專利名稱：表現(xiàn)出殺精子活性的苯乙基－5－溴吡啶基硫脲(pbt)和二氫烷氧基芐基氧代嘧啶(dabo ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的PBT和DABO衍生物。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及表現(xiàn)出殺精子活性的新的PBT和DABO衍生物。
背景技術(shù)：
人免疫缺陷病毒(HIV)-獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的病原體是導(dǎo)致育齡婦女死亡的增長最迅速的病因。在全世界所有HIV感染中，異性間的傳播占90％，并且在美國導(dǎo)致新感染HIV的比例不斷增加。到2000年為止，有一千三百萬婦女感染了HIV，而在全世界范圍內(nèi)總共有四千萬感染HIV的個(gè)體。在缺乏有效的預(yù)防性抗HIV疫苗或抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的情況下，人們需要用來抑制粘膜和產(chǎn)期HIV傳播的由女性控制的陰道殺微生物劑。
有人擔(dān)心，在全球范圍內(nèi)使用洗滌劑型殺精子藥例如壬苯醇醚-9(N-9)實(shí)際上可能會(huì)增加HIV傳播的危險(xiǎn)。N-9已經(jīng)作為不需處方即可以出售的殺精子凝膠劑、泡沫劑、霜?jiǎng)?、海綿擦拭劑、薄膜劑、和發(fā)泡片劑使用了30年以上。因?yàn)閾?jù)表明N-9在體外能滅活HIV，所以目前它成為唯一考慮的用于在婦女中防止性傳播HIV感染的局部用殺微生物劑。然而，使用N-9的主要缺點(diǎn)是其對(duì)上皮細(xì)胞有去污劑型作用。將N-9作為陰道用避孕藥頻繁使用會(huì)增加子宮頸陰道感染、刺激、或潰瘍的危險(xiǎn)性。因?yàn)檫B續(xù)使用N-9可改變陰道菌叢以及增加機(jī)會(huì)感染的危險(xiǎn)性，所以它可能增加子宮頸外上皮和子宮頸內(nèi)粘膜對(duì)HIV感染的易感性。此外，最近的臨床試驗(yàn)表明，當(dāng)作為綜合預(yù)防措施的一部分來提供以預(yù)防HIV/AIDS的異性傳播時(shí)，含有N-9的陰道避孕藥對(duì)HIV/AIDS和其它STDs的傳播沒有任何作用。參見例如Roddy等人，1998，N.Eng.J.Med.339504-510；Hira等人，1997，Int.J.STD AIDS 8243-250)。
與目前市售的陰道殺微生物劑相比，沒有洗滌劑型膜毒性的新的、有效、安全、且由女性控制使用的局部用殺微生物劑應(yīng)該有臨床優(yōu)點(diǎn)。生理受精取決于射出的精子游動(dòng)、結(jié)合透明帶、以及穿透卵子的能力。每一這些活動(dòng)性都主要取決于精子的運(yùn)動(dòng)性。因此，給所選的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物例如非核苷類抑制劑(NNIs)加上殺精子功能可以是抑制HIV的異性陰道傳播以及防止受孕的有效手段。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了新的非核苷類抑制劑(NNIs)苯乙基-5-溴吡啶基硫脲(PBT)和二氫烷氧基芐基氧代嘧啶(DABO)衍生物。這些化合物可用作精子固定劑或避孕劑。據(jù)本申請(qǐng)人所知，PBT和DABO衍生物在現(xiàn)有技術(shù)中沒有研究過，并且沒有認(rèn)識(shí)到它們具有任何避孕活性例如殺精子或精子固定活性。
本發(fā)明提供了具有化學(xué)結(jié)構(gòu)(I)的鹵代PBT衍生物或其可藥用鹽 其中R、R1、R2、R3、和R4獨(dú)立地為氫、F、Cl、Br、或I，并且R、R1、R2、R3、和R4當(dāng)中至少有一個(gè)是F、Cl、Br、或I。
本發(fā)明還提供了包含式(III)的新的DABO衍生物化合物或其可藥用鹽 其中R1和R2相同或不同，并且是氫、鹵素、烷基、鏈烯基、羥基、烷氧基、烷硫基、硫羥基、膦基、ROH、或RNH基團(tuán)，其中R是烷基；Y是S或O；且R3是烷基、鏈烯基、芳基、芳烷基、ROH、或RNH2基團(tuán)，其中R是烷基。
本發(fā)明還提供了在哺乳動(dòng)物中抑制受孕的方法。所述方法包含用殺精子有效量的本發(fā)明新的鹵代PBT衍生物或新的DABO衍生物與哺乳動(dòng)物精子接觸。
本發(fā)明另一方面是抑制精子運(yùn)動(dòng)的方法。所述方法包含用精子運(yùn)動(dòng)抑制有效量的本發(fā)明鹵代PBT衍生物或DABO衍生物與精子接觸。
本發(fā)明還提供了包含殺精子有效量的殺精子劑和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑的組合物。所述殺精子劑包括本發(fā)明鹵代PBT衍生物或DABO衍生物。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明鹵代PBT衍生物或DABO衍生物的殺精子產(chǎn)品。
通過閱讀下述附圖、詳細(xì)說明、實(shí)施例和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯而易見。
附圖的簡要說明附

圖1是下述化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)N-[2-(2，5-二甲氧基苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(D-PBT)；N-[2-(2-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(F-PBT)；5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-(芐基)嘧啶-4-(1H)-酮(S-DABO)；和N-[2-(2-吡啶基)乙基]-N’-[2-溴吡啶基)]硫脲(trovirdine，一種PETT衍生物)。
附圖2表示的是trovirdine、D-PBT、F-PBT、S-DABO、和N-9對(duì)精子運(yùn)動(dòng)的濃度-依賴性抑制。在測定培養(yǎng)基中，將精子的高運(yùn)動(dòng)性部分與濃度遞增的(31.2μM-500μM)trovirdine、D-PBT、F-PBT、S-DABO、和N-9或1％DMSO一起培養(yǎng)3小時(shí)，并通過CASA評(píng)估能運(yùn)動(dòng)的精子的百分比。每一數(shù)據(jù)點(diǎn)代表3-4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。
附圖3表示的是在F-PBT存在下時(shí)間-依賴性精子固定。在測定培養(yǎng)基中，在1mM F-PBT或僅1％DMSO存在下將能運(yùn)動(dòng)的精子在37℃培養(yǎng)。以5或10分鐘的時(shí)間間隔通過CASA測定精子的運(yùn)動(dòng)性。每一數(shù)據(jù)點(diǎn)代表兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。
附圖4表示的是F-PBT對(duì)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響。在測定培養(yǎng)基中，在1mM F-PBT存在下培養(yǎng)精子的運(yùn)動(dòng)部分，并用在″Materialsand Methods″中描述的Hamilton Thorne-IVOS version 10 CASA測定時(shí)間-依賴性運(yùn)動(dòng)特征。值對(duì)于VCL、VAP、VSL是μm/s；對(duì)于ALH是μm；對(duì)于MOT、STR、LIN是％；對(duì)于BCF是Hz。
附圖5A表示的是D-PBT、F-PBT、S-DABO、和N-9對(duì)精子頂體膜完整性的影響。在或不在遞增濃度的三種NNIs和N-9存在下將能運(yùn)動(dòng)的精子預(yù)培養(yǎng)6小時(shí)。通過FITC-豌豆(Pisum sativum)凝集素結(jié)合測定法測定的頂體完整精子的百分比以三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD表示。
附圖5B-5E是精子的激光掃描同焦熒光圖像。所示精子進(jìn)行了三種標(biāo)記，即用FITC-豌豆凝集素標(biāo)記頂體(綠色)、用TOTO-3碘化物標(biāo)記DNA(藍(lán)色)、用尼羅紅標(biāo)記膜脂質(zhì)(紅色)。在頂體完整精子中，精子頭的頂體區(qū)域表現(xiàn)出均勻的亮綠色熒光。在頂體發(fā)生反應(yīng)的精子中，綠色熒光不存在或者局限在精子頭的中緯線部分。附圖5B表示的是僅暴露于0.5％DMSO的精子；附圖5C表示的是暴露于500μMF-PBT的精子；附圖5D表示的是暴露于500μMS-DABO的精子。附圖5B、5C、或5D沒有一個(gè)表現(xiàn)出培養(yǎng)6小時(shí)后精子的頂體反應(yīng)增加。附圖5E表示的是暴露于500μM N-9的精子，并僅表示了頂體發(fā)生反應(yīng)的精子(原始放大倍數(shù)為×1000)。
發(fā)明詳述定義除非另外指出，否則在本申請(qǐng)中使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語都具有其在本領(lǐng)域內(nèi)常用的含義。在本申請(qǐng)中使用的下述詞語或短語具有指定含義。
如在本文中使用的“DABO”是指二氫烷氧基芐基氧代嘧啶化合物。
如在本文中使用的“S-DABO”是指化合物5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-(芐基)嘧啶-4-(1H)-酮類。
如在本文中使用的“PBT”是指化合物苯乙基-5-溴吡啶基硫脲。
如在本文中使用的“F-PBT”是指化合物N-[2-(2-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲。
如在本文中使用的“D-PBT”是指化合物N-[2-(2，5-二甲氧基苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲。
如在本文中使用的“N-9”是指殺病毒/殺精子劑壬苯醇醚-9。
如在本文中使用的“逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)”是指具有與HIV-1 RT類似的NNI結(jié)合點(diǎn)的酶。
如在本文中使用的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(HIV-RT)的“非核苷類抑制劑(NNI)”是指能結(jié)合到HIV-RT的變構(gòu)位點(diǎn)上從而非競爭性地抑制HIV-RT活性的化合物。HIV-RT的非核苷類抑制劑的實(shí)例包括但不限于S-DABO、F-PBT、和D-PBT。
如在本文中使用的術(shù)語“類似物”或“衍生物”可互換地表示在結(jié)構(gòu)和功能上與另一物質(zhì)相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)。類似物或衍生物含有從其它物質(zhì)修飾的結(jié)構(gòu)，并保持其它物質(zhì)的功能，在本申請(qǐng)中，是保持與NNI-RT結(jié)合位點(diǎn)相互作用的能力。類似物或衍生物不是必須、但是可以由其它物質(zhì)合成得到。例如，DABO類似物或衍生物是指在結(jié)構(gòu)上與DABO相關(guān)、但不是必須從DABO制得的化合物。
如在本文中使用的“可藥用鹽”是指保持母化合物的所需生物活性、并且不產(chǎn)生任何不良毒性作用的鹽?？伤幱名}的實(shí)例包括但不限于(a)與無機(jī)酸形成的酸加成鹽，所述無機(jī)酸有例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；和與有機(jī)酸形成的鹽，所述有機(jī)酸有例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、鞣酸、撲酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸；(b)與多價(jià)金屬陽離子例如鋅離子、鈣離子、鉍離子、鋇離子、鎂離子、鋁離子、銅離子、鈷離子、鎳離子、鎘離子等形成的鹽；或(c)與由N，N’-二芐基乙二胺或乙二胺形成的有機(jī)陽離子形成的鹽；或(d)(a)與(b)或(c)的組合，例如鋅鞣酸鹽等。優(yōu)選的酸加成鹽是三氟乙酸鹽和乙酸鹽。
如在本文中使用的“可藥用載體”包括當(dāng)與本發(fā)明化合物混合在一起時(shí)使得化合物能保持其生物活性例如抑制精子活動(dòng)的能力、并且與個(gè)體的免疫系統(tǒng)不發(fā)生反應(yīng)的任何物質(zhì)。其實(shí)例包括但不限于任何標(biāo)準(zhǔn)藥物載體，例如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳液例如油/水乳液、和各種類型的濕潤劑。用于氣霧劑或非胃腸道給藥的優(yōu)選稀釋劑是磷酸鹽緩沖鹽水或標(biāo)準(zhǔn)(0.9％)鹽水。通過公知的常規(guī)方法配制含有這樣的載體的組合物(參見，例如Remington’s PharmaceuticalSciences，第43章，14th Ed.，Mack Publishing Col，Easton Pa.18042，USA)。
化合物在具有改善的抗HIV活性的治療劑的發(fā)展史中，合成了新的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的NNIs。在1998年3月17日提交的美國專利申請(qǐng)09/040538公開了逆轉(zhuǎn)錄酶的非核苷類抑制劑—結(jié)合HIV-RT袋的NNI復(fù)合物，及使用它們的方法，該申請(qǐng)引入本發(fā)明以作參考。
我們出乎意料地發(fā)現(xiàn)，其中一些NNIs具有殺精子和/或精子固定活性，這使得它們可用作避孕活性劑和精子固定產(chǎn)品以及方法。具有殺精子活性的NNIs包括PBT和DABO的新衍生物。本發(fā)明PBT和DABO衍生物可特別用于形成可減少性傳播疾病傳播、尤其是HIV傳播的避孕產(chǎn)品。將精子與這些殺精子NNIs接觸可抑制精子的運(yùn)動(dòng)性并達(dá)到所需的殺精子和/或受孕抑制效果。
表現(xiàn)出顯著殺精子活性的PBT衍生物包括具有化學(xué)結(jié)構(gòu)(I)的鹵代PBT衍生物或其可藥用鹽 其中R、R1、R2、R3、和R4獨(dú)立地為氫、F、Cl、Br、和I，并且R、R1、R2、R3、和R4當(dāng)中至少有一個(gè)是F、Cl、Br、或I。
優(yōu)選地，在結(jié)構(gòu)(I)中，R、R1、R2、R3、和R4當(dāng)中有一個(gè)是F或Cl。一些、但不是全部合適的本發(fā)明鹵代PBT衍生物列舉如下N-[2-(2-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲N-[2-(2-氯苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲N-[2-(3-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲N-[2-(3-氯苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲N-[2-(4-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲N-[2-(4-氯苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲。
一種更優(yōu)選的本發(fā)明PBT衍生物是具有下示化學(xué)結(jié)構(gòu)(II)的N-[2-(2-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(F-PBT) 本發(fā)明PBT衍生物可如實(shí)施例中所述，和如Vig等人在BIOORG.MED.CHEM.，61789-1797(1998)中所述合成得到。簡言之，將2-氨基-5-溴吡啶與1，1-硫代羰基二咪唑縮合以生成硫代羰基衍生物前體。再進(jìn)一步與適當(dāng)鹵代的苯乙胺反應(yīng)以生成目標(biāo)鹵代PBT衍生物。
表現(xiàn)出顯著殺精子活性的DABO衍生物包括具有下示化學(xué)結(jié)構(gòu)(III)的DABO衍生物或其可藥用鹽 其中R1和R2相同或不同，并且是氫、鹵素、烷基、鏈烯基、羥基、烷氧基、烷硫基、硫羥基、膦基、ROH、或RNH基團(tuán)，其中R是烷基。優(yōu)選地，一個(gè)或多個(gè)R1和R2是具有1-3個(gè)碳原子(C1-C3)的烷基，例如甲基(Me)、乙基(Et)、或異丙基(i-Pr)。優(yōu)選地，R1是烷基、鏈烯基、ROH、或RNH2。R2優(yōu)選為鹵素、烷基、或C1-C3烷氧基；Y是S或O，優(yōu)選為S。R3是烷基、鏈烯基、芳基、芳烷基、ROH、或RNH基團(tuán)，其中R是烷基，并且優(yōu)選為C1-C3烷基。
優(yōu)選的DABO衍生物包括具有下示所示化學(xué)結(jié)構(gòu)(IV)的化合物或其可藥用鹽 其中R1是Me、Et、或i-Pr，且R2是H或Me。
有些、但不是全部合適的本發(fā)明DABO衍生物化合物包括下述化合物(a)-(d)或其可藥用鹽(a)5-甲基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-芐基-嘧啶-4-1H-酮，(b)5-乙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6芐基-嘧啶-4-1H-酮，(c)5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-芐基-嘧啶-4-1H-酮，和(d)5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-(3，5-二甲基芐基)-嘧啶-4-1H-酮。
一種更優(yōu)選的本發(fā)明DABO衍生物是下述化學(xué)結(jié)構(gòu)(V)所示化合物5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-(芐基)-嘧啶-4-(1H)-酮(S-DABO)及其可藥用鹽 DABO衍生物可如實(shí)施例中所述，和如Vig等人，BIOORG MED CHEMLETTERS，81461-1466(1998)所述制得。
制備DABO衍生物(a)-(d)的一般合成方案如下所示
試劑和條件a)R2CHBrCOOEt/Zn/THF，b)HCl(aq)，c)(H2N)2CS/Na/EtOH，d)DMF，K2CO3，氯甲基甲基硫化物，15h。
簡言之，由市售苯基乙腈制得2-烷基-4-(苯基)-3-氧代丁酸乙酯1a-d。在乙醇鈉存在下將該β-酮基酯與硫脲縮合，以生成相應(yīng)的硫尿嘧啶2a-d?；衔?1a-d和2a-d)是按照現(xiàn)有技術(shù)中的方法制得的(Danel，K.等人，Acta Chemica Scandinavica，1997，51，426-430；Mai，A.等人，J.Med.Chem.，1997，40，1447-1454；Danel，K.等人，J.Med.Chem.，1998，41，191-198)。
然后在碳酸鉀存在下將硫尿嘧啶與甲基氯甲基硫化物在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中反應(yīng)，以中等產(chǎn)率獲得了化合物3a-d。將硫尿嘧啶化合物2(1mmol)、甲基氯甲基硫化物(1mmol)、和碳酸鉀(1mmol)在無水DMF(5ml)中的混合物于室溫?cái)嚢柽^夜。用水(50ml)處理后，用乙酸乙酯萃取該溶液(3×50ml)。合并萃取液，用飽和NaCl洗滌(2×50ml)，干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮，獲得了粗產(chǎn)物3a-d，通過柱色譜法純化(洗脫劑為己烷∶乙酸乙酯)。
本申請(qǐng)實(shí)施例中描述了一些PBT衍生物和DABO衍生物的純度和物理化學(xué)特征，Vig等人，BIOORG.MED.CHEM.，61789-1797(1998)；和Vig等人，BIOORG MED CHEM LETTERS，81461-1466(1998)中對(duì)此作了更詳細(xì)報(bào)道。
組合物、產(chǎn)品和方法本發(fā)明PBT和DABO衍生物可配制成殺精子用組合物。這樣的組合物可特別用于哺乳動(dòng)物，即用乳腺分泌的乳汁哺育其幼子的任何高級(jí)脊椎動(dòng)物，例如人、兔和猴子。本發(fā)明組合物還可用作精子固定組合物。預(yù)計(jì)本發(fā)明可由人在大多數(shù)實(shí)際應(yīng)用中使用。
本發(fā)明組合物含有一種或多種如上所公開的殺精子PBT和DABO衍生物和其可藥用鹽。殺精子PBT和DABO衍生物的含量一般為實(shí)現(xiàn)所需殺精子和抗病毒保護(hù)結(jié)果所必需的量。對(duì)于具體組合物，該量可隨需要而變。殺精子PBT和DABO衍生物的含量一般為占避孕用組合物總重量的約0.025-0.5％重量。殺精子PBT和DABO衍生物的含量優(yōu)選為占組合物總重量的約0.05-0.5％重量、更優(yōu)選為0.05-0.25％重量。
本發(fā)明組合物可不僅含有殺精子PBT和DABO衍生物，而且隨著具體需要還含有可藥用載體、稀釋劑或賦形劑，即用于將殺精子NNIs適當(dāng)?shù)剡f送給和/或保持在與精子接觸的位置上以提供所需殺精子和/或抗病毒保護(hù)活性的物質(zhì)。
用于施用殺精子劑的藥物組合物中的一種有益組分是如在US5595980中描述的聚合遞送組分，該文獻(xiàn)引入本發(fā)明以作參考。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這樣的聚合遞送組分能提高所施用的殺精子劑的有效性和減輕陰道刺激。
除了聚合組分以外，本發(fā)明避孕組合物的平衡部分、即一般占組合物約0.1-99.8％、經(jīng)常約50-99.8％重量的部分可任選包含一種或多種美容組分。這樣的美容組分是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且在本領(lǐng)域中經(jīng)常稱為稀釋劑、溶劑和輔料。美容組分一般包括例如水、乙醇、異丙醇、甘油、丙二醇、山梨醇和其它高分子量醇。此外，本發(fā)明避孕組合物可含有少量、例如占避孕組合物重量約0.1-5％重量的其它添加劑，例如穩(wěn)定劑、表面活性劑、薄荷醇、桉樹油、其它精油、香料等。聚氧化乙烯20脫水山梨醇一月桂酸酯是用于本發(fā)明組合物的優(yōu)選穩(wěn)定劑。美容組分、其它添加劑的選擇和用量、以及混合操作可依據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)進(jìn)行。
本發(fā)明殺精子活性組分和含有所述組分的避孕組合物可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的手段遞送到哺乳動(dòng)物陰道中。遞送本發(fā)明組合物的典型形式包括例如霜?jiǎng)?、洗劑、凝膠劑、泡沫劑，陰道間裝置例如海綿、避孕套包括女用避孕套、栓劑和薄膜。此外，本發(fā)明避孕化合物和組合物可用作個(gè)人用養(yǎng)護(hù)產(chǎn)品例如避孕套潤滑劑等。除了本發(fā)明組合物以外。這樣的潤滑劑還可包含已知的常用組分，例如濕潤劑，例如甘油、山梨醇、甘露醇、二元醇和二元醇醚；緩沖劑，例如葡萄糖酸-d-內(nèi)酯；殺菌劑或滅菌劑，例如葡萄糖酸洗必太；防腐劑，例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯；粘度調(diào)節(jié)劑，例如羥乙基纖維素等；其它輔料，例如著色劑和香料。本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到，遞送形式的物理性質(zhì)例如粘度可廣泛變化。例如，凝膠形式的本發(fā)明組合物的粘度例如150000厘泊可基本上高于洗液形式的本發(fā)明組合物的粘度例如100厘泊。關(guān)于這樣的遞送形式的材料、組分、比例和操作的進(jìn)一步詳細(xì)內(nèi)容可依據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)來選擇。
本發(fā)明避孕組合物優(yōu)選以能有效地固定精子例如存在于陰道中的精子和/或抑制精子穿透子宮頸粘液的劑量施用到接觸精子的位置上，例如施用到哺乳動(dòng)物的陰道中。典型劑量為約0.0001-0.001克組合物/千克哺乳動(dòng)物體重。
還可以使用如在US 5069906中描述的陰道間裝置來幫助施用殺精子活性組分或含有所述組分的避孕組合物，該文獻(xiàn)引入本發(fā)明以作參考。
在以上述組合物形式施用殺精子活性組分時(shí)，還可以將組合物配制成能迅速地釋放和/或延時(shí)釋放殺精子劑藥物的制劑。US 4707362中描述了提供迅速和延時(shí)釋放的這樣的制劑，該文獻(xiàn)引入本發(fā)明以作參考。
還可將本發(fā)明殺精子NNIs摻入到殺精子產(chǎn)品例如陰道插入物、避孕套或其它這種裝置中，這樣當(dāng)使用這樣的產(chǎn)品時(shí)，可遞送殺精子NNI與精子接觸。
用下述實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明，但這些實(shí)施例不應(yīng)理解為是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例為了開發(fā)既能預(yù)防HIV傳播又能控制生育的陰道殺微生物避孕藥，我們合成了新的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)非核苷類抑制劑(NNIs)，并測定了其抗HIV和殺精子的雙重功能。
用作HIV RT抑制劑的新NNIs是基于計(jì)算機(jī)模型合成的，其中在該計(jì)算機(jī)模型中用9個(gè)有獨(dú)立晶體結(jié)構(gòu)的RT-NNI復(fù)合物構(gòu)建一個(gè)復(fù)合結(jié)合袋。[插入物指引]新的NNIs包括N-[2-(2，5-二甲氧基苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(D-PBT)、N-[2-(2-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(F-PBT)、和5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-(芐基)-嘧啶-4-(1H)-酮(S-DABO)。
如附圖1所示，NNI trovirdine可看作由硫脲基連接在一起的兩個(gè)化學(xué)基團(tuán)。該分子的一半是由形成分子內(nèi)氫鍵鍵合雜環(huán)的吡啶基硫脲部分組成。該分子的另一半是通過乙基接頭與硫代羰基隔開的吡啶環(huán)。使用trovirdine的計(jì)算機(jī)docking操作處理顯示了可用于在吡啶環(huán)和乙基接頭周圍并且靠近trovirdine的5-溴位點(diǎn)處摻入較大官能團(tuán)的多個(gè)位點(diǎn)。因此，加入戰(zhàn)略設(shè)計(jì)的官能團(tuán)以產(chǎn)生對(duì)于HIV RT的NNI結(jié)合袋有潛在較高親和力的新衍生物。通過用2，5-二甲氧基苯基部分(D-PBT)或在鄰位有氟原子的苯基(F-DBT)替換trovirdine的2-吡啶基環(huán)合成了兩個(gè)新的PBT衍生物(D-PBT和F-PBT)。通過強(qiáng)效HEPT衍生物的模型化研究和通過在胸腺嘧啶環(huán)的C-5位置加入異丙基(S-DABO)完成了DABO的衍生化。
通過使用感染HIV的人外周血液單核細(xì)胞(PBMCs)測定病毒RT活性和p24抗原生成(作為病毒復(fù)制的標(biāo)記物)，比較這三種新的NNI(D-PBT、F-DBT和S-DABO)與trovirdine和殺病毒劑/殺精子劑壬苯醇醚-9(N-9)的抗HIV活性。分別通過計(jì)算機(jī)輔助精子分析(CASA)和同焦激光掃描顯微鏡檢查(CLSM)來分析對(duì)精子運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)學(xué)和精子膜完整性的影響。使用MTT測定法測試NNI與N-9抗正常人子宮頸外和子宮頸內(nèi)上皮細(xì)胞的生長抑制作用。所有這三種NNIs都是純化的重組HIV RT的強(qiáng)效抑制劑，并且以毫微摩爾濃度消除了HIV在PBMC中的復(fù)制(IC50＜1nM)，而N-9與trovirdine的IC50值分別為2.2μM和0.007μM。兩種NNIs-F-PBT與S-DABO還表現(xiàn)出濃度-和時(shí)間-依賴性的殺精子活性。I.材料和方法A.化學(xué)合成所用的所有化學(xué)品都是得自Aldrich Chemical Company(Milwaukee，Wisconsin)。所有反應(yīng)都是在氮?dú)夥障逻M(jìn)行的。使用EM Science硅膠60和一種下述溶劑進(jìn)行柱色譜法乙酸乙酯、甲醇、氯仿、己烷、或二氯甲烷。核磁共振(NMR)光譜是在Varian(Palo Alto，CA)300 MHz儀器(Mercury 2000型)記錄的，并且化學(xué)位移(δ)是以相對(duì)于內(nèi)標(biāo)物四甲基硅烷(0ppm)的百萬分之分?jǐn)?shù)(ppm)報(bào)告的。13C NMR光譜是使用質(zhì)子去偶技術(shù)在同一儀器上在CDCl3中于75MHz記錄的。所報(bào)告的關(guān)于13C NMR的化學(xué)位移是參照在77ppm的氯仿三重峰。熔點(diǎn)是用Mel-Temp 3.0(Laboratory Devices Inc.，Holliston，MA)熔化儀器測定的，并且未經(jīng)校正。UV光譜是用Beckmann(Fullerton，CA)型DU 7400 UV/Vis分光計(jì)記錄的，其中使用通路長度為1cm的小池和甲醇溶劑。用FT-Nicolet(Madison，WI)型Protege 460儀器記錄傅里葉變換紅外光譜。質(zhì)譜分析是用Hewlett-Packard(Palo Alto，CA)Matrix Assisted LaserDescription飛行時(shí)間(MALDI-TOF)分光計(jì)(G2025A型)以分子離子檢測方式進(jìn)行的(所用基質(zhì)是氰基羥基肉桂酸)。有些樣本是用Finnigan(Madison，WI)MAT 95儀器分析的。元素分析是通過Atlantic Microlabs(Norcross，GA)進(jìn)行的。1.Trovirdine的化學(xué)合成依據(jù)文獻(xiàn)中記載的方法合成Trovirdine(N-[2-(2-吡啶基)乙基]-N’-[2-溴吡啶基)]硫脲)。參見Cantrell等人，J MED CHEM394261-4274(1996)。2.D-PBT的化學(xué)合成按照Vig等人在BIOORG.MED.CHEM.，61789-1797(1998)中描述的方法合成化合物D-PBT([N-[2-(2，5-二甲氧基苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲)。
簡言之，如反應(yīng)方案1所示合成D-PBT。反應(yīng)方案1 所得D-PBT的純度和性質(zhì)如下所示白色固體(2g，67％)；mp 133-138℃；UV(MeOH)λmax202，205，231，276和300nm；IR(KBr圓片)ν3209，3152，3078，3028，2951，2831，1595，1533，1468，1306，1227，1095，1059，1022，862，825，796，707cm-1；1H NMR(CDCl3)δ 11.24(br s，1H)，9.30(brs，1H)，8.10-8.09(d，1H)，7.65(dd，1H)，6.82-6.76(m，4H)，4.03-3.97(q，2H)，3.77(s，3H)，3.76(s，3H)，3.00-2.96(t，2H)；13C NMR(CDCl3)δ178.7，153.1，151.8，151.7，146.5，140.9，128.1，117.7，113.3，112.6，111.2，110.9，55.7，55.5，45.6，和29.9；MALDI-TOF MS實(shí)測值394.0(M-1)，396.0(M+1)，計(jì)算值395.0；元素分析(C16H18BrN3O2S)C，H，N，S，Br。3.F-PBT的化學(xué)合成按照Vig等人在BIOORG.MED.CHEM.，61789-1797(1998)中描述的方法合成化合物F-PBT(N-[2-(2-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲)。
更具體來說，依據(jù)反應(yīng)方案2合成F-PBT。簡言之，將2-氨基-5-溴吡啶與1，1-硫代羰基二咪唑縮合，以生成硫代羰基衍生物前體。進(jìn)一步與適當(dāng)取代的苯乙胺反應(yīng)，當(dāng)與2-氟苯乙胺反應(yīng)時(shí)，生成目標(biāo)產(chǎn)物F-PBT。反應(yīng)方案2 其中i)1，1-硫代羰基二咪唑，乙腈，室溫，12小時(shí)；和ii)DMF，2-氟苯乙胺，100℃，15小時(shí)。
具體采用下述操作來合成F-PBT在室溫將硫代羰基二咪唑(8.90g，50mmol)和2-氨基-5-溴吡啶(8.92g，50mmol)加到50mL無水乙腈中。將該反應(yīng)混合物攪拌12小時(shí)，過濾沉淀，用冷的乙腈洗滌(2×25mL)，并真空干燥，獲得了11.40g(80％)化合物A。向化合物A(0.55當(dāng)量)在二甲基甲酰胺(15mL)內(nèi)的懸浮液中加入適當(dāng)胺-2-氟苯乙胺(0.50當(dāng)量)。將該反應(yīng)混合物加熱至100℃并攪拌15小時(shí)。將該反應(yīng)混合物倒入冰冷的水中，將該懸浮液攪拌30分鐘。將產(chǎn)物過濾，用水洗滌，干燥，通過柱色譜法進(jìn)一步純化，以良好產(chǎn)率獲得了目標(biāo)化合物。
所得N-[2-(2-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(F-PBT)的純度和性質(zhì)如下所示產(chǎn)率71％；mp 156-157℃；UV(MeOH)λmax209，256，274和305nm；IR(KBr)ν3446，3234，3163，3055，2935，1672，1595，1560，1531，1466，1390，1362，1311，1265，1227，1169，1136，1089，1003，864，825，756cm-1；1H NMR(CDCl3)δ11.36(br s，1H)，9.47(br s，1H)，8.05-8.04(d，1H)，7.72-7.68(dd，1H)，7.30-7.03(m，4H)，6.87-6.84(d，1H)，4.06-3.99(q，2H)，3.10-3.05(t，2H)；13C NMR(CDCl3)δ179.1，163.1，151.7，146.2，141.1，131.2，131.1，128.5，128.4，124.1，115.5，115.2，113.6，112.2，45.8和28.2；19F NMR(CDCl3)δ-42.58&-42.55(d)；MaldiTof，實(shí)測值355.0(M+1)，計(jì)算值354.0；元素分析(C14H13BrFN3S)C，H，N，S。4.S-DABO的化學(xué)合成按照Vig等人在BIOORG MED CHEM LETTERS，81461-1466(1998)中描述的方法合成S-DABO，即5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-(芐基)-嘧啶-4-(1H)-酮(S-DABO)。
更具體來說，如反應(yīng)方案3所示制備S-DABO。反應(yīng)方案3 其中a)R2CHBrCOOEt/Zn/THF，b)HCl(aq)，c)(H2N)2CS/Na/EtOH，d)DMF，K2CO3，氯甲基甲基硫化物，15小時(shí)。
簡言之，由市售苯基乙腈制得2-異丙基-4-(苯基)-3-氧代丁酸乙酯。在乙醇鈉存在下將該β-酮基酯與硫脲縮合，以生成硫尿嘧啶。2-異丙基-4-(苯基)-3-氧代丁酸乙酯和硫尿嘧啶化合物是按照現(xiàn)有技術(shù)中的方法制得的(Danel，K.等人，Acta Chemica Scandinavica，1997，51，426-430；Mai，A.等人，J.Med.Chem.，1997，40，1447-1454；Danel，K.等人，J.Med.Chem.，1998，41，191-198)。然后在碳酸鉀存在下將硫尿嘧啶與甲基氯甲基硫化物在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中反應(yīng)，以中等產(chǎn)率獲得了化合物3a-d。將硫尿嘧啶化合物2(1mmol)、甲基氯甲基硫化物(1mmol)、和碳酸鉀(1mmol)在無水DMF(5ml)中的混合物于室溫?cái)嚢柽^夜。用水(50ml)處理后，用乙酸乙酯(3×50ml)萃取該溶液。合并萃取液，用飽和NaCl洗滌(2×50ml)，干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮，獲得了粗產(chǎn)物3a-d，通過硅膠60柱色譜法純化(洗脫劑為己烷∶乙酸乙酯)。
所得5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-芐基-嘧啶-4-1H-酮(S-DABO)的純度和性質(zhì)如下所示產(chǎn)率57％；mp 116-117℃；1H NMR(CDCl3)δ1.22(d，6H)，2.07(s，3H)，3.03(q，1H)，3.88(s，2H)，4.21(s，2H)，7.24-7.13(m，5H)，12.43(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ15.4(SCH3)，19.6(CH3)，28.0(CH)，36.3(CH2Ph)，40.9(SCH2)，125.3(C-5)，138.3-126.3(Ph)，155.5(C-6)，161.1(C-4)，164.5(C-2)；CI-MS 321.1(M+1)。
B.體外測定抗HIV活性在CCRF-CEM細(xì)胞中繁殖HIV-1的HTLVIIIB株，用MT-2細(xì)胞滴定從受感染細(xì)胞的無細(xì)胞上清液獲得的病毒貯存物。收集無細(xì)胞上清液，并以1ml等分試樣在-70℃冷凍。用MT-2細(xì)胞測定病毒貯存物的效價(jià)，在該實(shí)驗(yàn)中使用的病毒的細(xì)胞病變作用是HIV-1對(duì)MT-2細(xì)胞的典型作用。
為了在體外分析測試藥物-D-PBT、F-PBT、S-DABO、trovirdine、和N-9(IGEPAL CO-630；Rhone Poulenc，Cranbury，NJ)的抗HIV-1活性，將得自HIV-1陰性供體的正常外周血液單核細(xì)胞(PBMCs)在RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco-BRL，Grand Island，NY)中培養(yǎng)72小時(shí)，其中所述培養(yǎng)基含有20％(v/v)熱滅活的胎牛血清、3％白介素、2.2mM L-谷氨酰胺、25mM HEPES、2g/L NaHCO3、50μg/ml慶大霉素、和4μg/ml植物凝集素，然后在潮濕的5％CO2氣氛中于37℃在1小時(shí)吸附時(shí)間內(nèi)以0.1的感染復(fù)數(shù)暴露于HIV-1。在二甲亞砜(DMSO)中制備NNIs、trovirdine、D-PBT、F-PBT、和S-DABO的貯存液(10mM)，將N-9在培養(yǎng)基中稀釋。將細(xì)胞在96-孔微量滴定板(100μl/孔；2×106個(gè)細(xì)胞/ml，一式三份孔)中在和不在不同濃度(0.001μM-100μM)抗HIV劑存在下培養(yǎng)7天。未感染對(duì)照組的細(xì)胞以相同方式處理，只是在制備過程中省去病毒感染操作。在感染后第7天從各孔中取出等分試樣的培養(yǎng)物上清液，并按照在下述文獻(xiàn)中描述的方法進(jìn)行RT測定和p24抗原測定Erice等人，ANTIMICROB AG CHEMOTHER，37835-838(1993)；Uckun等人，ANTIMICROB AGENTS CHEMOTHER，42383-388(1998)；和Zarling等人，Nature 34792-95(1990)。
該p24酶免疫測定是通過商業(yè)渠道獲得的未改進(jìn)動(dòng)力學(xué)測定(Coulter Corporation/Immunotech，Inc.，Westbrook，ME)。該測定使用抗HIV核心蛋白的涂敷在微孔條上的鼠單克隆抗體，存在于測試培養(yǎng)物上清液樣本中的抗原將結(jié)合到該微孔帶上。將該平板在ELISA讀數(shù)器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上于650nm讀數(shù)，使用由Coulter/Immunotech，Inc.提供的已知標(biāo)準(zhǔn)物計(jì)算p24水平，以ng/ml表示。通過比較用測試物處理的受感染細(xì)胞的p24值與未處理的受感染細(xì)胞(即病毒對(duì)照)的p24值來計(jì)算病毒抑制百分比。
使用無細(xì)胞Quan-T-RT系統(tǒng)(Amersham Corp.，ArlingtonHeights，IL)測定化合物D-PBT、F-PBT、S-DABO、和trovirdine抗純化的重組HIV RT的RT抑制活性，該系統(tǒng)利用的是閃爍親近測定原理，參見Bosworth N，和Towers P，閃爍親近測定法，NATURE，341167-168(1989)。在該測定中，通過生物素/鏈霉抗生物素蛋白連接將DNA/RNA引物/模板結(jié)合到SPA玻珠上。該引物DNA是已經(jīng)退火到聚(rA)模板上的16-mer寡聚(T)。將該引物/模板結(jié)合到用鏈霉抗生物素蛋白涂敷的SPA玻珠上。通過逆轉(zhuǎn)錄將3H-TTP摻入到該引物內(nèi)。簡言之，將在RT測定緩沖液(49.5mM Tris-HCl，pH8.0，80mM KCl，10mM MgCl2，10mM DTT，2.5mM EGTA，0.05％Nonidet-P-40)中稀釋至終濃度為0.5 Ci/樣本的3H-TTP加到結(jié)合在SPA玻珠上的退火DNA/RNA中。把測試化合物以0.001μM-100μM的濃度加到該反應(yīng)混合物中。加入10mU重組RT，并在37℃培養(yǎng)1小時(shí)，獲得了由于摻入3H-TTP而延伸的引物。通過加入0.2ml 120mM EDTA來中止反應(yīng)。用Beckman LS 7600儀器(Beckman Instruments，F(xiàn)ullerton，CA)將樣本在開放窗口中計(jì)數(shù)。
通過比較得自用測試藥物處理的受感染細(xì)胞的p24抗原值或RT活性與得自未處理受感染細(xì)胞的p24抗原值或RT活性來計(jì)算病毒復(fù)制的抑制百分比?；衔锏目笻IV活性以IC50值表示，所述IC50值是由劑量-響應(yīng)曲線計(jì)算的，并且定義為在HIV-1感染的PBMCs中使HIV-1 RT活性或p24抗原生成降低50％時(shí)藥物的濃度。使用如Uckun等人在ANTIMICROB AGENTS CHEMOTHER，42383-388(1998)中所公開的微量培養(yǎng)四唑鎓測定法(MTA)平行測定不同處理對(duì)細(xì)胞存活力的影響，該方法使用的是2，3-二(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑鎓氫氧化物(XTT)。
C.測定精子固定活性(SLA)為了測定與N-9相比trovirdine、D-PBT、F-PBT、S-DABO、和ZDV的殺精子作用，通過不連續(xù)(90-45％)Percoll梯度(ConceptionTechnologies，San Diego，CA)離心和如D’Cruz等人在BIOL REPROD，541217-1228(1996)中描述的“游泳”法制備合并的供體精子(n＝6)的高運(yùn)動(dòng)性部分。所有供體精子標(biāo)本都是在獲得同意后按照HughesInstitute Institutional Review Board的指導(dǎo)獲得的。將能運(yùn)動(dòng)的精子(≥10×106/ml)懸浮在1ml Biggers，Whitten，andWhittingam’s培養(yǎng)基(BWW)中，該培養(yǎng)基含有25mM HEPES(IrvineScientific，Santa Ana，CA)和0.3％BSA，并且其中存在和不存在測試物在1％DMSO中的系列兩倍稀釋物(500μM-31.2μM)。在DMSO中制備NNIs的貯存液(100mM)，并在測定培養(yǎng)基中稀釋以產(chǎn)生所需濃度。將相應(yīng)體積的DMSO(1％)加到對(duì)照管中。將N-9在BWW-0.3％BSA(pH7.4)中稀釋以產(chǎn)生所需濃度(31.2μM-500μM)。在37℃培養(yǎng)3小時(shí)后，按照在下述文獻(xiàn)中描述的方法通過CASA測定能運(yùn)動(dòng)的精子的百分比D’Cruz等人，BIOL REPROD，581515-1526，(1998)；和D’Cruz等人，MOL HUM REPROD，4683-693(1998)。將該運(yùn)動(dòng)性百分比與能運(yùn)動(dòng)精子的假處理對(duì)照懸浮液的運(yùn)動(dòng)性百分比比較。測試化合物的殺精子活性以EC50表示(使能運(yùn)動(dòng)的精子的比例下降50％時(shí)培養(yǎng)基中化合物的終濃度)。
為了測試在培養(yǎng)期間殺精子NNIs對(duì)SIA的影響，在1mM F-PBT、S-DABO(在1％DMSO中)存在下或僅在用作賦形劑對(duì)照的1％DMSO存在下，在BWW-0.3％BSA中將能運(yùn)動(dòng)的精子部分(107/ml)在37℃培養(yǎng)。以5或10分鐘的時(shí)間間隔，將一式兩份的等分試樣(4-μl)轉(zhuǎn)移到兩個(gè)20μm微細(xì)胞室(Conception Technologies)中，并通過CASA在60分鐘期間內(nèi)測定精子的運(yùn)動(dòng)性。
D.精子運(yùn)動(dòng)學(xué)參數(shù)對(duì)于CASA，在37℃將4μl每份精子懸浮液加到在計(jì)數(shù)室中的兩個(gè)20-μm微細(xì)胞室中。對(duì)于每個(gè)室，用Hamilton Thorne IntegratedVisual Optical System(IVOS)，version 10儀器(Hamilton ThorneResearch Inc.，Danvers，Mass.)掃描至少5-8個(gè)區(qū)域以進(jìn)行分析。每個(gè)區(qū)域記錄30秒。在30個(gè)讀框上以30/秒的讀框速度設(shè)置計(jì)算機(jī)校準(zhǔn)。其它設(shè)置如下最小對(duì)比度8；最小尺寸6；低-尺寸門，1.0；高-尺寸門，2.9；低-強(qiáng)度門，0.6；高-強(qiáng)度門，1.4；相襯照明；低路徑速度為10μm/s，閾平直度為80％；擴(kuò)大因數(shù)，1.95。
測定的精子運(yùn)動(dòng)學(xué)參數(shù)包括運(yùn)動(dòng)(MOT)和漸進(jìn)性(PRG)運(yùn)動(dòng)精子的數(shù)目；曲線速度(VCL；給定精子在一定時(shí)間內(nèi)移動(dòng)的總距離除以流逝的時(shí)間的一種量度)；平均路徑速度(VAP；消除精子頭擺動(dòng)的空間平均路程)，直線速度(VSL；從足跡開始到終點(diǎn)的直線距離除以所用時(shí)間)，交叉拍打頻率(BCF；精子頭橫越精子平均路徑的頻率)，側(cè)面頭移位的幅度(ALH；精子頭擺動(dòng)的平均寬度)，和派生物，平直度(STR＝VSL/VAP×100)和直線性(LIN＝VSL/VCL×100；精子足跡偏離直線)。記錄各個(gè)獨(dú)立細(xì)胞足跡的數(shù)據(jù)并分析。對(duì)于每一等分試樣，分析至少20個(gè)能運(yùn)動(dòng)的精子。
E.同焦激光掃描顯微鏡檢查(CLSM)通過CLSM測定用和不用遞增濃度的(31.2μM-500μM)三種NNIs(S-DABO、F-PBT和D-PBT)以及與之比較的N-9處理6小時(shí)后具有完整頂體的精子的百分比。用乙醇滲透，然后用三種熒光標(biāo)記物FITC-豌豆凝集素、TOTO-3碘化物、和尼羅紅(Molecular Probes，Eugene，Oreg.)將風(fēng)干的精子涂片染色，之所以使用這三種標(biāo)記物是因?yàn)樗鼈兊哪繕?biāo)不同(分別給頂體、核和膜脂質(zhì)染色)。用裝配著氪/氬混合氣體激光器(激發(fā)線488、568和647nm)、并固定在Nikon Eclipse E800系列立式顯微鏡上的BioRad MRC-1024激光掃描同焦顯微鏡(BioRadLaboratories，Hercules，CA)檢測樣本。用乙醇滲透后，分別用598/40nm、522 DF32、和680 DF32發(fā)射/濾器同時(shí)檢測熒光素、TOTO-3碘化物、和尼羅紅從頂體區(qū)域、核、和精子質(zhì)膜上發(fā)射的熒光。使用Nikon 100×(NA 1.35)物鏡和Kalman收集濾器獲得同焦圖像。將數(shù)字化圖像保存在Jaz磁盤(Iomega Corporation，Roy，UT)上，并用帶Adobe Photoshop軟件(Adobe Systems，Mountain View，CA)的Lasersharp(Bio-Rad)處理。用Fuji Pictrography 3000(FujiPhoto Film Co.，Tokyo，Japan)彩色打印機(jī)打印最終的圖像。
F.細(xì)胞增殖測定從Clonetics(San Diego，CA)獲得正常人子宮頸外上皮細(xì)胞(CrEC 4627)和子宮頸內(nèi)上皮細(xì)胞(CrEC-En 4312)，并在T-150cm2組織培養(yǎng)瓶(Corning Corp.，Corning，NY)內(nèi)在小導(dǎo)氣管上皮細(xì)胞基本培養(yǎng)基(Clonetics)中繁殖，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有50μg/ml BPE、0.5μg/ml氫化可的松、0.5μg/ml hEGF、0.1μg/ml視黃酸、10μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、5μg/ml胰島素、5μg/ml腎上腺素、和0.5mg/mlBSA-FAF。為了測定與N-9相比F-PBT和S-DABO的生長抑制作用，我們使用如Narla等人在CLIN CANCER RES，41405-1414(1998)中描述的基于MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)的比色測定法來定量測定細(xì)胞增殖。
簡言之，用0.125％(w/v)胰蛋白酶-0.02％EDTA(GIBCO)從指數(shù)期維持培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞，并離心(300g×5分鐘)。懸浮并計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞以100μl的體積按一式三份的方式加到96-孔組織培養(yǎng)板中。培養(yǎng)3小時(shí)和24小時(shí)后，棄去培養(yǎng)基，并用含有進(jìn)行過系列兩倍稀釋的藥物的100ml新鮮培養(yǎng)基替換，其中對(duì)于N-9，是將其在培養(yǎng)基中稀釋以產(chǎn)生3.9μM-250μM的濃度，對(duì)于F-PBT和S-DABO，是在培養(yǎng)基中稀釋以生產(chǎn)250μM-4mM的濃度。將NNIs在DMSO中重新配制以使其濃度為100mM。在無菌PBS中制備N-9的貯存液。具有僅含0.25％DMSO的培養(yǎng)基的對(duì)照孔用作對(duì)照。將培養(yǎng)板培養(yǎng)24小時(shí)，然后向各孔中加入10μl MTT溶液(5mg/ml，在PBS中)。僅含培養(yǎng)基和MTT的孔用作各平板的對(duì)照。將四唑鎓/甲反應(yīng)在37℃進(jìn)行4小時(shí)，然后向所有孔中加入100μl增溶緩沖液(10％十二烷基硫酸鈉，在0.1％HCl中)，并充分混合以將深藍(lán)色甲晶體溶解。
在37℃培養(yǎng)過夜后，用96-孔多掃描自動(dòng)讀數(shù)器在540nm測定光密度(OD)，使用該增溶緩沖液作為空白。為了將OD540值轉(zhuǎn)化成各孔中活細(xì)胞的數(shù)目，把該OD540值與所產(chǎn)生的關(guān)于各細(xì)胞系的標(biāo)準(zhǔn)OD540-對(duì)-細(xì)胞數(shù)目曲線上的OD540值比較。用下述公式計(jì)算存活百分比％存活＝活細(xì)胞數(shù)目[測試]/活細(xì)胞數(shù)目[對(duì)照]×100。所有測定都是以一式三份進(jìn)行，并且結(jié)果以IC50值表示。IC50定義為使細(xì)胞存活減少50％所需的濃度。
G.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果以各獨(dú)立測試的平均值或平均值+SD值表示。通過方差單向分析和Dunnett’s多重比較檢驗(yàn)分析測試組之間差異的統(tǒng)計(jì)顯著性。使用線性回歸分析來得到兩個(gè)測定的參數(shù)之間的相關(guān)值。＜0.05的p值認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)顯著性。采用非線性回歸分析，使用GraphPadPRISM 2.0版本軟件程序(San Diego，CA)來從濃度作用曲線中得到IC50和EC50值。
II.結(jié)果A.表通過下面兩個(gè)表來討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1.三種新NNIs對(duì)感染HIV的PBMC中的純化的重組HIV-RT的酶活性、p24抗原生成、以及人精子運(yùn)動(dòng)性的影響?；衔?抗HIV活性殺精子活性rRTaHTLVIIIBEC50(μM)dIC50rRT(μM)bIC50p24(μM)cD-PBT 0.1＜0.001 ＞500F-PBT 0.4＜0.001 147S-DABO 6.1＜0.001 202Trovirdine 0.80.007 ＞500N-9 Nde2.2 81a重組HIV逆轉(zhuǎn)錄酶bIC50RT＝將HIV-RT活性抑制50％的藥物濃度cIC50p24＝將HIV-p24抗原生成抑制50％的藥物濃度dEC50＝將精子運(yùn)動(dòng)性抑制50％的藥物濃度eND＝未測定表2.通過MTT測定法定量測定的F-PBT和N-9對(duì)正常人子宮頸外和子宮頸內(nèi)上皮細(xì)胞的細(xì)胞生長的影響。處理 精子子宮頸外上皮細(xì)胞a子宮頸內(nèi)上皮細(xì)胞aEC50(μM)bIC50(μM)cSIdIC50(μM) SIF-PBT 147 ＞1000＞6.8＞1000＞6.8S-DABO202 ＞4000＞19.8 ＞4000＞19.8N-9 81150.18 110.13a用5種不同濃度的(250μM-4000μM)F-PBT和S-DABO處理24小時(shí)后測試細(xì)胞增殖bEC50＝將精子運(yùn)動(dòng)性抑制50％的藥物濃度cIC50＝將細(xì)胞生長抑制50％的藥物濃度dSI＝等于IC50與EC50比值的選擇性指數(shù)B.新NNIs的抗HIV活性在使用純化的重組HIV RT的無細(xì)胞測定中測定如附圖1所示的三種新NNI衍生物以及trovirdine關(guān)于RT抑制活性的作用(作為IC50[rRT]列出)，并通過體外測定在感染HTLVIIIB的PBMCs中測定它們的抗HIV活性(IC50[p24])。如附圖1所示，正如通過在感染HIV的人PBMCs中測定p24抗原生成所表明的那樣，所有這三種NNIs都表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗HIV活性，其IC50值低于1nM。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，迄今為止所報(bào)道的最有效的NNI-Trovirdine的效力至少低7倍。而且，在抑制重組HIV RT方面，D-PBT與F-PBT的效力比trovirdine強(qiáng)至少2-8倍。所觀察到的由這三種NNIs所致的RT活性和p24生成下降并不是由于它們具有任何細(xì)胞毒性作用，這是因?yàn)榧词乖谧罡邷y試濃度下PBMC的細(xì)胞存活力也沒有受到影響(IC50[MTA]＞100μM)。這三種新NNIs的抗HIV活性(IC50[p24])比洗滌劑型殺微生物劑N-9(IC50＝2.2μM)高至少2000倍。
C.新NNIs的殺精子活性接下來測定了與N-9相比三種NNIs(S-DABO、D-PBT、和F-PBT)和trovirdine對(duì)人精子功能的影響。將人精子的高運(yùn)動(dòng)性部分暴露于trovirdine或D-PBT沒有影響精子運(yùn)動(dòng)性，即使在高達(dá)500μM濃度下也是如此(見附圖2和表1)。此外，使用CASA的精子運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)學(xué)證實(shí)，trovirdine或D-PBT處理沒有改變精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)，例如漸進(jìn)性運(yùn)動(dòng)(PRG)、足跡速度(VCL)、路徑速度(VAP)、直線速度(VLS)、游動(dòng)模式的平直度(STR)、精子足跡的直線性(LIN)、拍打頻率(BCF)、和側(cè)面精子頭移位的幅度(ALH)。與trovirdine或D-PBT相反，在PBT中苯基環(huán)的鄰位引入氟原子，或者在S-DABO胸腺嘧啶環(huán)的C-5位引入異丙基，產(chǎn)生了濃度依賴性殺精子活性。由F-PBT獲得的147μM的EC50值(95％CI94-330μM)在N-9的殺精子范圍內(nèi)(EC50值81μM；95％CI41-410μM)(見附圖2和表1)。而且，通過CASA測定的精子固定動(dòng)力學(xué)表明，暴露于化合物F-PBT后，在培養(yǎng)時(shí)間與漸進(jìn)精子運(yùn)動(dòng)性損失之間有直線關(guān)系(相關(guān)系數(shù)0.811，p＜0.005)(見附圖3)。暴露于F-PBT后，使能漸進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子的運(yùn)動(dòng)性下降50％所需的時(shí)間是10分鐘(95％CI8-12分鐘)。與之相比，對(duì)照樣本中的精子運(yùn)動(dòng)性在60分鐘的監(jiān)測期間內(nèi)保持穩(wěn)定(與基準(zhǔn)相比為95％±3％)。
F-PBT誘導(dǎo)的時(shí)間依賴性精子運(yùn)動(dòng)性損失(PRG)還伴有存活精子運(yùn)動(dòng)特征的顯著改變，特別是在足跡速度(VCL)、路徑速度(VAP)、和直線速度(VSL)方面的改變。用F-PBT處理的精子的代表性精子運(yùn)動(dòng)學(xué)參數(shù)與時(shí)間的關(guān)系如附圖4所示。VSL與VCL或者VSL與VAP的下降幅度相類似。因此，關(guān)于精子足跡直線性的值(LIN)與游動(dòng)模式平直度的值(STR)保持相對(duì)恒定。而且，當(dāng)能運(yùn)動(dòng)的精子的比例在運(yùn)動(dòng)性損失的直線相期間下降時(shí)，拍打頻率(BCF)、和側(cè)面精子頭移位的幅度(ALH)相對(duì)穩(wěn)定。在60分鐘的培養(yǎng)期間，對(duì)照精子的精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)沒有表現(xiàn)出顯著改變。
D.殺精子NNIs沒有類似于洗滌劑的膜毒性使用最廣泛的陰道殺精子劑壬苯醇醚-9是通過對(duì)精子質(zhì)膜的洗滌劑型作用而固定精子。因?yàn)槠淠て茐奶匦?，?jù)表明連續(xù)使用N-9會(huì)破壞子宮頸陰道上皮，引起急性組織炎性響應(yīng)，并增加通過異性傳播感染HIV的可能性。不引起任何非-特定膜毒性(這種毒性是洗滌劑型避孕藥的特征)的殺精子劑將具有臨床方面的優(yōu)點(diǎn)。
因此，通過將精子三重染色(用FITC-豌豆凝集素給頂體染色，用TOTO-3碘化物給核DNA染色，用尼羅紅給膜脂質(zhì)染色)使用CLSM測試F-PBT與S-DABO對(duì)精子頭頂體膜完整性的影響(作為膜破壞標(biāo)志)。通過CLSM檢查用FITC-凝集素、TOTO-3、和尼羅紅染色的精子，結(jié)果顯示了非常清楚的被FITC-凝集素染色的頂體(綠色)、被TOTO-3染色的核(藍(lán)色)、和被尼羅紅染色的膜(紅色)(見附圖5)。通過用同焦顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)6小時(shí)后，盡管在F-PBT和S-DABO存在下精子被完全固定，但是與顯示出頂體染色完全缺失的N-9相比，有＞90％的被處理精子顯示出頂體染色(見附圖5A)。因此，化合物F-PBT的殺精子活性沒有引起或伴有膜破壞作用。在僅暴露于賦形劑(即1％DMSO)(如附圖5B所示)或500μMF-PBT(如附圖5C所示)或S-DABO(如附圖5D所示)6小時(shí)的精子中，有一半以上的精子頭(即頂體區(qū)域)顯示出均勻、明亮的綠色熒光，這意味著頂體保持完整。與之相比，在相同條件下暴露于500μM N-9的精子(如附圖5E所示)由于膜完整性被破壞以及缺失頂體膜而沒有顯示出任何綠熒光。F-PBT與S-DABO的這些性質(zhì)與目前使用的殺精子劑N-9的活性特征形成了鮮明對(duì)照，N-9是通過類似于精子劑破壞精子膜并因此削弱精子功能的能力來發(fā)揮作用的。
E.與N-9相比F-PBT與S-DABO的選擇性殺精子活性使用測定細(xì)胞增殖和存活力的MTT測定法在體外測試與N-9相比F-PBT與S-DABO對(duì)融合的單層正常人子宮頸外和子宮頸內(nèi)上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性。將細(xì)胞暴露于劑量范圍介于3.9μM-4mM之間的這些化合物3或24小時(shí)。將通過MTT測定的關(guān)于F-PBT與S-DABO以及與之相比的N-9的濃度-響應(yīng)細(xì)胞存活曲線與通過CASA測定的殺精子活性進(jìn)行比較。在MTT測定中，N-9對(duì)子宮頸外上皮細(xì)胞和子宮頸內(nèi)上皮細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性，平均IC50值分別為15μM和11μM。與之相比，對(duì)于子宮頸外上皮細(xì)胞和子宮頸內(nèi)上皮細(xì)胞，F(xiàn)-PBT與S-DABO劑量存活曲線的IC50值分別＞4mM(S-DABO)和＞1mM(F-PBT)(見表2)。因此，N-9僅在細(xì)胞毒性濃度下有殺精子能力(EC50值81μM；選擇性指數(shù)對(duì)子宮頸外上皮細(xì)胞和子宮頸內(nèi)上皮細(xì)胞分別是0.18和0.13)，而F-PBT與S-DABO對(duì)這些細(xì)胞表現(xiàn)出高選擇性指數(shù)(SI對(duì)于子宮頸外上皮細(xì)胞和子宮頸內(nèi)上皮細(xì)胞分別是＞6.8和＞19.8)。因此，F(xiàn)-PBT與S-DABO抗這些生殖道細(xì)胞的活性非常低。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)了F-PBT與S-DABO的殺精子活性與非特異性細(xì)胞毒性無關(guān)。III.實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論
A.抗HIV活性現(xiàn)有技術(shù)中的模型化實(shí)驗(yàn)已經(jīng)揭示了產(chǎn)生更有效NNIs的幾個(gè)潛在配基衍生化位點(diǎn)。將PETT衍生物trovirdine修飾，通過用2，5-二甲氧基苯基替換吡啶基環(huán)，D-PBT(N-[2-(2，5-二甲氧基苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲)，或者用在鄰位有氟原子的苯基環(huán)替換吡啶基環(huán)，F(xiàn)-PBT(N-[2-[2-(2-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲)，獲得了更有效的抗HIV藥物。生物測定證實(shí)了這兩種NNIs比trovirdine-迄今為止所報(bào)道的其中一種最有效的PETT衍生物更有活性(至少7倍)，這兩種NNIs抗HIV活性的IC50[p24]值低于1nM。計(jì)算機(jī)docking操作還表明，在S-DABO胸腺嘧啶環(huán)的5-位加上異丙基可使得對(duì)位于S-DABO結(jié)合袋的相對(duì)疏水環(huán)境有更高親和力。DABO衍生物5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-(芐基)-嘧啶-4-(1H)-酮(S-DABO)具有很強(qiáng)的抗HIV活性，其抑制HIV復(fù)制的IC50值低于1nM。因此，所有這三種NNIs都比N-9強(qiáng)＞2000倍。
據(jù)發(fā)現(xiàn)，NNIs結(jié)合到靠近聚合酶位點(diǎn)的HIV-1 RT的特異變構(gòu)位點(diǎn)上，并通過改變RT的構(gòu)象或移動(dòng)性而干擾逆轉(zhuǎn)錄酶，從而非競爭性地抑制了該酶。與NNIs接觸的多個(gè)氨基酸殘基具有相當(dāng)高的柔性，從結(jié)構(gòu)到結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可以被恰當(dāng)?shù)腘NI替換。這些殘基包括Tyr180、Tyr181、Tyr318、Try319、Phe227、Leu234、Trp229、Pro95、和Glu138(來自RT的p51亞基)。本發(fā)明所研究的新PBT和DABO衍生物的提高的抗HIV活性很可能是由于它們較大的分子表面使其有利于結(jié)合NNI袋、以及具有更強(qiáng)的親脂性(由于用較大的二甲氧基苯基替換苯基環(huán)所致)、更良好的疏水接觸(由于在胸腺嘧啶環(huán)的C-5位加上異丙基取代基所致)、和與目標(biāo)氨基酸殘基-RT(44，45)的Pro95與Trp229更緊密地接觸(由于在未取代苯基環(huán)的的間位/鄰位加上甲氧基取代基或者在鄰位加上氟所致)。此外，這改變了構(gòu)象，構(gòu)象改變又影響鄰近氨基酸殘基、特別是Tyr183和Tyr188的位置，從而可導(dǎo)致HIV-1 RT失活。docking研究顯示，D-PBT的2-甲氧基提供了與氨基酸殘基Pro195和Trp229的緊密接觸。這啟示我們，將分別是獨(dú)一無二的所有結(jié)構(gòu)優(yōu)點(diǎn)組合起來可獲得更有效的RT抑制劑。
B.殺精子活性聯(lián)合采用精子運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)學(xué)與同焦激光掃描顯微鏡檢查證實(shí)了F-PBT與S-DABO以濃度和時(shí)間依賴方式使精子運(yùn)動(dòng)停止，并且與洗滌劑型殺精子劑N-9不同，這二者不影響精子質(zhì)膜和頂體膜的完整性。此外，與在殺精子劑量下對(duì)人子宮頸外和子宮頸內(nèi)上皮細(xì)胞有細(xì)胞毒性的N-9相比，F(xiàn)-PBT與S-DABO選擇性地殺精子。因此，子宮頸外上皮細(xì)胞似乎易受洗滌劑型殺精子劑N-9所致的細(xì)胞毒性傷害。獲得本發(fā)明新NNIs的殺精子功能意味著，將這些NNIs進(jìn)一步修飾可獲得甚至更有效的具有抗HIV和殺精子雙重活性、并且對(duì)生殖道上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性降低的雙功能NNIs。
用作具有強(qiáng)效殺精子活性的雙重功能抗HIV劑的新NNIs的合成代表著開發(fā)用于抑制異性陰道HIV傳播的新殺微生物劑的重要步驟。這些有希望的結(jié)果舉例說明了如下所述的雙重功能NNIs這些NNIs表現(xiàn)出獨(dú)特的臨床潛力，有希望成為由新女性控制的局部殺病毒陰道避孕藥的活性成分，以供有通過異性陰道傳播獲得HIV的高度危險(xiǎn)性的女性使用。
本文描述的本發(fā)明可變更以包括供選擇替代的實(shí)施方案。所有這些明顯的供選擇替代方案都包括在如下面權(quán)利要求書所保護(hù)的本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)。
本申請(qǐng)引用了多個(gè)出版物。這些出版物的公開內(nèi)容全文引入本申請(qǐng)作為參考，以更全面地描述本申請(qǐng)所屬領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)狀況。
權(quán)利要求
1.下式所示化合物或其可藥用鹽 其中R、R1、R2、R3、和R4獨(dú)立地為氫、F、Cl、Br、或I，并且R、R1、R2、R3、和R4當(dāng)中至少有一個(gè)是F、Cl、Br、或I。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R、R1、R2、R3、和R4當(dāng)中至少有一個(gè)是F或Cl。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中所述化合物選自N-[2-(2-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(2-氯苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(3-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(3-氯苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(4-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(4-氯苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；和它們的可藥用鹽。
4.權(quán)利要求3的化合物，其中所述化合物選自N-[2-(2-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲及其可藥用鹽。
5.抑制哺乳動(dòng)物受孕的方法，所述方法包含用殺精子有效量的權(quán)利要求1的化合物與哺乳動(dòng)物精子接觸。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述化合物選自N-[2-(2-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(2-氯苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(3-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(3-氯苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(4-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(4-氯苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；和它們的可藥用鹽。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述化合物選自N-[2-(2-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲及其可藥用鹽。
8.抑制精子運(yùn)動(dòng)的方法，所述方法包含用精子運(yùn)動(dòng)抑制有效量的權(quán)利要求1的化合物與精子接觸。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述化合物選自N-[2-(2-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(2-氯苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(3-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(3-氯苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(4-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(4-氯苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；和它們的可藥用鹽。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述化合物選自N-[2-(2-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲及其可藥用鹽。
11.一種組合物，它包含殺精子有效量的權(quán)利要求1的化合物和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述化合物選自N-[2-(2-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(2-氯苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(3-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(3-氯苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(4-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；N-[2-(4-氯苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲；和它們的可藥用鹽。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述化合物選自N-[2-(2-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲及其可藥用鹽。
14.權(quán)利要求11的組合物，其中所述藥物載體提供殺精子劑的快速和延時(shí)釋放。
15.權(quán)利要求11的組合物，其中所述藥物賦形劑選自陰道內(nèi)插入物和避孕套。
16.一種殺精子產(chǎn)品，它包含權(quán)利要求1的化合物。
17.權(quán)利要求13的產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品選自陰道插入物和避孕套。
18.下式所示化合物或其可藥用鹽 其中R1和R2相同或不同，并且是氫、鹵素、烷基、鏈烯基、羥基、烷氧基、烷硫基、硫羥基、膦基、ROH、或RNH基團(tuán)，其中R是烷基；Y是S或O；且R3是烷基、鏈烯基、芳基、芳烷基、ROH、或RNH2基團(tuán)，其中R是烷基。
19.下式所示權(quán)利要求18的化合物或其可藥用鹽 其中R1是Me、Et、或i-Pr，且R2是H或Me。
20.權(quán)利要求19的化合物，其中所述化合物選自5-甲基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-芐基-嘧啶-4-1H-酮；5-乙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-芐基-嘧啶-4-1H-酮；5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-芐基-嘧啶-4-1H-酮；5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-(3，5-二甲基芐基)嘧啶-4-1H-酮；和它們的可藥用鹽。
21.權(quán)利要求20的化合物，其中所述化合物選自5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-(芐基)-嘧啶-4-(1H)-酮及其可藥用鹽。
22.一種抑制哺乳動(dòng)物受孕的方法，所述方法包含用殺精子有效量的權(quán)利要求18的化合物與哺乳動(dòng)物精子接觸。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述化合物選自5-甲基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-芐基-嘧啶-4-1H-酮；5-乙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6芐基-嘧啶-4-1H-酮；5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-芐基-嘧啶-4-1H-酮；5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-(3，5-二甲基芐基)嘧啶-4-1H-酮；和它們的可藥用鹽。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述化合物選自5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-(芐基)-嘧啶-4-(1H)-酮及其可藥用鹽。
25.一種抑制精子運(yùn)動(dòng)的方法，所述方法包含用精子運(yùn)動(dòng)抑制有效量的權(quán)利要求18的化合物與精子接觸。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述化合物選自5-甲基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-芐基-嘧啶-4-1H-酮；5-乙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-芐基-嘧啶-4-1H-酮；5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-芐基-嘧啶-4-1H-酮；5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-(3，5-二甲基芐基)嘧啶-4-1H-酮；和它們的可藥用鹽。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述化合物選自5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-(芐基)-嘧啶-4-(1H)-酮及其可藥用鹽。
28.一種組合物，它包含殺精子有效量的權(quán)利要求18的化合物和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
29.權(quán)利要求28的組合物，其中所述化合物選自5-甲基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-芐基-嘧啶-4-1H-酮；5-乙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-芐基-嘧啶-4-1H-酮；5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-芐基-嘧啶-4-1H-酮；5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-(3，5-二甲基芐基)-嘧啶-4-1H-酮；和它們的可藥用鹽。
30.權(quán)利要求29的組合物，其中所述化合物選自5-異丙基-2-[(甲硫基甲基)硫基]-6-(芐基)-嘧啶-4-(1H)-酮及其可藥用鹽。
31.權(quán)利要求28的組合物，其中所述藥物載體提供殺精子劑的快速和延時(shí)釋放。
32.權(quán)利要求28的組合物，其中所述藥物賦形劑選自陰道插入物和避孕套。
33.一種殺精子產(chǎn)品，它包含權(quán)利要求18的化合物。
34.權(quán)利要求33的產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品選自陰道插入物和避孕套。
全文摘要
表現(xiàn)出殺精子活性以及抗病毒活性的新的苯乙基－5－溴吡啶基硫脲(PBT)和二氫烷氧基芐基氧代嘧啶(DABO)衍生物?？蓪⑦@些新的化合物摻入到避孕組合物中以提供殺精子或精子固定活性。
文檔編號(hào)A61F6/06GK1371367SQ99815250
公開日2002年9月25日 申請(qǐng)日期1999年12月29日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月31日
發(fā)明者F·M·烏昆, O·德魯茲 申請(qǐng)人:帕克·休斯研究所