專利名稱：用于治療和診斷卵巢癌的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及卵巢癌療法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及包括卵巢癌蛋白質(zhì)的至少一部分的多肽類并涉及編碼這類多肽的多核苷酸以及特異性識(shí)別這類多肽的抗體和免疫系統(tǒng)細(xì)胞?？梢詫⑦@類多肽、多核苷酸、抗體和細(xì)胞用于治療卵巢癌的疫苗和藥物組合物中。
背景技術(shù)：
卵巢癌在美國(guó)和全世界范圍內(nèi)是危害婦女健康的一個(gè)顯著問(wèn)題。盡管在檢測(cè)和治療這種癌癥方面已經(jīng)取得了發(fā)展，但是目前尚未獲得用于預(yù)防或治療的疫苗或其它普遍成功的方法?？刂七@種疾病目前依賴于將早期診斷與攻擊性治療結(jié)合起來(lái)的方法，所述的攻擊性治療包括諸如外科手術(shù)、放療、化療和激素療法這樣各種療法中的一種或多種。通常以包括分析特異性腫瘤標(biāo)記在內(nèi)的各種預(yù)后參數(shù)為基礎(chǔ)來(lái)選擇針對(duì)特定癌癥的治療過(guò)程。然而，使用確定的標(biāo)記通常產(chǎn)生難以解釋的結(jié)果且在許多癌癥患者中觀察到持續(xù)發(fā)生高死亡率。
免疫療法具有基本上改善癌癥治療和存活率的潛能。這類療法可以包括對(duì)卵巢癌抗原產(chǎn)生或增強(qiáng)免疫反應(yīng)的過(guò)程。然而，迄今為止，了解到的卵巢癌抗原相對(duì)較少且尚未證實(shí)對(duì)抗原產(chǎn)生的免疫反應(yīng)對(duì)治療有利。
因此，本領(lǐng)域中存在對(duì)鑒定卵巢腫瘤抗原和在卵巢癌療法中使用這類抗原的改進(jìn)方法的需求。本發(fā)明滿足了這些需求并進(jìn)一步提供了其它相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明概括簡(jiǎn)單地說(shuō)，本發(fā)明提供了用于治療諸如卵巢癌這樣的癌癥的組合物和方法。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了包括卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式的多肽類，使得該變化形式與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱。在某些實(shí)施方案中，所述的卵巢癌蛋白質(zhì)包括由選自SEQID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391組成的組的多核苷酸序列和這類多核苷酸的互補(bǔ)物編碼的序列。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼如上所述的多肽或其部分的多核苷酸、包括這類多核苷酸的表達(dá)載體和用這類表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
在其它方面中，本發(fā)明提供了藥物組合物和疫苗。藥物組合物可以包括生理上可接受的載體或賦形劑以及下列物質(zhì)中的一種或多種(i)一種包括卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式的多肽，使得該變化形式與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中所述的卵巢癌蛋白質(zhì)包括以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一種描述的序列；(ii)一種編碼這類多肽的多核苷酸；(iii)一種與這類多肽特異性結(jié)合的抗體；(iv)一種表達(dá)這類多肽的抗原呈遞細(xì)胞；和/或(v)一種與這類多肽發(fā)生特異性反應(yīng)的T細(xì)胞。疫苗可以包括非特異性免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑和下列物質(zhì)中的一種或多種(i)一種包括卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式的多肽，使得該變化形式與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中所述的卵巢癌蛋白質(zhì)包括內(nèi)多核苷酸編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸包括以SEQID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一種描述的序列；(ii)一種編碼這類多肽的多核苷酸；(iii)一種被特異性結(jié)合這類多肽的抗體所特異性結(jié)合的抗獨(dú)特型抗體；(iv)一種表達(dá)這類多肽的抗原呈遞細(xì)胞；和/或(v)一種與這類多肽發(fā)生特異性反應(yīng)的T細(xì)胞。
在其它方面中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括如上所述的至少一種多肽的融合蛋白以及編碼這類融合蛋白的多核苷酸。
在相關(guān)的方面中，本發(fā)明提供了包括融合蛋白或編碼融合蛋白的多核苷酸以及生理上可接受的載體的藥物組合物。
在其它方面中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括融合蛋白或編碼融合蛋白的多核苷酸以及非特異性免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑的疫苗。
在其它方面中，本發(fā)明提供了用于抑制患者體內(nèi)癌癥發(fā)生的方法，該方法包括給患者施用如上所述的藥物組合物或疫苗的步驟。
在其它方面中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于刺激和/或擴(kuò)充T細(xì)胞的方法，該方法包括使T細(xì)胞與下列物質(zhì)接觸的步驟(a)一種多肽，它包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列包括以SEQ IDNOs1-387或391中任意一種描述的序列；(b)一種編碼這類多肽的多核苷酸；和/或(c)一種在足以刺激和/或擴(kuò)充T細(xì)胞的條件和時(shí)間下表達(dá)這類多肽的抗原呈遞細(xì)胞。這類多肽、多核苷酸和/或抗原呈遞細(xì)胞可以存在于藥物組合物或疫苗內(nèi)以便用于刺激和/或擴(kuò)充哺乳動(dòng)物體內(nèi)的T細(xì)胞。
在其它方面中，本發(fā)明提供了用于抑制患者體內(nèi)卵巢癌發(fā)生的方法，該方法包括給患者施用如上所述制備的T細(xì)胞的步驟。
在其它方面中，本發(fā)明提供了用于抑制患者體內(nèi)卵巢癌發(fā)生的方法，該方法包括下列步驟(a)用下列物質(zhì)中的一種或多種培養(yǎng)分離自患者的CD4+和/或CD8+T細(xì)胞(i)一種多肽，它包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸包括以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的序列；(ii)一種編碼這類多肽的多核苷酸；或(iii)一種表達(dá)這類多肽的抗原呈遞細(xì)胞；從而使T細(xì)胞增殖；和(b)給患者施用有效量的增殖的T細(xì)胞并由此抑制患者體內(nèi)卵巢癌的發(fā)生?？梢栽趯?duì)患者給藥前克隆增殖的細(xì)胞。
在其它方面中，本發(fā)明還提供了用于鑒定分泌的腫瘤抗原的方法。這類方法包括下列步驟(a)將腫瘤細(xì)胞植入免疫缺陷型哺乳動(dòng)物體內(nèi)；(b)在足以使腫瘤抗原分泌入血清的一定時(shí)間后從免疫缺陷型哺乳動(dòng)物體內(nèi)獲得血清；(c)給免疫活性哺乳動(dòng)物免疫接種該血清；(d)從免疫活性哺乳動(dòng)物體內(nèi)獲得抗血清；和(e)用該抗血清篩選腫瘤表達(dá)文庫(kù)且由此鑒定分泌的腫瘤抗原。一種用于鑒定分泌的卵巢癌抗原的優(yōu)選方法包括下列步驟(a)將卵巢癌細(xì)胞植入SCID小鼠體內(nèi)；(b)在足以使卵巢癌抗原分泌入血清的一定時(shí)間后從SCID小鼠體內(nèi)獲得血清；(c)給免疫活性免疫小鼠接種該血清；(d)從免疫活性小鼠體內(nèi)獲得抗血清；和(e)用該抗血清篩選卵巢癌表達(dá)文庫(kù)且由此鑒定分泌的卵巢癌抗原。
本發(fā)明的這些和其它方面在參照下面的具體描述和所附的附圖時(shí)將變得顯而易見(jiàn)。將本文所公開(kāi)的所有參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考，就如同將它們分別引入作為參考一樣。
附圖簡(jiǎn)述附

圖1A-1S(SEQ ID NOs1-71)描述了編碼有代表性的分泌的卵巢癌抗原的多核苷酸的部分序列。
附圖2A-2C描述了附圖1克隆中的三種的全插入序列。附圖2A表示命名為07E的序列(11731；SEQ ID NO72)；附圖2B表示命名為09E的序列(11785；SEQ ID NO73)且附圖2C表示命名為08E的序列(13695；SEQ ID NO74)。
附圖3提供了對(duì)命名為08E的卵巢癌序列的顯微排列表達(dá)分析結(jié)果。
附圖4提供了編碼卵巢癌序列的多核苷酸部分序列(命名為3gSEQID NO75)，其中所述的卵巢癌序列是一種位于人T-細(xì)胞白血病I型病毒癌蛋白質(zhì)TAX與骨粘連蛋白之間的剪接融合體。
附圖5提供了命名為3f(SEQ ID NO76)的卵巢癌多核苷酸。
附圖6提供了命名為6b(SEQ ID NO77)的卵巢癌多核苷酸。
附圖7A和7B提供了命名為8e(SEQ ID NO78)和8h(SEQ ID NO79)的卵巢癌多核苷酸。
附圖8提供了命名為12c(SEQ ID NO80)的卵巢癌多核苷酸。
附圖9提供了命名為12h(SEQ ID NO81)的卵巢癌多核苷酸。
附圖10描述了對(duì)命名為3f的卵巢癌序列的顯微排列表達(dá)分析結(jié)果。
附圖11描述了對(duì)命名為6b的卵巢癌序列的顯微排列表達(dá)分析結(jié)果。
附圖12描述了對(duì)命名為8e的卵巢癌序列的顯微排列表達(dá)分析結(jié)果。
附圖13描述了對(duì)命名為12c的卵巢癌序列的顯微排列表達(dá)分析結(jié)果。
附圖14描述了對(duì)命名為12h的卵巢癌序列的顯微排列表達(dá)分析結(jié)果。
附圖15A-15EEE描述了編碼有代表性的分泌的卵巢癌抗原的附加的多核苷酸的部分序列(SEQ ID NOs82-310)。
附圖16是說(shuō)明全長(zhǎng)序列內(nèi)各種部分08E序列的位置的示意圖。
發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明一般涉及用于治療諸如卵巢癌這樣的癌癥的組合物和方法。本文所述的組合物可以包括免疫原性多肽類、編碼這類多肽的多核苷酸、諸如與多肽結(jié)合的抗體這樣的結(jié)合劑、抗原呈遞細(xì)胞(APCs)和/或免疫系統(tǒng)細(xì)胞(例如T細(xì)胞)。
本發(fā)明的多肽類一般包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或其變化形式。已經(jīng)使用免疫測(cè)定技術(shù)鑒定了某些卵巢癌蛋白質(zhì)且在本文中將其稱作卵巢癌抗原?！奥殉舶┛乖笔且环N以比正常卵巢細(xì)胞水平至少高兩倍水平的卵巢腫瘤細(xì)胞(優(yōu)選人體細(xì)胞)表達(dá)的蛋白質(zhì)。某些卵巢癌抗原以可檢測(cè)到的方式(在一種諸如ELISA或蛋白質(zhì)印跡這樣的免疫測(cè)定中)與針對(duì)來(lái)自植入了人卵巢腫瘤的免疫缺陷型動(dòng)物的血清而產(chǎn)生的抗血清發(fā)生反應(yīng)。這類卵巢癌抗原從卵巢腫瘤中排出或分泌入免疫缺陷型動(dòng)物的血清。因此，本文所提供的某些卵巢癌抗原是分泌抗原。本發(fā)明主題的某些核酸序列一般包括編碼全部或部分這類多肽的DNA或RNA序列或與這類序列互補(bǔ)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用評(píng)價(jià)卵巢腫瘤內(nèi)表達(dá)改變的技術(shù)所鑒定的卵巢癌序列。這類序列可以是多核苷酸或蛋白質(zhì)序列。正如使用本文提供的有代表性的測(cè)定法所測(cè)定的，一般在卵巢腫瘤中表達(dá)卵巢癌序列的水平至少高于正常卵巢組織內(nèi)的表達(dá)水平兩倍、且優(yōu)選至少高5倍。本文提供了某些卵巢癌多核苷酸的部分序列。還將由包括這類多核苷酸序列(或其互補(bǔ)物)的基因編碼的蛋白質(zhì)看作是卵巢癌蛋白質(zhì)。
抗體一般是如本文描述的能夠結(jié)合至少部分卵巢癌多肽的免疫系統(tǒng)蛋白質(zhì)或其抗原結(jié)合片段。可以在本文提供的組合物中使用的T細(xì)胞一般是對(duì)這類多肽具有特異性的T細(xì)胞(例如CD4+和/或CD8+)。本文所述的某些方法進(jìn)一步使用了表達(dá)如本文所提供的卵巢癌多肽的抗原呈遞細(xì)胞(諸如樹(shù)突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)。卵巢癌多核苷酸本發(fā)明包括編碼如本文所述的卵巢癌蛋白質(zhì)或其部分或其其它變化形式的任意多核苷酸。優(yōu)選的多核苷酸包括至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸、優(yōu)選至少30個(gè)連續(xù)的核苷酸且更優(yōu)選至少45個(gè)連續(xù)的核苷酸，它們可編碼卵巢癌蛋白質(zhì)的一部分。更優(yōu)選地，一種多核苷酸編碼諸如卵巢癌抗原這樣的卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分。本發(fā)明還包括與任意這類序列互補(bǔ)的多核苷酸。多核苷酸可以是單鏈(編碼或反義的)或雙鏈的且可以是DNA(基因組、cDNA或合成的)或RNA分子。附加的編碼或非編碼序列可以(但并不需要)存在于本發(fā)明的多核苷酸內(nèi)且多核苷酸可以(但并不需要)與其它分子和/或支持物連接。
多核苷酸可以包括天然序列(即編碼卵巢癌蛋白質(zhì)或其部分的內(nèi)源性序列)或可以包括這類序列的變化形式。多核苷酸變化形式可以含有一種或多種取代、缺失、添加和/或插入，使得所編碼的多肽的免疫原性相對(duì)于天然卵巢癌蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)不會(huì)被削弱。一般可以如本文所述評(píng)價(jià)對(duì)所編碼的多肽的免疫原性的作用。變化形式優(yōu)選表現(xiàn)出與編碼天然卵巢癌蛋白質(zhì)或其部分的多核苷酸序列至少約70％的同一性、更優(yōu)選至少約80％的同一性且最優(yōu)選至少約90％的同一性。
兩種多核苷酸或多肽序列的同一性百分比可以通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的諸如Megalign這樣的應(yīng)用默認(rèn)參數(shù)的計(jì)算機(jī)算法對(duì)序列進(jìn)行比較而方便地測(cè)定。兩種序列之間的比較一般通過(guò)比較用于鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域的比較窗口內(nèi)的序列來(lái)進(jìn)行。本文所用的“比較窗口”指的是至少約20個(gè)相鄰位置、通常30-約75或40-約50個(gè)相鄰位置的區(qū)段，其中可以在使兩種序列進(jìn)行最佳排列后對(duì)序列與相鄰位置的相同數(shù)量的參考序列進(jìn)行比較。例如，可以使用應(yīng)用默認(rèn)參數(shù)的生物信息學(xué)軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)Lasergene組中的Megalign程序?qū)τ糜诒容^的序列進(jìn)行最佳排列。優(yōu)選通過(guò)對(duì)至少20個(gè)位置比較窗口內(nèi)的兩種最佳排列的序列進(jìn)行比較來(lái)測(cè)定序列同一性的百分比，其中窗口內(nèi)的多核苷酸或多肽序列的部分可以包括相對(duì)于參考序列(不含添加或缺失)來(lái)說(shuō)為20％或20％以下、通常為5-15％或10-12％的添加或缺失(即缺口)。同一性百分比可以通過(guò)如下方法來(lái)計(jì)算測(cè)定相同核酸堿基或氨基酸殘基在兩種序列中出現(xiàn)的位置的數(shù)目得到配對(duì)位置的數(shù)目，將配對(duì)位置的數(shù)目除以參考序列中位置的總數(shù)(即窗口大小)并將結(jié)果乘以100得到序列同一性百分比。
此外或另一方面，變化形式可以基本上與天然基因或其部分或其互補(bǔ)物同源。這類多核苷酸變化形式能夠在中等嚴(yán)格條件下與天然出現(xiàn)的編碼天然卵巢癌蛋白質(zhì)的DNA序列(或互補(bǔ)序列)雜交。合適的中等嚴(yán)格條件包括在5％X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中預(yù)洗滌；在50℃-65℃下、5X SSC條件下雜交過(guò)夜；隨后在65℃下用含有O.1％SDS的2X、O.5X和O.2X SSC洗滌共兩次、每次20分鐘。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解存在編碼本文所述的多肽的許多核苷酸序列作為遺傳密碼簡(jiǎn)并的結(jié)果。這些多核苷酸中的某些與任意天然基因中的核苷酸序列具有最低限度的同源性。盡管如此，但是本發(fā)明特別關(guān)注因密碼子選擇上的差異而改變的多核苷酸。此外，包括本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因?qū)儆诒景l(fā)明的范圍。等位基因是作為一種或多種諸如核苷酸缺失、添加和/或取代這樣的突變結(jié)果而改變的內(nèi)源性基因。所得的mRNA和蛋白質(zhì)可以(但并不需要)具有改變的結(jié)構(gòu)或功能?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)(諸如雜交、擴(kuò)增和/或數(shù)據(jù)庫(kù)序列比較)來(lái)鑒定等位基因。
使用任意不同的技術(shù)可以制備多核苷酸。例如，正如下面更詳細(xì)地描述的，在給免疫活性小鼠注射來(lái)自植入了晚期傳代卵巢腫瘤的SCID小鼠血清后，可以通過(guò)用針對(duì)這類小鼠血清產(chǎn)生的抗血清篩選晚期傳代卵巢腫瘤表達(dá)文庫(kù)來(lái)鑒定卵巢癌多核苷酸。還可以使用用于評(píng)價(jià)不同基因表達(dá)的任意不同技術(shù)來(lái)鑒定卵巢癌多核苷酸。另一方面，可以從由卵巢腫瘤細(xì)胞制備的cDNA來(lái)擴(kuò)增多核苷酸。通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可以擴(kuò)增這類多核苷酸。就這一手段而言，可以以本文提供的序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)序列特異性引物且可以商購(gòu)或合成序列特異性引物。
可以使用眾所周知的技術(shù)將擴(kuò)增的部分用于從合適的文庫(kù)(例如卵巢癌cDNA文庫(kù))中分離全長(zhǎng)基因。在這類技術(shù)中，使用一種或多種適合于擴(kuò)增的多核苷酸探針或引物來(lái)選擇文庫(kù)(cDNA或基因組文庫(kù))。優(yōu)選將文庫(kù)進(jìn)行大小選擇以便包括較大的分子。還可以優(yōu)先選擇用于鑒定基因5’和上游區(qū)的隨機(jī)引物文庫(kù)。優(yōu)先選擇基因組文庫(kù)以便用于獲得內(nèi)含子和延伸的5’序列。
就雜交技術(shù)而言，可以使用眾所周知的技術(shù)標(biāo)記部分序列(例如通過(guò)切口平移或用32P末端標(biāo)記)。然后通過(guò)將含有變性細(xì)菌菌落(或含有噬菌體斑的菌苔)的濾膜與標(biāo)記的探針雜交來(lái)篩選細(xì)菌或噬菌體文庫(kù)(參見(jiàn)Sambrook等人，《分子克隆》(Molecular Cloning)“實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(A Laboratory Manual)，美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring HarborLaboratories)，紐約冷泉港，1989)。選擇雜交菌落或噬菌斑并使其擴(kuò)大且分離DNA用于進(jìn)一步的分析?？梢苑治鯿DNA克隆以便例如通過(guò)使用來(lái)自部分序列的引物和來(lái)自載體的引物進(jìn)行PCR來(lái)測(cè)定添加序列的數(shù)量?？梢陨上拗泼笀D譜和部分序列以便鑒定一種或多種重疊的克隆。然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以測(cè)定完全的序列，這一過(guò)程可以包括產(chǎn)生一系列缺失克隆。接著將所得的重疊序列裝配成單一的鄰接序列。通過(guò)使用眾所周知的技術(shù)連接合適的片段可以產(chǎn)生全長(zhǎng)cDNA分子。
另一方面，存在大量用于從部分cDNA序列中獲得全長(zhǎng)編碼序列的擴(kuò)增技術(shù)。在這類技術(shù)中，擴(kuò)增一般通過(guò)PCR來(lái)進(jìn)行。可以將任意不同的商購(gòu)試劑盒用于進(jìn)行擴(kuò)增步驟。例如，可以使用本領(lǐng)域中眾所周知的軟件來(lái)設(shè)計(jì)引物。優(yōu)選引物具有22-30個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度、具有至少50％的GC含量并在約68℃-72℃的溫度下與靶序列一起退火。可以如上所述測(cè)序擴(kuò)增的區(qū)域并將重疊的序列裝配成鄰接序列。
一種這類擴(kuò)增技術(shù)是反向聚合酶鏈反應(yīng)(參見(jiàn)Triglia等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)168186，1988)，該技術(shù)使用限制酶來(lái)產(chǎn)生公知基因區(qū)域內(nèi)的片段。然后通過(guò)分子內(nèi)連接使該片段成環(huán)形并用作使用來(lái)源于公知區(qū)域的分歧引物進(jìn)行PCR的模板。在一種可選擇的手段中，可以通過(guò)使用針對(duì)接頭序列的引物和對(duì)已知區(qū)域具有特異性的引物進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)恢復(fù)與部分序列鄰接的序列。一般使用相同的接頭序列和對(duì)已知區(qū)域具有特異性的引物對(duì)擴(kuò)增的序列進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。關(guān)于應(yīng)用兩種啟動(dòng)從已知序列向反向延伸的引物的這一過(guò)程的變化形式描述在WO96/38591中。另外的技術(shù)包括俘獲PCR(Lagerstrom等人，《實(shí)用PCR方法》(PCR Methods Applic.)1111-19，1991)和步行PCR(Parker等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)193055-60，1991)。還可以使用應(yīng)用擴(kuò)增的其它方法以便獲得全長(zhǎng)cDNA序列。
在某些情況中，能夠通過(guò)對(duì)諸如商購(gòu)自GenBank的表達(dá)序列標(biāo)記(EST)數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的序列進(jìn)行分析而獲得全長(zhǎng)cDNA序列。一般使用眾所周知的程序可以對(duì)重疊ESTs進(jìn)行檢索(例如NCBI BLAST檢索)且可以將這類ESTs用于產(chǎn)生連續(xù)的全長(zhǎng)序列。
在附圖1A-1S(SEQ ID NOS1-71)和附圖15A-15EEE(SEQ ID NOs82-310)中提供了編碼卵巢癌抗原部分的cDNA分子的某些核酸序列。附圖1A-1S中提供的序列看起來(lái)是新的。就附圖15A-15EEE中的序列而言，數(shù)據(jù)庫(kù)檢索顯示了基本上具有同一性的配對(duì)序列。通過(guò)使用用于鑒定分泌的腫瘤抗原的技術(shù)對(duì)卵巢腫瘤cDNA表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行血清學(xué)篩選來(lái)分離這些多核苷酸。簡(jiǎn)單地說(shuō)，由載體λ-篩選(Novagen)中SCID-衍生的人卵巢腫瘤(OV9334)制備晚期傳代卵巢腫瘤表達(dá)文庫(kù)。通過(guò)給免疫活性小鼠注射來(lái)自植入了一種晚期傳代卵巢腫瘤的SCID小鼠的血清而獲得篩選用血清。這項(xiàng)技術(shù)使得鑒定編碼分泌腫瘤抗原的免疫原性部分的cDNA分子成為可能。
本發(fā)明特別包括本文所述的多核苷酸、以及包括這類序列的全長(zhǎng)多核苷酸、這類全長(zhǎng)多核苷酸的其它部分和與這類全長(zhǎng)分子的全部或部分互補(bǔ)的序列。還可以將這項(xiàng)技術(shù)用于鑒定分泌自其它類型腫瘤的抗原，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
附圖4-9(SEQ ID NOs75-81)以及SEQ ID NOs313-384中提供了編碼卵巢癌蛋白質(zhì)部分的cDNA分子的其它核酸序列。通過(guò)篩選用于與腫瘤相關(guān)的表達(dá)(即正如使用本文提供的有代表性的檢測(cè)試驗(yàn)所測(cè)定的，在卵巢腫瘤中比在正常卵巢組織中至少大5倍的表達(dá))的cDNAs的顯微排列來(lái)鑒定這些序列。使用Synteni顯微排列(Palo Alto，CA)、按照制造商的說(shuō)明(且主要如Schena等在《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9310614-10619，1996和Heller等在《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)942150-2155，1997中所述)來(lái)進(jìn)行這類篩選。SEQ ID NOs311和391提供了摻入這些核酸序列中的某些的全長(zhǎng)序列。
可以將任意不同的眾所周知的技術(shù)用于評(píng)價(jià)與腫瘤相關(guān)的cDNA的表達(dá)。例如，可以使用應(yīng)用標(biāo)記的多核苷酸探針的雜交技術(shù)。另一方面或此外，可以使用諸如實(shí)時(shí)PCR的擴(kuò)增技術(shù)(參見(jiàn)Gibson等人，《基因組研究》(Genome Research)6995-1001，1996；Heid等人，《基因組研究》(Genome Research)6986-994，1996)。實(shí)時(shí)PCR是一種評(píng)價(jià)擴(kuò)增過(guò)程中PCR產(chǎn)物累積水平的技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)使得在多個(gè)樣品中定量評(píng)價(jià)mRNA的水平成為可能。簡(jiǎn)單地說(shuō)，從腫瘤和正常組織中提取mRNA并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備cDNA。例如，可以使用Perkin Elmer/Applied Biosystems(Foster City，CA)7700 Prism儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。例如，可以使用由Perkin Elmer/Applied Biosystems(Foster City，CA)提供的引物表達(dá)程序?yàn)樗P(guān)注的基因設(shè)計(jì)配對(duì)引物和熒光探針。開(kāi)始可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員測(cè)定引物和探針的最佳濃度且對(duì)照(例如β-肌動(dòng)蛋白)引物和探針例如可以商購(gòu)自Perkin Elmer/Applied Biosystems(Foster City，CA)。為了對(duì)樣品中特異性RNA的量進(jìn)行定量，在使用含有所關(guān)注基因的質(zhì)粒的同時(shí)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線?？梢允褂脤?shí)時(shí)PCR中測(cè)定的Ct值生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，它們與檢測(cè)試驗(yàn)中所用的起始cDNA濃度相關(guān)。10-106所關(guān)注基因的拷貝范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)稀釋度一般是足夠的。此外，生成對(duì)照序列的標(biāo)準(zhǔn)曲線。這要求對(duì)組織樣品中的起始RNA含量與用于比較目的的對(duì)照組量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
一般可以通過(guò)包括例如通過(guò)固相亞磷酰胺化學(xué)合成法在內(nèi)的本領(lǐng)域中已知的任意方法來(lái)制備多核苷酸的變化形式。還可以使用諸如寡核苷酸定向位點(diǎn)特異性誘變(參見(jiàn)Adelman等人，《DNA》2183，1983)這樣的標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)在多核苷酸序列中引入修飾。另一方面，可以通過(guò)體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄編碼卵巢癌抗原或其部分的DNA序列來(lái)生成RNA分子，條件是用合適的RNA聚合酶啟動(dòng)子(諸如T7或SP6)將所述DNA引入載體。如本文所述，可以將某些部分用于制備編碼的多肽。此外或另一方面，可以給患者施用某一部分，使得在體內(nèi)生成編碼的多肽。
還可以將與編碼序列互補(bǔ)的序列的一部分(即反義多核苷酸)用作探針或調(diào)制基因表達(dá)。也可以將可轉(zhuǎn)錄成反義RNA的cDNA構(gòu)建體引入細(xì)胞或組織以便有利于產(chǎn)生反義RNA。可以如本文所述使用反義多核苷酸以便抑制卵巢癌蛋白質(zhì)的表達(dá)?？梢詫⒎戳x技術(shù)用于通過(guò)形成三股螺旋而控制基因表達(dá)，這一過(guò)程危及到雙螺旋為結(jié)合聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)分子而充分打開(kāi)的能力(參見(jiàn)Gee等人，在Huber和Carr的《分子和免疫手段》(Molecular and Immunologic Approaches)，F(xiàn)utura PublishingCo.(Mt.Kisco，NY；1994)中所述)。另一方面，可以將反義分子設(shè)計(jì)成與基因的控制區(qū)(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))雜交并阻斷該基因的轉(zhuǎn)錄或通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄物與核糖體的結(jié)合而阻斷翻譯。
可以將任意多核苷酸進(jìn)一步進(jìn)行修飾以便增加體內(nèi)的穩(wěn)定性?？赡艿男揎棸ǖ幌抻谠?’和/或3’末端添加側(cè)翼序列；在主鏈中使用硫代磷酸酯或2’O-甲基硫代磷酸酯而不是磷酸二酯酶鍵；和/或包括諸如肌苷、queosine和wybutosine這樣的非傳統(tǒng)堿基以及乙酰基、甲基、硫代和其它修飾形式的腺嘌呤、胞苷、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶和鳥(niǎo)苷。
可以使用確立的重組DNA技術(shù)使本文所述的核苷酸序列與各種其它核苷酸序列連接。例如，可以將多核苷酸克隆入包括質(zhì)粒、噬菌粒、λ噬菌體衍生物和粘粒在內(nèi)的任意不同克隆載體。特別關(guān)注的載體包括表達(dá)載體、復(fù)制載體、探針生成載體和測(cè)序載體。一般來(lái)說(shuō)，載體將含有在至少一種生物體中有功能的復(fù)制起點(diǎn)、便利的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)和一種或多種選擇性標(biāo)記。其它元件將取決于所需的用途且這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
在某些實(shí)施方案中，可以配制多核苷酸以便使它們進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并在其中進(jìn)行表達(dá)。這類制劑特別可用于如下所述的治療目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解存在許多在靶細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸的方法且可以使用任意合適的方法。例如，可以將多核苷酸引入病毒載體，諸如但不限于腺病毒、與腺相關(guān)的病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或牛痘或其它痘病毒(例如鳥(niǎo)類痘病毒)。用于將DNA摻入這類載體的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以另外轉(zhuǎn)移或摻入用于選擇性標(biāo)記的基因(以便有助于鑒定或選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞)和/或靶向部分，諸如編碼特異性靶細(xì)胞上受體的配體的基因以便使所述載體變?yōu)榘刑禺愋暂d體。還可以使用抗體、通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)完成定向。
用于治療目的的其它制劑包括膠體分散系統(tǒng)，諸如大分子復(fù)合物、微膠囊、微球體、珠和包括水包油乳液、膠粒、混合膠粒和脂質(zhì)體在內(nèi)的以脂類為基礎(chǔ)的系統(tǒng)。優(yōu)選用作體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)載體的膠體系統(tǒng)是脂質(zhì)體(即人工膜囊泡)。這類系統(tǒng)的制備方法和應(yīng)用在本領(lǐng)域中是眾所周知的。卵巢癌多肽類在本發(fā)明的上下文中，多肽類可以包括如本文所述的至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或其變化形式。如上所述，某些卵巢癌蛋白質(zhì)是由卵巢腫瘤細(xì)胞表達(dá)的卵巢癌抗原且它們?cè)诿庖邷y(cè)定(諸如ELISA)中以可檢測(cè)到的方式與針對(duì)來(lái)自植入了卵巢腫瘤的免疫缺陷型動(dòng)物的血清而產(chǎn)生的抗血清發(fā)生反應(yīng)。其它的卵巢癌蛋白質(zhì)由本文所述的卵巢癌多核苷酸編碼。本文所述的多肽類可以具有任意長(zhǎng)度?？赡艽嬖趤?lái)源于天然蛋白質(zhì)和/或異源序列的另外的序列且這類序列可以(但并不需要)進(jìn)一步具有免疫原性或抗原特性。
本文所用的“免疫原性部分”是一種被B-細(xì)胞和/或T-細(xì)胞表面抗原受體所識(shí)別(即特異性結(jié)合)的抗原的一部分。這類免疫原性部分一般包括至少5個(gè)卵巢癌蛋白質(zhì)或其變化形式的氨基酸殘基、更優(yōu)選至少10個(gè)氨基酸殘基且更優(yōu)選至少20個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選的免疫原性部分由如本文所述分離的cDNA分子編碼。使用眾所周知的技術(shù)一般可以鑒定另外的免疫原性部分，這類技術(shù)概括在Paul的《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(FundamentalImmunology)第3版243-247(Rayen Press，1993)及其中的參考文獻(xiàn)中。這類技術(shù)包括篩選能夠與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性抗體、抗血清和/或T-細(xì)胞系或克隆反應(yīng)的多肽類。如本文所述，如果抗血清和抗體與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性結(jié)合(即它們?cè)贓LISA或其它免疫測(cè)定中與卵巢癌蛋白質(zhì)反應(yīng)且不與不相關(guān)的蛋白質(zhì)以可檢測(cè)到的方式反應(yīng))，那么它們是“卵巢癌蛋白質(zhì)特異性的”。如本文所述且使用眾所周知的技術(shù)可以制備這類抗血清、抗體和T細(xì)胞。天然卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分是一種以基本上不低于全長(zhǎng)多肽反應(yīng)性的水平與這類抗血清、抗體和/或T-細(xì)胞反應(yīng)的部分(例如在ELISA和/或T-細(xì)胞反應(yīng)性檢測(cè)試驗(yàn)中)。這類免疫原性部分可以在這類檢測(cè)試驗(yàn)中以類似于或高于全長(zhǎng)蛋白質(zhì)反應(yīng)性的水平發(fā)生反應(yīng)。一般可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法來(lái)進(jìn)行這類篩選，諸如那些描述在Harlow和Lane的《抗體》(Antibodies)“實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(A Laboratory Manual)，美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring HarborLaboratory)，1988中的方法。例如，可以將多肽固定在固體支持物上并與患者的血清接觸以使抗體在血清內(nèi)與固定化多肽結(jié)合。然后將未結(jié)合的血清除去并使用例如125I-標(biāo)記的蛋白質(zhì)A來(lái)檢測(cè)結(jié)合的抗體。
如上所述，一種組合物可以包括天然卵巢癌蛋白質(zhì)的變化形式。本文所用的多肽“變化形式”是一種在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面不同于天然卵巢癌蛋白質(zhì)的多肽，使得該多肽的免疫原性基本上不會(huì)被削弱。換句話說(shuō)，相對(duì)于天然卵巢癌蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，變化形式與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性抗血清反應(yīng)的能力可以得到增強(qiáng)或不會(huì)改變；或可以使這種能力比天然卵巢癌蛋白質(zhì)降低50％以下且優(yōu)選降低20％以下。一般可以通過(guò)修飾上述多肽序列之一并評(píng)價(jià)所修飾的多肽與本文所述的卵巢癌蛋白質(zhì)特異性抗體或抗血清的反應(yīng)性來(lái)鑒定這類變化形式。優(yōu)選的變化形式包括諸如N-末端前導(dǎo)序列或跨膜結(jié)構(gòu)域這樣的一種或多種部分已經(jīng)被除去的那些變化形式。其它優(yōu)選的變化形式包括已經(jīng)將小部分(例如1-30個(gè)氨基酸、優(yōu)選5-15個(gè)氨基酸)從成熟蛋白質(zhì)的N-和/或C-末端除去的變化形式。
多肽變化形式優(yōu)選顯示出與天然多肽具有至少約70％、更優(yōu)選至少約90％且最優(yōu)選至少約95％的同一性。優(yōu)選一種變化形式含有保守置換?！氨Ｊ刂脫Q”是一種氨基酸取代另一種具有相似特性的氨基酸的情況，使得肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以預(yù)測(cè)基本上未改變的多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性。氨基酸取代一般可以以其殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性為基礎(chǔ)來(lái)進(jìn)行。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；且?guī)в芯哂邢嗨朴H水值的不帶電荷的極性頭基團(tuán)的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸?？梢源肀Ｊ匦愿淖兊钠渌M的氨基酸包括(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。另外或另一方面，一種變化形式可以含有非保守性改變。例如，還(或另外)可以通過(guò)缺失或添加對(duì)多肽的免疫原性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性具有最低影響的氨基酸來(lái)修飾變化形式。
如上所述，多肽類可以包括共同翻譯或翻譯后指導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)的N-末端上的信號(hào)(或前導(dǎo))序列。還可以使該多肽與一種接頭或易于合成、純化或鑒定該多肽(例如聚-His)或促進(jìn)該多肽與固體支持物結(jié)合的其它序列結(jié)合。例如，可以使多肽與免疫球蛋白Fc區(qū)接合。
可以使用任意不同的眾所周知的技術(shù)來(lái)制備多肽類。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意不同的表達(dá)載體可以方便地由DNA序列制備由如本文所述的DNA序列編碼的重組多肽類。可以在已經(jīng)用含有編碼重組多肽的DNA分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的合適的宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。合適的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母和高等真核細(xì)胞。優(yōu)選所用的宿主細(xì)胞是大腸桿菌、酵母或諸如COS或CHO這樣的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系?？梢允紫仁褂蒙藤?gòu)的濾膜濃縮來(lái)自將重組蛋白質(zhì)或多肽分泌入培養(yǎng)基的合適的宿主/載體系統(tǒng)的上清液。在濃縮后，可以將濃縮物施用于諸如親和性基質(zhì)或離子交換樹(shù)脂這樣的合適的純化基質(zhì)。最后，可以使用一個(gè)或多個(gè)反向HPLC步驟來(lái)進(jìn)一步純化重組多肽。
還可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)、通過(guò)合成方式來(lái)生產(chǎn)具有少于約100個(gè)氨基酸且一般少于約50個(gè)氨基酸的部分和其它變化形式。例如，可以使用任意商購(gòu)的固相技術(shù)、諸如Merrifield固相合成法來(lái)合成這類多肽，其中將氨基酸依次添加到不斷伸長(zhǎng)的氨基酸鏈上。參見(jiàn)Merrifield的《美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志》(J.Am.Chem.Soc.)852149-2146，1963。自動(dòng)化合成多肽類的設(shè)備商購(gòu)自諸如AppliedBioSystems，Inc.(Foster City，CA)這樣的供應(yīng)商且可以按照制造商的說(shuō)明操作它。
在某些具體的實(shí)施方案中，多肽可以是包括本文所述的多個(gè)多肽或包括一種如本文所述的多肽和一種諸如卵巢癌蛋白質(zhì)或這類蛋白質(zhì)的變化形式這樣的已知腫瘤抗原的融合蛋白。例如，融合配偶體可以輔助產(chǎn)生T輔助細(xì)胞表位(一種免疫融合配偶體)、優(yōu)選由人識(shí)別的T輔助細(xì)胞表位或可以輔助以高于天然重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量表達(dá)蛋白質(zhì)(表達(dá)增強(qiáng)子)。某些優(yōu)選的融合配偶體既是免疫的又是表達(dá)增強(qiáng)的融合配偶體?？梢詫?duì)其它融合配偶體進(jìn)行選擇以便增加蛋白質(zhì)的溶解性或能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)靶向至所需的胞內(nèi)區(qū)室。另外的融合配偶體包括有利于純化蛋白質(zhì)的親和性標(biāo)記。
一般可以使用包括化學(xué)結(jié)合在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備融合蛋白。優(yōu)選將融合蛋白表達(dá)為重組蛋白質(zhì)，使得在表達(dá)系統(tǒng)中相對(duì)于非融合蛋白來(lái)說(shuō)它們產(chǎn)生的量增加。簡(jiǎn)單地說(shuō)，可以將編碼多肽成分的DNA序列單獨(dú)裝配并連入合適的表達(dá)載體。使用或不用肽接頭將編碼一種多肽成分的DNA序列的3’末端與編碼第二種多肽成分的DNA序列的5’末端連接以便序列的讀框處于同相中。這使得翻譯成保留兩種成分多肽生物活性的單一融合蛋白成為可能。
可以使用肽接頭使第一種和第二種多肽成分相隔的距離足以確保使各多肽折疊成其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。使用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將這類肽接頭序列摻入融合蛋白?？梢砸韵铝幸蛩貫榛A(chǔ)選擇合適的肽接頭(1)其采取柔性擴(kuò)展構(gòu)象的能力；(2)其不具有采取能與第一種和第二種多肽上功能表位發(fā)生相互作用的二級(jí)結(jié)構(gòu)的能力；和(3)可能與多肽功能表位發(fā)生相互作用的疏水性或帶電荷殘基的缺乏。優(yōu)選的肽接頭序列含有Gly、Asn和Ser殘基。可以將諸如Thr和Ala這樣的其它接近中性的氨基酸用于肽接頭序列?？梢杂杏玫赜米鹘宇^的氨基酸序列包括那些概括在Maratea等人，《基因》(Gene)4039-46，1985、Murphy等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)838258-8262，1986、美國(guó)專利號(hào)4,935,233和美國(guó)專利號(hào)4,751,180中的序列。接頭序列一般可以具有1-約50個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。當(dāng)?shù)谝环N和第二種多肽具有可用于分離功能結(jié)構(gòu)域并防止空間干擾的非必需N-末端氨基酸區(qū)時(shí)，并不需要接頭序列。
將連接的DNA序列可操作地與合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)元件連接。導(dǎo)致表達(dá)DNA的調(diào)節(jié)元件僅位于編碼第一種多肽的DNA序列的5’端。類似地，終止翻譯所需的終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)僅位于編碼第二種多肽的DNA序列的3’端。
還提供了包括本發(fā)明多肽和不相關(guān)的免疫原性蛋白質(zhì)的融合蛋白。優(yōu)選所述的免疫原性蛋白質(zhì)能夠引起回憶反應(yīng)。這類蛋白質(zhì)的實(shí)例包括破傷風(fēng)蛋白質(zhì)、結(jié)核蛋白質(zhì)和肝炎蛋白質(zhì)(例如，參見(jiàn)Stoute等人，《新英格蘭藥物雜志》33686-91，1997)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫融合配偶體來(lái)源于蛋白質(zhì)D、即一種革蘭氏陰性菌流感嗜血桿菌B的表面蛋白(WO91/18926)。優(yōu)選蛋白質(zhì)D衍生物包括約三分之一的蛋白質(zhì)(例如N-末端的前100-110個(gè)氨基酸)且可以使蛋白質(zhì)D衍生物脂化。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在N-末端上包含脂蛋白D融合配偶體的前109個(gè)殘基以便形成具有附加的外源T-細(xì)胞表位的多肽并提高大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)水平(由此起表達(dá)增強(qiáng)子的作用)。脂尾確保以最佳方式將抗原呈遞給抗原呈遞細(xì)胞。其它融合配偶體包括來(lái)自流感病毒NS1(血凝素)的非結(jié)構(gòu)蛋白。一般來(lái)說(shuō)，使用N-末端的81個(gè)氨基酸，不過(guò)，可以使用包括T-輔助細(xì)胞表位的不同片段。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫融合配偶體是稱作LYTA的蛋白質(zhì)或其部分(優(yōu)選C-末端部分)。LYTA來(lái)源于肺炎鏈球菌，它可合成稱作酰胺酶LYTA的N-乙?；?L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因編碼；《基因》(Gene)43265-292，1986)。LYTA是一種特異性降解肽聚糖主鏈中的某些鍵的自溶素。LYTA蛋白質(zhì)的C-末端結(jié)構(gòu)域是導(dǎo)致與膽堿或與某些諸如DEAE這樣的膽堿類似物親和的原因。已經(jīng)利用這種特性開(kāi)發(fā)了用于表達(dá)融合蛋白的C-LYTA表達(dá)質(zhì)粒。已經(jīng)描述了在氨基末端含有C-LYTA片段的雜交蛋白質(zhì)的純化(參見(jiàn)《生物技術(shù)》(Biotechnology)10795-798，1992)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以將LYTA的重復(fù)部分摻入融合蛋白。在178位殘基開(kāi)始的C-末端區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了重復(fù)部分。特別優(yōu)選的重復(fù)部分含有188-305位殘基。
一般來(lái)說(shuō)，分離了如本文所述的多肽類(包括融合蛋白)和多核苷酸?！胺蛛x”的多肽或多核苷酸是一種來(lái)源于其原始環(huán)境中的部分。例如，如果天然存在的蛋白質(zhì)分離自天然系統(tǒng)中某些或全部共存的物質(zhì)，那么它是分離的。優(yōu)選這類多肽至少具有約90％的純度、更優(yōu)選至少具有約95％的純度且最優(yōu)選至少具有約99％的純度。例如，如果將多核苷酸克隆入不屬于天然環(huán)境中的一部分的載體，那么將其看作是分離的。結(jié)合劑本發(fā)明進(jìn)一步提供了諸如抗體及其抗原結(jié)合片段這樣的活性劑，它們特異性結(jié)合卵巢癌蛋白質(zhì)。一般認(rèn)為如果本文所用的抗體或其抗原結(jié)合片段在可檢測(cè)的水平上(例如在ELISA中)與卵巢癌蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)且在相似條件下不與不相關(guān)的蛋白質(zhì)以可檢測(cè)的方式發(fā)生反應(yīng)，那么它與卵巢癌蛋白質(zhì)“特異性結(jié)合”。本文所用的“結(jié)合”指的是兩種獨(dú)立分子之間的非共價(jià)結(jié)合而形成“復(fù)合物”。例如，可以通過(guò)測(cè)定形成所述復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)結(jié)合能力。結(jié)合常數(shù)是復(fù)合物的濃度除以產(chǎn)物成分的濃度時(shí)獲得的數(shù)值。在本發(fā)明的上下文中，當(dāng)形成復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)超過(guò)約103L/mol時(shí)，一般認(rèn)為兩種化合物“結(jié)合”。可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法測(cè)定結(jié)合常數(shù)。
使用本文提供的有代表性的檢測(cè)試驗(yàn)，結(jié)合劑可能還能夠區(qū)分患有和不患有諸如卵巢癌這樣的癌癥的患者。換句話說(shuō)，與卵巢癌抗原結(jié)合的抗體或其它結(jié)合劑會(huì)產(chǎn)生一種指示至少約20％癌癥患者中癌癥存在的信號(hào)并產(chǎn)生一種指示至少約90％未患癌癥個(gè)體中這種疾病不存在的陰性信號(hào)。為了測(cè)定結(jié)合劑是否能夠滿足這種需求，如本文所述對(duì)來(lái)自患有和不患癌癥患者(如使用標(biāo)準(zhǔn)臨床試驗(yàn)測(cè)定的)的生物樣品(例如血液、血清、白細(xì)胞轉(zhuǎn)移、尿和/或腫瘤活檢組織)檢測(cè)可結(jié)合結(jié)合劑的多肽類的存在。顯然應(yīng)檢測(cè)患有和不患該病的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性數(shù)量的樣品。各結(jié)合劑應(yīng)滿足上述標(biāo)準(zhǔn)；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到可以以組合方式使用結(jié)合劑以便改善敏感性。
滿足上述要求的任意活性劑可以是一種結(jié)合劑。例如，結(jié)合劑可以是包有或不包有肽成分的核糖體、RNA分子或多肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合劑是抗體或其抗原結(jié)合片段?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意不同技術(shù)制備抗體。例如，參見(jiàn)Harlow和Lane的《抗體》(Antibodies)“實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(A Laboratory Manual)，美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring Harbor Laboratory)，1988。一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)包括如本文所述生產(chǎn)單克隆抗體在內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)或通過(guò)將抗體基因轉(zhuǎn)染入合適的細(xì)菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主可以生產(chǎn)抗體，從而產(chǎn)生重組抗體。在一種技術(shù)中，開(kāi)始將包括多肽的免疫原注入任意不同的哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、家兔、綿羊或山羊)。在該步驟中，本發(fā)明的多肽類可以用作不加修飾的免疫原。另一方面，特別就相對(duì)較短的多肽類而言，如果使所述多肽與諸如牛血清白蛋白或匙孔血藍(lán)蛋白這樣的載體蛋白連接，那么可以引起優(yōu)良的免疫反應(yīng)。優(yōu)選按照包括一次或多次加強(qiáng)免疫的預(yù)定方案將免疫原注入動(dòng)物宿主并定期對(duì)動(dòng)物取血。然后，例如可以通過(guò)使用與合適的固體支持物偶聯(lián)的多肽的親和色譜法從這類抗血清中純化對(duì)所述多肽具有特異性的多克隆抗體。
例如，可以使用Kohler和Milstein在《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol.)6511-519，1976中所述的技術(shù)及其改進(jìn)技術(shù)來(lái)制備對(duì)所關(guān)注的抗原多肽具有特異性的單克隆抗體。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這些方法包括制備能夠產(chǎn)生具有所需特異性(即與所關(guān)注多肽的反應(yīng)性)的抗體的無(wú)限增殖細(xì)胞系的步驟。例如，可以由獲自如上所述免疫接種動(dòng)物的脾細(xì)胞產(chǎn)生這類細(xì)胞系。然后，例如通過(guò)與骨髓瘤細(xì)胞融合配偶體、優(yōu)選一種與免疫接種動(dòng)物同基因的配偶體融合使所述的脾細(xì)胞無(wú)限增殖化。可以使用各種融合技術(shù)。例如，可以使脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞與非離子型去污劑混合幾分鐘且然后以低密度將它們平板接種在維持雜交細(xì)胞而不是骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的選擇性培養(yǎng)基上。優(yōu)選的選擇技術(shù)使用HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷)選擇。在足夠的時(shí)間、通常約為1-2周后，觀察到雜交體集落。選擇單一集落并檢測(cè)其培養(yǎng)物上清液對(duì)所述多肽的結(jié)合活性。優(yōu)選具有高反應(yīng)性和特異性的雜交瘤。
單克隆抗體可以分離自生長(zhǎng)雜交瘤集落的上清液。此外，可以將各種技術(shù)用于提高產(chǎn)量，諸如將雜交瘤細(xì)胞系注入諸如小鼠這樣的合適脊椎動(dòng)物宿主的腹膜腔的技術(shù)。然后從腹水液或血液中收集單克隆抗體。可以通過(guò)諸如色譜法、凝膠過(guò)濾法、沉淀法和提取法這樣的常規(guī)技術(shù)從所述抗體中除去污染物?？梢詫⒈景l(fā)明的多肽類用于例如親和色譜步驟中的純化過(guò)程。
在某些實(shí)施方案中，可以優(yōu)選使用抗體的抗原結(jié)合片段。這類片段包括可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備的Fab片段。簡(jiǎn)單地說(shuō)，可以通過(guò)蛋白質(zhì)A珠柱上的親和色譜法從家兔血清中純化免疫球蛋白(Harlow和Lane的《抗體》(Antibodies)“實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(A Laboratory Manual)，美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring Harbor Laboratory)，1988)并通過(guò)木瓜蛋白酶將其消化而產(chǎn)生Fab和Fc片段?？梢酝ㄟ^(guò)蛋白質(zhì)A珠柱上的親和色譜法分離Fab和Fc片段。
可以將本發(fā)明的單克隆抗體與一種或多種治療劑偶聯(lián)。在這方面合適的治療劑包括放射性核素、分化誘導(dǎo)物、藥物、毒素及其衍生物。優(yōu)選的放射性核素包括90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。優(yōu)選的藥物包括氨甲蝶呤、嘧啶和嘌呤類似物。優(yōu)選的分化誘導(dǎo)物包括佛波酯和丁酸。優(yōu)選的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒素、白喉毒素、霍亂毒素、gelonin、假單胞菌外毒素、志賀菌屬毒素和美洲商陸抗病毒蛋白。
可以以直接或間接(例如通過(guò)連接基團(tuán))的方式使治療劑與合適的單克隆抗體偶聯(lián)(例如通過(guò)共價(jià)結(jié)合的方式)。治療劑與抗體之間的直接反應(yīng)在它們各自具有能夠彼此發(fā)生反應(yīng)的取代基時(shí)是可能的。例如，在一種物質(zhì)上的諸如氨基或巰基這樣的親核基可能能夠與諸如酐或?；u這樣的含羰基的基團(tuán)或與另一種物質(zhì)上的含良好的離去基團(tuán)(例如鹵化物)的烷基發(fā)生反應(yīng)。
另一方面，可能需要通過(guò)連接基團(tuán)偶聯(lián)治療劑和抗體。連接基團(tuán)可以起治療劑與抗體之間的間隔基的作用以便避免干擾結(jié)合能力。連接基團(tuán)還可以用于增加治療劑或抗體上的取代基的化學(xué)反應(yīng)性且由此提高偶聯(lián)功效?；瘜W(xué)反應(yīng)性的提高還可有助于治療劑、或治療劑上的官能基的應(yīng)用，否則是不可能的。
可以將各種雙功能或多功能試劑即相同和不同功能試劑(諸如在Pierce Chemical Co.，Rockford，IL目錄中所述的那些試劑)用作連接基團(tuán)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。例如，通過(guò)氨基、羧基、巰基或氧化的碳水化合物殘基可以進(jìn)行偶聯(lián)。存在大量描述這類方法的參考文獻(xiàn)，例如Rodwell等人的美國(guó)專利號(hào)4,671,958。
盡管治療劑在不含本發(fā)明的免疫綴合物的抗體部分時(shí)更為有效，但是可能需要使用在攝入細(xì)胞過(guò)程中或攝入細(xì)胞時(shí)可裂解的連接基團(tuán)。已經(jīng)描述了大量不同的可裂解的連接基團(tuán)。在胞內(nèi)從這些連接基團(tuán)中釋放治療劑的機(jī)理包括通過(guò)下列方式進(jìn)行裂解還原二硫鍵(例如Spitler的美國(guó)專利號(hào)4,489,710)；照射遇光不穩(wěn)定的鍵(例如Senter等人的美國(guó)專利號(hào)4,625,014)；水解衍生的氨基酸側(cè)鏈(例如kohn等人的美國(guó)專利號(hào)4,638,045)；血清互補(bǔ)物介導(dǎo)的水解(例如Rodwell等人的美國(guó)專利號(hào)4,671,958)；和酸催化的水解(例如Blattler等人的美國(guó)專利號(hào)4,569,789)。
可能需要將一種以上的治療劑與抗體偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將多個(gè)治療劑分子與一個(gè)抗體分子偶聯(lián)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將一種類型以上的治療劑與一種抗體偶聯(lián)。無(wú)論特定的實(shí)施方案如何，可以按照不同方式制備與一種以上治療劑形成的免疫綴合物。例如，可以將一種以上的治療劑直接與一種抗體分子偶聯(lián)或可以使用為附著提供多個(gè)位點(diǎn)的接頭。另一方面，可以使用一種載體。
載體可以以多種方式，包括直接或通過(guò)連接基團(tuán)共價(jià)結(jié)合帶有治療劑。合適的載體包括諸如白蛋白這樣的蛋白質(zhì)(例如Kato等人的美國(guó)專利號(hào)4,507,234)、肽類和諸如氨基葡聚糖這樣的多糖類(例如Shih等人的美國(guó)專利號(hào)4,699,784)。載體還可以通過(guò)非共價(jià)鍵或通過(guò)諸如包裹在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)而帶有治療劑(例如美國(guó)專利號(hào)4,429,008和4,873,088)。對(duì)放射性核素具有特異性的載體包括放射性鹵化的小分子和螯合化合物。例如，美國(guó)專利號(hào)4,735,792中公開(kāi)了有代表性的放射性鹵化小分子及其合成方法。可以由包括含氮和硫原子作為結(jié)合金屬或金屬氧化物(放射性核素)用供體原子的那些螯合化合物制成放射性核素螯合物。例如，Davison等人的美國(guó)專利號(hào)4,673,562中公開(kāi)了有代表性的螯合化合物及其合成方法。
可以使用抗體和免疫綴合物的不同給藥途徑。一般來(lái)說(shuō)，給藥可以是靜脈內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、皮下給藥或在切除腫瘤的部位給藥。顯然抗體/免疫綴合物的準(zhǔn)確劑量將取決于所用的抗體、腫瘤上抗原的密度和抗體的清除率而改變。
本文還提供了模擬卵巢癌蛋白質(zhì)免疫原性部分的抗獨(dú)特型抗體。使用眾所周知的技術(shù)，可以針對(duì)特異性結(jié)合卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分的抗體或其抗原結(jié)合片段產(chǎn)生這類抗體。模擬卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分的抗獨(dú)特型抗體是結(jié)合如本文所述可特異性結(jié)合卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分的抗體或其抗原結(jié)合片段的那些抗體。T細(xì)胞免疫治療組合物還或另一方面可以包括對(duì)卵巢癌蛋白質(zhì)具有特異性的T細(xì)胞。一般可以使用標(biāo)準(zhǔn)程序在體外或體內(nèi)制備這類細(xì)胞。例如，使用商購(gòu)自CellPro Inc.，Bothell WA的諸如CEPRATETM系統(tǒng)這樣的商購(gòu)細(xì)胞分離系統(tǒng)可以使T細(xì)胞存在于骨髓(或分離自)骨髓、外周血液或骨髓部分或諸如患者這樣的哺乳動(dòng)物外周血液中(另外參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,240,856；美國(guó)專利號(hào)5,215,926；WO89/06280；WO91/16116和WO92/07243)。另一方面，T細(xì)胞可以來(lái)源于相關(guān)的或不相關(guān)的人、非人動(dòng)物、細(xì)胞系或培養(yǎng)物。
可以用卵巢癌多肽、編碼卵巢癌多肽的多核苷酸和/或表達(dá)這類多肽的抗原呈遞細(xì)胞(APC)來(lái)刺激T細(xì)胞。這種刺激過(guò)程在足以使對(duì)所述多肽具有特異性的T細(xì)胞生成的條件和時(shí)間下進(jìn)行。優(yōu)選卵巢癌多肽或多核苷酸存在于諸如微球體這樣的轉(zhuǎn)運(yùn)載體內(nèi)以便促進(jìn)特異性T細(xì)胞生成。
如果T細(xì)胞殺死包被有卵巢癌多肽或表達(dá)編碼這類的基因的靶細(xì)胞，那么將T細(xì)胞看作對(duì)卵巢癌多肽具有特異性。使用任意不同的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以評(píng)價(jià)T細(xì)胞特異性。例如，在鉻釋放測(cè)定或增殖測(cè)定中，裂解和/或增殖比陰性對(duì)照增加2倍以上的刺激指數(shù)表明了T細(xì)胞的特異性。例如，可以如Chen等人在《癌癥研究》(Cancer Res.)541065-1070，1994中所述進(jìn)行這類測(cè)定。另一方面，通過(guò)各種已知的技術(shù)可以完成對(duì)T細(xì)胞增殖的檢測(cè)。例如，通過(guò)測(cè)定DNA合成的增加率(例如通過(guò)用含氚胸苷脈沖標(biāo)記T細(xì)胞培養(yǎng)物并測(cè)定摻入DNA的含氚胸苷的量)可以檢測(cè)T細(xì)胞的增殖情況。正如使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞因子檢測(cè)試驗(yàn)所測(cè)定的，與卵巢癌多肽(200ng/ml-100μg/ml、優(yōu)選100ng/ml-25μg/ml)接觸3-7天應(yīng)導(dǎo)致T細(xì)胞增殖至少增加2倍和/或如上所述接觸2-3小時(shí)應(yīng)導(dǎo)致T細(xì)胞激活，其中細(xì)胞因子的釋放水平(例如TNF或IFN-γ)提高2倍表示T細(xì)胞激活(參見(jiàn)Coligan等人《最新免疫學(xué)方案》(CurrentProtocols in Immunology)第1卷，Wiley Interscience(Greene1998))。為響應(yīng)卵巢癌多肽、多核苷酸或表達(dá)卵巢癌多肽的APC已經(jīng)被激活的T細(xì)胞可以是CD4+和/或CD8+。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以使卵巢癌多肽特異性T細(xì)胞擴(kuò)充。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，T細(xì)胞來(lái)源于患者或相關(guān)或不相關(guān)的供體且在刺激和擴(kuò)充后給患者施用它們。
為了治療目的，可以使為響應(yīng)卵巢癌多肽、多核苷酸或APC而增殖的CD4+或CD8+T細(xì)胞在體外或體內(nèi)的數(shù)量擴(kuò)充。按照不同方式可以完成這類T細(xì)胞在體外的增殖。例如，可以通過(guò)添加或不添加諸如白細(xì)胞介素-2這樣的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子和/或合成卵巢癌多肽的細(xì)胞刺激物使T細(xì)胞重新與卵巢癌多肽接觸。另一方面，通過(guò)克隆可以使在有卵巢癌多肽存在的情況下增殖的一種或多種T細(xì)胞的數(shù)量擴(kuò)充。用于克隆細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的且包括有限稀釋。例如，在擴(kuò)充后，可以如Chang等人在《腫瘤學(xué)與血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)綜述》(Crit.Rev.Oncol.Hematol.)22213，1996中所述將所述細(xì)胞給藥回患者體內(nèi)。藥物組合物和疫苗在某些方面中，可以將如本文所述的多肽類、多核苷酸、結(jié)合劑和/或免疫系統(tǒng)細(xì)胞混入藥物組合物或疫苗。藥物組合物包括一種或多種這類化合物或細(xì)胞和生理上可接受的載體。疫苗可以包括一種或多種這類化合物或細(xì)胞和非特異性免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑。非特異性免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑可以是增強(qiáng)對(duì)外源抗原的免疫反應(yīng)的任意物質(zhì)。非特異性免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑的實(shí)例包括佐劑、可生物降解的微球體(例如polylactic galactide)和脂質(zhì)體(化合物混入其中；例如，參見(jiàn)Fullerton的美國(guó)專利號(hào)2,235,877)。例如，疫苗制品一般描述在M.F.Powell和M.J.Newman編輯的“疫苗設(shè)計(jì)(亞單位和佐劑法)”(Vaccine Design(the subunit andadjuvant approach))、Plenum Press(NY，1995)中。本發(fā)明范圍內(nèi)的藥物組合物和疫苗還可以含有具生物活性的或無(wú)活性的其它化合物。例如，可以將存在的其它腫瘤抗原的一種或多種免疫原性部分混入融合多肽或作為混入所述組合物或疫苗中的獨(dú)立化合物。
藥物組合物或疫苗可以含有編碼如上所述的一種或多種多肽類的DNA，使得所述多肽在原位生成。如上所述，所述DNA可以存在于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)在內(nèi)的任意不同轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中。合適的核酸表達(dá)系統(tǒng)含有在患者體內(nèi)表達(dá)所必需的DNA序列(諸如合適的啟動(dòng)子和終止信號(hào))。細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)涉及給予表達(dá)在其細(xì)胞表面上多肽的免疫原性部分的細(xì)菌(諸如卡介苗)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以使用可包括應(yīng)用非致病性(缺陷型)復(fù)制活性病毒的病毒表達(dá)系統(tǒng)(例如牛痘或其它痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒)引入所述DNA。例如，合適的系統(tǒng)公開(kāi)在下列文獻(xiàn)中Fisher-Hoch等人的PNAS 86317-321，1989；Flexner等人的《紐約科學(xué)院年鑒》(Ann.N.Y.Acad.Sci.)56986-103，1989；Flexner等人的《疫苗》(Vaccine)817-21，1990；美國(guó)專利號(hào)4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美國(guó)專利號(hào)4,777,127；GB2，200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner的《生物技術(shù)》(Biotechniques)6616-627，1988；Rosenfeld等人的《科學(xué)》(Science)252431-434，1991；Kolls等人的PNAS 91215-219，1994；Kass-Eisler等人的PNAS 9011498-11502，1993；Guzman等人的《循環(huán)》(Circulation)882838-2848，1993；和Guzman等人的《循環(huán)研究》(Cir.Res.)731202-1207，1993。用于將DNA混入這類表達(dá)系統(tǒng)的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的。例如，正如Ulmer等人在《科學(xué)》(Science)2591745-1749，1993中描述和由Cohen在《科學(xué)》(Science)2591691-1692，1993中綜述的，所述DNA還可以是“裸的”。通過(guò)將所述DNA包被在有效轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞的可生物降解的珠上可以提高裸DNA的攝取。
盡管可以將本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的載體用于本發(fā)明的藥物組合物中，但是載體的類型將取決于給藥方式?？梢詾楹线m的給藥方式來(lái)配制本發(fā)明的組合物，例如，所述的給藥方式包括局部給藥、口服給藥、鼻部給藥、靜脈內(nèi)給藥、顱內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、皮下給藥或肌內(nèi)給藥。就諸如皮下注射這樣的非腸道給藥而言，所述的載體優(yōu)選包括水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩沖液。就口服給藥而言，可以使用任意上述載體或固體載體諸如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。還可以將可生物降解的微球體(例如聚乳酸聚乙醇酸酯)用作本發(fā)明藥物組合物的載體。例如，適宜的可生物降解的微球體公開(kāi)在美國(guó)專利號(hào)4,897,268和5,075,109中。
這類組合物還可以包括緩沖液(例如中性緩沖鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露糖醇、蛋白質(zhì)、多肽類或諸如甘氨酸這樣的氨基酸、抗氧化劑、諸如EDTA或谷胱甘肽這樣的螯合劑、佐劑(例如氫氧化鋁)和/或防腐劑。另一方面，可以將本發(fā)明的組合物配制成凍干物。還可以使用眾所周知的技術(shù)將化合物包裹在脂質(zhì)體內(nèi)。
可以將任意不同的非特異性免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑用于本發(fā)明的疫苗中。例如，可以包括佐劑。大多數(shù)佐劑含有用于防止抗原快速分解代謝的諸如氫氧化鋁或礦物油這樣的物質(zhì)和諸如脂質(zhì)A，即Bortadella pertussis或結(jié)核分枝桿菌衍生的蛋白質(zhì)這樣的免疫反應(yīng)刺激物。例如，合適的佐劑是商購(gòu)的弗氏不完全佐劑和弗氏完全佐劑(Difco Laboratories，Detroit，MI)、Merck Adjuvant 65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)、明礬、可生物降解的微球體、單磷?；|(zhì)A和quil A。還可以將諸如GM-CSF或白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-7或白細(xì)胞介素-12這樣的細(xì)胞因子用作佐劑。
在本文所提供的疫苗中，優(yōu)選將佐劑組合物設(shè)計(jì)成主要誘發(fā)Th1類型的免疫反應(yīng)。高水平的Th1-型細(xì)胞因子(例如IFN-γ、IL-2和IL-12)傾向于促進(jìn)誘發(fā)對(duì)給予的抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。相反，高水平的Th2-型細(xì)胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和TNF-β)傾向于促進(jìn)誘發(fā)體液免疫反應(yīng)。在施用如本文所提供的疫苗后，患者維持包括Th1-和Th2-型反應(yīng)在內(nèi)的免疫反應(yīng)。在一個(gè)反應(yīng)主要為T(mén)h1-型反應(yīng)的優(yōu)選的實(shí)施方案中，Th1-型細(xì)胞因子的水平增加至高于Th2-型細(xì)胞因子水平的程度。使用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)試驗(yàn)可以方便地評(píng)價(jià)這些細(xì)胞因子的水平。就對(duì)細(xì)胞因子家族的綜述而言，參見(jiàn)Mosmann和Coffman的《免疫學(xué)回顧年鑒》(Ann.Rev.Immunol.)7145-173，1989。
例如，用于主要引起Th1-型反應(yīng)的優(yōu)選的佐劑包括單磷?；|(zhì)A、優(yōu)選3-脫氧-?；瘑瘟柞；|(zhì)A(3D-MPL)與鋁鹽的組合物。MPL佐劑商購(gòu)自Ribi ImmunoChem Research Inc.(Hamilton，MT；參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,436,727、4,877,611、4,866,034和4,912,094)。另外優(yōu)選的是AS-2(SmithKline Beecham)。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸是未甲基化的)也可誘發(fā)主要為T(mén)h1的反應(yīng)。這類寡核苷酸是眾所周知的且例如描述在WO96/02555中。另一種優(yōu)選的佐劑是皂苷、優(yōu)選QS21，可以單獨(dú)或與其它佐劑一起使用它們。例如，增強(qiáng)的系統(tǒng)包括單磷?；|(zhì)A和皂苷衍生物的組合物、諸如WO94/00153中所述的QS21和3D-MPL的組合物或如WO96/33739中所述用膽固醇驟冷QS21的低反應(yīng)原性組合物。其它優(yōu)選的制劑包括水包油型乳液和生育酚。在水包油型乳液中包括QS21、3D-MPL和生育酚的特別有效的佐劑配方描述在WO95/17210中?？梢允褂卯a(chǎn)生抗原、免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑和合適的載體或賦形劑的組合物的眾所周知的方法制備本文所提供的任意疫苗。
可以將本文所述的組合物作為緩釋制劑(即，諸如在給藥后達(dá)到緩慢釋放化合物目的的膠囊或海綿狀物這樣的制劑)的一部分進(jìn)行給藥。一般可以使用眾所周知的技術(shù)來(lái)制備這類制劑且例如可以通過(guò)口服、直腸或皮下植入或通過(guò)在所需靶位點(diǎn)植入的方式給予它們。緩釋制劑可以含有分散在載體基質(zhì)中和/或包含在控速膜圍繞的儲(chǔ)存器內(nèi)的多肽、多核苷酸或抗體。在這類制劑中使用的載體是生物相容性的且也可以是可生物降解的；優(yōu)選該制劑具有以相對(duì)恒定的水平釋放活性成分的能力。在緩釋制劑中含有的活性化合物的量取決于植入部位、釋放速率和預(yù)計(jì)的釋放期限以及所治療或預(yù)防疾病的性質(zhì)。
可以在藥物組合物和疫苗中使用任意不同的轉(zhuǎn)運(yùn)載體以便有利于產(chǎn)生以腫瘤細(xì)胞為靶的抗原特異性免疫反應(yīng)。轉(zhuǎn)運(yùn)載體包括諸如樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞這樣的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)和可以改造成有效APCs的其它細(xì)胞?？梢缘槐貙?duì)這類細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以便增加呈遞抗原的能力、改善對(duì)T細(xì)胞反應(yīng)的激活和/或維持T細(xì)胞反應(yīng)、本身具有抗腫瘤作用和/或與受體(即配對(duì)的HLA單元型)免疫相容。APCs一般可以分離自任意不同的生物液體和器官(包括腫瘤和腫瘤外圍組織)且可以是自體、同種異體、同源或異源細(xì)胞。
本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施方案使用樹(shù)突細(xì)胞或其祖代細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞。樹(shù)突細(xì)胞是高度有效的APCs(Banchereau和Steinman《自然》(Nature)392245-251，1998)且已經(jīng)證實(shí)它們可有效地作為引起預(yù)防或治療性抗腫瘤免疫性的生理佐劑(參見(jiàn)Timmerman和Levy《藥物回顧年鑒》《Ann.Rev.Med.》50507-529，1999)。一般來(lái)說(shuō)，正如使用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)試驗(yàn)所測(cè)定的，可以以樹(shù)突細(xì)胞的典型形狀(在原位為星狀，具有在體外可見(jiàn)的顯著的胞質(zhì)突(樹(shù)突))為基礎(chǔ)和以缺乏B細(xì)胞(CD19和CD20)、T細(xì)胞(CD3)、單核細(xì)胞(CD14)和天然殺傷細(xì)胞(CD56)的分化標(biāo)記為基礎(chǔ)來(lái)鑒定它。當(dāng)然，可以將樹(shù)突細(xì)胞進(jìn)行改造以便表達(dá)通常不見(jiàn)于體內(nèi)或來(lái)自體內(nèi)的樹(shù)突細(xì)胞上的特異性細(xì)胞表面受體或配體且這類修飾的樹(shù)突細(xì)胞是本發(fā)明所關(guān)注的。作為樹(shù)突細(xì)胞的替代物，可以在疫苗中使用分泌型小泡的承載抗原的樹(shù)突細(xì)胞(稱作外來(lái)體)(參見(jiàn)Zitvogel等人《天然藥物》(Nature Med.)4594-600，1998)。
樹(shù)突細(xì)胞和祖代細(xì)胞可以獲自外周血液、骨髓、腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞、腫瘤外圍組織浸潤(rùn)細(xì)胞、淋巴結(jié)、脾、皮膚、臍帶血或任意其它合適的組織或液體。例如，通過(guò)向采集自外周血液的單核細(xì)胞培養(yǎng)物中添加諸如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFα這樣的細(xì)胞因子的組合物可以使樹(shù)突細(xì)胞從體內(nèi)分化。另一方面，通過(guò)向培養(yǎng)基中添加GM-CSF、IL-13、TNFα、CD40配體、LPS、flt3配體和/或誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞成熟和增殖的其它化合物的組合物可以使采集自外周血液、臍帶血或骨髓的CD34陽(yáng)性細(xì)胞分化成樹(shù)突細(xì)胞。
將樹(shù)突細(xì)胞方便地分類成“未成熟”和“成熟”的細(xì)胞，這要求存在一種用于區(qū)分兩種充分表征的表型的簡(jiǎn)便方式。然而，這種命名法不應(yīng)排除所有可能的分化中間階段。未成熟樹(shù)突細(xì)胞的特征在于APC具有高度攝取抗原并進(jìn)行加工的能力，這一能力與高度表達(dá)Fcγ受體、甘露糖受體和DEC-205標(biāo)記相關(guān)。成熟表型的特征一般在于對(duì)這些標(biāo)記的表達(dá)程度較低、而對(duì)導(dǎo)致T細(xì)胞激活的諸如I和II型MHC、粘附分子(例如CD54和CD11)和共刺激分子(例如CD40、CD80和CD86)這樣的細(xì)胞表面分子的表達(dá)程度較高。
一般可以用編碼卵巢癌抗原(或其部分或其其它變化形式)的多核苷酸轉(zhuǎn)染APCs，使得在細(xì)胞表面上表達(dá)抗原或其免疫原性部分。這類轉(zhuǎn)染過(guò)程可以在體內(nèi)發(fā)生且然后可以將包括這類轉(zhuǎn)染細(xì)胞的組合物或疫苗用于如本文所述的治療目的。另一方面，可以給患者施用靶向樹(shù)突細(xì)胞或其它抗原呈遞細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染在體內(nèi)發(fā)生。例如，一般可以使用諸如WO97/24447中所述的方法或由Mahvi等人在《免疫學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)》(Immunology and Cell Biology)75456-460，1997中所述的基因槍手段這樣的本領(lǐng)域中已知的任意方法在體內(nèi)和從體內(nèi)轉(zhuǎn)染樹(shù)突細(xì)胞。通過(guò)用多肽、DNA(裸或在質(zhì)粒載體內(nèi))或RNA、或用表達(dá)抗原的重組細(xì)菌或病毒(例如牛痘、禽痘、腺病毒或慢病毒屬載體)培養(yǎng)樹(shù)突細(xì)胞或祖代細(xì)胞可以對(duì)樹(shù)突細(xì)胞進(jìn)行抗原承載。在承載前，可以使所述多肽與提供T細(xì)胞輔助作用的免疫配偶體(例如載體分子)共價(jià)綴合。另一方面，可以單獨(dú)或在有所述多肽存在的情況下用非綴合的免疫配偶體對(duì)樹(shù)突細(xì)胞進(jìn)行脈沖。癌癥療法在本發(fā)明的其它方面中，可以將本文所述的組合物用于諸如卵巢癌這樣的癌癥的免疫療法。在這類方法中，一般給患者施用藥物組合物和疫苗。本文所用的“患者”指的是任意溫血?jiǎng)游?、?yōu)選人?；颊呖梢曰加邪┌Y也可以不患癌癥。因此，可以將上述藥物組合物和疫苗用于預(yù)防癌癥的發(fā)生或治療患有癌癥的患者。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，患者患有卵巢癌。可以使用本領(lǐng)域中一般可接受的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)診斷這類癌癥、包括存在的惡性腫瘤?？梢栽谕饪剖中g(shù)摘除原發(fā)性腫瘤和/或諸如給予放療或常規(guī)的化療藥這樣的治療之前或之后給予藥物組合物和疫苗。
在某些實(shí)施方案中，免疫療法可以是主動(dòng)免疫療法，其中治療依賴于體內(nèi)刺激內(nèi)源性宿主免疫系統(tǒng)以便通過(guò)給予改進(jìn)免疫反應(yīng)的活性劑(諸如腫瘤疫苗、細(xì)菌佐劑和/或細(xì)胞因子)對(duì)腫瘤產(chǎn)生反應(yīng)。
在其它實(shí)施方案中，免疫療法可以是被動(dòng)免疫療法，其中治療過(guò)程包括用可直接或間接介導(dǎo)抗腫瘤作用且不必依賴于完整宿主免疫系統(tǒng)的確立的腫瘤免疫反應(yīng)性(諸如效應(yīng)細(xì)胞或抗體)轉(zhuǎn)運(yùn)活性劑的步驟。效應(yīng)細(xì)胞的實(shí)例包括表達(dá)本文所提供的多肽的T淋巴細(xì)胞(諸如CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和CD4+T-輔助腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞)、殺傷細(xì)胞(諸如天然殺傷細(xì)胞和淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞)、B細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(諸如樹(shù)突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)?？梢詫?duì)本文所述多肽具有特異性的T細(xì)胞受體和抗體受體克隆、表達(dá)并轉(zhuǎn)染入用于過(guò)繼免疫療法的其它載體或效應(yīng)細(xì)胞中。還可以將本文所提供的多肽類用于生成用于被動(dòng)免疫療法的抗體或抗獨(dú)特型抗體(如上文所述和美國(guó)專利號(hào)4,918,164中所述)。
一般可以通過(guò)如本文所述在體外生長(zhǎng)而獲得用于過(guò)繼免疫療法的足量的效應(yīng)細(xì)胞。通過(guò)保留體內(nèi)的抗原識(shí)別作用而使單一抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞擴(kuò)充至幾十億總數(shù)的培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域中是眾所周知的。這類體外培養(yǎng)條件一般經(jīng)常在有細(xì)胞因子(諸如IL-2)和非分裂性飼養(yǎng)細(xì)胞存在的情況下應(yīng)用使用抗原的間歇刺激。如上所述，可以將本文所提供的免疫反應(yīng)性多肽類用于使抗原特異性T細(xì)胞培養(yǎng)物快速擴(kuò)充以便生成足夠數(shù)量的用于免疫療法細(xì)胞。特別地，可以用免疫反應(yīng)性多肽類將諸如樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或B細(xì)胞這樣的抗原呈遞細(xì)胞進(jìn)行脈沖或使用本領(lǐng)域中眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用一種或多種多核苷酸轉(zhuǎn)染它們。例如，可以用帶有適合于增加重組病毒或其它表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)的啟動(dòng)子的多核苷酸轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞。用于療法的所培養(yǎng)的效應(yīng)細(xì)胞必須能夠生長(zhǎng)并廣泛分布且在體內(nèi)長(zhǎng)期存活。研究已經(jīng)證實(shí)通過(guò)用補(bǔ)充了IL-2的抗原反復(fù)刺激可以誘導(dǎo)所培養(yǎng)的效應(yīng)細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)并以基本數(shù)量長(zhǎng)期存活(例如，參見(jiàn)Cheever等人，《免疫回顧》(Immunological Reviews)157；177，1997)。
另一方面，可以將表達(dá)本文所述的多肽的載體引入取自患者的干細(xì)胞并在體外以克隆方式增殖而用于自體移植回同一患者。
給藥途徑和頻率以及劑量將根據(jù)個(gè)體與個(gè)體的差異而改變且可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)方便地確定。一般來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)注射(例如皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)、經(jīng)鼻內(nèi)(例如通過(guò)吸入)、口服或在切除腫瘤的部位給予所述的藥物組合物和疫苗。優(yōu)選可以在52周的期限內(nèi)給予1-10次劑量。優(yōu)選以1個(gè)月的間隔給予6次劑量且可以在此后定期給予加強(qiáng)接種。替代方案可能適合于個(gè)別的患者。當(dāng)如上所述給藥時(shí)，合適的劑量是能夠促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)的化合物的量且至少高于基礎(chǔ)(即未治療的)水平10-50％?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)定患者體內(nèi)的抗腫瘤抗體或通過(guò)能夠殺傷體外患者腫瘤細(xì)胞的溶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞的疫苗依賴性產(chǎn)生來(lái)監(jiān)測(cè)這類反應(yīng)。這類疫苗也應(yīng)能夠產(chǎn)生免疫反應(yīng)，這種免疫反應(yīng)導(dǎo)致接種疫苗的患者比未接種疫苗的患者的臨床結(jié)果改善(例如更快的緩解、完全或部分或較長(zhǎng)的不帶病的存活)。一般來(lái)說(shuō)，就包括一種或多種多肽類的藥物組合物和疫苗而言，存在于劑量中的各多肽的量在約100μg-5mg/kg宿主的范圍。合適的劑量大小將根據(jù)患者的身材而改變，不過(guò)一般在約0.1mL-約5mL的范圍。
一般來(lái)說(shuō)，適宜的劑量和治療方案提供了足以達(dá)到治療和/或預(yù)防有益效果量的活性化合物?？梢酝ㄟ^(guò)確定治療患者與未治療患者相比較改善的臨床結(jié)果(例如更快的緩解、完全或部分或較長(zhǎng)的不帶病的存活)來(lái)監(jiān)測(cè)這類反應(yīng)。預(yù)先存在的對(duì)卵巢癌抗原的免疫反應(yīng)的增加通常與改善的臨床結(jié)果相關(guān)。一般可以使用標(biāo)準(zhǔn)增殖、細(xì)胞毒性或細(xì)胞因子檢測(cè)試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)這類免疫反應(yīng)，所述的檢測(cè)試驗(yàn)使用治療前和治療后獲自患者的樣品來(lái)進(jìn)行。用于鑒定分泌的卵巢癌抗原的篩選本發(fā)明提供了用于鑒定分泌的腫瘤抗原的方法。在這類方法中，將腫瘤植入諸如SCID小鼠這樣的免疫缺陷型動(dòng)物并維持足以使腫瘤抗原分泌入血清的時(shí)間。一般來(lái)說(shuō)，可以將腫瘤經(jīng)皮下植入免疫缺陷型動(dòng)物或植入免疫缺陷型動(dòng)物的生殖腺脂墊內(nèi)并維持1-9個(gè)月、優(yōu)選1-4個(gè)月。一般可以如WO97/18300中所述進(jìn)行植入。然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)且如本文所述將含有分泌抗原的血清用于制備免疫活性小鼠體內(nèi)的抗血清。簡(jiǎn)單地說(shuō)，可以將50-100μL血清(收集自三組免疫缺陷型小鼠，各組帶有不同SCID-衍生的人卵巢腫瘤)按1∶1(vol∶vol)與諸如RIBI－MPL或MPL＋TDM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)這樣合適的佐劑混合并按每月一次的間隔經(jīng)腹膜內(nèi)注入同源免疫活性動(dòng)物、總計(jì)5個(gè)月。通過(guò)在第三次、第四次和第五次免疫接種后取血可以從以這類方式免疫接種的動(dòng)物體內(nèi)獲得抗血清。一般將所得的抗血清預(yù)先清除大腸桿菌和噬菌體抗原并用于(一般在諸如1∶200這樣的稀釋后使用)血清學(xué)表達(dá)篩選。
文庫(kù)一般是一種含有來(lái)自植入SCID小鼠類型的一種或多種腫瘤的cDNAs的表達(dá)文庫(kù)?？梢杂弥T如λ-篩選(Novagen)這樣的任意合適的載體制備這種表達(dá)文庫(kù)?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定編碼與抗血清反應(yīng)的多肽的cDNAs并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序?？梢赃M(jìn)一步表征這類cDNA分子以便評(píng)價(jià)在腫瘤和正常組織中的表達(dá)情況并評(píng)價(jià)患者體內(nèi)抗原的分泌情況。
本文所提供的方法具有超過(guò)發(fā)現(xiàn)腫瘤抗原的其它方法的優(yōu)點(diǎn)。特別地，由這類方法鑒定的所有抗原應(yīng)通過(guò)腫瘤細(xì)胞的壞死而分泌或釋放。這類抗原可以在腫瘤細(xì)胞表面呈遞一定的時(shí)間，這一時(shí)間足以在免疫接種后通過(guò)免疫系統(tǒng)起到靶向和殺傷作用。用于檢測(cè)癌癥的方法一般來(lái)說(shuō)，可以以獲自患者的生物樣品(諸如血液、血清、尿和/或腫瘤活檢組織)中存在的一種或多種卵巢癌蛋白質(zhì)和/或編碼這類蛋白質(zhì)的多核苷酸為基礎(chǔ)檢測(cè)患者體內(nèi)的癌癥。換句話說(shuō)，可以將這類蛋白質(zhì)用作標(biāo)記以便指示存在或不存在諸如卵巢癌這樣的癌癥。此外，可以將這類蛋白質(zhì)用于檢測(cè)其它癌癥。一般本文提供的結(jié)合劑可檢測(cè)與生物樣品中活性劑結(jié)合的蛋白質(zhì)的水平?？梢詫⒍嗪塑账嵋锖吞结樣糜跈z測(cè)編碼腫瘤蛋白質(zhì)的mRNA的水平，它也可指示存在或不存在癌癥。一般來(lái)說(shuō)，與卵巢癌相關(guān)的序列應(yīng)以在腫瘤組織中比在正常組織中至少高3倍的水平存在。
就使用結(jié)合劑檢測(cè)樣品中的多肽標(biāo)記而言，存在各種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的測(cè)定方式。例如，參見(jiàn)Harlow和Lane的《抗體》(Antibodies)“實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(A Laboratory Manual)，美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold SpringHarbor Laboratory)，1988。一般來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)下列步驟確定患者體內(nèi)存在或不存在癌癥(a)使獲自患者的生物樣品與結(jié)合劑接觸；(b)在該樣品中檢測(cè)與結(jié)合劑結(jié)合的多肽的水平；和(c)比較多肽水平與預(yù)定的截?cái)嘀怠?br> 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，測(cè)定包括使用固定在固體支持物上的結(jié)合劑以便結(jié)合多肽并從樣品剩余部分中除去多肽的步驟。然后可以使用含有報(bào)道基團(tuán)并特異性結(jié)合到結(jié)合劑/多肽復(fù)合物上的檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)合的多肽。例如，這類檢測(cè)試劑可以包括特異性結(jié)合多肽的結(jié)合劑或抗體或特異性結(jié)合該結(jié)合劑的其它活性劑諸如抗免疫球蛋白、蛋白質(zhì)G、蛋白質(zhì)A或凝集素。另一方面，可以使用競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定，其中用報(bào)道基團(tuán)標(biāo)記多肽并在用樣品培養(yǎng)結(jié)合劑后使之與固定化結(jié)合劑結(jié)合。樣品中成分抑制標(biāo)記的多肽與結(jié)合劑結(jié)合的程度表示含有固定化結(jié)合劑的樣品的反應(yīng)性。用于這類檢測(cè)試驗(yàn)中的合適的多肽類包括如上所述的全長(zhǎng)卵巢癌蛋白質(zhì)及其結(jié)合劑結(jié)合的部分。
固體支持物可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的腫瘤蛋白質(zhì)可以與之結(jié)合的任意物質(zhì)。例如，固體支持物可以是微量滴定平板或硝化纖維素或其它合適的膜中的檢測(cè)孔。另一方面，所述的支持物可以是諸如玻璃、玻璃纖維、膠乳這樣的珠或盤(pán)或諸如聚苯乙烯或聚氯乙烯這樣的塑料物質(zhì)。所述的支持物還可以是諸如那些公開(kāi)在例如美國(guó)專利號(hào)5,359,681中的磁粉或纖維光學(xué)傳感器?？梢允褂贸浞置枋鲈趯＠涂茖W(xué)文獻(xiàn)中的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)將結(jié)合劑固定在固體支持物上。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“固定化”指的是諸如吸附這樣的非共價(jià)結(jié)合和共價(jià)結(jié)合(可以是活性劑與支持物上官能基之間的直接連接或可以是通過(guò)交聯(lián)劑的連接)。優(yōu)選通過(guò)吸附到微量滴定平板中的孔或膜上的固定化。在這樣的情況下，通過(guò)使結(jié)合劑在一種合適的緩沖液中與固體支持物接觸合適的時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)吸附。時(shí)間隨溫度而改變，但一般在約1小時(shí)至約1天。一般來(lái)說(shuō)，接觸塑料微量滴定平板(諸如聚苯乙烯或聚氯乙烯)孔與約10ng-約10μg且優(yōu)選約100ng-約1μg量的結(jié)合劑接觸足以固定適當(dāng)量的結(jié)合劑。
一般可以通過(guò)首先使支持物和將與該支持物和結(jié)合劑上諸如羥基或氨基這樣的官能基反應(yīng)的雙功能試劑反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)結(jié)合劑與固體支持物的共價(jià)結(jié)合。例如，可以使用苯并喹啉或通過(guò)用結(jié)合配偶體上的胺和活性氫縮合支持物上的醛基使結(jié)合劑與帶有合適的聚合物涂層的支持物共價(jià)結(jié)合(例如，參見(jiàn)Pierce的《免疫技術(shù)目錄與手冊(cè)》(ImmunotechnologyCatalog and Handbook)，1991的A12-A13)。
在某些實(shí)施方案中，測(cè)定是雙抗體夾層測(cè)定。本測(cè)定通過(guò)首先使已經(jīng)固定在通常為微量滴定平板的孔的固體支持物上的抗體與樣品接觸來(lái)進(jìn)行，使得樣品中的多肽能夠與固定化抗體結(jié)合。然后從固定化多肽-抗體復(fù)合物中除去未結(jié)合的樣品并加入含有報(bào)道基團(tuán)的檢測(cè)試劑(優(yōu)選能夠與多肽上的不同位點(diǎn)結(jié)合的第二種抗體)。接著使用適合于特異性報(bào)道基團(tuán)的方法測(cè)定保持與固體支持物結(jié)合的檢測(cè)試劑的量。
更具體地說(shuō)，一旦如上所述將抗體固定在支持物上，則支持物上的剩余蛋白質(zhì)已合位點(diǎn)一般被阻斷。任何合適的阻斷劑對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的，諸如牛血清白蛋白或Tween 20TM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。然后用樣品培養(yǎng)固定化抗體并使所述多肽與該抗體結(jié)合。在培養(yǎng)前可以將該樣品用諸如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)這樣合適的稀釋劑稀釋。一般來(lái)說(shuō)，合適的接觸時(shí)間(即培養(yǎng)時(shí)間)是足以檢測(cè)多肽在獲自患卵巢癌個(gè)體的樣品中的存在的多肽的時(shí)間期限。優(yōu)選的接觸時(shí)間足以實(shí)現(xiàn)在結(jié)合與未結(jié)合多肽之間達(dá)到至少約95％的平衡的結(jié)合水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到通過(guò)檢測(cè)一定時(shí)間期限內(nèi)發(fā)生的結(jié)合水平可以方便地測(cè)定達(dá)到平衡所必需的時(shí)間。在室溫下，培養(yǎng)約30分鐘的時(shí)間一般是足夠的。
然后通過(guò)用諸如含有0.1％Tween 20TM的PBS這樣合適的緩沖液洗滌固體支持物而除去未結(jié)合的樣品。接著將含有報(bào)道基團(tuán)的第二種抗體加入到固體支持物中。優(yōu)選的報(bào)道基團(tuán)包括如上所述的那些基團(tuán)。
然后用固定化抗體-多肽復(fù)合物將檢測(cè)試劑培養(yǎng)足以檢測(cè)結(jié)合多肽的時(shí)間期限。一般可以通過(guò)檢測(cè)在一定時(shí)間期限內(nèi)發(fā)生的結(jié)合水平來(lái)測(cè)定合適的時(shí)間期限。接著將未結(jié)合的檢測(cè)試劑除去并使用報(bào)道基團(tuán)檢測(cè)結(jié)合的檢測(cè)試劑。用于檢測(cè)報(bào)道基團(tuán)的方法取決于報(bào)道基團(tuán)的性質(zhì)。就放射性基團(tuán)而言，一般合適的是閃爍計(jì)數(shù)法或放射自顯影法?？梢詫⒐庾V法用于檢測(cè)染料、發(fā)光基團(tuán)和熒光基團(tuán)?？梢允褂每股锼氐鞍讬z測(cè)生物素、使其與不同的報(bào)道基團(tuán)(通常是放射性或熒光基團(tuán)或酶)偶聯(lián)。一般可以通過(guò)添加底物(一般持續(xù)特定的時(shí)間期限)、隨后對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行光譜或其它分析來(lái)檢測(cè)酶報(bào)道基團(tuán)。
為了確定存在或不存在諸如卵巢癌這樣的癌癥，一般將由保持與固體支持物結(jié)合的報(bào)道基團(tuán)檢測(cè)的信號(hào)與符合預(yù)定截?cái)嘀档男盘?hào)進(jìn)行比較。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于檢測(cè)癌癥的截?cái)嘀凳怯脕?lái)自未患癌癥患者的樣品培養(yǎng)固定化抗體時(shí)獲得的信號(hào)平均值。一般來(lái)說(shuō)，將產(chǎn)生三種預(yù)定截?cái)嘀狄陨系臉?biāo)準(zhǔn)偏差的信號(hào)的樣品看作是癌癥的陽(yáng)性信號(hào)。在可替代的優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用Receiver Operator Curve、按照Sackett等人在《臨床流行病學(xué)》(Clinical Epidemiology)“臨床醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)科學(xué)”(A Basic Science for Clinical Medicine)，LittleBrown and Co.，1985，p.106-7中所述的方法來(lái)測(cè)定所述的截?cái)嘀怠：?jiǎn)單地說(shuō)，在本實(shí)施方案中，可以根據(jù)符合診斷試驗(yàn)結(jié)果的各種可能的截?cái)嘀档恼鎸?shí)陽(yáng)性率(即敏感性)和假陽(yáng)性率(100％-特異性)的配對(duì)圖來(lái)測(cè)定截?cái)嘀?。圖上最接近左上角的截?cái)嘀?即包圍最大面積的值)是最準(zhǔn)確的截?cái)嘀登铱梢詫a(chǎn)生高于通過(guò)本方法測(cè)定的截?cái)嘀档男盘?hào)的樣品看作是陽(yáng)性的。另一方面，截?cái)嘀悼梢匝貓D向左移動(dòng)而將假陽(yáng)性率減小到最低限度或向右移動(dòng)以便將假陰性率減小到最低限度。一般來(lái)說(shuō)，將產(chǎn)生高于通過(guò)本方法測(cè)定的截?cái)嘀档男盘?hào)的樣品看作是癌癥陽(yáng)性的。
在一個(gè)所涉及的實(shí)施方案中，測(cè)定可以以一種流通或帶狀試驗(yàn)形式進(jìn)行，其中將結(jié)合劑固定在諸如硝化纖維素這樣的膜上。在流通試驗(yàn)中，當(dāng)樣品通過(guò)膜時(shí)，樣品中的多肽與固定化結(jié)合劑結(jié)合。接著當(dāng)含有第二種結(jié)合劑的溶液流過(guò)膜時(shí)，第二種標(biāo)記的結(jié)合劑與結(jié)合劑-多肽復(fù)合物結(jié)合。接著如上所述檢測(cè)結(jié)合的第二種結(jié)合劑。在帶狀試驗(yàn)形式中，將與結(jié)合劑結(jié)合的膜的一端浸入含有樣品的溶液。樣品沿膜遷移過(guò)含有第二種結(jié)合劑的區(qū)并到達(dá)固定化結(jié)合劑的區(qū)域。第二種結(jié)合劑集中在固定化抗體區(qū)域表示存在癌癥。一般來(lái)說(shuō)，第二種結(jié)合劑集中在該部位產(chǎn)生一種可以目測(cè)讀取的圖形諸如線條。沒(méi)有這類圖形表示陰性結(jié)果。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)生物樣品含有足以在上述形式的雙抗體夾層測(cè)定中產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)的多肽量時(shí)，對(duì)固定在膜上的結(jié)合劑的量進(jìn)行選擇以便產(chǎn)生可目測(cè)辨別的圖形。用于這類測(cè)定的優(yōu)選的結(jié)合劑是抗體及其抗原結(jié)合片段。優(yōu)選固定在膜上的抗體的量在約25ng-約1μg且更優(yōu)選在約50ng-約500ng的范圍。一般可以使用極小量的生物樣品來(lái)進(jìn)行這類試驗(yàn)。
當(dāng)然，存在適用于本發(fā)明腫瘤蛋白質(zhì)或結(jié)合劑的大量其它的測(cè)定方案。上述描述僅是典型的。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以方便地修改上述方案以便使用卵巢癌多肽檢測(cè)與生物樣品中的這類多肽結(jié)合的抗體。對(duì)這類卵巢癌蛋白質(zhì)特異性抗體的檢測(cè)可能與存在癌癥相關(guān)。
還可以或另一方面以存在的與生物樣品中的卵巢癌蛋白質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)的T細(xì)胞為基礎(chǔ)檢測(cè)癌癥。在某些方法中，用卵巢癌蛋白質(zhì)、編碼這類多肽的多核苷酸和/或表達(dá)至少一種這類多肽的免疫原性部分的APC培養(yǎng)包括分離自患者的CD4+和/或CD8+T細(xì)胞的生物樣品并檢測(cè)存在或不存在T細(xì)胞的特異性激活。合適的生物樣品包括但不限于分離的T細(xì)胞。例如，可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)從患者體內(nèi)分離T細(xì)胞(諸如通過(guò)對(duì)外周血液淋巴細(xì)胞進(jìn)行Ficoll/Hypaque密度梯度離心)。在37℃下，可以在體外用卵巢癌蛋白質(zhì)(例如5-25μg/ml)將T細(xì)胞培養(yǎng)2-9天(一般為4天)。需要在沒(méi)有卵巢癌蛋白質(zhì)存在的情況下培養(yǎng)T細(xì)胞樣品的另一等分試樣用作對(duì)照。就CD4+T細(xì)胞而言，優(yōu)選通過(guò)評(píng)價(jià)T細(xì)胞的增殖來(lái)檢測(cè)激活情況。就CD8+T細(xì)胞而言，優(yōu)選通過(guò)評(píng)價(jià)溶細(xì)胞活性來(lái)檢測(cè)激活情況。增殖水平至少高于未患病患者2倍和/或溶細(xì)胞活性水平至少高于未患病患者20％表示患者體內(nèi)存在癌癥。
如上所述，還可以或另一方面以編碼生物樣品中的卵巢癌蛋白質(zhì)的mRNA水平為基礎(chǔ)檢測(cè)癌癥。例如，可以將至少兩種寡核苷酸引物用于以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的測(cè)定以便擴(kuò)增來(lái)源于生物樣品的卵巢癌蛋白質(zhì)cDNA的一部分，其中至少一種寡核苷酸引物對(duì)編碼卵巢癌蛋白質(zhì)的多核苷酸具有特異性(即與之雜交)。然后使用諸如凝膠電泳這樣的本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)分離并檢測(cè)擴(kuò)增的cDNA。類似地，可以將與編碼卵巢癌蛋白質(zhì)的多核苷酸特異性雜交的寡核苷酸探針用于雜交測(cè)定以便檢測(cè)生物樣品中存在的編碼腫瘤蛋白質(zhì)的多核苷酸。
為了在測(cè)定條件下進(jìn)行雜交，寡核苷酸引物和探針應(yīng)包括與編碼至少10個(gè)核苷酸、且優(yōu)選至少20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的卵巢癌蛋白質(zhì)的多核苷酸的一部分具有至少約60％、優(yōu)選至少約75％且更優(yōu)選至少約90％同一性的寡核苷酸序列。優(yōu)選寡核苷酸引物和/或探針如上所述的，在中等嚴(yán)格條件下與編碼本文所述的多肽的多核苷酸雜交?？捎杏玫赜糜诒疚乃鲈\斷方法的寡核苷酸引物和/或探針優(yōu)選至少具有10-40個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的寡核苷酸引物包括具有本文所提供序列的至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸、更優(yōu)選至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸的DNA分子。用于以PCR為基礎(chǔ)的測(cè)定和雜交測(cè)定的技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的(例如，參見(jiàn)Mullis等人在美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring Harbor)的《數(shù)量生物學(xué)專題論叢》(Symp.Quant.Biol.)51263，1987；Erlich編輯《PCR技術(shù)》(PCR Technology)，Stockton Press，NY，1989中所述)。
一種優(yōu)選的測(cè)定使用RT-PCR，其中將PCR與反轉(zhuǎn)錄聯(lián)用。一般來(lái)說(shuō)，RNA提取自諸如活檢組織這樣的生物樣品且將其反轉(zhuǎn)錄以便產(chǎn)生cDNA分子。使用至少一種特異性引物的PCR擴(kuò)增生成cDNA分子，例如，可以使用凝膠電泳將其分離并觀察?？梢詫?duì)取自試驗(yàn)患者和來(lái)自未患癌癥的個(gè)體的生物樣品進(jìn)行擴(kuò)增?？梢詫?duì)跨度為兩個(gè)數(shù)量級(jí)的cDNA的幾種稀釋液進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。一般將在試驗(yàn)患者樣品的幾種稀釋液中的表達(dá)比非癌癥樣品的相同稀釋液中的表達(dá)提高2倍或2倍以上的情況看作陽(yáng)性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將編碼這類蛋白質(zhì)的卵巢癌蛋白質(zhì)和多核苷酸用作監(jiān)測(cè)癌癥的進(jìn)展的標(biāo)記。在本實(shí)施方案中，可以在一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行如上所述用于癌癥診斷的測(cè)定并評(píng)價(jià)反應(yīng)性多肽水平上的改變。例如，可以將本測(cè)定每24-72小時(shí)進(jìn)行一次、持續(xù)6個(gè)月至1年的期限且此后根據(jù)需要進(jìn)行。一般來(lái)說(shuō)，癌癥在那些由結(jié)合劑所檢測(cè)的多肽水平在增加一段時(shí)間內(nèi)的患者中有發(fā)展。相反，當(dāng)反應(yīng)性多肽水平隨時(shí)間保持恒定或減少時(shí)，癌癥沒(méi)有發(fā)展。
可以直接對(duì)腫瘤進(jìn)行某些體內(nèi)診斷測(cè)定。一種這樣的測(cè)定包括使腫瘤細(xì)胞與結(jié)合劑接觸的步驟。然后可以通過(guò)報(bào)道基團(tuán)直接或間接檢測(cè)所結(jié)合的結(jié)合劑。還可以將這類結(jié)合劑用于組織學(xué)應(yīng)用。另一方面，可以在這類應(yīng)用中使用多核苷酸探針。
如上所述，為了改善敏感性，可以在給定的樣品中檢測(cè)多個(gè)卵巢癌蛋白質(zhì)標(biāo)記。顯然可以在單一測(cè)定中合并使用對(duì)本文提供的不同蛋白質(zhì)具有特異性的結(jié)合劑。此外，可以同時(shí)使用多個(gè)引物或探針?？梢砸猿Ｒ?guī)實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)選擇腫瘤蛋白質(zhì)標(biāo)記以便確定產(chǎn)生最佳敏感性的組合。此外或另一方面，可以將用于本文提供的腫瘤蛋白質(zhì)的測(cè)定與用于其它已知腫瘤抗原的測(cè)定相結(jié)合。診斷試劑盒本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于上述任意診斷方法的試劑盒。這類試劑盒一般包括進(jìn)行診斷測(cè)定所必需的兩種或多種成分。成分可以是化合物、試劑、容器和/或器械。例如，試劑盒內(nèi)的一種容器中可以含有與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的單克隆抗體或其片段。可以如上所述將這類抗體或片段附著到固體物質(zhì)上。一種或多種另外的容器中可以裝有諸如試劑或緩沖液這樣的用于測(cè)定的成分。這類試劑盒還可以或另一方面含有如上所述的檢測(cè)試劑，該檢測(cè)試劑含有適合于直接或間接檢測(cè)抗體結(jié)合情況的報(bào)道基團(tuán)。
另一方面，可以將試劑盒設(shè)計(jì)成可檢測(cè)編碼生物樣品中卵巢癌蛋白質(zhì)的mRNA的水平。這類試劑盒一般包括至少一種如上所述的寡核苷酸探針或引物，它們與編碼卵巢癌蛋白質(zhì)的多核苷酸雜交。例如，可以在PCR或雜交測(cè)定中使用這類寡核苷酸。可以存在于這類試劑盒中的附加成分包括第二種寡核苷酸和/或診斷試劑或容器以有利于檢測(cè)編碼卵巢癌蛋白質(zhì)的多核苷酸。
提供下列實(shí)施例是為了說(shuō)明而非限定的目的。
實(shí)施例實(shí)施例1有代表性卵巢癌蛋白質(zhì)cDNAs的鑒定本實(shí)施例解釋了編碼卵巢癌蛋白質(zhì)的cDNA分子的鑒定。
將抗-SCID小鼠血清(對(duì)來(lái)自攜帶晚期傳代卵巢癌的SCID小鼠的血清產(chǎn)生的)預(yù)清除大腸桿菌和噬菌體抗原并以1∶200的稀釋度用于血清學(xué)表達(dá)篩選中。使用定向RH寡脫氧胸苷引導(dǎo)的cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒和λScreen載體(Novagen)由SCID-衍生的人卵巢腫瘤(OV9334)制成所篩選的文庫(kù)。使用噬菌體λ篩選。篩選了約400,000pfu的擴(kuò)增的OV9334文庫(kù)。
分離196個(gè)陽(yáng)性克隆。附圖1A-1S和SEQ ID NOs1-71中提供了某些看起來(lái)是新的序列。三種完全的插入序列如附圖2A-2C中所示(SEQ IDNOs72-74)。附圖15A-15EEE中提供了具有已知序列的其它克隆(SEQ IDNOs82-310)。數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定了下列基本上與附圖15A-15EEE中提供的序列相同的序列。
使用顯微排列技術(shù)進(jìn)一步表征這些克隆以便測(cè)定不同腫瘤和正常組織內(nèi)mRNA的表達(dá)水平。使用Synteni(Palo Alto，CA)顯微排列、按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行了這類分析。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物排列在載物片上，其中各產(chǎn)物在排列中具有唯一的位置。mRNA提取自所檢測(cè)的組織樣品、將其反轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生熒光標(biāo)記的cDNA探針。用標(biāo)記的cDNA探針探測(cè)顯微排列并掃描載物片以便測(cè)定熒光強(qiáng)度。使用Synteni氏提供的GEMtools軟件分析數(shù)據(jù)。一種克隆(13695、也稱作08E)的結(jié)果如附圖3中所示。實(shí)施例2使用顯微排列技術(shù)鑒定卵巢癌cDNAs本實(shí)施例解釋了通過(guò)PCR扣除和顯微排列分析來(lái)鑒定卵巢癌多核苷酸。使用Synteni(Palo Alto，CA)顯微排列、按照制造商的說(shuō)明(且基本上如Schena等人在《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9310614-10619，1996和Heller等人在《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)942150-2155，1997中所述)來(lái)分析cDNAs顯微排列的卵巢癌腫瘤特異性表達(dá)。
使用包括四種卵巢腫瘤(它們中的三種是轉(zhuǎn)移瘤)的cDNA的試驗(yàn)者和cDNA型五種正常組織(腎上腺、肺、胰腺、脾和腦)的驅(qū)動(dòng)者來(lái)進(jìn)行PCR扣除。對(duì)從這種扣除中回收的cDNA片段進(jìn)行DNA顯微排列分析，其中將所述片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增、粘附到嵌片上并與來(lái)源于人卵巢腫瘤和不同正常人組織的mRNAs的熒光標(biāo)記探針雜交。在這種分析中，掃描載物片并測(cè)定熒光強(qiáng)度且使用Synteni的GEMtools軟件分析數(shù)據(jù)。一般來(lái)說(shuō)，將在腫瘤細(xì)胞中顯示出表達(dá)至少增加5倍(相對(duì)于正常細(xì)胞而言)的序列看作卵巢腫瘤抗原。分析熒光結(jié)果并通過(guò)DNA測(cè)序和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索以便確定所述序列的新穎性而進(jìn)一步表征卵巢腫瘤中顯示出表達(dá)增加的克隆。
使用這類測(cè)定法鑒定了屬于人T-細(xì)胞白血病I型病毒癌蛋白質(zhì)TAX(參見(jiàn)Jin等人，《細(xì)胞》(Cell)9381-91，1998)與稱作骨粘連蛋白的胞外基質(zhì)蛋白之間的剪接融合體的卵巢腫瘤抗原。剪接點(diǎn)序列存在于融合點(diǎn)上。附圖4和SEQ ID NO75中提供了這種克隆的序列。還從這類測(cè)定法中獨(dú)立地鑒定了未剪接和未改變的骨粘連蛋白。
將由本方法鑒定的其它克隆在本文中稱作3f、6b、8e、8h、12c和12h。這些克隆的序列如附圖5-9和SEQ ID NOs76-81中所示。如上所述進(jìn)行顯微排列分析并如附圖10-14中所示。通過(guò)篩選卵巢腫瘤(SCID-衍生的)cDNA文庫(kù)而獲得包括克隆3f、6b、8e和12h的全長(zhǎng)序列。這種2996個(gè)堿基對(duì)的序列(命名為0772P)如SEQ ID NO311中所示且編碼的914個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO312中所示。PSORT分析表明1a型跨膜蛋白位于漿膜上。除上述序列中的某些外，這種篩選鑒定了下列序列



這種篩選進(jìn)一步鑒定了本文稱作21013、21003和21008的克隆0772P的多種形式。PSORT分析表明21003(SEQ ID NO386；翻譯成SEQ ID NO389)和21008(SEQ ID NO387；翻譯成SEQ ID NO390)代表0772P的1a型跨膜蛋白形式。21013(SEQ ID NO385；翻譯成SEQ ID NO388)看起來(lái)是該蛋白質(zhì)的截短形式且通過(guò)PSORT分析將其推斷為分泌性蛋白。
另外的序列分析產(chǎn)生了08E的全長(zhǎng)克隆(2627bp，與諾慎分析觀察到的信息大小一致；SEQ ID NO391)。如下獲得了這種核苷酸序列發(fā)現(xiàn)原始08E序列(Orig08Econs)與來(lái)自EST克隆(IMAGE#1987589)的序列有33個(gè)核苷酸重疊。這種克隆在原始08E序列的上游提供了1042個(gè)另外的核苷酸。對(duì)唯一EST和08E序列(ESTx08EPCR)使用引物、通過(guò)對(duì)由卵巢原發(fā)性腫瘤文庫(kù)產(chǎn)生的多個(gè)PCR片段進(jìn)行測(cè)序證實(shí)了EST與08E之間的連接鍵。當(dāng)錨式PCR從卵巢腫瘤文庫(kù)中產(chǎn)生全部終止于推定起始甲硫氨酸上游的幾種克隆(錨式PCRcons)、而沒(méi)有產(chǎn)生任何另外的序列信息時(shí)，進(jìn)一步證實(shí)了全長(zhǎng)情形。附圖16表示說(shuō)明全長(zhǎng)08E序列中各部分序列位置的示意圖。
可以由全長(zhǎng)08E序列翻譯兩種蛋白質(zhì)序列。就“a”(SEQ ID NO393)而言，它開(kāi)始于推定的起始甲硫氨酸。第二種形式“b”(SEQ ID NO392)包括核苷酸序列5’端的27個(gè)另外的上游殘基。
盡管本文已經(jīng)為解釋目的描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但是顯然可以根據(jù)以上描述對(duì)其進(jìn)行各種修改而不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。因此，除所附的權(quán)利要求外，它們并不用來(lái)限定本發(fā)明。序列表概括SEQ ID NOs1-71是附圖1A-1S中所示的卵巢癌抗原多核苷酸。
SEQ ID NOs72-74是附圖2A-2C中所示的卵巢癌抗原多核苷酸。
SEQ ID NO75是卵巢癌多核苷酸3g(附圖4)。
SEQ ID NO76是卵巢癌多核苷酸3f(附圖5)。
SEQ ID NO77是卵巢癌多核苷酸6b(附圖6)。
SEQ ID NO78是卵巢癌多核苷酸8e(附圖7A)。
SEQ ID NO79是卵巢癌多核苷酸8h(附圖7B)。
SEQ ID NO80是卵巢癌多核苷酸12e(附圖8)。
SEQ ID NO81是卵巢癌多核苷酸12h(附圖9)。
SEQ ID NOs82-310是15A-15EEE中所示的卵巢癌抗原多核苷酸。
SEQ ID NO311是卵巢癌多核苷酸0772P的全長(zhǎng)序列。
SEQ ID NO312是0772P氨基酸序列。
SEQ ID NOs313-384是卵巢癌抗原多核苷酸。
SEQ ID NOs385-390代表0772P形式的序列。
SEQ ID NO391是卵巢癌多核苷酸08E的全長(zhǎng)序列。
SEQ ID NOs392-393是由08E編碼的蛋白質(zhì)序列。
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，它包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與抗原特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組(a)以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(b)上述多核苷酸的互補(bǔ)物。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述的多肽包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組(a)以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(b)這類多核苷酸的互補(bǔ)物。
3.一種編碼權(quán)利要求1所述多肽中至少5個(gè)氨基酸殘基的分離的多核苷酸，該多核苷酸包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與抗原特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組(a)以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(b)上述多核苷酸的互補(bǔ)物。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其中所述的多核苷酸編碼所述多肽的免疫原性部分。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包括以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387、391中任意一種描述的序列或任意上述序列的互補(bǔ)物。
6.一種與權(quán)利要求3所述多核苷酸互補(bǔ)的分離的多核苷酸。
7.一種包括權(quán)利要求3或權(quán)利要求6的多核苷酸的表達(dá)載體。
8.一種用權(quán)利要求7的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
9.一種包括權(quán)利要求1的多肽和生理上可接受的載體的藥物組合物。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中所述的多肽包括由一種多核苷酸編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸包括以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一種描述的序列。
11.一種包括權(quán)利要求1的多肽和一種非特異性免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑的疫苗。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗，其中所述的多肽包括由一種多核苷酸編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸包括以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一種描述的序列。
13.一種藥物組合物，它包括(a)一種編碼卵巢癌多肽的多核苷酸，其中所述的多肽包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與抗原特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列的組(i)以SEQ ID NOs1-81、319-331、359、385-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互補(bǔ)物；以及(b)一種生理上可接受的載體。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述的多核苷酸包括以SEQ ID NOs1-81、319-331、359、385-387、391中任意一種描述的序列或任意上述序列的互補(bǔ)物。
15.一種疫苗，它包括(a)一種編碼卵巢癌多肽的多核苷酸，其中所述的多肽包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與抗原特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組(i)以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互補(bǔ)物；以及(b)一種非特異性免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑。
16.一種根據(jù)權(quán)利要求15所述的疫苗，其中所述的多核苷酸包括以SEQID NOs1-81、319-331、359、385-387或391中任意一種描述的序列。
17.一種藥物組合物，它包括(a)一種與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體，其中所述的卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列的組(i)以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互補(bǔ)物；以及(b)一種生理上可接受的載體。
18.一種用于抑制患者體內(nèi)卵巢癌發(fā)生的方法，該方法包括給患者施用有效量的活性劑和由此抑制患者體內(nèi)卵巢癌發(fā)生的步驟，所述的活性劑選自下列物質(zhì)組成的組(a)一種卵巢癌多肽，它包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與抗原特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(ii)這類多核苷酸的互補(bǔ)物；(b)一種編碼如(a)中所述的多肽的多核苷酸；以及(c)一種與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體，所述的卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(ii)這類多核苷酸的互補(bǔ)物。
19.一種根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的活性劑存在于權(quán)利要求9、13或17中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物內(nèi)。
20.一種根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的活性劑存在于權(quán)利要求11、15或18中任意一項(xiàng)所述的疫苗內(nèi)。
21.一種包括至少一種權(quán)利要求1的多肽的融合蛋白。
22.一種編碼權(quán)利要求21的融合蛋白的多核苷酸。
23.一種包括權(quán)利要求21的融合蛋白和生理上可接受的載體的藥物組合物。
24.一種包括權(quán)利要求21的融合蛋白和非特異性免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑的疫苗。
25.一種包括權(quán)利要求22的多核苷酸和生理上可接受的載體的藥物組合物。
26.一種包括權(quán)利要求22的多核苷酸和非特異性免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑的疫苗。
27.一種用于抑制患者體內(nèi)卵巢癌發(fā)生的方法，該方法包括給患者施用有效量的權(quán)利要求23或權(quán)利要求25的藥物組合物的步驟。
28.一種用于抑制患者體內(nèi)卵巢癌發(fā)生的方法，該方法包括給患者施用有效量的權(quán)利要求24或權(quán)利要求26的疫苗的步驟。
29.一種藥物組合物，它包括(a)一種表達(dá)卵巢癌多肽的抗原呈遞細(xì)胞，所述的卵巢癌多肽包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與抗原特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(ii)這類多核苷酸的互補(bǔ)物；以及(b)一種藥物上可接受的載體或賦形劑。
30.一種疫苗，它包括(a)一種表達(dá)卵巢癌多肽的抗原呈遞細(xì)胞，所述的卵巢癌多肽包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與抗原特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互補(bǔ)物；以及(b)一種非特異性免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑。
31.一種疫苗，它包括(a)一種抗獨(dú)特型抗體或其抗原結(jié)合片段，它們被一種與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體所特異性結(jié)合，其中所述的卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(ii)這類多核苷酸的互補(bǔ)物；以及(b)非特異性免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑。
32.一種根據(jù)權(quán)利要求30或權(quán)利要求31所述的疫苗，其中所述的免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑是一種佐劑。
33.一種藥物組合物，它包括(a)一種與卵巢癌多肽發(fā)生特異性反應(yīng)的T細(xì)胞，所述的卵巢癌多肽包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與抗原特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(ii)這類多核苷酸的互補(bǔ)物；以及(b)一種生理上可接受的載體。
34.一種疫苗，它包括(a)一種與卵巢癌多肽發(fā)生特異性反應(yīng)的T細(xì)胞，所述的卵巢癌多肽包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與抗原特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(ii)這類多核苷酸的互補(bǔ)物；以及(b)一種非特異性免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑。
35.一種用于抑制患者體內(nèi)卵巢癌發(fā)生的方法，該方法包括給患者施用有效量的權(quán)利要求29或權(quán)利要求33的藥物組合物的步驟。
36.一種用于抑制患者體內(nèi)卵巢癌發(fā)生的方法，該方法包括給患者施用有效量的權(quán)利要求30、31或34中任意一項(xiàng)所述的疫苗的步驟。
37.一種用于刺激和/或擴(kuò)充T細(xì)胞的方法，該方法包括使T細(xì)胞與下列物質(zhì)接觸的步驟(a)一種卵巢癌多肽，它包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與抗原特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(ii)這類多核苷酸的互補(bǔ)物；以及(b)一種編碼這類多肽的多核苷酸；和/或(c)在足以刺激和/或擴(kuò)充T細(xì)胞的條件和時(shí)間下表達(dá)這類多肽的抗原呈遞細(xì)胞。
38.一種根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中將所述的T細(xì)胞在擴(kuò)充前克隆。
39.一種用于在哺乳動(dòng)物體內(nèi)刺激和/或擴(kuò)充T細(xì)胞的方法，該方法包括給哺乳動(dòng)物施用一種藥物組合物且由此在哺乳動(dòng)物體內(nèi)刺激和/或擴(kuò)充T細(xì)胞的步驟，所述的藥物組合物包括(a)下列物質(zhì)中的一種或多種(i)一種卵巢癌多肽，它包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與抗原特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和這類多核苷酸的互補(bǔ)物；(ii)一種編碼卵巢癌多肽的多核苷酸；或(iii)一種表達(dá)卵巢癌多肽的抗原呈遞細(xì)胞；以及(b)一種生理上可接受的載體或賦形劑。
40.一種用于在哺乳動(dòng)物體內(nèi)刺激和/或擴(kuò)充T細(xì)胞的方法，該方法包括給哺乳動(dòng)物施用一種疫苗且由此在哺乳動(dòng)物體內(nèi)刺激和/或擴(kuò)充T細(xì)胞的步驟，所述的疫苗包括(a)下列物質(zhì)中的一種或多種(i)一種卵巢癌多肽，它包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與抗原特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱；其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和這類多核苷酸的互補(bǔ)物；(ii)一種編碼卵巢癌多肽的多核苷酸；和(iii)一種表達(dá)卵巢癌多肽的抗原呈遞細(xì)胞；以及(b)一種非特異性免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑。
41.一種用于抑制患者體內(nèi)卵巢癌發(fā)生的方法，該方法包括給患者施用按照權(quán)利要求39或權(quán)利要求40所述方法制備的T細(xì)胞的步驟。
42.一種用于抑制患者體內(nèi)卵巢癌發(fā)生的方法，該方法包括下列步驟(a)用下列物質(zhì)中的一種或多種培養(yǎng)分離自患者的CD4+T細(xì)胞(i)一種卵巢癌多肽，它包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與抗原特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和這類多核苷酸的互補(bǔ)物；(ii)一種編碼卵巢癌多肽的多核苷酸；或(iii)一種表達(dá)卵巢癌多肽的抗原呈遞細(xì)胞；從而使T細(xì)胞增殖；和(b)給患者施用有效量的增殖的T細(xì)胞并由此抑制患者體內(nèi)卵巢癌的發(fā)生。
43.一種用于抑制患者體內(nèi)卵巢癌發(fā)生的方法，該方法包括下列步驟(a)用下列物質(zhì)中的一種或多種培養(yǎng)分離自患者的CD4+T細(xì)胞(i)一種卵巢癌多肽，它包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與抗原特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和這類多核苷酸的互補(bǔ)物；(ii)一種編碼卵巢癌多肽的多核苷酸；或(iii)一種表達(dá)卵巢癌多肽的抗原呈遞細(xì)胞；從而使T細(xì)胞增殖；(b)克隆一種或多種增殖的細(xì)胞；和(c)給患者施用有效量的克隆的T細(xì)胞。
44.一種用于抑制患者體內(nèi)卵巢癌發(fā)生的方法，該方法包括下列步驟(a)用下列物質(zhì)中的一種或多種培養(yǎng)分離自患者的CD8+T細(xì)胞(i)一種卵巢癌多肽，它包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與抗原特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和這類多核苷酸的互補(bǔ)物；(ii)一種編碼卵巢癌多肽的多核苷酸；或(iii)一種表達(dá)卵巢癌多肽的抗原呈遞細(xì)胞；從而使T細(xì)胞增殖；和(b)給患者施用有效量的增殖的T細(xì)胞并由此抑制患者體內(nèi)卵巢癌的發(fā)生。
45.一種用于抑制患者體內(nèi)卵巢癌發(fā)生的方法，該方法包括下列步驟(a)用下列物質(zhì)中的一種或多種培養(yǎng)分離自患者的CD8+T細(xì)胞(i)一種卵巢癌多肽，它包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與抗原特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會(huì)被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和這類多核苷酸的互補(bǔ)物；(ii)一種編碼卵巢癌多肽的多核苷酸；或(iii)一種表達(dá)卵巢癌多肽的抗原呈遞細(xì)胞；從而使T細(xì)胞增殖；(b)克隆一種或多種增殖的細(xì)胞；和(c)給患者施用有效量的克隆的T細(xì)胞。
46.一種用于鑒定分泌的腫瘤抗原的方法，該方法包括下列步驟(a)將腫瘤細(xì)胞植入免疫缺陷型哺乳動(dòng)物體內(nèi)；(b)在足以使腫瘤抗原分泌入血清的一定時(shí)間后從免疫缺陷型哺乳動(dòng)物體內(nèi)獲得血清；(c)給免疫活性哺乳動(dòng)物免疫接種該血清；(d)從免疫活性哺乳動(dòng)物體內(nèi)獲得抗血清；和(e)用該抗血清篩選腫瘤表達(dá)文庫(kù)且由此鑒定分泌的腫瘤抗原。
47.一種根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述的免疫缺陷型哺乳動(dòng)物是SCID小鼠且其中所述的免疫活性哺乳動(dòng)物是免疫活性小鼠。
48.一種用于鑒定分泌的卵巢癌抗原的方法，該方法包括下列步驟(a)將卵巢癌細(xì)胞植入SCID小鼠體內(nèi)；(b)在足以使卵巢癌抗原分泌入血清的一定時(shí)間后從SCID小鼠體內(nèi)獲得血清；(c)給免疫活性小鼠免疫接種該血清；(d)從免疫活性小鼠體內(nèi)獲得抗血清；和(e)用該抗血清篩選卵巢癌表達(dá)文庫(kù)且由此鑒定分泌的卵巢癌抗原。
49.一種用于確定患者體內(nèi)存在或不存在癌癥的方法，該方法包括下列步驟(a)使獲自患者的生物樣品與結(jié)合卵巢癌蛋白質(zhì)的結(jié)合劑接觸，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互補(bǔ)物；(b)檢測(cè)樣品中結(jié)合所述結(jié)合劑的多核苷酸的量；和(c)比較多核苷酸的量與預(yù)定的截?cái)嘀登矣纱舜_定患者體內(nèi)存在或不存在癌癥。
50.一種根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述的結(jié)合劑是一種抗體。
51.一種根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述的抗體是一種單克隆抗體。
52.一種根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述的癌癥是卵巢癌。
53.一種用于監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)癌癥發(fā)展的方法，該方法包括下列步驟(a)在第一時(shí)間點(diǎn)處使獲自患者的生物樣品與結(jié)合卵巢癌蛋白質(zhì)的結(jié)合劑及時(shí)接觸，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互補(bǔ)物；(b)檢測(cè)樣品中結(jié)合所述結(jié)合劑的多肽的量；和(c)在隨后的時(shí)間點(diǎn)處及時(shí)使用獲自患者的生物樣品重復(fù)步驟(a)和(b)；并且(d)將步驟(c)中檢測(cè)的多肽的量與步驟(b)中檢測(cè)的量進(jìn)行比較且由此監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)癌癥的發(fā)展情況。
54.一種根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述的結(jié)合劑是一種抗體。
55.一種根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中所述的抗體是一種單克隆抗體。
56.一種根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述的癌癥是卵巢癌。
57.一種用于確定患者體內(nèi)存在或不存在癌癥的方法，該方法包括下列步驟(a)使獲自患者的生物樣品和與編碼卵巢癌蛋白質(zhì)的多核苷酸雜交的寡核苷酸接觸，其中所述的卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互補(bǔ)物；(b)檢測(cè)樣品中與所述寡核苷酸雜交的多核苷酸的量；和(c)將與所述寡核苷酸雜交的多核苷酸的量與預(yù)定的截?cái)嘀颠M(jìn)行比較且由此確定患者體內(nèi)存在或不存在癌癥。
58.一種根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中使用聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定與所述寡核苷酸雜交的多核苷酸的量。
59.一種根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中使用雜交測(cè)定法測(cè)定與所述寡核苷酸雜交的多核苷酸的量。
60.一種用于監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)癌癥發(fā)展的方法，該方法包括下列步驟(a)使獲自患者的生物樣品和與編碼卵巢癌蛋白質(zhì)的多核苷酸雜交的寡核苷酸接觸，其中所述的卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互補(bǔ)物；(b)檢測(cè)樣品中與所述寡核苷酸雜交的多核苷酸的量；和(c)在隨后的時(shí)間點(diǎn)處及時(shí)使用獲自患者的生物樣品重復(fù)步驟(a)和(b)；并且(d)將步驟(c)中檢測(cè)的多核苷酸的量與步驟(b)中檢測(cè)的量進(jìn)行比較且由此監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)癌癥的發(fā)展情況。
61.一種根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中使用聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定與所述寡核苷酸雜交的多核苷酸的量。
62.一種根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中使用雜交測(cè)定法測(cè)定與所述寡核苷酸雜交的多核苷酸的量。
63.一種診斷用試劑盒，它包括(a)一種或多種與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述的卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互補(bǔ)物；以及(b)一種包括報(bào)道基團(tuán)的檢測(cè)試劑。
64.一種根據(jù)權(quán)利要求63所述的試劑盒，其中所述的抗體被固定在一種固體支持物上。
65.一種根據(jù)權(quán)利要求63所述的試劑盒，其中所述的固體支持物包括硝化纖維、膠乳或塑料物質(zhì)。
66.一種根據(jù)權(quán)利要求63所述的試劑盒，其中所述的檢測(cè)試劑包括抗免疫球蛋白、蛋白質(zhì)G、蛋白質(zhì)A或凝集素。
67.一種根據(jù)權(quán)利要求63所述的試劑盒，其中所述的報(bào)道基團(tuán)選自放射性同位素、熒光基團(tuán)、發(fā)光基團(tuán)、酶、生物素和染料顆粒組成的組。
68.一種診斷用試劑盒，它包括(a)一種包括在中等嚴(yán)格條件下與編碼卵巢癌蛋白質(zhì)的多核苷酸雜交的10-40個(gè)核苷酸的寡核苷酸，所述的卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列選自下列序列組成的組(i)以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的多核苷酸；和(ii)上述多核苷酸的互補(bǔ)物；以及(b)一種用于聚合酶鏈反應(yīng)或雜交測(cè)定的診斷試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于治療和診斷諸如卵巢癌這樣的癌癥的組合物和方法。組合物可以包括一種或多種卵巢癌蛋白質(zhì)、其免疫原性部分、編碼這類部分的多核苷酸或?qū)@類蛋白質(zhì)具有特異性的抗體或免疫系統(tǒng)細(xì)胞。例如,可以將這類組合物用于預(yù)防和治療諸如卵巢癌這樣的疾病。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于鑒定選自卵巢癌和/或其它腫瘤的腫瘤抗原的方法?？梢赃M(jìn)一步將本文提供的多肽類和多核苷酸用于診斷和監(jiān)測(cè)卵巢癌。
文檔編號(hào)A61K35/76GK1333830SQ99815694
公開(kāi)日2002年1月30日 申請(qǐng)日期1999年12月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月17日
發(fā)明者J·L·米特查姆, G·E·金, P·A·阿爾蓋特, T·N·弗魯達(dá)奇斯 申請(qǐng)人:科里克薩有限公司