duì)疾病、病程或感染生物對(duì)藥物反應(yīng)的診斷方法。真核生物，尤其哺乳動(dòng)物，特別是人，特別是那些感染或被懷疑感染含有BASB034基因或蛋白的有機(jī)體，可在核酸或氨基酸水平，通過廣為人知的技術(shù)以及這里提供的方法檢測(cè)到。
用于預(yù)后，診斷或其它分析的多肽及多核苷酸可以從一假定的感染和/或感染的個(gè)體之身體材料中獲得。任何這些來源的多核苷酸，特別是DNA或RNA，可以直接用于檢測(cè)或可以在分析前通過PCR或者任何其它擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。RNA，尤其mRNA，cDNA及基因組DNA也可用于同樣的方式進(jìn)行分析。通過擴(kuò)增，體中的感染或駐留生物體的種類和體系，有機(jī)體一種選定的多核苷酸的基因型而獲得。缺失及插入能通過擴(kuò)增產(chǎn)物大小與從相關(guān)生物體中選擇出的一種參考序列的基因型相比較而檢測(cè)到，相關(guān)生物體優(yōu)選地為相同屬的不同種或相同種的不同株。點(diǎn)突變可以用標(biāo)記的BASB034多核苷酸序列雜交擴(kuò)增的DNA來鑒定。用DNase或RNase分別消化DNA或RNA，可以從不完整或比較明顯錯(cuò)配的雙螺旋中區(qū)分出完整或明顯配對(duì)的序列，或通過檢測(cè)變性溫度(解鏈溫度)及復(fù)性動(dòng)力學(xué)的不同也可對(duì)配對(duì)正確與否加以區(qū)分。多核苷酸序列的不同也可以通過與參考序列在凝膠中的電泳遷移率改變加以檢測(cè)。可以使用或不用變性試劑。多核苷酸的差異也可以通過直接對(duì)DNA或RNA進(jìn)行測(cè)序來檢測(cè)。見，如，Myers等Science，2301242(1985)。在特異座位的序列變化也可以通過核酸酶保護(hù)分析來揭示，如RNase，V1及S1保護(hù)分析或化學(xué)裂解方法。見，如，Cotton等PNAS.USA，854397-4401(1985)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，包括BASB034核酸序列或其中片段的寡核苷酸探針陣列可以被構(gòu)建以完成如遺傳突變，血型分型，分類學(xué)如上的分類或鑒定的有效篩選。陣列技術(shù)方法是已知的并已有普遍的應(yīng)用，它可用于解決一系列遺傳學(xué)包括基因表達(dá)，遺傳連鎖，及遺傳變異方面的問題(見，如，Chee等，Science，274610(1996))。
這樣在另一方面，發(fā)明涉及診斷試劑盒，它包括(a)本發(fā)明的多核苷酸，優(yōu)選地為SEQ ID NO1，3，5或7中的核酸序列，或其片段；(b)與(a)中序列互補(bǔ)的核苷酸序列；(c)本發(fā)明的多肽，優(yōu)選地為SEQ ID NO2，4，6或8中的多肽或其片段；或者(d)本發(fā)明之多肽的抗體，優(yōu)選地抗多肽SEQ ID NO2，4，6或8。
應(yīng)該意識(shí)到在每一個(gè)這樣的試劑盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可包括基本的組分。這樣試劑盒可用于診斷疾病或疾病的易感染性。
本發(fā)明也涉及使用本發(fā)明的多核苷酸作為診斷試劑。通過檢測(cè)與疾病或致病性相關(guān)的本發(fā)明的多核苷酸，優(yōu)選SEQ ID NO1，3，5或7的突變形式，將會(huì)提供一種能增加或確定疾病的診斷、病程的預(yù)后，疾病名稱的確定或疾病易感染性的工具，這是基于多核苷酸的表達(dá)低下、過表達(dá)或表達(dá)變化而得出的結(jié)論?？梢酝ㄟ^各種技術(shù)，如本文其它地方描述的各種技術(shù)在多核苷酸水平檢測(cè)到在該多核苷酸中有突變的生物體，特別是感染的生物體。
來自本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽上攜帶突變或多形性(等位基因變異)的生物體的細(xì)胞，也可以通過一系列技術(shù)，如，血清分型，在多核苷酸或多肽水平被檢測(cè)到。例如，RT-PCR能用于在RNA水平檢測(cè)突變。尤其優(yōu)選的是用RT-PCR與自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，例如，GeneScan相結(jié)合使用。RNA，cDNA或基因組，DNA也可用于一致的目的，PCR。作為一個(gè)實(shí)例，與編碼BASB034多肽的多核苷酸互補(bǔ)的PCR引物可用于鑒定及分析突變。
本發(fā)明進(jìn)一步提供從5′和/或3′端移去1，2，3，或4個(gè)核苷酸的引物。這些引物可以用于，在其它事例之中，擴(kuò)增來源于個(gè)體的樣品，如身體材料中分離到的BASB034 DNA和/或RNA。引物可以用于擴(kuò)增從感染的個(gè)體中分離的多核苷酸。這樣，該多核苷酸可隨后用各種各樣的技術(shù)闡明其序列。這樣的話，多核苷酸中的突變可以被檢測(cè)到并且可以用于感染的診斷和/或預(yù)后，或其階段或病程，或感染原的血清分型和/或分類。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種疾病的診斷方法，優(yōu)選地細(xì)菌感染的診斷方法，更優(yōu)選地由粘膜炎莫拉氏菌引起的感染，包括確定來源于個(gè)體的樣品，例如身體原料中多核苷酸表達(dá)水平的升高，其中該多核苷酸具有SEQ ID NO1，3，5或7的序列。BASB034多核苷酸的表達(dá)升高或降低可用本領(lǐng)域中技術(shù)人員所熟知的任何方法測(cè)量以定量多核苷酸，例如，擴(kuò)增，PCR，RT-PCR，RNase保護(hù)，Northern印跡，光譜或其它雜交方法。
另外，本發(fā)明用于檢測(cè)，與正常對(duì)照組織樣品相比較，過表達(dá)的BASB034多肽的診斷分析可用于檢測(cè)感染的存在與否。能夠用于確定從宿主，例如身體材料得來的樣品中BASB034多肽水平的分析技術(shù)為本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所熟知。這樣的分析方法包括放射免疫分析，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析；Western雜交分析，抗體夾心分析，抗體檢測(cè)及ELISA分析。
本發(fā)明的多核苷酸可用作多核苷酸陣列的成分，優(yōu)選地高密度陣列或載網(wǎng)(grids)。這些高密度陣列對(duì)診斷及預(yù)后的研究方面特別有用。例如，每一個(gè)都含有一種不同基因的一系列點(diǎn)，并進(jìn)一步包括本發(fā)明的一種或多種多核苷酸，可用作探針進(jìn)行檢測(cè)，例如用雜交或核酸擴(kuò)增，用從身體材料獲得或來源的探針來確定在個(gè)體中特定的多核苷酸序列或相關(guān)序列的存在與否。這樣的一種存在可指示一種病原的存在，尤其是粘膜炎莫拉氏菌的存在，并且在診斷和/或預(yù)后疾病或病程中很有用。包括一定數(shù)量的SEQ ID NO1，3，5或7中的多核苷酸序列的變體的載網(wǎng)是優(yōu)選的。也優(yōu)選的是包括一定數(shù)量的編碼SEQID NO2，4，6或8中多肽序列的多核苷酸之變體的載網(wǎng)。抗體本發(fā)明的多肽及多核苷酸或其變體，或其表達(dá)細(xì)胞，可用作免疫原以產(chǎn)生分別對(duì)這樣的多肽或多核苷酸具有免疫特異性的抗體。
在發(fā)明的一些特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了抗BASB034多肽或多核苷酸的抗體。
抗本發(fā)明的多核苷酸或多肽的抗體，可通過給動(dòng)物，優(yōu)選非人動(dòng)物施用本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸，或兩者之一或兩者的表位指帶片段，兩者之一或兩者的類似物，表達(dá)兩者之一或兩者的細(xì)胞，通過常規(guī)方法而得到。對(duì)于制備單克隆抗體，任何本領(lǐng)域中所熟知的提供通過連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)制備抗體的技術(shù)都是可用的。包括各種各樣技術(shù)的實(shí)例，例如在Kohler G.及Milstein，C.Nature256495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today472(1983)；Cole等，MonoclonalAntibodies And Cancer Therary，Alan R.Liss，Inc.(1985)77-96頁(yè)中所描述的。
制備單鏈抗體的技術(shù)(U.S.專利4,946,778號(hào))可適用于制備本發(fā)明的多肽或多核苷酸的抗體。同樣地，轉(zhuǎn)基因小鼠，或其它機(jī)體或動(dòng)物，如其它哺乳動(dòng)物，可用于表達(dá)對(duì)本發(fā)明中的多肽或多核苷酸免疫特異性的人源化抗體。
可選擇地，噬菌體展示技術(shù)可以用于從或者人淋巴細(xì)胞中篩選含有抗-BASB034的PCR擴(kuò)增的v-基因的所有組分中或者從原初文庫(kù)中(McCafferty等，(1990)，Nature348，552-554；Marks等，(1992)Biotechnology10，779-783)選擇與本發(fā)明的多肽可特異性結(jié)合的抗體基因。這些抗體的親和性也可通過鏈改組而得到改善(Clackson等，(1991)Nature352628)。
以上描述的抗體可用于分離或鑒定表達(dá)本發(fā)明的多肽或多核苷酸的克隆，或通過親合層析純化該多肽或多核苷酸。
這樣，抗BASB034多肽或BASB034多核苷酸的抗體可用于治療感染，這只是其中之一，尤其細(xì)菌感染。
多肽變體包括抗原性，表位性或免疫性等效的變體，形成本發(fā)明的一個(gè)特別的方面。
優(yōu)選地，抗體或其變體被修飾以使其在個(gè)體中的致免疫性降低。例如，如果個(gè)體為人，抗體將最優(yōu)選地是“人源化”的。其中該互補(bǔ)決定區(qū)或雜交瘤來源的抗體區(qū)域已被移植到人的單克隆抗體中，如，像在Jones等(1986)，Nature321，522-525或Tempest等，(1991)Biotechnology9，266-273中所描述的那樣。拮抗劑及激動(dòng)劑-分析及分子本發(fā)明中的多肽及多核苷酸也可用于評(píng)價(jià)在細(xì)胞，無(wú)細(xì)胞制備物，化學(xué)文庫(kù)，及天然產(chǎn)物混合物中小分子底物及配體的結(jié)合。這些底物及配體可以是天然底物及配體或者可以是結(jié)構(gòu)及功能模擬物，見，如Coligan等，Current Prolocols in Immunology 1(2)Chapter 5(1991)。
篩選方法可簡(jiǎn)單地通過一種直接或間接地與候選化合物相關(guān)的標(biāo)記測(cè)量一種候選化合物與該多肽或多核苷酸，或與攜帶多肽或多核苷酸的細(xì)胞或膜，或該多肽的一種融合蛋白的結(jié)合?？蛇x擇地，篩選方法可包括與一種標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)物的競(jìng)爭(zhēng)。進(jìn)一步，用含有該多肽或多核苷酸的適宜細(xì)胞的檢測(cè)系統(tǒng)，這些篩選方法可測(cè)試是否這個(gè)候選化合物通過多肽或多核苷酸的激活或抑制導(dǎo)致一種信號(hào)產(chǎn)生?；罨种苿┩ǔＴ谝环N已知的激動(dòng)劑存在下進(jìn)行分析，并且可以觀察到在候選化合物存在下通過激動(dòng)劑激活的效果。組成性活化的多肽或/和組成性表達(dá)的多肽及多核苷酸在一種激動(dòng)劑或抑制子存在下，通過測(cè)試是否該候選化合物導(dǎo)致了多肽或多核苷酸的抑制或激活，可用在篩選方法中以逆轉(zhuǎn)激動(dòng)劑或抑制劑。進(jìn)一步，篩選方法可簡(jiǎn)單地包括以下步驟將含有本發(fā)明的多肽或多核苷酸的溶液與候選化合物混合以形成一種混合物，比較混合物中BASB034多肽和/或多核苷酸與標(biāo)準(zhǔn)物的活性。融合蛋白，如此前所述的由Fc部分與BASB034多肽構(gòu)成的那些融合蛋白，也能用于高通量篩選分析中以鑒定發(fā)明中多肽的拮抗劑，同時(shí)也可鑒定系統(tǒng)發(fā)育和/或功能上相關(guān)的多肽(見D.Bennett等，J MolRecognition，852-58(1995)；及K.Johanson等，J Biol Chem.270(16)9459-9471(1995))。
多核苷酸，多肽以及與發(fā)明中的一種多肽結(jié)合和/或相互作用的抗體也可用作檢測(cè)細(xì)胞中增加的化合物對(duì)mRNA和/或多肽產(chǎn)生影響的構(gòu)型篩選方法。例如，可建立一種ELISA分析，用本領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法，以單克隆及多克隆抗體測(cè)量分泌的或細(xì)胞相關(guān)水平的多肽。這能夠用于從適當(dāng)?shù)臉?gòu)建細(xì)胞或組織中發(fā)現(xiàn)抑制或增強(qiáng)多肽產(chǎn)生的試劑(也分別叫做拮抗劑或激動(dòng)劑)。
本發(fā)明也提供一種篩選化合物以鑒定那些增強(qiáng)(激動(dòng)劑)或阻斷(拮抗劑)BASB034多肽活性或多核苷酸活性，特別是那些制菌的和/或殺菌的化合物的方法。該篩選方法可以包括高通量技術(shù)。例如，篩選激動(dòng)劑或拮抗劑，一種合成的反應(yīng)混合物，一種細(xì)胞間隔，如一種膜，細(xì)胞膜或細(xì)胞壁，或任何其中一種制備物，在可能為BASB034激動(dòng)劑或拮抗劑的候選分子存在或缺失下孵育含有BASB034多肽及標(biāo)記底物或該多肽的配體。候選分子激動(dòng)或拮抗BASB034多肽的能力反映在降低的標(biāo)記配體的結(jié)合或從這種底物產(chǎn)生的產(chǎn)物的降低中。天然結(jié)合的分子，也就是，沒有誘導(dǎo)BASB034多肽的效果是最好的拮抗劑。結(jié)合好的分子，或事實(shí)可能如此，生高從底物產(chǎn)生產(chǎn)物的速率，升高信號(hào)傳遞能力，或升高化學(xué)通道活性的分子為激動(dòng)劑。檢測(cè)從底物產(chǎn)生的產(chǎn)物，信號(hào)傳導(dǎo)或化學(xué)通道活性的速率或水平可通過用一種報(bào)告系統(tǒng)而增強(qiáng)。報(bào)告系統(tǒng)在該方面有用，報(bào)告系統(tǒng)包括但不限于比色，標(biāo)記的底物轉(zhuǎn)變成為產(chǎn)物，對(duì)BASB034多肽或多核苷酸活性變化敏感的一種報(bào)告基團(tuán)，以及本領(lǐng)域中所熟知的結(jié)合分析。
用于BASB034激動(dòng)劑分析的另一實(shí)例是一種競(jìng)爭(zhēng)性分析，它結(jié)合于BASB034及BASB034-結(jié)合分子的潛在激動(dòng)劑，重組的BASB034結(jié)合分子，天然底物或配體，或底物或配體模擬物，在適當(dāng)?shù)臈l件下用于競(jìng)爭(zhēng)性抑制分析。BASB034能夠被標(biāo)記，如通過放射活性或一種比色化合物，這樣，與結(jié)合分子結(jié)合的BASB034分子數(shù)量或轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的數(shù)量能被精密地檢測(cè)到以評(píng)價(jià)該潛在的拮抗劑的效果。
潛在的拮抗劑包括，除下面列舉之外還有其它的，小的有機(jī)分子，肽，多肽及與本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽結(jié)合的抗體，并因此抑制或滅絕其活性或表達(dá)。潛在的拮抗劑也可以是小的有機(jī)分子，肽，多肽如緊密相關(guān)的蛋白或在結(jié)合分子上結(jié)合一致位點(diǎn)的抗體，如結(jié)合分子，沒有誘導(dǎo)BASB034誘導(dǎo)的活性，因此通過從結(jié)合中去除BASB034多肽和/或多核苷酸而阻止BASB034多肽和/或多核苷酸的活性或表達(dá)。
潛在的拮抗劑包括一種小的分子，它結(jié)合多肽并占據(jù)該多肽上的結(jié)合位點(diǎn)，因此阻止和細(xì)胞結(jié)合分子的結(jié)合，由此導(dǎo)致正常的生物學(xué)活性被抑制。小分子的實(shí)例包括但不限于小的有機(jī)分子，肽或肽樣分子。其它潛在的拮抗劑包括反義分子(見Okano，J.Neurochem，56560(1991)；Oligodeoxynucleotides As Antisense Inhibitors of GeneExpression，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988)，描述了這些分子)。優(yōu)選的潛在拮抗劑包括與BASB034相關(guān)的化合物及其變體。
在進(jìn)一方面中，發(fā)明涉及通過遺傳工程生產(chǎn)包括發(fā)明的多肽，或其片段，以及各種亞類(IgG，IgM，IgA，IgE)的免疫球蛋白的重鏈或輕鏈恒定區(qū)各個(gè)部分的可溶性融合蛋白。優(yōu)選的作為免疫球蛋白是人IgG重鏈恒定區(qū)部分，特別是IgG1，其中融合發(fā)生在鉸鏈區(qū)。在一具體的實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分可簡(jiǎn)單地通過摻入一種斷裂序列而被去除，該斷裂序列可用凝血因子Xa切斷。而且，本發(fā)明涉及通過遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，以及涉及使用其中的融合蛋白進(jìn)行藥物篩選，診斷及治療。本發(fā)明的進(jìn)一方面也涉及編碼此類融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術(shù)的實(shí)例可在國(guó)際專利申請(qǐng)WO94/29458及WO94/22914中找到。
這里提供的每一多核苷酸序列可用于抗菌化合物的發(fā)現(xiàn)及開發(fā)。表達(dá)之后，所編碼的蛋白質(zhì)，也可用作抗菌藥物篩選的靶。此外，編碼該編碼蛋白的氨基末端區(qū)域或SD(shine-Delgarno)或各自mRNA的其它翻譯幫助序列的多核苷酸序列能被用于構(gòu)建反義序列以控制目標(biāo)編碼序列的表達(dá)。
本發(fā)明也提供了其中的多肽，多核苷酸，激動(dòng)劑或拮抗劑在干擾一或多種病原和作為感染宿主的真核生物優(yōu)選哺乳動(dòng)物的初始生理相互作用中的應(yīng)用。特別地，發(fā)明中的分子可用于阻止細(xì)菌，特別是革格氏陽(yáng)性和/或陰性細(xì)菌，粘附到真核細(xì)胞，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物，在內(nèi)在裝置上的胞外基質(zhì)蛋白或在傷口中的胞外基質(zhì)蛋白；阻止真核細(xì)胞，優(yōu)選地哺乳動(dòng)物，胞外基質(zhì)蛋白和介導(dǎo)組織損傷的細(xì)菌BASB034蛋白間的粘附；和/或阻止有感染性的致病機(jī)理的進(jìn)展啟動(dòng)而不是通過植入內(nèi)在裝置或通過其它的外科技術(shù)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了BASB034激動(dòng)劑及拮抗劑，優(yōu)選地殺菌的或制菌的激動(dòng)劑和拮抗劑。
本發(fā)明中的拮抗劑及激動(dòng)劑可以用于，例如，阻止，抑制和/或治療疾病。
在進(jìn)一步的一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明多肽的模擬肽(mimotopes)。模擬肽是一種肽序列，與天然肽(序列或結(jié)構(gòu)上)足夠相似，它可以被識(shí)別天然肽的抗體所識(shí)別；或當(dāng)與一種適宜的載體偶聯(lián)時(shí)它能夠富聚(raising)識(shí)別天然肽的抗體。
通過對(duì)選定的氨基酸增加，缺失或替換可以設(shè)計(jì)出用于特殊目的的模擬肽。這樣，可因與一蛋白載體容易結(jié)合的目的而修飾肽。例如，用一些化學(xué)接合方法來加入末端半胱氨酸是可取的。此外，對(duì)于肽接入一種含有遠(yuǎn)離該肽接合末端的疏水端的蛋白載體也是可取的，這樣該肽的游離未結(jié)合末端保持與該載體蛋白表面相聯(lián)系。由此呈現(xiàn)該肽的一種構(gòu)象，該構(gòu)象與上下文中可見的全部天然分子的肽的構(gòu)象最大地相似。例如該肽可以改變成具有N-末端半胱氨酸及C-末端疏水酰胺尾巴?？蛇x擇地，一或多個(gè)氨基酸的D-立體異構(gòu)型的增加或替換可以被完成以創(chuàng)造一有益的衍生物，例如增強(qiáng)肽的穩(wěn)定性。
可選擇地，模擬肽可用抗體以如噬菌體展示技術(shù)(EP0552267B1)等技術(shù)加以鑒定，該抗體可與本發(fā)明的多肽結(jié)合。這一技術(shù)，產(chǎn)生大量的肽序列，這些肽序列與天然肽的結(jié)構(gòu)相似并因此能夠與抗天然肽抗體結(jié)合，但不要它們自己與天然肽享有顯著的序列同源性。疫苗發(fā)明的另一方面涉及一種在個(gè)體，尤其哺乳動(dòng)物，優(yōu)選地人中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，包括用BASB034多核苷酸和/或多肽，或其片段或其變體接種該個(gè)體，足夠產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞免疫反應(yīng)以保護(hù)該個(gè)體免受感染，特別是細(xì)菌感染，最特別地是粘膜炎莫拉氏菌感染。也提供該免疫反應(yīng)減慢細(xì)菌復(fù)制的方法。發(fā)明的另一方面涉及在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，包括向該個(gè)體導(dǎo)入一種核酸載體，序列或核酶以指導(dǎo)BASB034多核苷酸和/或多肽或其片段或其變體的表達(dá)，以使在體內(nèi)表達(dá)BASA034多核苷酸或/和多肽，或其片段或其變體以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，如，產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞免疫反應(yīng)，包括，例如，細(xì)胞因子產(chǎn)生T細(xì)胞或細(xì)胞毒T細(xì)胞，以保護(hù)該個(gè)體，優(yōu)選地是人，免受疾病侵害，無(wú)論該疾病已經(jīng)存在與否。一種導(dǎo)入基因的實(shí)例是通過作為一種粒子或其它材料的包被而被加速導(dǎo)入靶細(xì)胞中。這樣的核酸載體可包括DNA，RNA，核酶，修飾的核酸，DNA/RNA雜交分子，DNA-蛋白質(zhì)化合物或RNA-蛋白質(zhì)化合物。
本發(fā)明的進(jìn)一步涉及一種免疫組合物，當(dāng)導(dǎo)入一個(gè)體，優(yōu)選地是人中時(shí)，能夠在其內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，在這樣的個(gè)體中誘導(dǎo)一種對(duì)BASB034多核苷酸和/或其編碼的多肽的免疫反應(yīng)，其中該組合物包括重組的BASB034多核苷酸和/或其編碼的多肽和/或包括DNA和/或RNA，該DNA和/或RNA編碼及表達(dá)所說的BASB034多核苷酸，其編碼的多肽，或本發(fā)明中其它的多肽的抗原。免疫反應(yīng)可用于治療或預(yù)防并可產(chǎn)生抗體免疫和/或細(xì)胞免疫形式，例如發(fā)生于CTL或OD4+T細(xì)胞中的細(xì)胞免疫。
BASB034多肽或其片段可與輔助蛋白(co-protein)或化學(xué)部分(chemical moiety)融合，該輔助蛋白或化學(xué)部分可以或不可以通過它們自己產(chǎn)生抗體，但它卻能夠穩(wěn)定第一蛋白并產(chǎn)生一種融合或修飾的蛋白，它將具有抗原和/或免疫原的特性，并優(yōu)選地保護(hù)特性。這樣融合的重組蛋白，優(yōu)選地進(jìn)一步含有一種抗原性輔助蛋白，如來源于嗜血流桿菌的脂蛋白D，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)或β-半乳糖苷酶，或任何其它相關(guān)的穩(wěn)定該蛋白并使制備及純化容易的大的輔助蛋白。而且，在提供一種接受該蛋白的有機(jī)體的免疫系統(tǒng)綜合刺激的意義上，該輔助蛋白可扮演一種佐劑的角色。該輔助蛋白可以附著在第一蛋白的氨基端或其羧基末端。
由本發(fā)明提供的是組合物，特別是疫苗組合物，及含有本發(fā)明中的多肽和/或多核苷酸的方法，以及免疫刺激性DNA序列，如那些在Sato，Y等Science273352(1996)中所述的。
本發(fā)明也提供使用所述的多核苷酸或特別是其中的片段的方法，它們已被證明編碼細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白非變化區(qū)域，這些多核苷酸或其中的片段用在多核苷酸構(gòu)建物中以用于粘膜炎莫拉氏菌感染的動(dòng)物模型中的遺傳免疫實(shí)驗(yàn)。這樣的實(shí)驗(yàn)在鑒定能夠引起預(yù)防或治療免疫反應(yīng)的蛋白表位中將是特別有用的。據(jù)信，該方法將考慮到隨后的特殊價(jià)值的單克隆抗體的制備，從成功地抵抗或清除感染的動(dòng)物需要的組織得來的，用于開發(fā)預(yù)防性試劑或細(xì)菌感染的治療試劑，尤其是在哺乳動(dòng)物，優(yōu)選地為人中，粘膜炎莫拉氏菌感染。
本發(fā)明也包括一種疫苗制劑，它包含本發(fā)明的致免疫重組多肽和/或多核苷酸，和一種適宜的載體，例如一種藥學(xué)上可接受的載體。由于多肽及多核苷酸在胃中可被破壞(break down)，優(yōu)選地不經(jīng)腸胃給藥，包括，例如，經(jīng)皮下，肌肉內(nèi)，靜脈，皮膚內(nèi)給藥。適于皮下給藥的形式包括水及非水無(wú)菌注射液，它可含有抗氧化劑，緩沖液，制菌化合物及溶解物，它使該制劑和體液等滲，優(yōu)選地與血液等滲；并且水及非水的無(wú)菌懸浮液可包括懸浮劑或稠化劑。該制劑可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如，密封于安瓿瓶及玻璃小瓶中并可貯存于凍干條件下，只是在使用前需要時(shí)加入無(wú)菌水載體。
本發(fā)明的疫苗制劑也包括用以增強(qiáng)該制劑的致免疫性的佐劑體系。優(yōu)選地該佐劑體系優(yōu)先升高一種TH1型的反應(yīng)。
免疫反應(yīng)可以概括地區(qū)分成兩種極端的類別，即一種體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(傳統(tǒng)地分別通過抗體及保護(hù)細(xì)胞效應(yīng)機(jī)制來辨別)。這些反應(yīng)的類別被稱作TH1型反應(yīng)(細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng))，及TH2型免疫反應(yīng)(體液反應(yīng))。
極端的TH1免疫應(yīng)答可能以產(chǎn)生以下兩種細(xì)胞為特點(diǎn)抗原特異性的單元型限制性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞，在小鼠中TH1類型應(yīng)答經(jīng)常以產(chǎn)生抗體IgG2a亞型為特點(diǎn)、而在人體中相應(yīng)的是IgG1類型的抗體，TH1類型免疫應(yīng)答以產(chǎn)生多種免疫球蛋白同位型為特點(diǎn)，在鼠類中包括IgG1、IgA和IgM。
可以認(rèn)為在這兩種類型免疫應(yīng)答產(chǎn)生的背后的原動(dòng)力是細(xì)胞因子，高水平的TH1類型細(xì)胞因子有利于誘導(dǎo)針對(duì)特定抗原的由細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而TH1類型免疫應(yīng)答的高水平傾向于促進(jìn)誘導(dǎo)針對(duì)性的體液免疫應(yīng)答。
TH1類型和TH2類型免疫應(yīng)答之間的區(qū)別并不是絕對(duì)的，實(shí)際上一個(gè)個(gè)體會(huì)產(chǎn)生一種主要是TH1或主要是TH2類型的免疫應(yīng)答。然而，通過使用Mosmann和Coffman在鼠的CD4＋veT細(xì)胞克隆中的條件去研究細(xì)胞因子的類型將會(huì)很方便。見(Mosmann，T.R.and Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2細(xì)胞不同類型的淋巴因子導(dǎo)致不同的功能特征Annual Review of Immunology，7，p145-173)。一般情況下，TH1類型應(yīng)答與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和TNF-γ和IL-2細(xì)胞因子相聯(lián)系。其他直接與TH1類型免疫應(yīng)答誘導(dǎo)相關(guān)的細(xì)胞因子不是由T細(xì)胞產(chǎn)生的，如IL-12。對(duì)應(yīng)的，TH2類型應(yīng)答與IL-4，IL-5，IL-6和IL-13的分泌相關(guān)。
已知一些疫苗佐劑非常適于誘發(fā)TH1或TH2類型的細(xì)胞因子應(yīng)答。一般情況下，在接種或感染之后免疫應(yīng)答TH1∶TH2平衡的最好標(biāo)志包括以下兩種用抗原再次誘發(fā)后在體外對(duì)由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的TH1或TH2細(xì)胞因子進(jìn)行直接測(cè)量，和/或測(cè)量抗原特異性抗體應(yīng)答IgG1∶IgG2a比例。
這樣，TH1類型佐劑就是一種佐劑當(dāng)在體外用抗原再次誘發(fā)時(shí)它可以優(yōu)先地誘導(dǎo)分離的T細(xì)胞群產(chǎn)生高水平和TH1類型細(xì)胞因子并且促進(jìn)產(chǎn)生CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和與TH1類型同位型相關(guān)的抗原特異性免疫球蛋白應(yīng)答。
能夠優(yōu)先地誘導(dǎo)TH1細(xì)胞應(yīng)答的佐劑參見國(guó)際專利申請(qǐng)WO94/00153和WO95/17209。
3De-O-?；瘑瘟姿狨(3D-MPL)就是這樣一種佐劑，這是由GB 2220211(Ribi)得知的，化學(xué)上它是3De-O-酰基化單磷酸酯A和4，5，6?；湹幕旌衔?。由Ribi Immunochem，Montana生產(chǎn)。3De-O-酰化單磷酸酯A的一種優(yōu)選形式見歐洲專利0689454B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)。
3D-MPL顆粒最好足夠小以便濾過0.22微米的膜進(jìn)行除菌(歐洲專利0689454)每劑中3D-MPL應(yīng)在10μg～100μg之間，最好在25～50μg，每劑量中的抗原一般在2～50μg范圍內(nèi)。
另一種優(yōu)選的佐劑包括QS21，它是由Quilluja Saponaria Molina樹皮得到的一種Hplc純化的無(wú)毒成分。任選地，可與3De-O-?；瘑瘟姿狨(3D-MPL)混合使用，任選聯(lián)用一種載體。
QS21的生產(chǎn)方法見US patent No.5,057,540。包含QS21的非反應(yīng)原性的佐劑以前有過敘述(WO96/33739)。這些包含QS21和膽固醇的制劑當(dāng)與一種抗原配合時(shí)是成功的TH1誘發(fā)佐劑。
TH1細(xì)胞應(yīng)答的另外一些優(yōu)選誘發(fā)佐劑包括免疫調(diào)節(jié)寡核苷酸，如非甲基化的CpG序列見WO96/02555。
我們也研究了把上述提到的不同的TH1誘發(fā)佐劑進(jìn)行組合產(chǎn)生TH1細(xì)胞應(yīng)答的優(yōu)先誘發(fā)劑。例如，QS21可與3D-MPL配制。QS21∶3D-MPL比例一般是1∶10到10∶1，最好在1∶5到5∶1，經(jīng)常是基本上1∶1，最佳協(xié)作的合適范圍為3D-MPL∶QS212.5∶1到1∶1。
候選地，在本發(fā)明的疫苗組合物中包含一種載體，這種載體可以是水包油乳劑，或是鋁鹽如鋁磷酸鹽或氫氧化鋁。
水包油乳劑最好包含一種可代謝的油，如角鯊烯，α生育酚和吐溫80。根據(jù)本發(fā)明，疫苗組合物中的抗原非常適合在這種乳劑中與QS21和3D-MPL混合，另外，水包油乳劑中的油可能包含斯潘85(span85)和/或卵磷酯和/或三辛酸甘油酯。
一般情況下對(duì)人用藥QS21和3D-NPL在疫苗中應(yīng)為1μg～200μg，如10～100μg，最好每劑量含10μg～50μg。一般情況下水包油乳劑會(huì)含有2～10％的角鯊烯，2～10％的α生育酚和0.3～3％的吐溫80。角鯊烯α生育酚的比例最好等于或小于1，這樣可以形成更穩(wěn)定一些的乳劑。還可以含有1％水平的斯潘85。在一些情況下，本發(fā)明的疫苗中進(jìn)一步含有一種穩(wěn)定劑可能效果不錯(cuò)。
無(wú)毒性水包油乳劑最好在水性載體中包含一種無(wú)毒油，如角鯊?fù)榛蚪酋徬?，一種乳化劑，如吐溫80。水性載體可以是，例如，磷酸緩沖鹽水。
一種非常強(qiáng)力的佐劑制劑在水包油乳劑中包含QS21，3D-MPL和生育酚，見WO95/17210。
本發(fā)明還提供了一種多價(jià)疫苗組合物，它包括本發(fā)明的疫苗制劑，和其它抗原，尤其是一些對(duì)治療癌癥，自體免疫疾病和相關(guān)疾病有用的抗原。這樣的多價(jià)疫苗可能包括上面描述的TH1誘導(dǎo)佐劑。
本發(fā)明雖然參照一些BASB034多肽和多核酸進(jìn)行描述，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到它們不僅包含天然生成的多肽和多核苷酸片段還包括類似的多肽和多核苷酸，后者雖含有插入、缺失或替換，但并沒有顯著改變重組多肽或多核苷酸的免疫原性。組合物，試劑盒和給藥本發(fā)明的另一方面提供了包含BASB034多肽和/或BASB034多核苷酸的組合物，用于細(xì)胞或一種多細(xì)胞生物。
本發(fā)明還涉及包括多核苷酸和/或多肽或它們的溴子動(dòng)劑或拮抗藥的組合物。本發(fā)明的多肽和多核苷酸可與下列載體結(jié)合使用未滅菌的和無(wú)菌的載體或用于細(xì)胞、組織或生物體的載體，如適于對(duì)生物個(gè)體用藥用載體。這些組合物包括，例如，一種媒介添加物或有效治療量的本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸和可藥用的載體或賦形劑。這些載體可包括，但不僅限于，鹽水，緩沖鹽水，右旋糖，水，甘油，乙醇和它們的組合。制劑應(yīng)適于用藥的方式。本發(fā)明進(jìn)一步涉及診斷和藥用包裝和試劑盒，包括裝有本發(fā)明前面提到的組分中的一種或多種的一個(gè)或多個(gè)容器。
本發(fā)明的多肽，多核苷酸和其它化合物可單獨(dú)使用也可與其他化合物如治療化合物聯(lián)用。
這些藥物組合物可通過任何有效方便的方法進(jìn)行用藥，包括，例如局部的，口服的，肛門的，陰道的，靜脈的，腹膜內(nèi)的，肌內(nèi)的，皮下的，鼻內(nèi)的，真皮內(nèi)的用藥。
在治療和預(yù)防中，該具有活性的藥劑可作為可注射成分用于生物個(gè)體，例如無(wú)毒的水性分散體，最好是等滲的。
另一方面，本發(fā)明提供了藥組合物，該組合物包括治療有效量的多肽和/或多核苷酸，例如本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸的可溶形式，增效或拮抗多肽或小分子化合物，以及藥用的載體或賦形劑。這些載體包括，但不僅限于，鹽水，緩沖鹽水，右旋糖，水，甘油，乙醇和它們的組合。本發(fā)明進(jìn)一步有關(guān)于藥盒和試劑盒，包括裝有本發(fā)明前面提到的組分中的一種或多種成分的一個(gè)或多個(gè)容器。多肽，多核苷酸和本發(fā)明的其他化合物可以單獨(dú)使用或與其他化合物如治療化合物結(jié)合使用。
組合物應(yīng)根據(jù)用藥方式，如全身的或口服的，進(jìn)行調(diào)整。優(yōu)選的全身用藥方式包括注射，一般是靜脈注射。也可使用其它的注射方式，如皮下，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。全身用藥的其它可選方式包括使用滲透劑，如膽汁鹽或夫西地酸或其它去垢劑進(jìn)行跨粘膜和跨真皮用藥。另外，如果本發(fā)明的多肽或其它化合物可制成腸衣或膠囊制品，口服也是可以的。這些化合物的用藥也可以是局部的，如使用軟膏，膏藥，凝膠，溶液，粉末等形式。
對(duì)哺乳動(dòng)物，尤其對(duì)人進(jìn)行用藥，該活性藥劑的日劑量水平應(yīng)為0.01mg/kg到10mg/kg，一般在1mg/kg左右。醫(yī)師無(wú)論如何應(yīng)確定生物個(gè)體的最適實(shí)際用量，該用量隨特定個(gè)體的年齡、體重和應(yīng)答而變化。以上的劑量只是平均水平，當(dāng)然會(huì)出現(xiàn)超出以上范圍的情況，這一情況屬于本發(fā)明的范疇。
所需劑量范圍取決于選取的多肽，用藥的方式，制劑的性質(zhì)，受治療者的情況和醫(yī)師的判斷。然而，合適的劑量在0.1～100μg/kg范圍內(nèi)。
疫苗組合物很容易制成可注射的形式。可使用傳統(tǒng)的佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答。用于接種的適當(dāng)單位劑量為0.5～5mg/kg抗原，這種劑量最好間隔1～3周，用藥1～3次，使用指定范圍的劑量不會(huì)觀察到本發(fā)明化合物的不利毒理反應(yīng)，進(jìn)而可用于合適的生物個(gè)體。
由于存在多種可使用的化合物并且不同用藥方式的效率不同，導(dǎo)致所需劑量的大范圍變化。例如，口服用藥將會(huì)需要的劑量多于靜脈注射。這些劑量水平的變化可使用標(biāo)準(zhǔn)的經(jīng)驗(yàn)程序調(diào)節(jié)優(yōu)化，這在本領(lǐng)域內(nèi)為人們熟知。序列數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)體介質(zhì)中的序列，和算法多核苷酸和多肽序列形成一種很有價(jià)值的信息來源用于確定它們的二維和三維結(jié)構(gòu)同時(shí)可用于鑒定類似的同源物的序列。通過以下過程可以大大加速上述進(jìn)程把序列存儲(chǔ)于一種計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中，用一種已知的大分子結(jié)構(gòu)程序處理存儲(chǔ)的數(shù)據(jù)或者使用熟知的搜索工具，如GCG套裝軟件去在序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索。
本發(fā)明還提供了用于分析特征序列或字串的方法尤其是基因序列和編碼的蛋白序列。優(yōu)選的序列分析方法包括，例如，序列同源分析方法，如一致性和相似性分析，DNA、RNA和蛋白的結(jié)構(gòu)分析、序列組裝，分支分析，序列基元分析，開放閱讀框架確定，核酸堿基使用(calling)，密碼子使用分析，核酸堿基修飾和序列色譜圖峰值分析。
提供了一種基于計(jì)算機(jī)的方法進(jìn)行同源性鑒定。這一方法包括以下步驟以計(jì)算機(jī)可讀媒介提供原始多核酸序列，包括本發(fā)明的多核苷酸序列；把該原始序列與至少一種其他的多核苷酸或多肽序列進(jìn)行比較，確定同源性。
還提供了一種基于計(jì)算機(jī)的用于鑒定同源性的方法，該方法包含以下步驟以計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)提供原始多肽序列，包括本發(fā)明的多肽序列；把該原始多肽序列與至少一種其他的多核苷酸或多肽序列進(jìn)行比較，確定同源性。
本說明書中引用的所有出版物和參考文獻(xiàn)，包括但不限于專利和專利申請(qǐng)，在這里以整體形式被參考引入，在被全面闡述的過程中，似乎每一個(gè)單獨(dú)的出版物或參考文獻(xiàn)都被明確地單獨(dú)地提出是在這里作為參考被引入的，被本申請(qǐng)要求優(yōu)先權(quán)的任何專利申請(qǐng)也以上述同樣方式作為整體參考引入。定義“一致性”在本領(lǐng)域中是指兩個(gè)或多個(gè)多肽序列之間或兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸之間的關(guān)系，它可通過比較序列確定，在本領(lǐng)域中，“一致性”同時(shí)指多肽或多核苷酸序列之間相關(guān)性的程度。可通過這些序列字串的相配進(jìn)行確定，“一致性”可通過已知的方法方便地計(jì)算出來，這些方法包括但不僅限于下列文獻(xiàn)中所描述的方法(ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxfoxd University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heine，G.，AcademicPress，1987；and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；and Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)。確定一致性的方法被設(shè)計(jì)給出被測(cè)序列間的最大的相配，另外，確定一致性的方法被編寫進(jìn)入公共可以得到的計(jì)算機(jī)程序中。用于確定兩序列間一致性的計(jì)算機(jī)程序包括但不限于，在GCG套裝軟件中的GAP程序(Devereux，J.，et al，Nucleic Acids Research 12(1)387(1984))，BLASTP，BLASTN(Altschul，S.F.et al.，J.Molec.Biol.215403-410(1990)，and FASTA(Pearson and Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85；2444-2448(1998)。BLAST家族程序可從NCBI和其他來源公開得到(BLASTManual，Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda，MD20894；Altschul，S.，et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1990)。大家熟知的SmithWaterman算法也可用于確定一致性。多肽序列比較包括以下參數(shù)算法Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48443-453(1970)比較模型BLOSSUM62 from tlenikoff and tlenikoff，Proc.Natl.Acad.
Sci.USA.8910915-10919(1992)。Gap Penalty8Gap Length Penalty2使用這些參數(shù)的程序可從Genetics Computer Group，Madison WI.以“gap”程序公開得到，前面提到的參數(shù)是多肽比較的默認(rèn)參數(shù)(對(duì)于末端的gaps，沒有penalty)。多核苷酸比較包括以下參數(shù)算法Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48443-453(1970)比較模型相配＝+10，錯(cuò)配＝0Gap Penalty50Gap Length Penalty3可從Genetics Computer Group，Madison WI.的“Gap”程序得到，這些參數(shù)是核酸比較的默認(rèn)參數(shù)。
對(duì)于多核苷酸和多肽“一致性”的優(yōu)選解釋見以下(1)和(2)。
(1)多核苷酸實(shí)施方案進(jìn)一步包括一種分離的多核苷酸，它包含一多核苷酸序列，該序列與SEQ ID No1這一參照序列至少有50，60，70，80，85，90，95，97或100％的一致性。多核苷酸序列可能與參照序列SEQ ID No1一致或者可能與參照序列相比有一定整數(shù)個(gè)數(shù)的核苷酸變化，其中這樣變化至少包括一個(gè)核苷酸缺失，替換，包括轉(zhuǎn)換和顛換，或插入。其中該變化可能發(fā)生在參照核苷酸序列的5′或3‘末端位置或兩末端之間的任意位置，這些位置要么分散于參照序列的核苷酸中，要么在參照核苷酸序列的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)組中，其中核苷酸變化的數(shù)目通過以下過程得來用參照序列SEQ ID No1的核苷酸總數(shù)去乘以用整數(shù)表示的一致性百分?jǐn)?shù)除以100然后用SEQ ID No1的核苷酸數(shù)目減去以上得到的乘積數(shù)值，即nn≤xn-(xn· y)。其中nn是核苷酸變化的數(shù)目，xn是SEQ ID No1中核苷酸的總數(shù)，y是0.50代表50％，0.60代表60％，0.70代表70％，0.80代表80％，0.85代表85％，0.90代表90％，0.95代表95％，0.97代表97％或者1.00代表100％。·是相乘運(yùn)算的表示符號(hào)，其中xn和y的乘積在從xn中減去之前四舍五入至最接近的整數(shù)。SEQ ID No2是編碼多肽的多核苷酸序列，它的變化會(huì)導(dǎo)致編碼序列中的無(wú)義，錯(cuò)義或讀框偏移突變，進(jìn)而改變由該多核苷酸編碼的多肽。
作為實(shí)例，本發(fā)明的多核苷酸序列可能與參照序列SEQ ID No1一致，也就是可能100％一致，或者它與參照序列相比可能包含一定整數(shù)個(gè)數(shù)的核苷酸變化，以致一致性百分比小于100％。這種變化至少包括一個(gè)核苷酸缺失，替換，包括轉(zhuǎn)換和顛換，或插入。其中該變化可能發(fā)生在參照核苷酸序列的5′或3‘末端位置或兩末端之間的任意位置，這些位置要么分散于參照序列的核苷酸中，要么處于參照序列的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)組中。特定的一致性百分比的核苷酸變化數(shù)目可由以下過程得出用參照序列SEQ ID No1的核苷酸總數(shù)去乘以用整數(shù)表示的一致性百分?jǐn)?shù)除以100，然后再用SEQ ID No1的核苷酸總數(shù)減去以上得到的乘積，即nn≤xn-(xn·y)，其中nn是核苷酸變化的數(shù)目，xn是SEQ ID No1中核苷酸的總數(shù)，y是，例如，0.70代表70％，0.80代表80％，0.85代表85％等，·是乘法運(yùn)算的表示符號(hào)，其中xn和y的乘積在從xn中減去之前四舍五入至最相近的整數(shù)。
(2)多肽實(shí)施方案進(jìn)一步包括一種分離的多肽，包含的多肽與多肽參照序列SEQ ID No2至少有50，60，70，80，85，90，95，97或100％的一致性。該多肽序列與參照序列SEQ ID No2可能一致或者可能包含一定整數(shù)數(shù)目的與參照序列不同的氨基酸。這些改變至少包括一個(gè)氨基酸缺失，替換，包括保守和非保守替換，或者插入。該變化可能發(fā)生在參照序列的氨基端或羧基端位置或者在兩端之間的任意位置。它們獨(dú)立地分散于參照序列的氨基酸中或位于參照序列的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)組中，該氨基酸變化的數(shù)目可通過以下過程得到用參照SEQ ID No2中氨基酸的總數(shù)去乘整數(shù)表示的一致性百分?jǐn)?shù)除以100，然后從SEQ ID No2的氨基酸總數(shù)中減去該乘積，即na≤xa-(xa· y)，其中na是氨基酸變化的數(shù)目，xa是SEQ ID No2中氨基酸的總數(shù)，y是0.50代表50％，0.60代表60％，0.70代表70％，0.80代表80％，0.85代表85％，0.90代表90％，0.95代表95％，0.97代表97％或1.00代表100％。·是乘法運(yùn)算的表示符號(hào)。xa和y的任何非整數(shù)乘積在從xa中減去之前要四舍五入至最接近的整數(shù)。
作為實(shí)例，本發(fā)明的一種多肽可能與參照序列SEQ ID No2一致，也就是100％一致，或者它可能包含與參照序列相比一定整數(shù)數(shù)目的氨基酸變化，以致一致性百分比小于100％。這些變化包括至少一個(gè)氨基酸缺失，替換，包括保守和非保守替換，或者插入。該變化可能發(fā)生在參照多肽序列的氨基或羧基末端位置或這兩個(gè)末端之間的任意位置。它們獨(dú)立地分散于參照序列的氨基酸中或者位于參照序列的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)組中，特定一致性百分比的氨基酸變化數(shù)目可由以下方法算出用SEQ ID No2中氨基酸的總數(shù)去乘整數(shù)表示的一致性百分?jǐn)?shù)除以100，然后從SEQ ID No2的氨基酸總數(shù)中減去該乘積，即na≤xa-(xa· y)，其中na是氨基酸變化的數(shù)目，xa是SEQ ID No2中氨基酸的總數(shù)，y是，例如，0.70代表70％，0.80代表80％，0.85代表85％等，·是乘法運(yùn)算的表示符號(hào)。xa和y的任何非整數(shù)乘積在從xa中減去之前要四舍五入至最接近的整數(shù)。
“個(gè)體”當(dāng)在這里用來指一種生物體的時(shí)候，是一種多細(xì)胞真核生物，包括但不僅限于后生動(dòng)物，哺乳動(dòng)物，卵生的(ovid)，卵胎生(bovid)，猿，靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類。
“分離的”是指從其自然狀態(tài)經(jīng)“人類的手”發(fā)生改變，也就是，如果它存在于自然界，它被改變或者從其原始環(huán)境移出或者兩者都存在。例如，天然存在于生活著的生物體內(nèi)的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但同樣的多核苷酸或多肽從其自然狀態(tài)下的共存物質(zhì)中分離出來則是“分離的”，正如該名詞在這里的使用。另外，通過轉(zhuǎn)染，遺傳操作或任何其他重組方法轉(zhuǎn)入的多核苷酸或多肽都是“分離的”，盡管它仍存在于該生物體中，后者可能是活的也可能是死的。
“多核苷酸”一般是指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，可能是未經(jīng)修飾的RNA或DNA或是經(jīng)過修飾的RNA或DNA，包括其單鏈和雙鏈區(qū)域。
“變體”是指不同于參照多核苷酸或多肽的一種多核苷酸或多肽，但仍保持根本的性質(zhì)，典型的多核苷酸變異體在核苷酸序列上與參照杠桿不同，變異體中核苷酸序列的改變可能會(huì)也可能不會(huì)改變參照多核苷酸所編碼有多肽的氨基酸序列，如下所述，核苷酸的變化可能會(huì)導(dǎo)致參照序列編碼多肽中氨基酸的替換，添加，缺失，融合和截短。典型的多肽變異體在氨基酸序列上與參照多肽不同，一般情況下，這種不同是有限的以便使變異體和參照多肽在總體上很相似并在一些區(qū)域內(nèi)完全一致。變異體和參照序列氨基酸的不同可以是一個(gè)或多個(gè)替換，添加，缺失的任何組合，一個(gè)替換的或插入的氨基酸殘基可能是也可能不是由遺傳密碼所編碼的。多核苷酸和多肽的變異體可能是自然發(fā)生的，如等位變異體，或者也可能不是自然發(fā)生的，多核苷酸和多肽的自然發(fā)生的變異體可通過突變技術(shù)或直接合成而得到。
“疾病”是指任何由細(xì)菌感染引起的或與其相關(guān)的疾病，包括，例如，嬰兒和兒童的中耳炎，中老年人的肺炎，竇炎，醫(yī)院的感染和侵入性疾病，伴隨聽力喪失的慢性中耳炎，中耳積水，聽神經(jīng)損傷，語(yǔ)言學(xué)習(xí)滯后，上呼吸道感染和中耳炎癥。
實(shí)施例下面的實(shí)施例使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)實(shí)施，除了那些詳細(xì)描述的技術(shù)，這些技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是熟知和常規(guī)的，這些實(shí)施例用于說明而不是對(duì)本發(fā)明起限制作用。
BASB034基因首次在Incyte PathoSeq數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)，該數(shù)據(jù)庫(kù)中含有粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC 43617(也叫菌株MC2931)的未完成的基因組DNA序列。BASB034多核苷酸的翻譯表現(xiàn)出與肺炎克雷伯氏菌外膜磷脂酶A蛋白的很強(qiáng)的同源性(214個(gè)氨基酸重疊中有42％一致)。
BASB034基因的序列通過實(shí)驗(yàn)得到進(jìn)一步的確證，為了這一目的，使用QIAGEN基因組DNA提取試劑盒(Qiagen Gmbh)，從1010個(gè)粘膜炎莫拉氏菌(菌株ATCC43617)細(xì)胞中提取基因組DNA。其中的1μg用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA擴(kuò)增，使用引物E481124(5′-GATTTA AGA GTA TGT TAT GAT G-3′)(SEQ ID NO9〕和E481125(5′-GTA TGG GTT GAT CAA ATA CAG-3′)〔SEQ ID NO10〕PCR產(chǎn)物用Biorobot9600(Qiagen Gmbh)設(shè)備純化然后使用Big Dye CycleSequencing試劑盒(Perkin-Elmer)和ABI377/PRISM DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。DNA測(cè)序使用豐度2在兩條鏈上同時(shí)進(jìn)行，全長(zhǎng)序列使用SequencherTM軟件(Applied Biosytems)進(jìn)行裝配，得到的DNA序列與SEQ ID NO1100％一致。
得到的DNA用于PCR擴(kuò)增，使用寡核苷酸MC-Pla-BamF(5′-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC CAA GCT GTA CCAAAT CCT GTG GCA TTT GTT G-3′)〔SEQ ID NO11〕和MC-Pla-SalRC(5′-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTATAG ACC CAT CCA GTC GTT AAG CAT AAG-3′)〔SEQ ID NO12〕使用限制性內(nèi)切酶(HphI，AluI，RsaI，EcoRV，Sau3AI)對(duì)相應(yīng)BASB034基因的擴(kuò)增產(chǎn)物分別水解得到的限制性酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，所使用的標(biāo)準(zhǔn)的生物學(xué)方法參見“MolecularCloning，a Laboratory Manual，Second Edition，EdsSambrook，F(xiàn)ritsch&Maniatis，Cold Spring Harbor press1989“得到的凝膠電泳圖見

圖1，對(duì)于每種菌株，相應(yīng)于這6種限制性內(nèi)切酶的圖譜被記錄并合并，然后劃分出有著一致合并RFLP圖譜的菌株組。使用這一方法，本研究所測(cè)菌株被分為3組(組1Mc2931、Mc2904、Mc2905、Mc2907、Mc2909、Mc2910、Mc2911、Mc2912、Mc2926、Mc2931、Mc2956、Mc2969、Mc2975；組2Mc2906、Mc2913；組3Mc2908。(Mc2960未能擴(kuò)增因此無(wú)法分類)。這些數(shù)據(jù)支持說明本研究所使用的粘膜炎莫拉氏菌種群表現(xiàn)出對(duì)于BASB034基因的核苷酸序列多樣性。2B其他菌株的DNA測(cè)序。
使用實(shí)施例1中描述的實(shí)驗(yàn)方法，確定了另外三種粘膜炎莫拉氏菌菌株中BASB034基因的序列。菌株Mc2908，Mc2913和Mc2969中的BASB034基因的核苷酸序列分別參見SEQ ID NO3，5和7，它們分別代表以前分類的三組菌株。這些核苷酸序列被翻譯成氨基酸序列，分別參見SEQ ID NO4，6和8。使用DNASTAR Lasergene套裝軟件的MegAlign程序形成核苷酸序列SEQ ID NO1，3，5，7的多重排列，見圖2。一致性的成對(duì)比較概括于表2，表明這四種BASB034基因序列相似性均在98％以上。使用同樣的程序形成蛋白序列SEQ IDNO2，4，6和8的多重排列，見圖3。一致性的成對(duì)比較概括于表3，表明這四種BASB034蛋白序列的相似性水平均在98％以上。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明粘膜炎莫拉氏菌菌株間BASB034基因有著非常強(qiáng)的序列保守性。
表1本研究中所使用的粘膜炎莫拉氏菌菌株的特征
表2BASB034多核苷酸序列成對(duì)一致性比較(以％)
表3BASB034多核苷酸序列成對(duì)一致性比較(以％)
實(shí)施例3構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)重組的BASB034ABASB034的克隆BamHI和SalI限制性酶切位點(diǎn)分別加到上游(〔SEQ ID NO11〕)和下游(〔SEQ ID NO12〕)擴(kuò)增引物中，使得BASB034的PCR產(chǎn)物能夠定向地克隆到市場(chǎng)上可購(gòu)得的E.coli表達(dá)質(zhì)粒pQE30(QiaGen，氨芐抗性)上。成熟的BASB034蛋白可以融合表達(dá)并在N-端帶有一個(gè)6(組氨酸)的親和層析標(biāo)記。根據(jù)廠家說明，使用硅膠基自旋柱(Silica gel-based spin columns)(QiaGen)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中的BASB034 PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。為了獲得克隆所必需的BamHI和SalI末端，根據(jù)廠家建議(Life Technologies)使用BamHI和SalI限制性酶對(duì)純化得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行完全地酶解。在使用第二種酶消化之前，再用上述的自旋柱對(duì)第一次酶解后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并用無(wú)菌水洗脫以去除鹽份。消化的DNA片段在與pQE30質(zhì)粒連接之前要再次使用硅膠基自旋柱對(duì)其進(jìn)行純化。B表達(dá)載體的制備為了制備用于連接的表達(dá)質(zhì)粒pQE30，類似地用BamHI和Sall進(jìn)行完全的酶解然后根據(jù)廠家說明用牛小腸磷酸酶(CIP，～0.02單位/pmole 5′末端，Life Technologies)處理以防止自身連接。大概使用6倍于制備好的載體的摩爾量的酶解用于連接反應(yīng)，使用本領(lǐng)域熟知的方法，用T4 DNA連接酶(～2.0單位/反應(yīng)，Life Technologies)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的～20μl連接反應(yīng)(～16℃，～16小時(shí))。使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法把等量的連接產(chǎn)物(～5μl)轉(zhuǎn)入電穿孔感受態(tài)(electro-competent)M15(pREP4)細(xì)胞。經(jīng)過37℃在～1.0ml LB肉汁培養(yǎng)基2-3小時(shí)的快速生長(zhǎng)時(shí)期，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞被鋪在含卡那霉素(50μg/ml)和氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂平板上，選擇培養(yǎng)基上含有兩種抗生素以確保所有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞既含pREP4質(zhì)粒(KnR)，該質(zhì)粒含有l(wèi)acIq基因，為抑制pQE30上IPTG誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)所必需，又含有pQE30-BASB034質(zhì)粒(ApR)。平板在37℃下培養(yǎng)過夜約16小時(shí)。用滅菌牙簽挑取單個(gè)的KnR/ApR菌落然后“斑“接種新鮮的LBKnR/ApR平板和～1.0ml LB KnR/ApR肉汁培養(yǎng)物，它們均在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱(平板)或振蕩水浴內(nèi)37℃培養(yǎng)過夜。
使用一種完全基于細(xì)胞的PCR分析以確證轉(zhuǎn)化體內(nèi)含有BASB034DNA插入，在這里，把～1.0ml過夜LB Kn/Ap肉汁培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到一支1.5ml的聚丙烯試管中，用Beckman微量離心機(jī)(～3min，室溫，～12000×g)離心收集細(xì)胞。細(xì)胞沉淀用～200μl的無(wú)菌水懸浮，使用～10μl等分級(jí)分用于含BASB034上、下游引物的～50μl體系PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)成分的終濃度與實(shí)例2中所指定的基本一致，除了這里使用～5.0單位的Taq聚合酶。開始的95℃變性步驟延長(zhǎng)至3分鐘以確保細(xì)菌的熱裂解和質(zhì)粒DNA的釋放。使用ABI Model9700熱循環(huán)儀和32循環(huán)3步驟熱擴(kuò)增，即95℃，45秒；55～58℃，45秒，72℃，1分鐘，對(duì)來自裂解轉(zhuǎn)化樣品中的BASB034 PCR片段進(jìn)行擴(kuò)增，熱擴(kuò)增之后，用瓊脂糖凝膠電泳(0.8％瓊脂糖，Tris-酯酸鹽-EDTA(TAE)緩沖液)。對(duì)～20μl等分級(jí)分的反應(yīng)物進(jìn)行分析，凝膠電泳、溴化乙淀染色后在UV光照下可觀察DNA片段。一種DNA分子大小標(biāo)準(zhǔn)(1Kb梯，LifeTechnologies)與測(cè)試樣品同時(shí)電泳過膠以估計(jì)PCR產(chǎn)物的大小，產(chǎn)生預(yù)計(jì)PCR產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化子被鑒定為含有BASB034表達(dá)構(gòu)建體的菌株。然后對(duì)這些菌株進(jìn)行分析以對(duì)重組BASB034進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。CPCR-陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的表達(dá)分析對(duì)于以上鑒定出來的每一種PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，用來自斑點(diǎn)平板的細(xì)胞接種含卡那霉素(50μg/ml)和氨芐青霉素的～5.0ml的LB肉汁培養(yǎng)基并在37℃搖晃(～250rpm)過夜培養(yǎng)，用等份(～1.0ml)的過夜接種培養(yǎng)物接種到含有～25ml LB Kn/Ap肉汁的錐形瓶中37℃振蕩(～250rpm)培養(yǎng)直至培養(yǎng)物渾濁度達(dá)到OD600約0.5，也就是對(duì)數(shù)期中間(通常約1.5～2.0小時(shí))。這時(shí)把大約一半的培養(yǎng)物(～12.5ml)轉(zhuǎn)移到另一支125ml的錐形瓶中并加入IPTG(1.0M無(wú)菌水貯液，Sigma)至終濃度1.0mM以誘導(dǎo)重組BASB034蛋白的表達(dá)，把經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的和未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)物在37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約4小時(shí)。誘導(dǎo)期后，取出經(jīng)誘導(dǎo)的和未經(jīng)誘導(dǎo)的樣品(約1.0ml)，用微量離心管在室溫下離心約3分鐘收集細(xì)胞。用～50μl的無(wú)菌水懸浮細(xì)胞顆粒，然后與等體積的含2-巰基乙醇的2×Laemelli SDS-PAGE樣品緩沖液混合，置于沸水浴中3分鐘以使蛋白變性，把等體積(～15μl)的粗IPTG誘導(dǎo)的和未誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解物加樣到完全一致的12％Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠(1mm厚的Mini-gels，Novex)，使用標(biāo)準(zhǔn)的SDS/Tris/甘氨酸電泳緩沖液(BioRad)在通常條件下把誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的裂解樣品與預(yù)染色的分子量標(biāo)記(SeeBlue，Novex)一起跑電泳。電泳后，一塊膠用考馬斯亮藍(lán)R250(BioRad)染色再脫色以觀察IPTG誘導(dǎo)的獨(dú)特的BASB034蛋白。第二塊膠使用BioRad Mini-Protean II雜交設(shè)備和Towbin′s甲醇(20％)轉(zhuǎn)移緩沖液在4℃下經(jīng)過2小時(shí)電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上(0.45微米孔徑，Novex)。根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行膜封閉和抗體培養(yǎng)，把二次免抗鼠抗體與HRP(QiaGen)結(jié)合后，使用單克隆的抗-RGS(His)3抗體來確證BASB034重組蛋白的表達(dá)和鑒定。用ABT不溶底物或Hyperfilm和Amersham ECL化學(xué)系統(tǒng)觀察抗組氨酸抗體的反應(yīng)方式。D序列確認(rèn)為了進(jìn)一步證實(shí)表達(dá)的IPTG誘導(dǎo)的重組BASB034蛋白是正確的閱讀框架而不是克隆假陽(yáng)性產(chǎn)生的假分子，所以確定了克隆插入的DNA序列。使用常規(guī)的不對(duì)稱PCR循環(huán)測(cè)序方法(ABI Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing，Perkin-Elmer)由一條鏈測(cè)得粘膜炎莫拉氏菌BASB034基因的DNA序列。測(cè)序反應(yīng)使用未消化的表達(dá)質(zhì)粒DNA(～0.5μg/rxn)作為模板，合適的pQE30載體特異性的和ORF特異性的測(cè)序引物(～3.5pmol/rxn)，除了模板和測(cè)序引物，每一個(gè)測(cè)序反應(yīng)物(～20μl)還含有四種不同的dNTP(即A，G，C和T)和四種相應(yīng)的ddNTPs(即ddA、ddG、ddC和ddT)終止核苷酸。每種終止核苷酸均與四種熒光染劑Joe，Tam，Rox或Fam中的一種相結(jié)合。單鏈測(cè)序延伸產(chǎn)物由于染料標(biāo)記的ddNTP終止物的引入而沿模板在隨機(jī)位置上發(fā)生終止。熒光染色標(biāo)記的終止產(chǎn)物通過使用微離心大小排除色譜柱(Princeton Genetics)進(jìn)行純化，然后真空干燥，用模板重懸緩沖液(Perkin-Elmer)懸浮以用于毛細(xì)電泳或去離子甲酰胺PAGE在95℃下5分鐘變性，然后用高分辨率毛細(xì)電泳(ABI310 AutomatedDNA Sequenator)依據(jù)廠商說明進(jìn)行分析。以每個(gè)反應(yīng)中收集DNA序列數(shù)據(jù)然后用ABI Sequence Analysis Software(Perkin-Elmer)在一臺(tái)PowerMAC計(jì)算機(jī)上自動(dòng)分析相對(duì)熒光峰值強(qiáng)度，在使用AutoAssembler軟件(Perkin-Elmer)之前要對(duì)單個(gè)的自動(dòng)分析DNA序列進(jìn)行人工編輯以確保精確性，測(cè)序表明表達(dá)質(zhì)粒包含正確的序列和正確的開放閱讀框架。實(shí)施例4制備重組的BASB034細(xì)菌菌株一種E.coli M15(pREP4)重組表達(dá)菌株被用于制備細(xì)胞團(tuán)進(jìn)一步純化重組的蛋白，它含有一種編碼來自粘膜炎莫拉氏菌的BASB034的質(zhì)粒(pQE30)。表達(dá)的菌株培養(yǎng)于含50μg/ml卡那霉素(“Kn”)和100μl/ml氨芐青霉素(“Ap”)的LB瓊脂平板上以確保該菌株同時(shí)含有pREP4 lacIq調(diào)控質(zhì)粒和pQE30-BASB034表達(dá)構(gòu)建體。-80℃冷凍保存時(shí)，把菌株在含有一致抗生素濃度的LB肉汁培養(yǎng)基中擴(kuò)繁然后與同體的含30％(w/v)的LB肉汁培養(yǎng)混合。培養(yǎng)基用于制備重組蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有2X YT肉湯(Difco)，含50μg/ml Kn和100μg/ml的Ap，往發(fā)酵罐中加入0.25ml/L的抗沫劑(Antifoam 204，Sigma)。為了誘導(dǎo)BASB034重組蛋白的表達(dá)，還要往發(fā)酵罐中加入IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)(終濃度1mM)。發(fā)酵用0.3ml快速凍融的冷凍培養(yǎng)物或使用選擇瓊脂平板培養(yǎng)物上的若干菌落去接種含50ml工作體積的500ml錐形接種瓶。37±1℃下在振蕩平臺(tái)(150rpm，Innova2100，New Brunswick Scientific)上培養(yǎng)約12小時(shí)，這一接種培養(yǎng)基然后用于接種含2X YT肉湯和Kn、Ap抗生素的工作容積為5L的發(fā)酵罐。該發(fā)酵罐(Bioflo3000，New BrunswickScientific)的操作條件為37±1℃，空氣噴射0.2～0.4VVM，250rpm的Rushton葉輪。在錐形瓶和接種罐中pH值均無(wú)需調(diào)節(jié)，發(fā)酵過程中，發(fā)酵罐中的pH值范圍為6.5至7.3當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(～0.7OD600)時(shí)，往發(fā)酵罐中加入IPTG(1.0M貯液，在無(wú)菌水中制備)，細(xì)菌誘導(dǎo)2～4小時(shí)然后使用28RS Heraeus(Sepatech)或RC5C超速離心機(jī)(Seorvall Instruments)收集，細(xì)胞漿存貯在-20℃直到用于處理。純化化學(xué)試劑和材料咪唑，鹽酸胍，Tris(羥甲基)和EDTA(乙二胺四乙酸)的生物工程純或更純均購(gòu)于Ameresco Chemical，Solon，Ohio。試劑純或更純的三硝基甲苯(叔-辛基苯氧基聚氧乙醇)，磷酸二氫鈉和尿素都購(gòu)自Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri。冰醋酸和鹽酸購(gòu)自Mallincrodt Baker Inc.，Phillipsburg，New Jersey。甲醇購(gòu)自FisherScientific，F(xiàn)airlawn，New Jersey.PefablocSC(4-(2-氨乙基)-苯亞磺酰氟)，完全蛋白酶雞尾酒藥片和PMSF(苯甲基磺酰氟)均購(gòu)自Rocho Diagnostics Corporation，Indianapolis，Indiana.苯丁抑制素、胃蛋白酶抑制劑A和E-64蛋白酶抑制劑購(gòu)自Calibio chem，LaJolla，California。Dulbecco′s磷酸緩沖鹽水(1×PBS)購(gòu)自Quality Biological，Inc.，Gaithersburg，Maryland。Dulbecco′s磷酸緩沖鹽水(10×PBS)購(gòu)自BioWhittaker，Walkersville，Maryland。五-組氨酸抗體、BSA購(gòu)自Qiagen，Valencia，California。與過氧化物酶結(jié)合的親和純羊抗鼠IgG購(gòu)自Jackson Immuno Research，West Grove，Penn。AEC單溶液購(gòu)自Zymed，South San Francisco，Califomia。所有其他的化學(xué)試劑均為試劑純或更純。
Ni-NTA Superflow樹脂購(gòu)自QiaGen，Inc.Valencia，California。預(yù)制的Tris-甘氨酸4～20％和10～20％聚丙烯酰胺凝膠及所有的緩沖液和溶液，SeeBlue預(yù)染色標(biāo)準(zhǔn)，MultiMark Multi-Colored Standards和PVDF轉(zhuǎn)移膜購(gòu)自Novex，San Diego，California。SDS-PAGE SilverStain試劑盒購(gòu)自Daiichi Pure Chemicals Company Limited，Tokyo，Japan?？捡R斯染液購(gòu)自Bio-Red Laboratories，Hercules，California。AcrodiscPF0.2m注射器過濾器購(gòu)自Whatman，Inc.，Clifton NewJersey。透析管8,000MWCO購(gòu)自BioDesign Inc.Od NeW York，CarmalNew York，BCA蛋白鑒定試劑Snake Skin透析管3,500MWCO購(gòu)自Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois。提取方案細(xì)胞沉淀置于室溫下30至60分鐘進(jìn)行凍融，稱量5至6克材料移至50ml一次性離心管中，加入5mls/gram的鹽酸胍(Gu-HCl)緩沖液(6M鹽酸胍，100mM磷酸二氫鈉，10mM Tris和0.05％TritonX-100，pH8.0)。使用PRO300D proseientific均漿器在3/4馬力重懸細(xì)胞漿1分鐘提取混合物在室溫下輕輕振蕩60至90分鐘。之后把提取混合物在15800×g下離心15分鐘(Sorvall RC5C離心機(jī)，11,500rpm)。上清(S1)輕輕移出并貯存用于進(jìn)一步純化，顆粒沉淀保存用于分析。把BASB034結(jié)合到Nickel-NTA樹脂上往S1中加入3～4ml的Ni-NTA樹脂，然后在室溫下輕輕振蕩l小時(shí)，接著把S1/Ni-NTA加到XK16 Pharmacia柱上，用1M的Gu-HCl緩沖液(1M鹽酸胍，100mM磷酸二氫鈉，10mM Tris和0.05的Triton X-100，pH8.0)進(jìn)行洗脫，然后再用磷酸緩沖液(100mM磷酸二氫鈉，10mM Tris和0.05％Triston X-100，pH6.3)洗脫。最后用250mM的咪唑緩沖液(250mM咪唑，100mM磷酸二氫鈉，10mMTris和0.05％Triton X-100，pH5.9)把蛋白從柱上洗脫下來。最終形式以0.1％Triton X-100和1X PBS，pH7.4為背景對(duì)BASB034進(jìn)行過夜透析以去除殘留的鹽酸胍和咪唑，純化得到的蛋白進(jìn)行鑒定并按以下敘述的方法去制備抗體。生化鑒定SDS-PAGE和Western雜交分析純化的重組蛋白溶入4～20％的聚丙烯酰胺凝膠然后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，如前所述100V下1個(gè)小時(shí)(Thebaine et al.1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA764350～4354)。PVDF膜用含有5％不含脂肪的干牛奶的25ml Dulbecco′s磷酸緩沖鹽水進(jìn)行預(yù)處理，以后的所有培養(yǎng)均使用這一預(yù)處理緩沖液。PVDF膜在室溫下用25ml 1∶500稀釋的免疫前血清或兔抗組氨酸免疫血清培養(yǎng)1小時(shí)，然后用洗脫緩沖液(20mMTris緩沖液，pH 7.5，含150mM氯化鈉和0.05％Tween-20)洗脫兩次。PVDF膜在室溫下用25ml 1∶500稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的羊-抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)培養(yǎng)30分鐘，然后用洗脫緩沖液洗脫四次再對(duì)每個(gè)PVDF膜用Zymed(San Francisco，CA)提供的3-氨基-9-乙基咔唑和尿素過氧化物顯影10分鐘。
SDS-PAGE(圖4)的結(jié)果顯示了一種大約60Kda大小的蛋白，該蛋白通過Western雜交(圖5)可與抗-RGS(組氨酸)抗體發(fā)生反應(yīng)。蛋白測(cè)序使用明確規(guī)定的化學(xué)方法，對(duì)純化的蛋白進(jìn)行氨基末端測(cè)序以確證制備的重組蛋白的正確。使用的測(cè)序儀為Hewlett-Packard241測(cè)序儀和1100LC。實(shí)施例5重組BASB034的抗血清制備通過使用純化的重組BASB034蛋白接種2只兔子以制備BASB034蛋白的多價(jià)抗血清每只兔子進(jìn)行總共三次肌內(nèi)免疫，每隔約21天注射一次，每次約20μg BASB034蛋白(開始用完全Freund佐劑，接下來用不完全的Freund佐劑，在首次免疫前(“預(yù)抽血”)和35天及57天對(duì)兔子進(jìn)行抽血。使用純化的重組BASB034蛋白(0.5μg/well)進(jìn)行ELISA以確定抗-BASB034蛋白效價(jià)。效價(jià)定義為等于或大于0.1的最大稀釋，通過下式進(jìn)行計(jì)算二個(gè)抗血清測(cè)試樣品的平均OD-二個(gè)緩沖液測(cè)樣品的平均OD，三次免疫后的效價(jià)大約在1000000附近。
如實(shí)施例4所述，抗血清被用作Western雜交中鑒定蛋白的第一抗體。Western雜交表明免疫動(dòng)物的血清中存在抗-BASB034抗體(圖6)。實(shí)施例6BASB034基因非編碼側(cè)翼序列分析及其利用來調(diào)控BASB034基因表達(dá)BASB034基因的非編碼側(cè)翼序列含有對(duì)基因表達(dá)有重要作用的調(diào)控元件，這一調(diào)控在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均有發(fā)生。這些區(qū)域的序列，該基因開放閱讀框架的上游或下游，可通過DNA測(cè)試得到。這些序列信息使得確定可能的調(diào)控基元成為可能，例如不同的啟動(dòng)子元件，終止子序列，誘導(dǎo)序列元件，阻遏子，可能的導(dǎo)致時(shí)相變化的序列，Shine-dalgarno序列，二級(jí)結(jié)構(gòu)可能參與調(diào)控的區(qū)域，還有其它類型的調(diào)控基元或序列。這些序列信息使得基因BASB034能夠調(diào)控其自然表達(dá)?；虮磉_(dá)的上游調(diào)控可通過改變以下序列實(shí)現(xiàn)啟動(dòng)子，Shine-dalgarno序列，可能的阻遏子或操縱元件或其他的相關(guān)元件，相應(yīng)的，表達(dá)的下游調(diào)控可通過類似類型的修飾來實(shí)現(xiàn)，另外，通過改變時(shí)相變化序列，基因的表達(dá)可被置于時(shí)相變化的控制下或者與這一調(diào)控解耦聯(lián)。在另外一種方法中，可把基因的表達(dá)置于一個(gè)或多個(gè)誘導(dǎo)元件的控制下以調(diào)控表達(dá)。這些調(diào)控的例子包括，但不僅限于，溫度變化誘導(dǎo)，加入誘導(dǎo)底物如選擇的碳水化合物及其衍生物。痕量元素，維生素，輔因子，金屬離子等。
以上所述的改變可通過幾種不同的途徑完成，參與基因表達(dá)的序列的改變可在體內(nèi)通過隨機(jī)突變完成，然后挑選目的表型。另一種方法包括分離感興趣的區(qū)域，通過隨機(jī)突變或定點(diǎn)突變，插入或缺失突變使其改變，改變的區(qū)域可通過同源重組轉(zhuǎn)入細(xì)菌的基因組，然后分析基因表達(dá)的效果。另一種方法是利用感興趣區(qū)域的序列知識(shí)替換或去除全部或部分天然調(diào)控序列，在這種情況下，目標(biāo)調(diào)控區(qū)域被分離并改變以包括以下不同來源的調(diào)控元件來自另外一個(gè)基因或來自不同基因調(diào)控元件組合或來自一段合成的調(diào)控序列或來自任何其他的調(diào)控序列或去除野生型調(diào)控序列的選定部分。然后，這些改變的序列可通過同源重組轉(zhuǎn)入細(xì)菌的基因組。以下是可用于基因表達(dá)上游調(diào)控的優(yōu)選啟動(dòng)子不完全清單來自腦膜炎奈瑟代球菌(N.meningitidis)或淋病奈瑟氏球菌(N.gonorroheae)的啟動(dòng)子porA，porB，ldpB，tbpB，p110，lst，hpuAB。
在一個(gè)例子中，基因的表達(dá)可通過把其啟動(dòng)子與一種較強(qiáng)的啟動(dòng)子交換而得以改變(分離該基因的上游序列，體外改變?cè)撔蛄性偻ㄟ^同源重組使其重新進(jìn)入基因組，上游調(diào)控的表達(dá)產(chǎn)物可在細(xì)菌中和由細(xì)菌脫落(或產(chǎn)生)的外膜囊泡中得到。在其他的例子中，這些描述的方法可用于制備家具有改良接種特性的重組細(xì)菌菌株。它們是，但不僅限于，減弱菌株，目的抗原增強(qiáng)表達(dá)的菌株，干預(yù)免疫應(yīng)答的基因踢除(或減弱表達(dá))的菌株，免疫優(yōu)勢(shì)蛋白調(diào)控表達(dá)的菌株，外膜囊泡調(diào)控脫落的菌株。
直接在BASB034基因上游的一段區(qū)域由SEQ ID NO13序列給出，該序列是本發(fā)明的又一方面。序列信息BASB034多核苷酸和多肽序列SEQ ID NO1菌株ATCC43617中的粘膜炎莫拉氏菌BASB034多核苷酸序列ATGAAAGTTTCACTGTCTACATTGACTTTATCTATTTTGTCATGTTTTGCTATCCTAGCCATTCAGCAAGCACAAGCTGTACCAAATCCTGTGGCATTTGTTGACGAAGTACGCAGTGAAAATGATCTTGGGCAAGACAATGAATTACCCATTGATGTCCAAAGTGCGACACAATCAGCGTCTACTGATACGGCTAATCCTTTAGACGAACATGAACCAGAGCTTTATACGACAGCTTTAGAAAATAAAACCATGCTGATTAACTGCTCAGCACTTAATCAAGATATCATGCGTTTGGCGTGCTATGACACTTTGGTGCATGGTGAGACGCCAGCGGTAATTAAAACCAAGCGTTCCATTCGCCTTGATGAAACAATTTGGCAGACCATCAAAGGCAAACCCCAGGTTATCTATCAAGAAACGACAGATCCGATTTTTTTAATGGGTAATGAAAAAGGCATGCTGACCAAAAAAGATGCCAAACAGCTTGAATATGCAGCCAAACAGTTTACACCACTGAGCTTATCATTTGATTTAGACCGAAATAATACACCACTTTGGTCATCACGACCACACAATCCGATGTATGTATTGCCCATATTTATGCACGGTAAGCCTAATCGAAGCCCAAATACGCCCAGTCATGAAGCAAAACAATTTACCCCAAATGAATTTCGTGCTCCCGAGCTAAAATTTCAGGTTTCTGTTAAGGTTAAAGCTGCTGAGGATTTATGGGGGACGGATTCAGATTTATGGTTTGGATATACACAGCAATCGCACTGGCAGATTTTTAATGGAAAAAACTCTCGTCCTTTTAGAGTACATGACTACCAGCCAGAGATTTTCTTAACTCAACCTGTATACTCAGACTTACCATGGGATGGCAAAGTCCGCATGATTGGCATGGGTGCGGTACATCATTCCAATGGTGAAAGTGCCAAACTGTCTCGCTCATGGAATCGTGCTTATTTGATGGCAGGCATGGAATGGAAAAACCTGACTGTCATGCCACGCATTTGGGGGCGTATCTTTAAAGAGGCTAGTGGCAGCCAGCCAGATGATAATCCTGATATCTTGGACTATTATGGTTATGGTGATGTGCGTTTTTTATATCAACTAGAAAATAAAAGTAATATTTCAGGTACGGTACGCTATAATCCACGCTCAGGCAAAGGTGCGTTGCAACTTGACTATGTCTATCCGCTTGGTAAGGGAATTAGTGGCTATTTTCAAATATTTCAAAGGCTATGGGCAGTCTTTGATTGATTATAATCATGAGGCGACAAGCTTTGGCGTCGGACTTATGCTTAACGACTGGATGGGTCTATAASEQ ID NO2由SEQ ID NO1的多核苷酸推導(dǎo)出的粘膜炎莫拉氏菌BASB034多肽序列SEQ ID NO3菌種Mc2908中的粘膜炎莫拉氏菌BASB034多核苷酸序列ATGAAAGTTTCACTGTCTACATTGACTTTATCTATTTTGCCATGTTTTGCTATCCTAGCCATTCAGCAAGCACAAGCTGTACCAAATCCTGTGGCATTTGTTGACGAAGTACGCAGTAAAAATGATCTTGGGCAAGACAATGAATTACTCATTGGTGTACAAAGTGCGACACAATCAGCGTCTACTGATACGGCTAATCCTTTAGACGAACATGAACCAGAGCTTTATACGACAGCTTTAGAAAATAAAACCATGCTGATTAACTGCTCAGCACTTAATCAAGATATCATGCGTTTGGCGTGCTATGACACTTTGGTGCATGGTGAGACGCCAGCGGTAATTAAAACCAAGCGTTCCATTCGCCTTGATGAAACAATTTGGCAGACCATCAAAGGCAAACCCCAGGTTGTCTATCAAGAAACGACAGATCCGATTTTTTTAATGGGTAATGAAAAAGGCATGCTGACCAAAAAAGATGCCAAACAGCTTGAATATGCAGCCAAACAGTTTACACCACTGAGCTTATCATTTGATTTAGACCGAAATAATACACCGCTTTGGTCATCACGACCACACAATCCGATGTATGTATTGCCCATATTTATGCACGGTAAGCCTAATCGAAGCCCAAATACGCCCAGTCATGAAGCAAGACAATTTACCCCAAATGAATTTCGTGCCCCTGAATTAAAATTTCAAGTTTCTGTTAAGGTTAAAGCTGCTGAGGATTTATGGGGGACGGATTCAGATTTATGGTTTGGGTATACACAGCAATCGCACTGGCAGATTTTTAATGGAAAAAACTCTCGTCCTTTTAGAGTACATGATTACCAGCCAGAGATTTTCTTAACTCAACCTGTGTACTCAGACTTACCATGGGATGGCAAAGTCCGCATGATTGGCATGGGTGCGGTACATCATTCCAATGGTGAAAGTGCCAAACTGTCTCGCTCATGGAATCGTGCTTATTTGATGGCAGGCATGGAATGGAAAAACCTGACTGTCATGCCACGCATTTGGGGGCGTATCTTTAAAGAGGGTAGTGGCAGCCAGCCAGATGACAATCCTGATATCTTGGACTATTATGGTTATGGTGATGTGCGTTTTTTATATCAACTAGAAAATAAAAGTAATATTTCAGGTACGGTACGCTATAATCCACGCTCAGGCAAAGGTGCGTTGCAACTTGACTATGTCTATCCGCTTGGTAAGGGAATTAGTGGCTATTTTCAAATATTTCAAGGCTATGGGCAGTCTTTGATTGATTATAATCATGAGGCGACAAGCTTTGGCGTCGGACTTATGCTTAACGACTGGATGGGTCTATAASEQ ID NO4由SEQ ID NO3的多核苷酸序列推導(dǎo)出的粘膜炎莫拉氏菌BASB034多肽序列SEQ ID NO5菌株Mc2913中的粘膜炎莫拉氏菌BASB034多核苷酸序列ATGAAAGTTTCACTGTCTACATTGACTTTATCTATTTTGTCATGTTTTGCTATCCTAGCCATTCAGCAAGCAAAAGCTGTACCAAATCCTGTGGCATTTGTTGACGAAGTACGCAGTGAAAATGATCTTGGGCAAGACAATGAATTACCCATTGATGTCCAAAGTGCGACACAATCAGCGTCTACTGATACGGCTAATCCTTTAGACGAACATGAACCAGAGCTTTATACGACAGCTTTAGAAAATAAAACCATGCTGATTAACTGCTCAGCACTTAATCAAGATATCATGCGTTTGGCGTGCTATGACACTTTGGTGCATGGTGAGACGCCAGCGGTAATTAAAACCAAGCGTTCCATTCGCCTTGATGAAACAATTTGGCAGACCATCAAAGGCAAACCCCAGGTTGTCTATCAAGAAACGACAGATCCCATTTTTTTAATGGGTAATGAAAAAGGCATGCTGACCAAAAAAGATGCCAAACAGCTTGAATATGCAGCCAAACAGTTTACACCACTGAGCTTATCATTTGATTTAGACCGAAATAATACACCACTTTGGTCATCACGACCACACAATCCGATGTATGTATTGCCCATATTTATGCACGGTAAGCCTAATCGAAGCCCAAATACGCCCAGTCATGAAGCAAGACAATTTACCCCAAATGAATTTCGTGCCCCTGAATTAAAATTTCAAGTTTCTGTTAAGGTTAAAGCTGCTGAGGATTTATGGGGGACGGATTCAGATTTATGGTTTGGATATACACAGCAATCGCACTCGCAGATTTTTAATGGAAAAAACTCTCGTCCTTTTAGAGTACATGATTACCAGCCAGAGATTTTCTTAACTCAACCTGTATACTCAGACTTACCATGGGATGGCAAAGTCCGCATGATTGGCATGGGTGCGGTACATCATTCCAATGGTGAAAGTGCCAAACTGTCTCGCTCATGGAATCGTGCTTATTTGATGGCAGGCATGGAATGGAAAAACCTGACTGTCATGCCACGCATTTGGGGGCGTATCTTTAAAGAGGGTAGTGGCAGCCAGCCAGATGACAATCCTGATATCTTGGACTATTATGGTTATGGTGATGTGCGTTTTTTATATCAACTAGAAAATAAAAGTAATATTTCAGGTACGGTACGCTATAATCCACGCTCAGGCAAAGGTGCGTTGCAACTTGACTATGTCTATCCGCTTGGTAAGGGAATTAGTGGCTATTTTCAAATATTTCAAGGCTATGGGCAGTCTTTGATTGATTATAATCATGAGGCGACAAGCTTTGGCGTCGGACTTATGCTTAACGACTGGATGGGTCTATAASEQ ID NO6由SEQ ID NO5的多核苷酸推導(dǎo)出的粘膜炎莫拉氏菌BASB034多肽序列SEQ ID NO7菌株Mc2969中的粘膜炎莫拉氏菌BASB034多核苷酸序列ATGAAAGTTTCACTGTCTACATTGACTTTATCTATTTTGCCATGTTTTGCCATCCTAGCCATTCAGCAAGCACAAGCTGTACCAAATCCTGTGGCATTTGTTGACGAAGTACGCAGTGAAAATGATCTTGGGCAAGACAATGAATTACCCATTGATGTCCAAAGTGCGACACAATCGGCGTCTACTGATACGGCTAATCCTTTAGACGAACATGAACCAGAGCTTTATACGACAGCTTTAGAAAATAAAACCATGCTGATTAACTGCTCAGCACTTAATCAAGATATCATGCGTTTGGCGTGCTATGACACTTTGGTGCATGGTGAGACGCCAGCGGTAATTAAAACCAAGCGTTCCATTCGCCTTGATGAAACAATTTGGCAGACCATCAAAGGCAAACCCCAGGTTGTCTATCAAGAAACGACAGATCCGATTTTTTTAATGGGTAATGAAAAAGGCATGCTGACCAAAAAAGATGCCAAACAGCTTGAATATGCAGCCAAACAGTTTACACCACTGAGCTTATCATTTGATTTAGACCGAAATAATACACCACTTTGGTCATCACGACCACACAATCCGATGTATGTATTGCCCATATTTATGCACGGTAAGCCTAATCGAAGCCCAAATACGCCCAGTCATGAAGCAAAACAATTTACCCCAAATGAATTTCGTGCTCCCGAGCTAAAATTTCAGGTTTCTGTTAAGGTTAAAGCTGCTGAGGATTTATGGGGGACGGATTCAGATTTATGGTTTGGATATACACAGCAATCGCACTGGCAGATTTTTAATGGAAAAAACTCTCGTCCTTTTAGAGTACATGACTACCAGCCAGAGATTTTCTTAACTCAACCTGTATACTCAGACTTACCATGGGATGGCAAAGTCCGCATGATTGGCATGGGTGCGGTACATCATTCCAATGGTGAAAGTGCCAAACTGTCTCGCTCATGGAATCGTGCTTATTTGATGGCAGGCATGGAATGGAAAAACCTGACTGTCATGCCACGCATTTGGGGGCGTATCTTTAAAGAGGGTAGTGGCAGCCAGCCAGATGATAATCCTGATATCTTGGACTATTATGGTTATGGTGATGTCCGTTTTTTATATCAACTAGAAAATAAAAGTAATATTTCAGGTACGGTACGCTATAATCCACGCTCAGGCAAAGGTGCGTTGCAACTTGACTATGTCTATCCGCTTGGTAAGGGAATTAGTGGCTATTTTCAAATATTTCAAGGCTATGGGCAGTCTTTGATTGATTATAATCATGAGGCGACAAGCTTTGGCGTCGGACTTATGCTTAACGACTGGATGGGTCTATAASEQ ID NO8由SEQ ID NO7的多核苷酸推導(dǎo)出的粘膜炎莫拉氏菌BASB034多肽序列MKVSLSTLTLSILPCFAILAIQQAQAVPNPVAFVDEVRSENDLGQDNELPIDVQSATQSASTDTANPLDEHEPELYTTALENKTMLINCSALNQDIMRLACYDTLVHGETPAVIKTKRSIRLDETIWQTIKGKPQVVYQETTDPIFLMGNEKGMLTKKDAKQLEYAAKQFTPLSLSFDLDRNNTPLWSSRPHNPMYVLPIFMHGKPNRSPNTPSHEAKQFIPNEFRAPELKFQVSVKVKAAEDLWGTDSDLWFGYTQQSHWQIFNGKNSRPFRVHDYQPEIFLTQPVYSDLPWDGKVRMIGMGAVHHSNGESAKLSRSWNRAYLMAGMEWKNLTVMPRIWGRIFKEGSGSQPDDNPDILDYYGYGDVRFLYQLENKSNISGTVRYNPRSGKGALQLDYVYPLGKGISGYFQIFQGYGQSLIDYNHEATSFGVGLMLNDWMGLSEQ ID NO9GAT TTA AGA GTA TGT TAT GAT GSEQ ID NO10GTA TGG GTT GAT CAA ATA CAGSEQ ID NO11AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC CAA GCT GTA CCA AAT CCTGTG GCA TTT GTT GSEQ ID NO12AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA TAG ACC CAT CCAGTC GTT AAG CAT AAGSEQ ID NO13ACTTGGCGAAAATACCATTTATATCGATTGTGATGTTATACAGGCAGATGGCGGTACACGCACAGCCAGTATCAGTGGTGCTGCGGTGGCACTTATTGATGCTTTAGAACACTTGCAGCGTCGTAAAAAGCTTACCCAAGATCCGCTTTTGGGCTTGGTGGCAGCGGTTTCTGTGGGTGTTAATCAAGGCCGTGTATTGCTTGATTTGGATTATGCTGAAGATTCAACTTGTGATACCGATTTAAATGTGGTCATGACGCAGGCAGGTGGGTTTATTGAGATTCAAGGCACAGCAGAAGAAAAGCCATTTACTCGTGCTGAAGCTAATGCGATGCTTGATTTGGCAGAGCTGGGAATTGGGCAGATTATCGAAGCCCAAAAGCAAGTATTAGGCTGGTGATATGCTAATCGTTGAAGATAATGGCGTGATCATCACATTAAATGGACAAGTAAAAGACCCATTATTTTGGTGGTCGATGATATTGCTGCTGCTGGGTGTCTTGGTGGCAATCATTTGTTTGATTGCACCCGTTTTTTATGCAATCGGTGCGTTGGCTTTATTTGCAGTTGTGGTATTTGTGTTTAATATTCAAAGGCAAAAAGCCAAAACTTGTCATATGTTTTCACAAGGTCGCTTGAAGATTACGTCCAAACGCTTTGAGATTCATAACAAATCACTAACCTTATCAGCATCGGCAACAATATCTGCTAAAGATAACAAAATGACAATTGTTGATCGGGGCATTGAATATCATTTTACAGGTTTTGCTGATGACCGTGAAATTAATATAGCCAAACAGGTACTTTTGGGAAAGTCAATCAAAACCAATGCGGTGGCGGTAACATTGGCTAAGTAGTTGTTGTGATACAGACAGGTTGGATGGTCTTTAACTCCACCCACCTAACTTTTTCTTTGTTTGGATTTAAGAGTATGTTATGATGGGCAGGATTTTATTTTAAGTCATCATTTAATGCAATCAGTTGTCCAGAGTAGCCGTTC保藏材料一種含有粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis Catlin)菌株的保藏物于1997年6月21日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(這里的“ATCC”)，分配的保藏號(hào)為43617存貯描述為Branhame lla catarrholis(Frosch and kolle)冷凍干燥，來源于一位患有慢性支氣管炎煤礦工人的跨氣管吸出物中的粘膜炎莫拉氏菌并由此構(gòu)建的1.5～2.9kb插入片段的文庫(kù)。該保藏物描述于Antimicrod Agents Chemother21506～508(1982)。
這里的“保藏的菌株”或“保藏的菌株的DNA”指的是粘膜炎莫拉氏菌菌種保藏物。
保藏的菌株包含全長(zhǎng)的BASB034基因。
由粘膜炎莫拉氏菌DNA插入pQE30形成的載體pMC-PLA1的保藏物于1999年2月12日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，分配的保藏號(hào)為207099。
如果與這里的序列描述發(fā)生沖突，要以保藏的菌株或保藏的克隆中的多核苷酸序列及其編碼的多肽序列為準(zhǔn)。
保藏的菌種/克隆保藏物的制備符合布達(dá)佩斯條約中關(guān)于用于專利程序目的的分子生物保藏的規(guī)定。專利一旦公開，保藏的菌株將無(wú)限制或條件地向公眾發(fā)放且不會(huì)改變，保藏的菌種只是為了本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員的方便而不是必須保藏，如35U.S.C.§112。
序列表<110>SmithKline Beecham Biologicals S.A.<120>新化合物<130>BM45332<160>13<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>1329<212>DNA<213>粘膜炎莫拉氏菌<400>1atgaaagttt cactgtctac attgacttta tctattttgt catgttttgc tatcctagcc 60attcagcaag cacaagctgt accaaatcct gtggcatttg ttgacgaagt acgcagtgaa 120aatgatcttg ggcaagacaa tgaattaccc attgatgtcc aaagtgcgac acaatcagcg 180tctactgata cggccaatcc tttagacgaa catgaaccag agctttatac gacagcttta 240gaaaataaaa ccatgctgat taactgctca gcacttaatc aagatatcat gcgtttggcg 300tgctatgaca ctttggtgca tggtgagacg ccagcggtaa ttaaaaccaa gcgttccatt 360cgccttgatg aaacaatttg gcagaccatc aaaggcaaac cccaggttat ctatcaagaa 420acgacagatc cgattttttt aatgggtaat gaaaaaggca tgctgaccaa aaaagatgcc 480aaacagcttg aatatgcagc caaacagttt acaccactga gcttatcatt tgatttagac 540cgaaataata caccactttg gtcatcacga ccacacaatc cgatgtatgt attgcccata 600tttatgcacg gtaagcctaa tcgaagccca aatacgccca gtcatgaagc aaaacaattt 660accccaaatg aatttcgtgc tcccgagcta aaatttcagg tttctgttaa ggttaaagct 720gctgaggatt tatgggggac 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Gln Pro Glu Ile Phe Leu Thr Gln Pro Val Tyr275 280 285Ser Asp Leu Pro Trp Asp Gly Lys Val Arg Met Ile Gly Met Gly Ala290 295 300Val His His Ser Asn Gly Glu Ser Als Lys Leu Ser Arg Ser Trp Asn305 310 315 220Arg Ala Tyr Leu Met Ala Gly Met Glu Trp Lys Asn Leu Thr Val Met325 330 335pro Arg Ile Trp Gly Arg Ile Phe Lys Glu Gly Ser Gly Ser Gln pro340 345 350Asp Asp Asn Pro Asp Ile Leu Asp Tyr Tyr Gly Tyr Gly Asp Val Arg355 360 365Phe Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Lys Ser Asn Ile Ser Gly Thr Val Arg370 375 380Tyr Asn Pro Arg Ser Gly Lys Gly Ala Leu Gln Leu Asp Tyr Val Tyr385 390 395 400Pro Leu G1y Lys Gly Ile Ser Gly Tyr phe Gln Ile Phe Gln Gly Tyr405 410 415Gly Gln Ser Leu Ile Asp Tyr Asn His Glu Ala Thr Ser Phe Gly Val420 425 430G1y Leu Met Leu Asn Asp Trp Met Gly Leu435 440<210>3<211>1329<212> DNA<213>粘膜炎莫拉氏菌<400>3atgaaagttt cactgtctac attgacttta tctattttgc catgttttgc tatcctagcc 60attcagcaag cacaagctgt accaaatcct gtggcatttg ttgacgaagt acgcagtaaa 120aatgatcttg ggcaagacaa tgaattactc attggtgtac 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Ile Lys Gly Lys Pro Gln Val Val Tyr Gln Glu Thr Thr Asp Pro130 135 140Ile Phe Leu Met Gly Asn Glu Lys Gly Met Leu Thr Lys Lys Asp Ala145 150 155 160Lys Gln Leu Glu Tyr Ala Ala Lys Gln Phe Thr Pro Leu Ser Leu Ser165 170 175Phe Asp Leu Asp Arg Asn Asn Thr Pro Leu Trp Ser Ser Arg Pro His180 185 190Asn Pro Met Tyr Val Leu Pro Ile Phe Met His Gly Lys Pro Asn Arg195 200 205Ser Pro Asn Thr Pro Ser His Glu Ala Arg Gln Phe Thr Pro Asn Glu210 215 220Phe Arg Ala Pro Glu Leu Lys Phe Gln Val Ser Val Lys Val Lys Ala225 230 235 240Ala Glu Asp Leu Trp Gly Thr Asp Ser Asp Leu Trp Phe Gly Tyr Thr245 250 255Gln Gln Ser His Trp Gln Ile Phe Asn Gly Lys Asn Ser Arg Pro Phe260 265 270Arg Val His Asp Tyr Gln Pro Glu Ile Phe Leu Thr Gln Pro Val Tyr275 280 285Ser Asp Leu Pro Trp Asp Gly Lys Val Arg Met Ile Gly Met Gly Ala290 295 300Val His His Ser Asn Gly Glu Ser Al Lys Leu Ser Arg Ser Trp Asn305 310315 320Arg Ala Tyr Leu Met Ala Gly Met Glu Trp Lys Asn Leu Thr Val Met325 330 335Pro Arg Ile Trp Gly Arg Ile Phe Lys Glu Gly Ser Gly Ser Gln Pro340 345 350Asp Asp Asn Pro Asp Ile Leu Asp Tyr Tyr Gly Tyr Gly Asp Val Arg355 360 365Phe Leu Tyr Gln Leu G1u Asn Lys Ser Asn Ile Ser Gly Thr Val Arg370 375 380Tyr Asn Pro Arg Ser Gly Lys Gly Ala Leu Gln Leu Asp Tyr Val Tyr385 390 395 400Pro Leu Gly Lys Gly Ile Ser Gly Tyr Phe Gln Ile Phe Gln Gly Tyr405 410 415Gly Gln Ser Leu Ile Asp Tyr Asn His Glu Ala Thr Ser Phe Gly Val420 425 430Gly Leu Met Leu Asn Asp Trp Met Gly Leu435 440<210>5<211>1329<212>DNA<213>粘膜炎莫拉氏菌<400>5atgaaagttt cactgtctac attgacttta tctattttgt catgttttgc tatcctagcc 60attcagcaag caaaagctgt accaaatcct gtggcatttg ttgacgaagt acgcagtgaa 120aatgatcttg ggcaagacaa tgaattaccc attgatgtcc aaagtgcgac acaatcagcg 180tctactgata cggctaatcc tttagacgaa catgaaccag agctttatac gacagcttta 240gaaaataaaa ccatgctgat taactgctca gcacttaatc aagatatcat gcgtttggcg 300tgctatgaca ctttggtgca tggtgagacg ccagcggtaa ttaaaaccaa gcgttccatt 360cgccttgatg aaacaatttg gcagaccatc aaaggcaaac cccaggttgt ctatcaagaa 420acgacagatc 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ttatgcttaa cgactggatg1120ggtctataa1329<210>6<211>442<212>蛋白質(zhì)<213>粘膜炎莫拉氏菌
<400>6Met Lys Val Ser Leu Ser Thr Leu Thr Leu Ser Ile Leu Ser Cys Phe1 5 10 15Ala Ile Leu Ala Ile Gln Gln Ala Lys Ala Val Pro Asn Pro Val Ala20 25 30Phe Val Asp Glu Val Arg Ssr Glu Asn Asp Leu Gly Gln Asp Asn Glu35 40 45Leu Pro Ile Asp Val Gln Ser Ala Thr Gln Ser Ala Ser Thr Asp Thr50 55 60Ala Asn Pro Leu Asp Glu His Glu Pro Glu Leu Tyr Thr Thr Ala Leu65 70 75 80Glu Asn Lys Thr Met Leu Ile Asn Cys Ser Ala Leu Asn Gln Asp Ile85 90 95Met Arg Leu Ala Cys Tyr Asp Thr Leu Val His Gly Glu Thr Pro Ala100 105 110Val Ile Lys Thr Lys Arg Ser Ile Arg Leu Asp Glu Thr Ile Trp Gln115 120 125Thr Ile Lys Gly Lys Pro Gln Val Val Tyr Gln Glu Thr Thr Asp Pro130 135 140Ile Phe Leu Met Gly Asn Glu Lys Gly Met Leu Thr Lys Lys Asp Ala145 150 155 160Lys Gln Leu Glu Tyr Ala Ala Lys Gln Phe Thr Pro Leu Ser Leu Ser165 170 175Phe Asp Leu Asp Arg Asn Asn Thr Pro Leu Trp Ser Ser Arg Pro His180 185 190Asn Pro Met Tyr Val Leu Pro Ile Phe Met His Gly Lys Pro Asn Arg195 200 205Ser Pro Asn Thr Pro Ser His Glu Ala Arg GIn Phe Thr Pro Asn Glu210 215 220Phe Arg Ala Pro Glu Leu Lys Phe Gln Val Ser Val Lys Val Lys Ala225 230 235 240Ala Glu Asp Leu Trp Gly Thr Asp Ser Asp Leu Trp Phe Gly Tyr Thr245 250 255Gln Gln Ser His Trp Gln Ile Phe Asn Gly Lys Asn Ser Arg Pro Phe260 265 270Arg Val His Asp Tyr Gln Pro Glu Ile Phe Leu Thr Gln Pro Val Tyr275 280 285Ser Asp Leu Pro Trp Asp Gly Lys Val Arg Met Ile Gly Met Gly Ala
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權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，包括與選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6和SEQ ID NO8的氨基酸序列有至少85％一致的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的分離的多肽，其中的氨基酸序列與選自SEQ IDNO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6和SEQ ID NO8的氨基酸序列有至少95％一致。
3.權(quán)利要求1的多肽，包括選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6和SEQ ID NO8的氨基酸序列。
4.SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6和SEQ ID NO8的分離的多肽。
5.一種權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的多肽的免疫原性片段，其中該免疫原性片段的免疫原性活性與多肽SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8基本一致。
6.一種分離的多核苷酸，包含一段核苷酸序列，該核苷酸序列編碼的多肽分別與SEQ ID NO2，4，6，8的氨基酸序列在全長(zhǎng)范圍內(nèi)有至少85％一致；或者與該分離的多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
7.一種分離的多核苷酸，包含一段核苷酸序列，該核苷酸序列與編碼多肽SEQ ID NO2，4，6，8的核苷酸序列在整個(gè)編碼區(qū)內(nèi)有至少85％一致；或者與該分離的多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
8.一種分離的多核苷酸，包含一段核苷酸序列，該序列分別與SEQID NO1，3，5，7在全長(zhǎng)范圍內(nèi)有至少85％一致；或者與該分離的多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求6到8中任一項(xiàng)的分離的多核苷酸，其中它與SEQ IDNO1，3，5，7至少有95％一致。
10.一種分離的多核苷酸，包括編碼多肽SEQ ID NO2，SEQ IDNO4，SEQ ID NO6或SEQ ID NO8的核苷酸序列。
11.一種分離的多核苷酸，包括多核苷酸SEQ ID NO1，SEQ IDNO3，SEQ ID NO5或SEQ ID NO7。
12.一種分離的多核苷酸，包含編碼多肽SEQ ID NO2，SEQ IDNO4，SEQ ID NO6或SEQ ID NO8的核苷酸序列，它可通過使用含SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5或SEQ ID NO7序列或其片段的探針在嚴(yán)格的雜交條件下篩選合適的文庫(kù)而得到。
13.一種表達(dá)載體或重組活微生物，包括權(quán)利要求6～12中任一項(xiàng)的分離的多核苷酸。
14.一種包括權(quán)利要求13的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，或所說宿主細(xì)胞的表達(dá)分離多肽的膜，所說的分離多肽包括與選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6或SEQ ID NO8中的氨基酸序列有至少85％一致的氨基酸序列。
15.一種制備多肽的方法，該多肽包括選自SEQ ID NO2，SEQ IDNO4，SEQ ID NO6或SEQ ID NO8中的氨基酸序列有至少85％一致的氨基酸序列，該方法包括在足以制備該多肽的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞和從培養(yǎng)基中收集多肽。
16.一種表達(dá)權(quán)利要求6～12中任一項(xiàng)的多核苷酸的方法，包括用含有至少一種所說多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞和在足以使該多核苷酸中任何一個(gè)發(fā)生表達(dá)的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。
17.一種疫苗組合物，包括有效量的權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的多肽和一種可藥用載體。
18.一種疫苗組合物，包括有效量的權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)的多核苷酸和可藥用載體。
19.權(quán)利要求17或18的疫苗組合物，其中該組合物包括至少一種其他的粘膜炎莫拉氏菌抗原。
20.一種抗體，它對(duì)于權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的多肽或免疫片段具有免疫專一性。
21.一種診斷莫拉氏菌感染的方法，包括鑒定權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的多肽，或者鑒定對(duì)于該多肽具有免疫專一性的抗體，它們存在于可能感染的動(dòng)物的生物樣品中。
22.包括有效量的權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的多肽的組合物在制備用于在動(dòng)物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。
23.包括有效量的權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)的多核苷酸的組合物在制備用于在動(dòng)物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。
24.一種用于治療患有粘膜炎莫拉氏菌病的人類患者的治療組合物，包括至少一種抗權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的多肽的抗體和合適的藥物載體。
全文摘要
本發(fā)明提供BASB034多肽及編碼該多肽的多核苷酸,以及通過重組技術(shù)生產(chǎn)該多肽的方法。也提供其在疾病診斷,預(yù)防及治療方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1326509SQ99813243
公開日2001年12月12日 申請(qǐng)日期1999年9月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月14日
發(fā)明者J·－L·呂勒 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司