專利名稱：篩選方法
技術領域：
本發(fā)明涉及篩選治肥胖病的藥物或調節(jié)食欲的藥物等方法，其特征為，應用孤兒受體蛋白，即SLC-1(FEBS Letters 398，253-258(1996)等)或其鹽和MCH[黑色素凝集激素(Melanin Concentrating Hormone)(Endocrinology，vol.125，1660-1665(1989)等)]或其衍生物或其鹽。
背景技術：
有兩種類型的SLC-1，一種是從人的基因組中發(fā)現(xiàn)的[FEBS Letters398，253-258(1996)]，另一種是從大鼠腦中cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的[Biochinica etBiophysica Acta 1401，216-220(1998)]。這兩種類型的SLC-1是總稱為G蛋白偶聯(lián)型受體蛋白或7跨膜型受體蛋白中的一種，其很多配體不清。
其中分析這些孤兒G蛋白偶聯(lián)型受體蛋白的配體，一般來說，其方法是只有根據(jù)G蛋白偶聯(lián)型受體蛋白的一級結構的相似性進行推斷。但是，有很多孤兒G蛋白偶聯(lián)型受體蛋白與已知的受體蛋白同源性相差很大，事實上，如果將已知配體的受體蛋白的亞型除外，僅從一級結構的相似性考慮其配體是很難的。另一方面，從基因分析而得到的很多G蛋白偶聯(lián)型受體中推測還存在很多對應的、未知的配體，迄今為止，得到證實的G蛋白偶聯(lián)型受體的配體的例子很少，SLC-1的配體存在與否未見報導。
本研究的課題就是確立篩選化合物等的方法，一是要探索針對SLC-1(孤兒G受體蛋白)的配體，二是要應用SLC-1以及其配體。
發(fā)明公開本發(fā)明人通過適當?shù)氖侄问咕幋aSLC-1的cDNA表達，并使用這種表達細胞，測定特異的細胞刺激(信號傳導)活性等，將其作為指標，成功地篩選出該受體蛋白能識別作為配體的多肽，并發(fā)現(xiàn)該多肽是一種激素MCH(黑色素凝集激素(Melanin Concentrating Hormone)。
本發(fā)明人進一步發(fā)現(xiàn)，可以篩選一種化合物，該化合物能使活性因子、即MCH或其鹽與所述SLC-1或其鹽之間的結合特性發(fā)生變化。
又發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的人型SLC-1的氨基酸序列為一種新的序列，它與現(xiàn)有文獻(FEBS Letters 398，253-258(1996)、WO96/18651號)不同。
即，本發(fā)明提供，(1)一種化合物或其鹽的篩選方法，該化合物或其鹽能使MCH或其鹽與SLC-1或其鹽之間的結合特性發(fā)生改變，其特征包括應用黑色素凝集激素(MCH)或其衍生物或其鹽以及SLC-1或其鹽。
(2)一種用于篩選化合物或其鹽的試劑盒，該化合物或其鹽能使MCH或其鹽與SLC-1或其鹽之間的結合特性發(fā)生改變，其特征為，該試劑盒包含MCH或其衍生物或其鹽以及SLC-1或其鹽。
(3)這種能使MCH或其鹽與SLC-1或其鹽之間的結合特性發(fā)生改變的化合物或其鹽，通過(1)中所述篩選方法或(2)中所述篩選試劑盒而獲得。
(4)一種藥物，它包含(3)中所述化合物或其鹽。
(5)(4)中所述藥物，為一種治肥胖病的藥物。
(6)一種含有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的蛋白質或其鹽。
(7)一種DNA，它所具有的堿基，為編碼(6)中所述的蛋白質。
(8)(1)中所述篩選方法或(2)中所述篩選試劑盒，其中MCH為一種肽，其肽包含與SEQ ID NO2所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。
(9)(1)中所述篩選方法或(2)中所述篩選試劑盒，其中衍生物為一種肽，在SEQ ID NO2所示氨基酸序列中其肽包含從N末端第5位至第19位的部分序列。
(10)(1)中所述篩選方法或(2)中所述篩選試劑盒，其中衍生物為一種肽，其肽包含由波德棟-亨特試劑(ボルトンハンタ-)所衍生的MCH或由波德棟-亨特試劑(ボルトン-ンタ-)所衍生的SEQ ID NO2所示氨基酸序列中從N末端第5位至第19位的部分序列。
(11)一種肽或其鹽，它包含由波德棟-亨特試劑(ボルトン-ンタ-)所衍生的MCH或由波德棟-亨特試劑(ボル トン-ンタ-)所衍生的SEQ ID NO2所示氨基酸序列中從N末端第5位至第19位的部分序列，以及
(12)一種化合物或其鹽，它用 化學式表示。
具體地說，有關本發(fā)明的SLC-1，若舉出所述公知的SLC-1或其鹽等，則有(13)SLC-1或其鹽的特征為，它們包含與SEQ ID NO5或11所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列，或(14)(13)中所述SLC-1或其鹽為一種蛋白質，它所包含的氨基酸序列為SEQ ID NO5或11所示氨基酸序列中缺失1-30個氨基酸，優(yōu)選其中缺失1-10個氨基酸，SEQ ID NO5或11所示氨基酸序列中附加(插入)1-30個氨基酸，優(yōu)選其中附加(或插入)1-10個氨基酸，或SEQ ID NO5或11所示氨基酸序列中被其它氨基酸置換1-30個，優(yōu)選其中置換1-10個氨基酸。
具體地說，有關本發(fā)明的MCH，若舉出所述公知的MCH或其鹽等，則有(15)MCH或其衍生物或其鹽的特征為，它包含與SEQ ID NO2所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列，或(16)(15)中所述MCH或其衍生物或其鹽為肽，這種肽的蛋白質所包含的氨基酸序列為，SEQ ID NO2所示氨基酸序列中缺失1-10個氨基酸，優(yōu)選其中缺失1-5個氨基酸，SEQ ID NO2所示氨基酸序列中附加(插入)1-10個氨基酸，優(yōu)選其中附加(或插入)1-5個氨基酸，或SEQ ID NO2所示氨基酸序列中被其它氨基酸置換1-10個，優(yōu)選其中置換1-5個氨基酸。


圖1是關于由大鼠腦制備而來的高效液相層析(HPLC)部分，并表示對CHO/SLC-1細胞進行特異性cAMP合成抑制活性的測定結果。
圖2表示對參考例1中大鼠腦高效液相層析(HPLC)部分的#34，經過鏈霉蛋白酶處理之后，cAMP合成抑制活性的變化情況。
圖3是關于參考例3中的用ODS層析柱(Develosil ODS-UG-3)純化的級分，并表示對CHO/SLC-1細胞進行特異性cAMP合成抑制活性的測定結果。
圖4是關于能使大鼠SLC-1基因表達的CHO細胞系，并通過原位雜交比較基因表達之量。
圖5表示在不同MCH濃度下，CHO/SLC-1細胞的cAMP合成抑制活性。
圖6表示在不同MCH濃度下，CHO/SLC-1細胞的花生四烯酸代謝物釋放活性。
圖7表示通過MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)及MCH(7-19)與GTPγS的結合，并利用其結合檢測方法測定其激動劑的活性。
圖8表示由非同位素波德棟-亨特試劑(ボルトン-ンタ-)所衍生的衍生物MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)及MCH(5-19)與GTPγS的結合，并利用其結合檢測方法測定其激動劑的活性。
圖9表示用波德棟-亨特試劑(ボルトン-ンタ-)制備的[125I]標記的MCH(4-19)，對細胞膜級分的特異性結合，該細胞膜級分由能使人SLC-1表達的CHO細胞制備而來。
圖10表示用波德棟-亨特試劑(ボルトン-ンタ-)制備的[125I]標記的MCH(4-19)之MCH結合抑制活性。
實施發(fā)明的最佳方案在本發(fā)明書中所說[基本相同]是指，多肽的活性基本相同，例如，配體(MCH)與受體(SLC-1)結合活性、生理特性等。
下面，進一步詳細說明本發(fā)明中所使用的SLC-1或其鹽(下文，通常簡稱為SLC-1)以及MCH或其衍生物或其鹽(下文，通常簡稱為MCH)的制造方法。
所述本發(fā)明中使用的SLC-1及MCH是來自于人或溫血動物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、豬、綿羊、牛、猴子等)以及魚類等的所有組織(例如，垂體、胰腺、腦、腎臟、肝臟、生殖腺、甲狀腺、膽囊、骨髓、副腎、皮膚、肌肉、肺、消化道、血管、心臟等)或細胞等的多肽，其中SLC-1可以是任意一種多肽，只要它含有與SEQ ID NO5或11所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列、而MCH只要含有與SEQ ID NO2所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列均可。例如，本發(fā)明的SLC-1除了上述所說的多肽外，還可以是與SEQ ID NO5或11所示氨基酸序列相同或基本相同的多肽并具有基本相同活性的多肽。所述基本相同的活性，例如有配體結合活性、信號傳導活性等。所說活性[基本相同]是指，配體結合活性等特性相同。因此，不管配體結合活性大小，多肽分子量的要素如何都不會影響其結合活性。所述本發(fā)明的MCH，除了是上述的多肽外，還可以是與SEQ IDNO2所示氨基酸序列相同或基本相同的多肽并具有基本相同活性的多肽。所述基本相同的活性，例如有受體結合活性等。所說活性[基本相同]是指，受體結合活性等特性相同。因此，不管受體結合活性大小，多肽分子量的要素如何都不會影響其結合活性。
本說明中的SLC-1及MCH按照慣例肽的標記描述，左端為N末端(氨基端)，右端為C末端(羧基端)。例如SEQ ID NO2、5或11所示多肽其C末端通常為羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，但是C末端也可為酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。所示該酯的R有，例如，C1-6烷基包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、或正丁基；C3-8環(huán)烷基包括環(huán)戊基和環(huán)己基等；C6-12芳基包括苯基和a-萘基等；C7-14芳烷基如苯基-C1-2烷基或a-萘基C1-2烷基，其中苯基-C1-2烷基又如苯甲基、苯乙基、二苯甲基等；a-萘基C1-2烷基又如a-萘甲基等，此外還有通常適用于口服給藥的酯如三甲基乙酰氧甲基。
本發(fā)明中所使用的SLC-1及MCH之鹽可以與生理上可接受的堿(如堿金屬)或酸(如無機酸或有機酸)形成鹽，優(yōu)選生理上可接受的酸加成鹽。這類的鹽有，與無機酸(例如，鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)形成的鹽，或與有機酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的鹽等。
本發(fā)明中所使用的SLC-1及MCH既可根據(jù)人或其它溫血動物細胞或組織純化多肽的公知方法(例如，F(xiàn)EBS Letters 398，253-258(1996)、WO96/18651號)來制備，也可以用隨后敘述的合成方法制備蛋白質(多肽)。也可通過培養(yǎng)含有隨后所述蛋白質(多肽)之編碼DNA的轉化體來制備。
當從人、溫血動物、魚類等組織或細胞中制備該蛋白質(多肽)時，首先將人或溫血動物組織或細胞勻漿，然后用酸、有機溶劑等抽提，通過鹽析、透析、凝膠過濾、反向層析、離子交換層析、親和層析法等多種層析技術的聯(lián)用來分離純化該抽提物。
如上所述，本發(fā)明中所使用的SLC-1及MCH可按照公知的蛋白質(多肽)合成方法制備，或可用適當?shù)碾拿盖懈詈蠸LC-1和/或MCH的蛋白質(肽)來制備。其蛋白質(肽)的合成法，例如，可以用固相合成法和液相合成法的任意一種。即，當能夠構成SLC-1和/或MCH的部分肽或氨基酸與其殘余部分縮合，其產物有保護基時，通過除去保護基團可以制備目的蛋白質(肽)。此時的公知縮合方法或除去保護基團方法例如在下列1)-5)中均有描述1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti肽的合成，Interscience Publishers，紐約(1966)2)Schroeder和Luebke肽，Academic Press，紐約(1965)3)泉屋信夫等多肽合成的基礎與實驗，丸善公司(1975)4)矢島治明和樹原俊平生物化學實驗教材1，蛋白質化學IV，205(1977)5)矢島治明主編藥物開發(fā)續(xù)篇，卷14，肽合成，廣川書店還有，反應后將一般的純化方法如，溶劑抽提法、蒸餾法、柱層析法、液體層析法、重結晶法等進行組合來純化回收本發(fā)明的蛋白質(肽)。通過上述方法得到的蛋白質(肽)若為游離體時，按照公知方法可以適當轉換為鹽，相反獲得其鹽時按照公知方法也可以轉化為游離體。
為了合成本發(fā)明SLC-1及MCH的酰胺物，可以使用可用于酰胺合成的市售的樹脂。這類樹脂的實例包括氯甲基樹脂、羥甲基樹脂、二苯甲胺樹脂、氨甲基樹脂、4-芐氧基苯甲醇樹脂，4-甲基二苯甲胺樹脂，PAM樹脂，4-羥甲基甲苯乙酰胺甲基樹脂，聚丙烯酰胺樹脂，4-(2′，4′-二甲氧基苯羥甲基)苯氧基樹脂以及4-(2′，4′二甲氧苯基-Fmoc-氨乙基)苯氧基樹脂。使用這些樹脂時，將那些α-氨基及其側鏈上功能基團受到相應保護的氨基酸，在樹脂上按目標多肽的序列順序，用本領域公知的各種縮合方法縮合。反應結束時，將蛋白質(肽)從樹脂上切除下來，同時除去各種保護基團，必要時在高度稀釋溶液中實施分子內二硫鍵形成反應，以獲得目標蛋白質(肽)。
進行上述受保護氨基酸的縮合反應時，可使用蛋白質(肽)合成的多種活化試劑，但優(yōu)選使用碳二亞胺。其碳二亞胺有DCC、N，N′-二異丙基碳二亞胺以及N-乙基-N′-(3-二甲基氨基脯氨酰基)碳二亞胺。用這些試劑活化時，直接在樹脂上添加受保護的氨基酸及外消旋抑制劑(例如，HOBt)，或先將受保護的氨基酸活化為對稱酸酐、HOBt酯或HOOBt酯，然后添加到樹脂上。適用于受保護氨基酸的活化反應或適用于與樹脂的縮合反應的溶劑選自已知可用于蛋白質(肽)縮合反應的溶劑。這樣的溶劑有酰胺類如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺以及N-甲基吡咯烷酮等；鹵化烴類如二氯甲烷和氯仿等；醇類如三氟乙醇等；亞砜類如二甲亞砜等；叔胺類如吡啶等、醚類如二惡烷和四氫呋喃等；腈類如乙腈和丙腈等；酯類如乙酸甲酯和乙酸乙酯等；以及這些溶劑的適當混合物。反應溫度從已知適用于肽成鍵反應的范圍中選取，通常選約-20℃-50℃?；罨陌被嵫苌锿ǔＲ赃^量1.5～4倍的量使用。用茚三酮反應檢驗所述縮合反應程度；當所述縮合不充分時，可通過不除去保護基團而重復縮合反應來完成。當即使重復反應后仍未充分縮合時，用乙酸酐或乙酰咪唑將未反應的氨基酸乙?；?，以消除對后續(xù)反應的可能負影響。
用于該蛋白質(肽)合成時保護初始氨基的保護基團有，例如Z、Boc、叔戊氧基羰基、異冰片基氧羰基、4-甲氧芐氧羰基、Cl-Z、Br-Z、金剛烷(adamantyl)氧基羰基，三氟乙?；?、鄰苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基亞硫酰基、二苯硫膦基，以及Fmoc。其羧基的保護基團有，例如所述的C1-6烷基、C3-8環(huán)烷基、C7-14芳烷基、2-金剛烷基、4-硝基芐基、4-甲氧芐基、4-氯芐基、苯甲酰甲基，芐氧羰基酰肼基、叔丁氧羰基酰肼基以及三苯甲基酰肼基。
絲氨酸以及蘇氨酸的羥基可以通過例如酯化作用或醚化作用來保護。適于酯化作用的基團有低級C1～6烷?；缫阴；?，芳?；绫郊柞；约皝碜蕴妓岬幕鶊F如芐氧羰基和乙氧羰基。適于醚化的基團有苯甲基、四氫吡喃基和叔丁基。
適于保護酪氨酸中酚羥基的基團有，例如Bzl、Cl2-Bzl、2-硝基芐基、Br-Z和叔丁基。
適于保護組氨酸中咪唑基的基團有，Tos、4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺?；NP、芐氧甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc。
活化原料羧基的有，如對應的酸酐、迭氮基、活化酯[與乙醇(五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基苯酚、氰基甲醇、對硝基苯酚、HONB、N-羥甲基琥珀酰亞酰胺、N-羥甲基酞酰亞胺、HOBt)形成的酯]等?；罨习被挠信c此對應的磷酸胺。
保護基的去除(脫離)方法有，在Pd-黑或Pd-碳等催化劑的存在下在氫氣流中的催化還原反應；通過氫氟酸酐、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或它們的混合液進行酸的處理；二異丙烯乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪等的堿處理；通過液氨中的鈉還原反應等等。上述酸處理的脫離反應一般在約-20℃～40℃的溫度下進行，在酸處理作用中，添加如甲氧基苯、苯酚、硫代甲氧基苯、間苯甲酚、對甲酚、二甲基硫化物、1，4-丁二硫醇、1，2-乙二硫醇等陽離子捕集劑是有效的。組氨酸咪唑保護基所用的2，4-二硝基苯基通過硫代苯酚除去，色氨酸吲哚保護基的甲?；怂?，2-乙二硫醇、1，4-丁二硫醇等存在下經過酸處理而脫離保護之外，也可以通過堿處理如氫氧化鈉稀溶液、稀釋氨等除去方法。
從公知的基團中適當選擇與原料反應無關的官能團的保護及保護基以及其保護基的脫離，從公知方法中適當選擇與反應有關的官能團的活化。
SLC-1及MCH胺物的其它獲得方法有，如首先將羧基末端氨基酸的α-羧基胺基化保護再在氨基側使肽鏈增加到所要求的長度，制造2種肽(或氨基酸)，一種為該肽鏈N末端只除去α-氨基保護基，另一種為C末端除去羧基保護基，使這兩種肽在所述混合溶劑中縮合。有關縮合反應的詳細情況與前述一樣。由縮合得到的保護肽經過純化之后，按照上述方法除去所有的保護基，可以得到粗蛋白(肽)。這種粗蛋白(肽)通過各種純化的已知方法，進行凍結干燥主要的組分進而得到蛋白質(肽)的胺物。
為獲得SLC-1及MCH的酯物，將如羧基末端氨基酸的α-羧基與要求的乙醇類縮合轉換為氨基酸酯后，再與蛋白質(肽)的胺物合成一樣從而獲得蛋白質(肽)的酯物。
作為本發(fā)明所使用的衍生物，可為任意的化合物，只要它們能與SLC-1結合的均可①MCH的部分肽、②構成MCH的氨基酸缺陷的肽、由其它氨基酸附加到構成氨基酸的肽、構成的氨基酸被其它氨基酸置換的肽、或③MCH以及①中所述的部分肽或②中所述的肽被標記的。
具體地說，MCH的部分肽有，包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列從N末端第5位至第19位的部分序列的肽或其酰胺或其酯或其鹽等。更具體地說，具有SEQ ID NO19、20、21、22、23或24所示氨基酸序列的肽或其酰胺或其酯或其鹽等。
為了用SLC-1進行隨后所述的篩選，尤其優(yōu)選使用具有SEQ ID NO21所示氨基酸序列的肽或其酰胺或其酯或其鹽等。
另外，所述的構成MCH的氨基酸缺陷的肽、由其它氨基酸附加到構成氨基酸的肽、構成的氨基酸被其它氨基酸置換的肽為這樣一種肽在SEQID NO2中缺失1或2個以上(優(yōu)選1-10個，更優(yōu)選1個或2個)；或者，在其氨基酸序列中附加1或2個以上(優(yōu)選1-10個，更優(yōu)選1-5最優(yōu)選1個或2個)；或者，在其氨基酸序列中被其它氨基酸置換1或2個以上(優(yōu)選1-10個，更優(yōu)選1-5最優(yōu)選1個或2個)。
該氨基酸序列中的氨基酸基本為相同的置換物，例如，其氨基酸可以在所屬分類特性的范圍內選擇其它的氨基酸例如(i)非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸等。(ii)極性(中性)氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等。(iii)帶正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸、組氨酸等。(iv)帶負電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸等。
但是，上面所說的用其它氨基酸置換或缺失，其缺失置換或缺失的位置優(yōu)選在構成MCH的氨基酸中不包括Cys的位置。
上面所述MCH以及①中所述的部分肽或②中所述的肽被標記的事項，公知方法有，同位素標記、熒光標記(例如，由熒光素標記的)、生物素標記、酶標記等。
具體地說，例如，通過公知方法可以利用MCH等，該MCH被[3H]、[125I]、[14C]、[35S]等標記的。尤其是，用波爾棟-亨特試劑(ボルトン一ハンタ一)可以利用根據(jù)公知方法制備的MCH或它的衍生物的標記物。
作為該MCH或它的衍生物的標記物其實例為，(1)[125I]-[N-(3-(4-羥基-3-碘代苯基)丙酰基)-Asp1]-MCH
(2)[125I]-[N-(3-(4-羥基-3-碘代苯基)丙?；?-Phe2]-MCH(2-19) (3)[125I]-[N-(3-(4-羥基-3-碘代苯基)丙酰基)-Asp3]-MCH(3-19) (4)[125I]-[N-(3-(4-羥基-3-碘代苯基)丙?；?-Met4]-MCH(4-19) (5)[125I]-[N-(3-(4-羥基-3-碘代苯基)丙酰基)-Leu5]-MCH(5-19) (6)[125I]-[N-(3-(4-羥基-3-碘代苯基)丙?；?-Aro6]-MCH(6-19)
(7)[125I]-[N-(3-(4-羥基-3-碘代苯基)丙酰基)-Cys7]-MCH(7-19) 其中最優(yōu)選[125I]-[N-(3-(4-羥基-3-碘代苯基)丙?；?-Met4]-MCH(4-19)。
MCH或其衍生物的鹽有與所述SLC-1及MCH的鹽一樣。
編碼本發(fā)明SLC-1的DNA可以是下面情形的任何一種其DNA具有編碼蛋白質的堿基序列，其蛋白質含有與SEQ ID NO5或11所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列；而編碼本發(fā)明MCH的DNA可以是下面情形的任何一種其DNA具有編碼肽的堿基序列，其肽含有與SEQ IDNO2所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。它們可以是基因組DNA、DNA基因文庫、前述細胞·組織中的cDNA、前述細胞·組織中的cDNA文庫、合成DNA。文庫使用的載體包括噬菌體、質粒、粘粒、噬粒等。還有，從所述細胞·組織中制備的RNA組分，用該組分可以直接根據(jù)Reverse Transcriptase Polymerase chain Reaction(下文，簡稱RT-PCR法)進行擴增。
更具體地說，可以使用2種DNA，一種DNA是(1)在嚴謹條件下，與這樣一種DNA序列雜交的DNA，即這樣一種DNA序列是它具有編碼蛋白質或肽的堿基序列，其蛋白質或肽含有與SEQ ID NO2、5或11所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列；另一種DNA是(2)為了簡并遺傳密碼，編碼含有同一氨基酸序列的蛋白質或肽，但它不與(1)所具有的序列及由(1)所決定的序列形成雜合體。雜交可以用公知方法或其改良方法實施。其中所述嚴謹條件是指，例如42℃、50％甲酰胺4×SSPE(1×SSPE＝150mMNaCl，10mM NaH2PO4·H2O，1mM EDTA pH7.4)、5×Denhart′s溶液、0.1％SDS。
編碼本發(fā)明的SLC-1及MCH的DNA可以通過下面遺傳工程的方法生產。
作為DNA的克隆方法(克隆化)，該DNA完全編碼本發(fā)明多肽，按照下列方法進行。即，首先合成含有部分本發(fā)明SLC-1及MCH的堿基序列的DNA，用該DNA作為引物，再根據(jù)公知的PCR法進行完全編碼目的DNA的擴增，或者通過與標記物雜交篩選，此標記物是用，例如編碼具有SLC-1及MCH的部分或全部的DNA片段或合成DNA，將其DNA片段插入到合適載體中的DNA文庫。雜交反應可以根據(jù)分子克隆第二版(J.Sambrook等，冷泉港實驗室出版社，1989)描述的方法進行。也可用商品化的文庫根據(jù)所附說明書進行雜交。
已經克隆的編碼該SLC-1及MCH的DNA，既可單獨使用，也可根據(jù)目的需要，在用限制酶消化后或連接一接頭之后使用。該DNA可能在5′端包含ATG作為翻譯起始密碼子，而在3′端有TAA、TGA或TAG作為翻譯終止密碼子。這些翻譯起始和終止密碼子也可加上合適的合成DNA接頭。
含有編碼該SLC-1及MCH的DNA的表達載體可通過以下方法生產，例如，(a)從編碼本發(fā)明的DNA上切下所需DNA片段，(b)將該DNA片段連接到一合適公知載體上的啟動子下游。
可以使用的載體包括來自大腸桿菌的質粒(例如，pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、來自枯草桿菌的質粒(例如，pUB110、pTP5、pC194)、來自酵母的質粒(例如，pSH19、pSH15)、噬菌體如λ噬菌體等、動物病毒如反轉錄病毒、痘苗病毒、桿狀病毒等。本發(fā)明所使用的啟動子可以是任意啟動子，只要它能與所用基因表達宿主匹配。
如果轉換的宿主為動物細胞時，分別優(yōu)選SV40啟動子、反轉錄病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、巨細胞病毒啟動子、SRα啟動子。當宿主為大腸桿菌屬的細菌時，優(yōu)選的啟動子有trp啟動子、T7啟動子、lac啟動子、recA啟動子、λPL啟動子、lpp啟動子等。在使用枯草桿菌屬的細菌作宿主時，優(yōu)選的啟動子有SPO1啟動子、SPO2啟動子和penP啟動子等。在用酵母作宿主時，優(yōu)選的啟動子有PHO5啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子和ADH1啟動子、GAL啟動子等。在使用昆蟲細胞作宿主時，優(yōu)選多角體蛋白啟動子、P10啟動子。
表達載體除了上述之外根據(jù)需要還可以使用含有增強子、剪接信號、PolyA附加信號、選擇標記物、SV40復制起點(以下簡稱為SV40ori)等的載體。其中選擇標記物有二氫葉酸還原酶(以下簡稱為dhfr)基因[抗氨甲蝶呤(MTX)]、抗氨芐青霉素基因(以下簡稱為Ampr)、抗新酶素基因(以下簡稱為Neo、抗G418)等。尤其是用CHO(dhfr)細胞將dhfr基因作為選擇標記物時又可以用不含腺嘌呤脫氧核苷來選擇目的基因。
又，根據(jù)需要在本發(fā)明多肽或其部分肽的N-末端加上適合于宿主的信號序列。當宿主為大腸桿菌屬細菌時，可以使用pho A信號序列、Omp A信號序列等；當宿主為桿菌屬細菌時可以使用α-淀粉酶信號序列、枯草菌素信號序列等；當宿主為酵母菌時可以使用MFα信號序列、SUC2信號序列等；當宿主為動物細胞時可以使用胰島素信號序列、α-IL信號序列、抗體分子信號序列等。
使用如此構建的、含有編碼本發(fā)明SLC-1或MCH的DNA載體可以制造轉化體。
其宿主有，如大腸桿菌屬細菌、桿菌屬細菌、酵母菌、昆蟲細胞、昆蟲、動物細胞等。
具體地說，其大腸桿菌屬的例子有大腸桿菌(Eschericha cili)K12DH1[(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，60卷，160(1968)]、JM103[(Nucleic AcidsResearch)，9卷，309(1981)]、JA221[(Joumal of Molecular Biology)，120卷，517(1969)]、HB101[Journal of Molecular Biology)，41卷，459(1969)]、C600[(Genetics)，39卷，440(1954)]等。
其桿菌屬有枯草桿菌(Bacills subtilis)MI114[Gene.24卷，255(1983)]、207-21[(Journal of Biochemistry)，95卷，87(1984)]等。
其酵母菌有，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12等。
昆蟲使用的是家蠶的幼蟲[前田等.Nature.315卷，592(1982)]。
其昆蟲細胞有，例如病毒為AcNPV時從草地夜蛾幼蟲(Spodopterafrugiperda cell，Sf)來的細胞系、從粉紋夜蛾中腸(Trichoplusia ni)來的細胞系MG1細胞、從粉紋夜蛾卵(Trichoplusia ni)來的High FiveTM細胞、從Mamestrabrassicae來的細胞或從Estigmena acrea來的細胞等。病毒為BmNPV時有來自于蠶細胞系(Bombyx mori N，BmN細胞)等。該Sf細胞，還有如Sf9細胞(ATCC CRL1711)、Sf21細胞(Vaughu，J.L. et al. In Vivo.13，213-217(1977))等。
動物細胞有，例如猴子細胞COS-7，Vero、中國倉鼠細胞CHO(以下簡稱為CHO細胞)、dhft基因缺陷中國倉鼠細胞CHO(以下簡稱為CHO(dhfr-)細胞)、小鼠L細胞、小鼠3T3、小鼠骨髓瘤細胞、人HEK293細胞、293細胞、C127細胞、BALB373細胞、Sp-2/O細胞等。
為了轉化大腸桿菌屬細菌按照[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69卷2110(1972)]和[Gene，17卷，107(1982)]描述的方法進行轉換。
為了轉化桿菌屬細菌按照[Molecular and General Genetics，168卷，11(1979)]描述的方法進行轉換。
為了轉化酵母菌按照[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75卷1929(1978)]描述的方法進行轉換。
為了轉化昆蟲細胞或昆蟲按照[Bio/Technology.6，47-55(1988)]描述的方法進行轉換。
為了轉化動物細胞按照[《病毒學》.52卷，456(1973)]苗述的方法進行轉換。
受體細胞的載體導入法有，例如脂轉染法[Felgner，P.L.et al.Proceedingsof The National Academy of Sciences of The United States of Ameriica，84，7413(1987)]、磷酸鈣轉染[Graham，F(xiàn).L.and van der Eb，A.J.Virology，52，456-467(1973)]、電穿孔法[Nuemann，E.et al EMBO J.，1841-845(1982)]等。
由此，可以獲得用含有本發(fā)明SLC-1或MCH之編碼DNA的表達載體轉化的轉化體。
為使本發(fā)明SLC-1或MCH能穩(wěn)定地進行基因表達采取利用動物細胞進行選擇的方法，該方法是通過克隆選擇篩選細胞的，即將已導入到上面所述動物細胞的表達載體整合到染色體上。具體地說，就是把上述所說的選擇標記作為指標來選擇轉化體。如此地用選擇標記獲得的動物細胞，通過重復克隆選擇能獲得穩(wěn)定的細胞系，這種細胞系具有高效表達本發(fā)明SLC-1或MCH的能力。當用dhfr基因作為選擇標記時，培養(yǎng)時的MTX濃度為逐漸上升，通過選擇抗耐性的細胞系，在細胞內同時與dhfr基因一起使編碼本發(fā)明SLC-1或MCH的DNA擴增，也可獲得更高效表達的動物細胞系。
在可以進行基因表達的條件下，培養(yǎng)由編碼本發(fā)明SLC-1或MCH的NDA進行轉化的所述轉化體，通過生成、積累本發(fā)明SLC-1或MCH，可以制造本發(fā)明的SLC-1或MCH。
培養(yǎng)宿主為大腸桿菌屬細菌、桿菌屬細菌的轉化體時，其培養(yǎng)基適用于液體培養(yǎng)基，該轉化體的發(fā)育含有必要的碳源、氮源、無機物以及其它物質。碳源有葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等；氮源有銨鹽、硝酸鹽、玉米糊、蛋白胨、酪蛋白、肉汁、黃豆餅粉、馬鈴薯提取液等無機或有機物質；無機物有氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂等。也可以添加酵母提取物、維生素、生長因子等。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選約為5-8。
大腸桿菌屬細菌的培養(yǎng)基，優(yōu)選M9培養(yǎng)基它含有葡萄糖、酪蛋白氨基酸[米勒，Journal ofExperiments in Molecular Genetics，431-433，Cold SpringHarbor Laboratory，New Youk 1972]。根據(jù)需要，為使啟動子更能發(fā)揮有效作用還可以添加如，3β-吲哚丙烯酸之類的藥物。
當宿主為大腸桿菌屬細菌時，轉化體通常在15-43℃培養(yǎng)，時間約3-24小時，必要時可以通氣或攪拌。
當宿主為桿菌屬細菌時，轉化體通常在30-40℃培養(yǎng)，時間約6-24小時，必要時可以通氣或攪拌。
當培養(yǎng)宿主為酵母的轉化體時，其培養(yǎng)基有Burkholder基礎培養(yǎng)基[Bostian，K.L.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77卷，4505(1980)]或含有0.5％酪蛋白氨基酸的SD培養(yǎng)基[Bitter，G.A.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81卷，5330(1984)]。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為約5-8。轉化體通常在20-35℃培養(yǎng)，時間約24-72小時，必要時可以通氣或攪拌。
當培養(yǎng)宿主為昆蟲細胞的轉化體時，其培養(yǎng)基可以選用在Grace′s Insecl培養(yǎng)基[Gracc，T.C.C. Nature.195，788(1962)]中適當添加固相化10％牛血清等添加物。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為約6.2-6.4。轉化體通常在27℃培養(yǎng)，時間約3-5夭，必要時可以通氣或攪拌。
當培養(yǎng)宿主為動物細胞的轉化體時，其培養(yǎng)基包括含有約5-20％的胎牛血清的MEM培養(yǎng)基[Science，122卷.501(1952)]、RPMI1640培養(yǎng)基[TheJoumal of the American Medical Association.199卷，519(1967)]、199培養(yǎng)基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73卷，1(1950)]等。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為約6-8。轉化體通常在30-40℃培養(yǎng)，時間約15-60小時，必要時可以通氣或攪拌。
尤其是，用CHO(dhfr-)細胞及dhfr基因作標記時，優(yōu)選使用DMEM培養(yǎng)基，它包含經過透析幾乎不含胸腺嘧啶的牛胎血清。
為了從上述培養(yǎng)物中分離純化本發(fā)明SLC-1或MCH可以采用以下方法實施。
當從培養(yǎng)菌體或細胞中提取本發(fā)明SLC-1或MCH時，最適宜的方法是，培養(yǎng)后通過公知方法收集菌體或細胞，將其懸浮于適當?shù)木彌_液中，通過超聲波、溶菌酶和/或反復凍融法等破碎菌體或細胞，經過離心沉淀和過濾得到本發(fā)明SLC-1或MCH的粗提取液。緩沖液中也可以加入蛋白變性劑如尿素和/或鹽酸胍等，表面活性劑如Triton X-100等(注冊商標。下文通常簡稱為TM)。
當本發(fā)明SLC-1或MCH被分泌在培養(yǎng)液中時，結束培養(yǎng)后，按照公知方法離心將菌體或細胞，使它們與上清液分開，收集上清液。
上清或包含在所獲抽提物中的本發(fā)明SLC-1或MCH可通過將已知的分離和純化方法適當組合來進行純化。這些眾所周知的分離純化方法包括利用溶解性差異的方法如鹽析、溶劑沉淀等；主要利用分子量差異的方法如透析、超濾、凝膠過濾、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳等；利用電荷差異的方法如離子交換層析等；利用特異性親和力差異的方法如親和層析等；利用疏水性差異的方法例如反相高效液相色譜等；利用等電點差異的方法如等電聚焦電泳或層析聚焦等。
當如此獲得的本發(fā)明SLC-1或MCH為游離形式時，可用眾所周知的方法或其改良法將其轉換為鹽。相反，當獲得的本發(fā)明SLC-1或MCH為鹽時，可用眾所周知的方法或改良法將其轉換為游離形式或另一種鹽形式。
重組產生的本發(fā)明SLC-1或MCH，在純化前或純化后，可用相應蛋白修飾酶處理，從而使本發(fā)明SLC-1或MCH經適當修飾，部分去除一段蛋白質(肽)。這種蛋白修飾酶的例子包括胰酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酰內肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。另外，為了切下N末端的氨基酸，可以使用公知的埃德曼降解法，該方法根據(jù)埃德曼(Edman)試劑(苯異硫氰酸)把末端氨基酸切下來。
如此產生的本發(fā)明SLC-1或MCH可以通過酶免疫測定法進行檢測，該測定使用了特異性抗原。
下面，關于篩選化合物或其鹽的方法和用于篩選化合物或其鹽的試劑盒(下文，簡化為本發(fā)明篩選方法、本發(fā)明篩選試劑盒)進行詳細闡述，所述化合物或其鹽能使MCH或其鹽和SLC-1或其鹽之間的結合特性發(fā)生變化，該篩選方法的特征為，其應用MCH或其衍生物或其鹽以及SLC-1或其鹽；該試劑盒的特征為，其應用MCH或其標記物或其鹽以及SLC-1或其鹽。
或者使用SLC-1或其鹽，或者使用與MCH或它的衍生物或其鹽形成的結合測定系(配體-受體測定系)，而所述MCH或它的衍生物或其鹽是利用了由重組型SLC-1構建的表達系，由此可以篩選上面所述的、能使MCH或其鹽和SLC-1或其鹽之間的結合特性發(fā)生變化的化合物(如，肽、蛋白質、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產物等)或其鹽。
這種化合物包括，具有SLC-1介導的細胞刺激活性(例如，促進或抑制花生四烯酸釋放、乙酰膽堿釋放、細胞內鈣離子釋放、細胞內cAMP產生、細胞內cGMP產生、磷酸肌醇的產生、細胞膜電位變化、細胞內蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的降低等的活性)的化合物；和不具有該細胞刺激活性的化合物(即SLC-1拮抗劑)。所謂[能使MCH或其鹽和SLC-1或其鹽之間的結合特性發(fā)生變化]包含兩種情況，一種情況是抑制MCH或其鹽和SLC-1或其鹽之間的結合，另一種情況是促進MCH或其鹽和SLC-1或其鹽之間的結合。
即，本發(fā)明提供一種篩選方法，該方法是篩選使本發(fā)明MCH或其鹽和SLC-1或其鹽之間的結合特性發(fā)生變化的化合物或其鹽，其特征為，(i)使SLC-1或其鹽同本發(fā)明MCH或其衍生物或其鹽在接觸時，和(ii)使所述的本發(fā)明MCH或其鹽和SLC-1或其鹽同本發(fā)明MCH或其衍生物或其鹽及待測化合物在接觸時進行兩者的比較。
在(i)和(ii)的情況下，本發(fā)明篩選方法有以下特征，例如，測定并比較其結合于該SLC-1或其鹽的配體量或其細胞刺激活性。
更具體地，本發(fā)明提供了(1)一種篩選方法，該方法是篩選一種化合物或其鹽，該化合物或其鹽能使本發(fā)明MCH或其鹽和SLC-1或其鹽之間的結合特性發(fā)生變化，其特征為，使一標記的本發(fā)明MCH或其衍生物或其鹽(當使用所述「被標記的MCH等或其鹽」作為「MCH的衍生物或其鹽」時，無須再標記。以下相同。)同所述SLC-1或其鹽接觸時，和使一標記的本發(fā)明MCH或其衍生物或其鹽及待測化合物與SLC-1或其鹽接觸時，測定并比較同該SLC-1或其鹽結合的標記本發(fā)明MCH或其衍生物或其鹽的量；(2)一種篩選方法，該方法是篩選一種化合物或其鹽，該化合物或其鹽能使本發(fā)明MCH或其鹽和SLC-1或其鹽之間的結合特性發(fā)生變化，其特征為，使一標記的本發(fā)明MCH或其衍生物或其鹽同含有SLC-1的細胞或該細胞的膜級分接觸時，和使一標記的本發(fā)明MCH或其衍生物或其鹽及待測化合物與含有SLC-1的細胞或該細胞的膜級分接觸時，測定并比較同該細胞或該細胞膜級分結合的標記本發(fā)明MCH或其衍生物或其鹽的量；(3)一種篩選方法，該方法是篩選一種化合物或其鹽，該化合物或其鹽能使本發(fā)明MCH或其衍生物或其鹽與SLC-1或其鹽之間的結合特性發(fā)生變化，其特征為，使一標記的本發(fā)明MCH或其衍生物或其鹽同，通過培養(yǎng)含有編碼SLC-1的DNA的轉化體而表達在細胞膜上的SLC-1接觸時，和使一標記的本發(fā)明MCH或其衍生物或其鹽及待測化合物同，通過培養(yǎng)含有編碼SLC-1的DNA的轉化體而表達在細胞膜上的SLC-1接觸時，測定并比較同該SLC-1結合的標記本發(fā)明MCH或其衍生物或其鹽的量。
(4)一種篩選方法，該方法是篩選一種化合物或其鹽，該化合物或其鹽能使本發(fā)明MCH或其鹽和SLC-1或其鹽之間的結合特性發(fā)生變化，其特征為，使能活化SLC-1的化合物(例如，MCH或其衍生物或其鹽)同含有SLC-1的細胞接觸時，和能使活化SLC-1的化合物及待測化合物與含有SLC-1的細胞接觸時，測定并比較SLC-1介導的細胞刺激活性(例如，促進或抑制花生四烯酸釋放、乙酰膽堿釋放、細胞內鈣離子釋放、細胞內cAMP產生、細胞內cGMP產生、磷酸肌醇的產生、細胞膜電位變化、細胞內蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的降低等的活性)；以及(5)一種篩選方法，該方法是篩選一種化合物或其鹽，該化合物或其鹽能使本發(fā)明MCH或其鹽和SLC-1或其鹽之間的結合特性發(fā)生變化，其特征為，使能活化SLC-1的化合物(例如，MCH或其衍生物或其鹽)同，通過培養(yǎng)含有編碼SLC-1的DNA的轉化體而表達在細胞膜上的SLC-1接觸時，和能使活化SLC-1的化合物及待測化合物同，通過培養(yǎng)含有編碼SLC-1的DNA的轉化體而表達在細胞膜上的SLC-1接觸時，測定并比較SLC-1介導的細胞刺激活性(例如，促進或抑制花生四烯酸釋放、乙酰膽堿釋放、細胞內鈣離子釋放、細胞內cAMP產生、細胞內cGMP產生、磷酸肌醇的產生、細胞膜電位變化、細胞內蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的降低等的活性)。
下面進一步說明所述篩選方法。
首先，作為用于本發(fā)明篩選方法的SLC-1，只要其含有所述SLC-1的均可，但是優(yōu)選含有SLC-1等的人、溫血動物及魚類臟器的細胞膜級分。然而人的臟器最難獲得，因此用于本發(fā)明篩選方法的SLC-1等，通過重組體才適用于能大量表達人的SLC-1等。關于人型SLC-1，比較現(xiàn)有文獻(FEBSLetters 398，253-258(1996))中的氨基酸序列所示的SLC-1，使用含有SEQ IDNO11所示氨基酸序列的SLC-1可以進行高敏感度的篩選。
在生產本發(fā)明SLC-1時，可使用上述表達方法。
在本發(fā)明篩選方法中，當使用含有SLC-1的細胞或該細胞膜級分時，可以按照隨后所述方法。
在使用含有SLC-1的細胞時，該細胞可用戊二醛、福爾馬林等固定。固定方法可以按照公知的方法實施。
所述含有SLC-1的細胞是指，已表達SLC-1的宿主細胞，而該宿主細胞，包括所述的大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等等。
所述細胞膜級分是指，破碎細胞后，用眾所周知的方法獲得的含有大量細胞膜的級分。其中細胞破碎法包括，用Potter-Elvehjem勻漿器擠壓、用Waring blender或Polytron(Kinematica公司產品)破裂、超聲破裂、用Frenchpress加壓使細胞通過細嘴噴射而破裂。細胞膜組分分離主要通過離心力來實現(xiàn)，如分級離心和密度梯度離心。例如，細胞破碎液在低速(500-3000rpm)離心一小段時間(正常為1-10分鐘)，得到的上清高速(15000-30000rpm)通常離心0.5-2小時。由此獲得的沉淀部分用作細胞膜級分。細胞膜級分富含表達的SLC-1以及膜成分如細胞來源的磷脂和膜蛋白。
在含有該SLC-1等的細胞和細胞膜級分中，SLC-1含量優(yōu)選103-108分子/細胞，更優(yōu)選105-107分子/細胞。隨著表達量的增加，單位細胞膜級分的配體結合活性(比活)增加，因而不但可以構建高敏感篩選體系，而且可以在同一批獲得大量的樣品。
為了篩選使本發(fā)明MCH或其鹽與SLC-1等之間的結合特性發(fā)生變化的化合物而進行所述的(1)-(3)，需要合適的SLC-1級分和標記的本發(fā)明配體或有配體活性的化合物(MCH或其衍生物)。所述SLC-1級分優(yōu)選天然的SLC-1級分，或與其具有同等活性的重組型SLC-1級分。此處術語“同等活性”是指在配體結合活性等同天然SLC-1所擁有的活性等同。作為標記的配體或有配體活性的化合物，有標記的配體或有配體活性的化合物(MCH或其衍生物)等。例如它們用[3H]、[125I]、[14C]或[35S]等標記。尤其是利用，用試劑通過眾所周知的方法而得到的MCH衍生物的標記物。
所述MCH衍生物的標記物的實例包括，例如，所述的(1)-(7)所示化合物。
具體地說，為了篩選使本發(fā)明MCH或其鹽與SLC-1之間的結合特性發(fā)生變化的化合物，首先，將含有SLC-1的細胞或其膜級分懸浮于本方法的相應的緩沖液中，制備標準受體?？梢允褂萌魏尉彌_液，只要它不干擾配體-受體結合。此類緩沖液有pH值約4-10(優(yōu)選6-8)的磷酸緩沖液或Tris-HCl緩沖液。為了降低非特異結合，可任選在緩沖液中加入表面活性劑如CHAPS、Tween-80TM(Kao-Atlas公司)、毛地黃皂甘或脫氧膽酸。為了抑制蛋白酶對SLC-1或其衍生物的降解，可加入蛋白酶抑制劑如PMSF、亮抑蛋白酶肽、E-64(Peptide Institute公司產品)和胃蛋白酶抑制劑。將一定量(5000-500000cpm)的標記的SLC-1或其衍生物加入到0.01-10ml的受體溶液中，同時還存在有10-4M-10-1μM的待測化合物。為了測定非特異性結合(NSB)，需提供一個含有過量未標記的SLC-1或其衍生物反應管。在約0-50℃(優(yōu)選約4-37℃)反應20分鐘-24小時(優(yōu)選30分鐘-3小時)。在反應完成后，反應混合物用玻璃纖維濾紙等過濾，用適量的相同緩沖液洗滌。然后用閃爍計數(shù)器或λ-計數(shù)儀測定在玻璃纖維濾紙中的殘留放射活性。在不存在拮抗物時，從其值(B0)中減去非特異結合值(NSB)而得到的(B0-NSB)，作100％時，特異的結合量(B-NSB)，可以以有抑制拮抗能力的增補物質進行選擇，例如，抑制低于50％的待測化合物。
測定本發(fā)明SLC-1和MCH或其衍生物之間的結合方法可以使用BIAcore(Amerham Pharmacia Biotech公司產品)。在這個方法中，按照儀器所附說明書中的氨基結合法將MCH或其衍生物固定于傳感器芯片上，在其傳感器芯片上以2-20μl/分的流速使磷酸或Tris等的緩沖液通過，磷酸緩沖液包含膜級分I、或膜級分II以及待測化合物，膜級分I或含有SLC-1或含有的SLC-1是從含有SLC-1細胞或含有編碼SLC-1的DNA的轉化體純化而來的；膜級分II或含有SLC-1或含有純化的SLC-1。由于在傳感器上MCH或其衍生物與SLC-1結合而使胞質團表面發(fā)生共鳴，同時存在的待測化合物也隨之變化通過觀察這種變化可以篩選使SLC-1和MCH之間的結合改變的化合物。該方法也可同樣地進行下述的測定將SLC-1固定于傳感器芯片上，在其傳感器上使含有MCH或其衍生物，或含有MCH或其衍生物及待測化合物的磷酸緩沖液或Tris緩沖液通過的方法。待測化合物與上面所述一樣。
用于篩選使本發(fā)明MCH或其鹽和SLC-1或其鹽之間的結合特性改變的化合物用所述(4)-(5)的方法進行?？砂凑毡娝苤姆椒ɑ蛏唐坊姆治鲈噭┖衼頊y定SLC-1介導的細胞刺激活性(例如，促進或抑制花生四烯酸釋放、乙酰膽堿釋放、細胞內鈣離子釋放、細胞內cAMP產生、細胞內cGMP產生、磷酸肌醇的產生、細胞膜電位變化、細胞內蛋白的磷酸化、c-fos的激活和pH的降低的活性)。具體地說，首先，將包含SLC-1的細胞在多孔平板上培養(yǎng)。在篩選之前，先置換新鮮培養(yǎng)基或對細胞無毒的緩沖液，加入待測化合物并保溫一定時間，然后提取細胞或回收上清將反應產物用各種方法進行定量。當利用細胞內的分解代謝酶測定作為細胞刺激活性指示劑的物質(例如花生四烯酸)的產生有困難時，可加入該分解代謝酶的抑制劑進行測定?？梢詸z測cAMP產生的抑制活性等活性，作為細胞抑制活性，所述細胞受毛喉素等刺激而導致基本生產量增加。
測定細胞刺激活性而進行篩選時，需要合適的能表達SLC-1的細胞。其細胞優(yōu)選具有所述重組型SLC-1表達細胞系，SLC-1表達轉化體可以是穩(wěn)定表達系或暫時性表達系。動物細胞可以使用所述的種類。
其中待測化合物包括，例如肽、蛋白質、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產物、細胞提取液、植物提取液、動物組織提取液等。
關于所述配體-受體檢測系統(tǒng)，具體地使用下述的檢測系統(tǒng)。
(1)受體表達細胞若被受體激動劑刺激的話，細胞內的G蛋白被活化便與GTP結合。這種現(xiàn)象在受體表達細胞的膜級分中也能觀察到。通常地，GTP加水分解生成GDP，而在反應液中事先添加GTPγS，則GTPγS與GDP同樣結合到G蛋白上，但不加水分解而是保持與含有G蛋白的細胞膜結合的狀態(tài)。若用標記的GTPγS通過檢測殘存在細胞膜上的放射性活性可以測定受體激動劑對受體表達細胞刺激的活性。利用該反應，可以測定MCH或其衍生物對SLC-1表達細胞的刺激活性。該方法并不是如所述的(4)-(5)使用含有SLC-1細胞，而是像所述(1)-(3)一樣是使用含有SLC-1膜級分的檢測法，但是該方法是如所述(4)-(5)測定細胞刺激活性的，在本測定法中，顯示對SLC-1膜級分促進GTPγS結合活性的物質是激動劑。具體地說，可根據(jù)隨后所述實施例9、實施例16以及它們的改良法進行實施。在此，添加MCH或其衍生物，或者添加MCH或其衍生物以及待測化合物，與單獨添加MCH或其衍生物進行比較，通過觀察GTPγS與SLC-1細胞膜級分產生促進結合活性的變化可以篩選使MCH與SLC-1之間的結合改變的化合物。此時可以選擇能顯示MCH或其衍生物對SLC-1細胞膜級分促進GTPγS結合活性的化合物作為有拮抗抑制能力的增補物質。另一方面，只僅待測化合物，也可通過觀察GTPγS與SLC-1細胞膜級分產生促進結合活性的變化可以篩選激動劑。
下面更具體地敘述有關篩選法的例子。根據(jù)下面將要敘述的實施例9或實施例16的方法制備的人或大鼠含有SLC-1的細胞膜級分，用稀釋膜的緩沖液(50mM Tris，5mM MgCl2，150mM NaCl，1μMGDP，0.1％BSA pH7.4)稀釋該膜級分。稀釋度因受體表達的量而不同。將稀釋的膜級分各自裝入0.2ml的Falcon中，加MCH或其衍生物或者加MCH或其衍生物以及待測化合物，再加[35S]GTPγS使終濃度為200Pm。25℃保溫1小時后，再加冰冷卻的洗滌緩沖液(50mM Tris，5mM MgCl2，150mM NaCl，0.1％BSA，0.05％CHAPS pH7.4 1.5ml)，用玻璃纖維濾紙GF/F過濾。65℃保溫30分鐘，干燥后用閃爍計數(shù)器測定殘留在濾紙上的膜級分中[35S]GTPγS放射活性。將只加有MCH或其衍生物實驗組的放射活性作為100％，沒有加MCH或其衍生物實驗組的放射活性作為0％，求出MCH或其衍生物對GTPγS與待測化合物結合促進活性的影響。例如，GTPγS結合促進活性低于50％時，可選擇待測化合物作為具有拮抗抑制能力的增補物質。
(2)SLC-1表達細胞由于MCH刺激而使細胞內cAMP的量減少。利用該反應可以測定MCH對SLC-1表達細胞的刺激活性。
只要能夠使SLC-1表達的動物細胞，例如對小鼠、大鼠、兔、山羊、牛等進行免疫而獲得抗cAMP抗體和125I標記cAMP(均為廠家商品)，其細胞中cAMP的產量可以通過這種廠家產品進行測定，當然這種測定也適用于RIA或抗cAMP抗體與標記cAMP組合的EIA。另外，使用針對蛋白A或針對用于產生抗cAMP抗體的動物IgG等的抗體，根據(jù)SPA法對抗cAMP抗體進行定量，即SPA法使用含有固相閃爍體珠子和125I標記cAMP(Amerham Pharmacia Biotech制作的試劑盒)。
測定cAMP產生抑制的活性更詳細的情況依據(jù)下面將要闡述的實施例14及其改進方法。在這個檢測體系中，由配體來提高細胞內cAMP水平，該配體應為如毛喉素或降鈣素等，它是一種能使細胞內cAMP水平提高的配體，通過添加MCH或其衍生物，或者添加MCH或其衍生物以及待測化合物可以觀察到細胞內cAMP水平的變化，這種變化是由于僅僅投藥MCH或其衍生物而產生的抑制細胞內cAMP的水平，進而可以篩選能使MCH與SLC-1之間的結合發(fā)生變化的化合物。同時，可以選擇一種化合物作為具有抑制拮抗能力的增補物質。這種化合物通過MCH或其衍生物的刺激顯示了對SLC-1表達細胞產生cAMP抑制活性。另外，通過只添加待測化合物來研究cAMP產生抑制活性，由此可以篩選具有激動劑活性的化合物。
下文較詳細地闡述篩選方法。以每孔細胞密度為5×104個，將CHO/SLC-1細胞播種于24孔平板上，培養(yǎng)48小時。用含有0.2mM的3-異丁基甲基黃嘌呤和0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s緩沖液(pH7.4)洗滌(下文，將含有0.2mM的3-異丁基甲基黃嘌呤和0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s緩沖液(pH7.4)稱作反應緩沖液)細胞。然后加0.5ml的反應緩沖液于培養(yǎng)箱保溫30分鐘。除去反應緩沖液，加入新的反應緩沖液0.25ml之后，再給細胞添加0.25ml的2μM毛喉素反應緩沖液，該緩沖液已加有1nM的MCH或其衍生物或者1nM的MCH或其衍生物以及待測化合物，37℃下反應24分鐘。再加100μl的20％高氯酸停止反應，接著于冰塊上放置1小時，進而提取細胞內cAMP。用cAMP EIA試劑盒(AmerhamPharmacia Biotech)測定提取液中的cAMP的量。用毛喉素刺激產生cAMP的量看作100％，而用1nM的MCH或其衍生物產生抑制cAMP的量看作0％，求出待測化合物對由MCH或其衍生物的刺激而產生cAMP抑制活性的影響。待測化合物抑制MCH或其衍生物的活性使cAMP產生活性例如不低于50％可以選擇待測化合物作為具有抑制拮抗能力的增補物質。
為了測定促進cAMP產生活性，使用上述方法定量在不添加毛喉素而添加待測化合物的CHO/SLC-1細胞中所產生的cAMP。
(3)將含有應答元件(CRE)的DNA，導入ピッカジ-ンベィッック載體或ピッカヅ-ン增強子載體(東洋Ink株式會社生產)的熒光素酶基因上游的多克隆位點上，以此作為CRE-報道基因載體。在轉染的CRE-報道基因載體細胞中，隨著cAMP的水平提高，進而刺激誘導CRE介導的熒光素酶基因表達和表達后的熒光素酶蛋白質的產生。也就是說，通過測定熒光素酶的活性可以檢測細胞內導入CRE-報道基因載體而引起cAMP量的變化。將CRE-報道基因載體轉染到SLC-1表達細胞利用這種細胞可以篩選能使MCH與SLC-1的結合發(fā)生改變的化合物。具體篩選方法如下。
以每孔為5×103個細胞密度將轉染CRE-報道基因的SLC-1表達細胞播種于24孔平板上，培養(yǎng)48小時。用含有0.2mM的3-異丁基甲基黃嘌呤和0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s緩沖液(pH7.4)洗滌(下文，將含有0.2mM的3-異丁基甲基黃嘌呤和0.05％的BSA和20mM的HEPESHank′s緩沖液(pH7.4)稱作反應緩沖液)細胞。然后加0.5ml的反應緩沖液于培養(yǎng)箱保溫30分鐘。除去反應緩沖液，加入新的反應緩沖液0.25ml之后，再給細胞添加0.25ml的2μM毛喉素反應緩沖液，該緩沖液已加有1nM的MCH或其衍生物或者1nM的MCH或其衍生物以及待測化合物，37℃下反應24分鐘。用ピッカヅ-ン細胞溶解劑(東洋Ink株式會社生產)使細胞溶解，在溶解液中添加發(fā)光基質(東洋Ink株式會社生產)。用發(fā)光光度計、閃爍計數(shù)器或 計數(shù)器測定熒光素酶發(fā)出的光。能使MCH與SLC-1的結合發(fā)生改變的化合物并產生了影響可以通過比較僅投藥MCH或其衍生物來測定熒光素酶發(fā)出光的大小。同時，由于MCH或其衍生物的投藥而抑制了由于毛喉素刺激而增加發(fā)光強度，但可以將能夠使這種抑制得到恢復的化合物選作具有抑制拮抗能力的增補物質。另一方面，只投藥待測化合物同投藥MCH或其衍生物一樣由于毛喉素刺激而增加發(fā)光強度，進而觀察到有同樣的抑制作用，由此可以篩選激動劑。
作為報道基因可以使用例如除了熒光素酶還有堿性磷酸酶、氯霉素-乙?；D移酶或β-半乳糖苷酶。這些報道基因的基因產物酶活性如下所述用廠家的測定試劑盒能簡單地測定。例如堿性磷酸酶的活性用和光純藥生產的Lumi-phos 530、氯霉素-乙酰基轉移酶(chlormphenicol acetyltransferase)活性用和光純藥生產的FAST CAT Chlormphenicol Acetyltransferase AssayKIT、β-半乳糖苷酶活性用和光純藥生產的AuroraGal-XE測定。
(4)SLC-1表達細胞受到MCH刺激后將花生四烯酸代謝產物釋放于細胞外。事先將有放射活性的花生四烯酸攝取細胞內再將該活性釋放于細胞外，可以測定其放射活性。測定方法可以根據(jù)隨后所述實施例6以及其改良方法。添加MCH或其衍生物或者添加MCH或其衍生物以及待測化合物，研究MCH或其衍生物對花生四烯酸代謝產物釋放活性的影響，由此可以篩選影響于MCH與SLC-1之間結合的化合物。由于MCH或其衍生物的刺激使花生四烯酸代謝產物釋放，抑制這種活性的化合物將作為篩選有拮抗抑制能力的增補物質。另外，僅添加待測化合物，用隨后所述改良的實施例6方法研究SLC-1表達細胞釋放花生四烯酸代謝產物活性，由此可以篩選具有激動劑活性的化合物。這種篩選化合物的方法通過下面具體闡述。
以每孔為5×104個細胞密度將CHO/SLC-1細胞播種于24孔平板上，培養(yǎng)24小時后，加[3H]花生四烯酸使每孔為0.25μCi。添加[3H]花生四烯酸16小時之后，用含有0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s緩沖液(pH7.4)洗滌細胞，各孔添加500μl的緩沖液，該緩沖液含有終濃度為10nM的MCH或其衍生物或者10nM的MCH或其衍生物以及待測化合物，這些化合物溶于含有0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s緩沖液(pH7.4)。以下，將含有0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s緩沖液(pH7.4)稱作反應緩沖液。37℃下保溫60分鐘。然后將400μl的反應液加入閃光劑中，用閃光計數(shù)器測定釋放于反應液中的[3H]花生四烯酸代謝物的產量。將未添加有MCH或其衍生物的反應緩沖液的培養(yǎng)基中[3H]花生四烯酸代謝物的產量看作0％，將添加10nM的MCH或其衍生物的培養(yǎng)基中[3H]花生四烯酸代謝物的產量看作100％，求出待測化合物對MCH或其衍生物與SLC-1之間結合的影響?；ㄉ南┧岽x產物活性如果低于50％，可以將待測化合物選作具有拮抗抑制能力的增補物質。
(5)SLC-1表達細胞通過MCH刺激使細胞內Ca離子濃度增大，由此可以研究待測化合物對MCH與SLC-1之間結合的影響。
將SCL-1表達細胞播種于滅菌的顯微鏡用蓋玻片，2天后，將培養(yǎng)液置換于懸浮的4mM Fura-2 AM(同仁化學研究所)HBSS，室溫放置2小時30分。用HBSS洗滌后，將蓋玻片放入比色杯中，用熒光測定儀測定505nm熒光強度比之差，這是在激發(fā)波長為340nm及380nm的情況下測定的，同時加入MCH或其衍生物或者加入MCH或其衍生物以及待測化合物。這時比較僅投藥MCH或其衍生物產生熒光強度的變化，根據(jù)測定添加待測化合物而產生的熒光強度的變化可以篩選對MCH和SLC-1之間結合產生影響的化合物。如下所述，還可使用FLIPR(モレキュラ-デバィス公司產品)裝置進行篩選。即，細胞懸浮液含有Fluo-3M(同仁化學研究所監(jiān)制)，經過細胞吸收之后，離心，洗滌數(shù)次上清液后，將細胞播種于96孔平板之上。放入FLIPR裝置中，同F(xiàn)ura-2一樣加入MCH或其衍生物或者加入MCH或其衍生物以及待測化合物。這時比較僅投藥MCH或其衍生物產生熒光強度的變化，根據(jù)測定添加待測化合物而觀察到的熒光強度的變化可以篩選對MCH和SLC-1之間結合產生影響的化合物。在這些情況下，將由于添加MCH或其衍生物而抑制熒光強度增大的化合物選作具有拮抗抑制能力的增補物質。另一方面，也可根據(jù)由于僅添加待測化合物而增大熒光強度來篩選激動劑。
如水母發(fā)光蛋白一樣隨著細胞內Ca離子濃度的增大而發(fā)光，首先使這樣的蛋白質基因在SLC-1細胞中同時表達，隨著細胞內Ca離子濃度的增加，水母發(fā)光蛋白與Ca結合形成結合蛋白而發(fā)光，利用這個特點，添加MCH或其衍生物或者加入MCH或其衍生物以及待測化合物，然后與僅投藥MCH或其衍生物進行比較，通過測定添加待測化合物而產生發(fā)光強度的變化，可以篩選對MCH和SLC-1之間結合產生影響的化合物。其篩選方法同上，但沒有吸收熒光物質的除外。
(6)眾所周知，在能夠表達受體的細胞中添加受體激動劑，細胞內肌醇三磷酸濃度增大。MCH的刺激觀察到SLC-1細胞產生所述的反應，由此可以篩選對MCH和SLC-1之間結合產生影響的化合物。將細胞播種于24孔平板上，給培養(yǎng)第一天的細胞添加肌醇[2-3H](2.5μCi/Well)，在培養(yǎng)基中充分清洗培養(yǎng)1天的細胞，然后，再添加MCH或其衍生物或者加入MCH或其衍生物以及待測化合物，之后加10％的高氯酸停止該反應。用1.5M KOH、60mM HEPES溶液中和，再過0.5ml的Aglx8樹脂柱(Bio-Rad)，用5mMNa2BO360mMHCOONH4洗滌，再用閃爍計數(shù)器測定用1MHCOONH40.1MHCOOH洗脫的放射活性。將未添加有MCH或其衍生物的反應緩沖液的培養(yǎng)基中放射活性看作0％，將添加有MCH或其衍生物的培養(yǎng)基中放射活性看作100％，求出待測化合物對MCH或其衍生物與SLC-1之間結合的影響。肌醇三磷酸產生活性如果低于50％，可以將待測化合物選作具有拮抗抑制能力的增補物質。
(7)將含有佛波酯應答元件(TRE)的DNA，導入ピ ッカヅ-ンベィッック載體或ピッカヅ-ン增強子載體(東洋Ink株式會社生產)的熒光素酶基因上游的多克隆位點上，以此作為TRE-報道基因載體。在轉染的TRE-報道基因載體細胞中，隨著cAMP的水平提高，進而刺激誘導TRE介導的熒光素酶基因表達和表達后的熒光素酶蛋白質的產生。也就是說，通過測定熒光素酶的活性可以檢測細胞內轉染TRE-報道基因載體而引起cAMP量的變化。將TRE-報道基因載體轉染到SLC-1表達細胞利用這種細胞可以篩選能使MCH與SLC-1的結合發(fā)生改變的化合物。具體篩選方法如下。
以每孔為5×103個細胞密度將轉染TRE-報道基因的SLC-1表達細胞播種于24孔平板上，培養(yǎng)48小時。用含有0.05％的BSA和20mM的HEPESHank′s緩沖液(pH7.4)洗滌細胞。添加10nM的MCH或其衍生物或者添加10nM的MCH或其衍生物以及待測化合物，37℃下反應60分鐘。用細胞溶解劑(東洋Ink株式會社生產)使細胞溶解，在溶解液中添加發(fā)光基質(東洋Ink株式會社生產)。用光度計、液體閃爍掃描計數(shù)器或計數(shù)器測定熒光素酶發(fā)出的光。能使MCH與SLC-1的結合發(fā)生改變的化合物并產生了影響可以通過比較僅投藥MCH或其衍生物來測定熒光素酶的發(fā)光量。同時，由于MCH或其衍生物的投藥使細胞內Ca離子濃度提高進而增加了發(fā)光量，但是能夠抑制這種增加發(fā)光量的化合物，可選作具有拮抗抑制能力的增補物質。另一方面，只投藥待測化合物同投藥MCH或其衍生物一樣觀察到發(fā)光量的增加，可以篩選激動劑。
作為報道基因可以使用例如除了熒光素酶，還有堿性磷酸酶、氯霉素-乙?；D移酶或β-半乳糖苷酶。這些報道基因的基因產物酶活性如下所述，用廠家的測定試劑盒能簡單地測定。例如堿性磷酸酶的活性用和光純藥生產的Lumi-Phos 530、氯霉素-乙?；D移酶(chlormphenicolacetyltransferase)活性用和光純藥生產的FAST CAT chlormphenicolAcetyltransferase Assay KIT、β-半乳糖苷酶活性用和光純藥生產的AuroraGal-XE測定。
(8)對MCH產生效應的SLC-1表達細胞由于MAP激酶的激活而觀察到了增殖。根據(jù)MAP激酶的激活、胸腺嘧啶脫氧核苷的摻入、細胞數(shù)的計測(MTT等)可以檢測其增殖情況。由此可以對能夠改變MCH或其衍生物與SLC-1結合的化合物進行篩選。
有關MAP激酶活性的檢測，是將MCH或其衍生物、或者MCH或其衍生物及待測化合物添加于細胞內，然后從細胞溶解液中獲得抗MAP激酶抗體，經過免疫沉淀法得到MAP激酶級分，再使用例如，和光純藥生產的MAP Kinase Assay Kit和γ-[32P]-ATP很容易檢測到MAP激酶活性。有關摻入胸腺嘧啶脫氧核苷活性的檢測，首先播種SLC-1表達細胞，將MCH或其衍生物、或者MCH或其衍生物及待測化合物添加于細胞內，然后加[methyl-3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷，溶解該細胞，根據(jù)閃爍計數(shù)器的計數(shù)來檢測摻入細胞內標記胸腺嘧啶脫氧核苷的放射性。
有關SLC-1表達細胞增殖的檢測，首先播種表達細胞，再添加MCH或其衍生物、或者MCH或其衍生物及待測化合物于細胞內，進而添加MTT[(3-4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑嗡溴化物]，MTT被細胞吸收后由MTT變?yōu)镸TT甲臜，用鹽酸使MTT甲臜酸化并同異丙醇一起溶解細胞，然后在570nm吸收波長處進行測定，進而檢測細胞的增殖情況。
利用摻入的標記胸腺嘧啶脫氧核苷活性來篩選能使MCH與SLC-1結合發(fā)生改變的化合物，具體篩選過程如下在24孔平板上每孔播種5000個SLC-1表達細胞，培養(yǎng)1天。再在不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，使細胞處于饑餓狀態(tài)。給細胞添加MCH或其衍生物、或者MCH或其衍生物及待測化合物，培養(yǎng)24小時，再在每個孔里添加0.015MBq的[methyl-3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷，培養(yǎng)6個小時。用PBS洗滌細胞，然后加入甲醇放置10分鐘。加5％三氯醋酸放置15分鐘后，用蒸餾水將固定的細胞洗滌4次。再用0.3N氫氧化鈉溶液溶解細胞，用閃爍計數(shù)器測定溶解液中的放射活性。有關檢測能使MCH與SLC-1結合發(fā)生改變的化合物帶來的影響，主要通過只給藥MCH或其衍生物，并比較摻入的胸腺嘧啶脫氧核苷使放射活性增大，這時由于給藥MCH或其衍生物而使放射活性增大，但是所述化合物抑制了這種放射活性的增加，進而可以選擇該化合物作為具有抑制拮抗能力的增補物質。另一方面，只投藥待測化合物其效果與投藥于MCH或其衍生物相同，并觀察到放射活性的增加，由此可以進行激動劑的篩選。
(9)若添加MCH于SLC-1表達細胞，K離子通道被激活，細胞內的K離子被釋放到細胞外。K離子和同族元素的Rb離子通過與K離子無區(qū)別的K離子通道釋放到細胞外，因此加入標記的Rb(86Rb)使細胞吸收，然后通過MCH刺激測定釋放出來的(86Rb)，由此可以檢測MCH的作用。利用(86Rb)釋放活性來篩選能使MCH與SLC-1結合發(fā)生改變的化合物，具體篩選過程如下播種于24孔平板上將培養(yǎng)2天的SLC-1表達細胞于含有1mCi/ml培養(yǎng)基中保溫2小時。充分洗滌培養(yǎng)基，完全清除細胞外溶液中的86RbCl，添加MCH或其衍生物、或者MCH或其衍生物及待測化合物，30分鐘后回收細胞外溶液，用γ計數(shù)器測定放射活性。有關檢測能使MCH或其衍生物與SLC-1結合發(fā)生改變的化合物帶來的影響，主要通過只給藥MCH或其衍生物，并比較由于[86Rb]的釋放使放射活性增強，這時由于給藥MCH或其衍生物而使放射活性增大，但是所述化合物抑制了這種放射活性的增加，進而可以選擇該化合物作為具有抑制拮抗能力的增補物質。另一方面，只投藥待測化合物其效果與投藥于MCH或其衍生物相同，并觀察到放射活性的增加，由此可以進行激動劑的篩選。
(10)利用Cytosensor裝置(モレキュラ-デバィス公司產品)測定由于SLC-1表達細胞與MCH反應而引起細胞外pH(acidification rate)的變化，由此可以測定MCH的活性。用Cytosensor裝置測定細胞外pH的變化可以篩選能使MCH與SLC-1結合發(fā)生改變的化合物，具體篩選過程如下在Cytosensor裝置內的膠囊中過夜培養(yǎng)SLC-1表達細胞，其容器中待細胞外pH穩(wěn)定以后，灌注含有0.1％BSA的RPMIl640培養(yǎng)基(モレキュラ-デバィス公司產品)約2個小時。待pH穩(wěn)定后，將含有MCH或其衍生物、或者MCH或其衍生物及待測化合物的培養(yǎng)基灌注于細胞之上，由此測定培養(yǎng)基的pH變化。有關檢測能使MCH與SLC-1結合發(fā)生改變的化合物帶來的影響，主要通過只給藥MCH或其衍生物，并比較由于SLC-1表達細胞的細胞外pH變化，這時由于給藥MCH或其衍生物而使細胞外pH變化，但是所述化合物抑制了這種放射活性的增加，進而可以選擇該化合物作為具有抑制拮抗能力的增補物質。另一方面，只投藥待測化合物其效果與投藥于MCH或其衍生物相同，并觀察細胞外pH變化，由此可以進行激動劑的篩選。
(11)酵母(Saccharomyces cerevisiae)的單倍體交配型(hapoidα-matingType)(MATα)的性信息素受體STe2與G蛋白Gpal結合，應答于性信息素α-交配因子(mating factor)并激活MAP激酶，以下，F(xiàn)arl(細胞周期停滯、cellcycle arrest)以及轉錄活化因子Ste12被激活。Ste12誘導各種蛋白質的表達，其蛋白質含有與接合有關的FUS1。另一方面，調節(jié)因子Sst2具有抑制以上過程的功能。在這個抑制系統(tǒng)中，形成轉導受體基因的酵母，根據(jù)受體激動劑的刺激，激活酵母細胞內信號傳導系，可以嘗試構建受體激動劑與受體之間的反應測定體系，這個體系中利用了刺激結果而產生的增殖等指標[Pausch，M.H.，Tredns in Biotechnology，vol.15，pp.487-494(1997)]。利用如此構建的轉導受體基因酵母的體系，可以進行篩選能使MCH與SLC-1之間結合特性發(fā)生變化的化合物。
除去編碼MATα酵母的Ste2以及Gpal的基因，取而代之的是導入SLC-1基因以及編碼Gpal-Gai2結合蛋白的基因。除去編碼Far基因以不使細胞周期停滯(cell-cycle arrest)，再除去編碼Sst的基因，由此可以使應答于MCH的敏感性增強。將合成組氨酸的基因HIS3與FUS1連接而轉導FUS1-HIS3基因。這些基因重組的操作過程依照例如，Price等[Price，L.A.et al.，Molecurlar and Cellular Biology，vol.15，PP.6188-6195(1995)]所述的方法，通過將生長釋放抑制激素受體2型(SSTR2)基因置換為SLC-1，進而可以簡便地進行基因重組。這樣所構建的酵母性狀改變對SLC-1的配體即MCH敏感度很高，其結果是，激活MAP激酶產生合成組氨酸的酶，在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基中可以生長發(fā)育。根據(jù)這個酵母在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基中發(fā)育的一個指標，可以觀察到對MCH而產生效應的SLC-1表達酵母。下面，闡述篩選能使MCH與SLC-1之間結合特性發(fā)生改變的化合物。
如上所述，將性狀改變的酵母過夜培養(yǎng)于完全為合成的培養(yǎng)基中即，液體培養(yǎng)基，加入已不含組氨酸的溶解瓊脂培養(yǎng)基，其濃度為2×104cell/ml，并播種于9×9cm的角形平板上。瓊脂固化后，將浸透有MCH或其衍生物、或者MCH或其衍生物以及待測化合物的滅菌濾紙覆蓋于瓊脂表面之上，30℃下培養(yǎng)3天。有關檢測能使MCH與SLC-1結合發(fā)生改變的化合物而帶來的影響，主要通過只給藥MCH或其衍生物，并比較由于濾紙周圍酵母的生長發(fā)育，這時由于給藥MCH或其衍生物而使酵母的生長發(fā)育，但是所述化合物抑制了這種生長發(fā)育，進而可以選擇該化合物作為具有抑制拮抗能力的增補物質。另一方面，只投藥待測化合物其效果與投藥于MCH或其衍生物相同，并觀察酵母的生長發(fā)育，由此可以進行激動劑的篩選。還有，事先添加MCH或其衍生物于瓊脂培養(yǎng)基中，僅使滅菌的濾紙浸透有待測化合物并進行培養(yǎng)，在整個平板上觀察到濾紙周圍受到酵母發(fā)育的影響，由此也可以研究使MCH與SLC-1結合發(fā)生改變的化合物而帶來的影響。
(12)將SLC-1的RNA注入到非洲爪蟾卵母細胞中，若用MCH刺激，細胞內Ca離子濃度增大，產生氯化鈣活化流(Calcium-activated chloridecurrent)。進而可以形成膜電位的變化(與K離子濃度梯度變化相同)。根據(jù)在由MCH而轉導SLC-1非洲爪蟾的卵母細胞中觀察到這種反應，由此可以篩選使MCH與SLC-1之間結合給予變化的化合物。
因冷凍而不能活動的雌性非洲爪蟾，從中取出卵母細胞塊，將卵塊溶于MBS(88mM NaCl，1mM KCl，0.41mM CaCl2，0.33mM Ca(NO3)2，0.82mM MgSO4，2.4mM NaHCO3，10nM HEPES，pH7.4)，其中含有膠原酶(0.5mg/ml)待卵塊溶化后，于19℃，用150rpm處理1-6個小時。把細胞外溶液換成MBS液，再洗滌3次，用顯微操作器將poly(A)+SLC-1cDNA(50ng/50nl)進行顯微注射。SLC-1 mRNA或者取自于組織和細胞、或者在體外由質粒轉錄形成。將SLC-1 mRNA于MBS溶液中20℃下培養(yǎng)3天。將它放入voltage clamp裝置的凹處，用林格溶液(Ringer液)沖洗，再將用于固定電位的玻璃微電極、用于測定電位的玻璃微電極插入細胞內，負極置于細胞外。待電位平穩(wěn)后，用含有MCH或其衍生物、或者MCH或其衍生物以及待測化合物的林格溶液(Ringer液)沖洗，記錄電位變化。有關檢測能使MCH與SLC-1結合發(fā)生改變的化合物而帶來的影向，主要通過只給藥MCH或其衍生物，并比較轉導SLC-1非洲爪蟾卵母細胞，這時由于給藥MCH或其衍生物而引起卵細胞膜電位的變化，但是所述化合物抑制了這種生長發(fā)育，進而可以選擇該化合物作為具有抑制拮抗能力的增補物質。另一方面，只投藥待測化合物其效果與投藥于MCH或其衍生物相同，并觀察到細胞膜電位的變化，由此可以進行激動劑的篩選。
在這個體系中，也可以導入各種G蛋白基因的poly(A)+RNA，以增大變化量使反應更容易進行測定。如水母發(fā)光蛋白在Ca存在的情況下，進行共同注射帶有發(fā)光性質蛋白基因的poly(A)+RNA，由此可以觀察到沒有膜電位變化的發(fā)光現(xiàn)象也可以測定該反應。
篩選能使MCH或其鹽與SLC-1或其鹽之間的結合特性發(fā)生改變的化合物或其鹽的試劑盒包括，SLC-1或其鹽、或含有SLC-1的細胞、或者含有SLC-1的細胞膜級分、以及MCH或其衍生物或其鹽。
本發(fā)明篩選試劑盒包括如1.用于篩選的試劑(1)用于分析和沖洗的緩沖液加有0.05％牛血清白蛋白(Sigma公司)的Hank’s平衡鹽溶液(Gibco公司產品)。
溶液用0.45μm孔徑濾膜過濾滅菌并在4℃貯存?；蚩梢栽谂R用時配制。
(2)SLC-1標樣將表達SLC-1的CHO細胞在12孔板上傳代培養(yǎng)，每孔5×105細胞，37℃，5％CO2和95％空氣保溫培養(yǎng)兩天。
(3)標記的配體用[3H]、[125I]、[14C]或[35S]標記本發(fā)明的MCH。
溶于適當?shù)娜軇┗蚓彌_液中，并將其保存在4℃或-20℃。溶液在使用時用分析緩沖液稀釋到1μM。
(4)體標準液將MCH溶解于含有0.1％牛血清白蛋白(Sigma公司)的PBS使之濃度為1mM，-20℃保存。
2分析方法(1)用于表達SLC-1的CHO細胞在12孔板上進行培養(yǎng)。在用1ml的用于分析的緩沖液洗滌2次后，每孔加入490μl該緩沖液。
(2)加5μl的10-3M-10-10M的待測化合物，向所述系統(tǒng)中加5μl的標記MCH，得到的混合液在室溫保溫1小時。為了測定非特異結合，在所述系統(tǒng)中加5μl的10-3M的配體(MCH)而不是待測化合物。
(3)除去孔中的反應混合液，將培養(yǎng)孔洗滌3遍，每次均用1ml的洗滌液。用0.2NNaOH-1％SDS溶解與細胞結合的標記配體(MCH)，然后與4ml的液閃劑A(和光純藥公司產品)混合。
(4)用閃爍計數(shù)器(Beckman公司產品)測定放射性。其最大結合量用下式求得PMB＝[(B-NSB)/(B0-NSB)]×100PMB最大結合百分率B 加樣時的值NSB非特異結合量B0最大結合量利用本發(fā)明的篩選方法或篩選試劑盒得到的化合物或其鹽是一種能使MCH或其鹽與SLC-1或其鹽之間的結合改變(抑制或促進結合)的化合物，具體地說，它們是一種介導SLC-1刺激細胞活性(所謂的SLC-1激動劑)、或者非刺激細胞活性(所謂的SLC-1拮抗劑)的化合物或其鹽。所述這種化合物為肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、發(fā)酵化合物等，這些化合物有新的或已知的。
評價上面所述的化合物是激動劑還是拮抗劑，其具體方法如(i)或(ii)。
(i)用上面所述(1)-(3)的篩選方法實施的結合測定，得到能使MCH或其鹽與SLC-1或其鹽之間的結合特性改變(特別是抑制結合)的化合物，然后測定該化合物介導SLC-1是否具有刺激細胞的活性。若具有細胞刺激活性的化合物或其鹽則為SLC-1激動劑，若該化合物不具有細胞刺激活性的化合物或其鹽則為SLC-1拮抗劑。
(ii)(a)讓待測化合物與含有SLC-1的細胞接觸，測定介導上述SLC-1的細胞刺激活性，若有活性的話，則為SLC-1激動劑。(b)讓能激活SLC-1的化合物(例如，本發(fā)明的多肽或SLC-1激動劑等)與含有SLC-1的細胞接觸，同時讓能激活SLC-1的化合物以及待測化合物與含有SLC-1的細胞接觸，來測定并比較介導SLC-1的細胞刺激活性。能夠使由激活SLC-1的化合物而引起細胞刺激活性的改變，若降低細胞刺激活性的化合物或其鹽則為SLC-1拮抗劑。
該SLC-1激動劑同MCH或其鹽一樣對SLC-1具有生理活性，因此，SLC-1激動劑同MCH或其鹽一樣，安全低毒適用作藥物。
相反，SLC-1拮抗劑可以抑制MCH或其鹽對SLC-1產生的生理活性，因此，SLC-1拮抗劑可作為抑制該受體活性的一種藥物，這種藥物既安全又低毒。
MCH或其鹽與增進食欲(攝食)作用以及促進催產素分泌作用等有關，因此可以用作增加食欲(攝食)的藥物或促進催產素分泌的藥物等，用所述篩選方法或篩選試劑盒得到該化合物，其中SLC-1激動劑除了用作增加食欲(攝食)藥物外，還可用作如下病癥的治療或預防藥物等，如微弱陣痛、弛緩性出血、胎盤娩出前后、子宮復舊不全、剖腹產、人工流產、乳汁淤積、食欲不振如神經性食欲不振等以及伴隨著食欲不振的貧血、低蛋白病癥等。SLC-1拮抗劑除了用作治肥胖病的制劑(藥物)、調節(jié)食欲(攝食)不振的制劑外，還用作激烈陣痛、強直性子宮收縮、胎兒窒息、子宮破裂、頸管裂傷、早產、普-威綜合征、糖尿病及其合并癥(糖尿病性腎病、糖尿病性網(wǎng)膜炎、糖尿病性神經障礙等)、高血壓、高血脂、冠狀動脈硬化、痛風、呼吸系統(tǒng)疾病(Pickwick綜合征、睡眠時無呼吸綜合征)、脂肪肝、不孕癥、變形性骨關節(jié)病等(尤其是治肥胖病的制劑(藥物)、調節(jié)食欲(攝食)的制劑等)。
用上述篩選方法或篩選試劑盒得到的化合物之鹽可以使用藥學上可接受的鹽。例如有無機堿形成的鹽、有機堿形成的鹽、無機酸形成的鹽、有機酸形成的鹽、堿性或酸性氨基酸形成的鹽。
與無機堿形成合適的鹽有例如，堿金屬鹽如鈉鹽、鉀鹽等；堿土類金屬鹽如鈣鹽、錳鹽等；還有鋁鹽、銨鹽等。
與有機堿形成合適的鹽有例如，與三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、2，6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、環(huán)己胺、二環(huán)己胺、N，N-二芐基乙二胺等形成的鹽等。
與無機酸形成合適的鹽有例如，與鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸等形成的鹽。
與有機酸形成合適的鹽有例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸形成的鹽等。
與堿性氨基酸形成合適的鹽有例如，精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸等形成的鹽，與酸性氨基酸形成合適的鹽有例如，天冬氨酸、谷氨酸等形成的鹽等。
用本發(fā)明篩選方法或篩選試劑盒得到的化合物或其鹽用作上述醫(yī)藥產品時，實施方法同所述本發(fā)明多肽一樣。
將本發(fā)明通過篩選方法或篩選試劑盒得到的化合物或其鹽用作所述醫(yī)藥產品使用時，可以按照常規(guī)方法實施。例如，必要時加糖衣或腸溶性糖衣制成片劑、膠囊、酏劑、微膠囊等劑型口服，或以可注射型制劑如無菌溶液或懸浮在水或其它可藥用液體中的懸浮液形式經非胃腸道給藥。例如，該化合物或其鹽與生理學上可接受的已知載體、調味劑、賦形劑、載色劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、粘合劑等制成藥劑常用的單位劑型?？刂浦苿┲械幕钚猿煞质沟迷诮o定范圍內獲得合適劑量。
可與片劑、膠囊等混合的添加劑包括，粘和劑如明膠、玉米淀粉、西黃耆膠和金合歡膠；賦形劑如結晶纖維素；膨脹劑如玉米淀粉、明膠和藻酸；潤滑劑如硬脂酸鎂；甜味劑如蔗糖、乳糖和糖精；加味劑如薄荷、akamonooil和櫻桃。當單位劑型為膠囊形式時，可進一步將液體載體如油和脂肪同上述添加劑一起使用?？筛鶕?jù)常規(guī)制藥方法制備注射用無菌組合物，例如將活性成分與天然植物油如芝麻油和椰子油等溶解或懸浮在載體，如注射用的水溶液來制備藥物。
用于注射的液體介質之例包括，生理鹽水、包含葡萄糖和其它輔助制劑(如D-山梨醇、D-甘露醇和氮化鈉等)的等滲溶液，并可以進一步同合適的助溶劑如醇(如乙醇等)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇等)、非離子表面活性劑(如聚山梨酸酯80TM和HCO-50等)等結合使用。油性介質有芝麻油和豆油，它們可與助溶劑如苯甲酸芐酯和苯甲醇結合使用。
此外，也可進一步與緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液和乙酸鈉緩沖液等)、鎮(zhèn)靜劑(例如苯扎氯胺和鹽酸普魯卡因等)、穩(wěn)定劑(如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐劑(例如苯甲醇、酚等)、抗氧化劑等結合使用。由此制備的注射液體一般裝在合適的無菌安瓿中。
如此所獲制劑安全、低毒，因此可投藥于人或其它哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、綿羊、豬、牛、貓、狗、猴、黑猩猩等)。
本發(fā)明用篩選方法或篩選試劑盒得到化合物或其鹽的給藥劑量視病癥情況而定，當口服給藥時，一般成年人(體重60kg)，一次正常劑量為，大約0.1-1000mg，優(yōu)選大約1.0-300mg，更優(yōu)選3.0-50mg。當非胃腸道給藥時，其一次投藥量視給藥對象、受體器官、癥狀、投藥方法等情況而定，例如以針劑給藥時，一般成年人肥胖癥患者(體重60kg)，SLC拮抗劑的劑量為大約0.01-30mg，優(yōu)選大約0.1-20mg，更優(yōu)選大約0.1-10mg，優(yōu)選靜脈注射給藥。對于其它動物種類，可以按每60kg體重換算相應的給藥劑量。
在說明書和附圖中，堿基和氨基酸的代碼使用IUPAC-IUB生化命名委員會規(guī)定的或本領域通用的代碼，如下例所示。對于有光學異構體的氨基酸，除非特別說明，均指L形式。
DNA脫氧核糖核酸cDNA互補的脫氧核糖核酸A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鳥嘌呤C胞嘧啶Y胸腺嘧啶或胞嘧啶N胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鳥嘌呤
R 腺嘌呤或鳥嘌呤M 胞嘧啶或腺嘌呤W 胸腺嘧啶或腺嘌呤S 胞嘧啶或鳥嘌呤RNA 核糖核酸mRNA 信使核糖核酸dATP 脫氧腺苷三磷酸dTTP 脫氧胸腺嘧啶三磷酸dGTP 脫氧鳥苷三磷酸dCTP 脫氧胞嘧啶三磷酸ATP 腺苷三磷酸EDTA 乙二胺四乙酸SDS 十二烷基硫酸鈉TFA 三氟乙酸EIA 酶免疫測定Gly或G甘氨酸Ala或A丙氨酸Val或V纈氨酸Leu或L亮氨酸Ile或I異亮氨酸Ser或S絲氨酸Thr或T蘇氨酸Cys或C半胱氨酸Met或M蛋氨酸Glu或E谷氨酸Asp或D天冬氨酸Lys或K賴氨酸Arg或R精氨酸His或H組氨酸Phe或F苯丙氨酸Tyr或Y酪氨酸
Trp或W色氨酸Pro或P脯氨酸Asn或N天冬酰胺Gln或Q谷氨酰胺pGlu 焦谷氨酸Me甲基Et乙基Bu丁基Ph苯基TC四氫噻唑-4(R)-羧基酰胺基Bom 芐氧甲基NMP N-甲基-2-吡咯烷酮PAM 苯乙酰胺甲基用下列符號表示本說明書中多次使用的取代基、保護基以及試劑Tos對甲苯磺?；鵋ONB N-羥基-5-降冰片烯基-2，3-二羧基亞胺Bzl芐基Z 芐氧羰基Br-Z 2-溴芐氧羰基Cl-Z 2-氯芐氧羰基Boc叔丁氧基羰基HOBt 1-羥基苯并三唑DCCN，N′-二環(huán)己基碳二亞胺TFA三氟乙酸Fmoc N-9-芴基甲氧基羰基DNP二硝基苯酚Bum叔丁氧基甲基Trt三苯甲基BSA牛血清白蛋白CHAPS 3-[(3-膽胺丙基)二甲基氨]-1-丙烷磺酸酯
PMSF苯甲基磺酰氟E64 (L-3-反-羧基環(huán)氧乙烷-2-羰基)L-亮氨酰-胍基丁胺GDP 鳥苷-5′-二磷酸MEMα 極限必需培養(yǎng)基Fura-2AM1-[6-氨基-2-(5-羧基-2-惡唑)-5-苯并呋喃]-2-(2-氨基-5-甲苯氧基)-乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸戊乙酰氧基甲酯HBSSHank′s平衡鹽溶液Fluo-3AM1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羥基-3-氧基-9-占噸基)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲苯氧基)-乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸戊乙酰氧基甲酯HEPES 2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪]乙烷磺酸MeBzl 4-甲基芐基NMPN-甲基-2-吡咯烷酮本說明書的序列表中的序列編號分別表示如下。
表示由大鼠腦純化而來的SLC-1的配體多肽，并從其多肽N末端序列分析中得到的氨基酸序列。
由大鼠腦純化而來的SLC-1的配體多肽并鑒定為大鼠MCH，表示其氨基酸序列。
表示合成DNA，此DNA用于篩選編碼大鼠SLC-1的cDNA。
表示合成DNA，此DNA用于篩選編碼大鼠SLC-1的cDNA。
表示大鼠SLC-1的全部氨基酸序列。
表示大鼠SLC-1cDNA全部堿基序列，其5′端附加Sal I識別序列，3′端附加Spe I識別序列。
表示核糖核酸探針(riboprobe)，用于在大鼠SLC-1表達每個CHO克隆細胞中，測定SLC-1的mRNA表達水平。
表示為獲得編碼人SLC-1的cDNA而使用的合成DNA。
表示為編碼人SLC-1的雙鏈cDNA而使用的引物。
表示編碼人SLC-1的cDNA全部堿基序列。
表示人SLC-1的全部氨基酸序列。
表示合成DNA，此DNA用于篩選編碼人SLC-1(S)的cDNA。
表示合成DNA，此DNA用于篩選編碼人SLC-1(S)的cDNA。
表示合成DNA，此DNA用于篩選編碼人SLC-1(L)的cDNA。
表示合成DNA，此DNA用于篩選編碼人SLC-1(L)的cDNA。
表示人SLC-1(S)的全部堿基序列，其5′端附加Sal I識別序列，3′端附加Spe I識別序列。
表示人SLC-1(L)cDNA的全部堿基序列，其5′端附加Sal I識別序列，3′端附加Spe I識別序列。
表示核糖核酸探針(riboprobe)，用于在人SLC-1(S)表達每個CHO克隆細胞以及人SLC-1(L)表達每個CHO克隆細胞中，測定SLC-1的mRNA表達水平。
表示Des-Asp1-MCH(MCH(2-19))的氨基酸序列。
表示Des-[Asp1、Phe2]-MCH(MCH(3-19))的氨基酸序列。

表示Des-[Asp1、Phe2、Asp3]-MCH(MCH(4-19))的氨基酸序列。
表示Des-[Asp1、Phe2、Asp3、Met4]-MCH(MCH(5-19))的氨基酸序列。
表示Des-[Asp1、Phe2、Asp3、Met4、Leu5]-MCH(MCH(6-19))的氨基酸序列。
表示Des-[Asp1、Phe2、Asp3、Met4、Leu5、Arg6]-MCH(MCH(7-19))的氨基酸序列。
在實施例8中得到的SEQ ID NO11所示堿基序列的DNA，由包含編碼該DNA的質粒轉化的轉化體Escherichia coli DH10B/phSLClL8于1999年2月1日保藏于通商產業(yè)省工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(NIBH)，其保藏編號為FERM BP-6632，于1999年1月21日保藏于財團法人發(fā)酵研究所(IFO)，其保藏編號為16254。
實施例用以下實施例和參考例，詳細說明本發(fā)明，但并不限定于本發(fā)明范圍。
參考例1特異抑制大鼠腦提取物中CHO/SLC-1細胞cAMP的合成并對其抑制活性的檢測用下述方法制備大鼠腦提取物的高效液相層析(HPLC)組分。從ちャ-ルズリバ-公司購入100只Wistar大鼠(雄性、8周齡)，取其腦，立刻放入煮沸的0.81蒸餾水中，煮沸10分鐘。煮沸后直接用冰冷卻，加48ml乙酸使終濃度為1.0M，用Poiytron勻漿器(20,000rpm、6分鐘)破碎組織細胞。離心破碎液(8,000rpm、30分鐘)取上清液，于沉淀加0.811.0M乙酸，再次用Polytron勻漿器破碎，離心破碎液(8,000rpm、30分鐘)取上清液。于沉淀加0.81的1.0M乙酸，再次用Polytron勻漿器破碎，徹夜攪拌，然后離心(8,000rpm、30分鐘)獲得上清液。緩慢地，在4℃下于上清液滴下2倍的冷丙酮，然后將第一次離心得到的上清液徹夜攪拌，將第二次離心得到的上清液攪拌4小時。加丙酮，將提取液離心(8,000rpm、30分鐘)除去沉淀，上清液通過蒸發(fā)器減壓蒸餾丙酮。給不含丙酮的提取液加等量的二乙醚，用分液漏斗將含有脂類物質的醚層分離回收水層。脫脂醚提取液通過蒸發(fā)器減壓濃縮將醚完全除去。將濃縮液用玻璃纖維濾紙(ァドバンテック、DP70(直徑90mm))過濾，將濾液加樣到C18(YMC、YMCgel ODS-AM 120-S50)玻璃層析柱(直徑20mm×240mm)。用300ml的1.0M乙酸洗滌該層析柱之后，用含有0.1％三氟乙酸的60％乙肼300ml洗脫。洗脫液減壓濃縮除去溶劑后，冷凍干燥。將冷凍干燥物約0.24g溶解于5mlDMSO，加45ml的1.0M乙酸，此為制備好的大鼠腦提取物樣品。將大鼠腦提取物樣品加樣用1.0M乙酸平衡的SP-Sephadex-C25層析柱(Amerham Pharmacia Biotech、凝膠體積100ml)上，用50ml的1.0M乙酸洗滌，然后，依次得到100ml的2.0M吡啶洗脫組分和100ml的2.0M吡啶乙酸洗脫組分。再將2.0M吡啶乙酸洗脫液減壓濃縮除去溶劑后，將濃縮液凍干。將約100mg的凍干粉溶解于10％乙肼，它含有10ml的0.1％三氟乙酸，加樣到HPLC的C18(TOSOTSKgel ODS-80Ts(直徑21.5×300mm))層析柱上，此層析柱是根據(jù)乙肼濃度梯度洗脫法而制備的，其中乙肼自10％至60％并包含0.1％三氟乙酸。將各組分減壓，干燥形成粉末，其殘渣用0.1ml的二甲亞砜(DMSO)溶解。
以每孔為5×104個細胞密度將實施例4制作的CHO/SLC-1細胞以及模擬(mock)CHO細胞播種于24孔平板上，培養(yǎng)48小時。將細胞用含有0.2mM 3-異丁基甲基黃嘌呤和0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s緩沖液(pH7.4)洗滌(以下，將0.2mM 3-異丁基甲基黃嘌呤和0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s緩沖液(pH7.4)稱為反應緩沖液)。然后，加0.5ml的反應緩沖液于培養(yǎng)箱保溫30分鐘。再除去反應緩沖液，給細胞加新的反應緩沖液0.25ml，然后再添加HPLC組分和含有2μM毛喉素的0.25ml反應緩沖液，于37℃反應24分鐘。加100μl的20％高氯酸停止反應，置于冰上1個小時，提取細胞內的cAMP。用cAMP免疫測定試劑盒(AmerhamPharmacia Biotech)測定提取液中的cAMP。其結果在組分編號33，34，35中檢測出CHO/SLC-1細胞顯示其特異的cAMP合成抑制活性(圖1)。圖1中，cAMP合成抑制活性是這樣表示的自添加含毛喉素的反應緩沖液時細胞內cAMP之量減去添加反應緩沖液時細胞內cAMP的量作為100％，自加有HPLC組分時細胞內cAMP之量減去添加反應緩沖液時細胞內cAMP的量作為0％。
參考例2 對大鼠腦提取物中大鼠SLC-1表達CHO細胞顯示其特異的cAMP合成抑制活性及其活性物質即蛋白酶的失活用蛋白分解酶即蛋白酶(Sigma，protease Type XIV(P5147))處理HPLC組分34，該組分具有對參考例1 CHO/SLC-1細胞產生cAMP合成抑制活性，并研究其活性物質是否為蛋白性物質。
在100μl的0.2M乙酸胺中加入所述大鼠腦提取物HPLC組分(#34)2μg。再加3μg的蛋白酶于37℃保溫2個小時，然后于沸水中加熱10分鐘使蛋白酶失活。再加0.05mg的BSA以及含有0.05mg的CHAPS蒸餾水2ml使之凍結干燥。為了研究蛋白酶本身或者研究蛋白酶受加熱及凍干的影響，同樣地只加熱處理蛋白酶，或者只加熱處理HPLC組分以及蛋白酶，然后再加HPLC組分，進行凍結干燥。每個凍結干燥的試驗材料用含有2μM毛喉素的反應緩沖液溶解，根據(jù)參考例1所示的方法測定CHO/SLC-1細胞cAMP合成抑制活性。其結果于圖2所示。對大鼠腦提取物中大鼠SLC-1表達CHO細胞顯示特異的cAMP合成抑制活性其活性物質因蛋白酶而完全失活，因此這種活性物質顯示了蛋白或者肽的特性。
參考例3 大鼠腦中大鼠SLC-1/CHO細胞顯示其特異的cAMP合成抑制活性并對其活性物質的制備以下具體闡述自大鼠腦制備的SLC-1/CHO細胞顯示其特異的cAMP合成抑制活性及其活性物質的典型實例。
如下所述，制備參考例1中具有活性組分33。對其活性組分進行減壓濃縮除去溶劑，凍干。將其溶于含有10％乙肼的10mM甲酸胺(pH 5.25)5ml，加樣陽離子交換柱(ト-ソ-TSKgel CM-22SW(直徑4.6mm×150mm))，然后按照自10mM至500mM的甲酸胺(pH 5.25)濃度梯度將活性物質洗脫下來。該甲酸胺含有10％乙肼。其有活性的在甲酸胺320mM附近被回收。在20ml的活性組分中加入含有0.1％三氟乙酸的2.5ml的10％乙肼，給二苯基-柱(セパレ-ッョングル-プ，Vydac 219-TP54)加樣后，然后按照自27.5％mM至42.5％并含有0.1％三氟乙酸的乙肼濃度梯度將活性物質洗脫下來。其有活性的在乙肼31.3％附近出現(xiàn)。給0.96ml的活性組分加含有0.1％三氟乙酸的4.4ml的10％乙肼，加樣于ODS柱(野村化學，Develosil ODS-UG-3)上，然后按照自27.5％mM至42.5％的、并含有0.1％三氟乙酸的乙肼濃度梯度將活性物質洗脫下來。在每個洗脫液的峰值收集。其活性在乙肼36.8％附近出現(xiàn)一個峰值(圖3)。
參考例4 由大鼠腦制備的大鼠SLC-1表達CHO細胞顯示其特異的cAMP合成抑制活性并對其活性物質鑒定為大鼠MCH由實施例3中制備的SLC-1/CHO細胞，對其中特異地顯示cAMP合成抑制活性物質的結構進行了分析。本活性物質如參考例2所示推測為蛋白或肽，因此利用含有活性最高峰值的洗脫液根據(jù)Sigam公司的產品LF3400，進行蛋白質測序分析了氨基酸末端序列。分析結果是，得到SEQ IDNO1所示的序列。在第7個殘基和第16個殘基處檢測出在序列分析反應中由Cys殘基而形成的脫水丙氨酸的PTH衍生物，并確定為Cys。此序列與大鼠黑色素凝集激素(melanin-concentrating hormone，MCH)的N末端第16個殘基氨基酸序列相同。因此本活性物質根據(jù)JEOL HX110質譜分析測定時發(fā)現(xiàn)它與大鼠MCH分子量幾乎相同并在質荷比(m/z)2387.3處觀察到信號，推測該活性物質的氨基酸序列為大鼠MCH的序列(SEQ ID NO2)。另外，關于參考例3得到的活性組分34及35進行合成反應獲得活性物質，證明兩者的活性均為大鼠的MCH。進一步將從ペニンスラ公司購入的大鼠MCH根據(jù)實施例5所敘述的方法對大鼠SLC-1表達細胞進行cAMP合成抑制活性的測定，其中顯示了其劑量依賴于抑制活性的特點，本活性物質被證明為大鼠MCH。
實施例1 根據(jù)采用大鼠腦cDNA的PCR法進行大鼠SLC-1受體cDNA的擴增以大鼠腦poly(A)+RNA(ク口-ンテック公司)為模板，使用隨機引物進行反轉錄反應進行該反轉錄時使用了寶酒造產品RNA PCR ver.2試劑盒的試劑。再以該反轉錄的產物為模板根據(jù)PCR法用SEQ ID NO3及4的合成DNA引物進行擴增。通過合成DNA引物構建擴增了受體蛋白翻譯區(qū)基因。此時在5′端及3′端各自附加限制性內切酶的識別序列，例如在基因的5′端附加識別限制性內切酶Sal I位點的堿基序列，在3′端附加識別限制性內切酶Spe I位點的堿基序列。上述反應溶液包括cDNA模板5μl、合成DNA引物各0.4μM、0.25mM dNTPs、pfu(ストラタヅ-ン公司產品)DNA聚合酶0.5μl及酶緩沖液，總體積為50μl。擴增周期使用熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer公司產品)94℃60秒加熱后，以94℃60秒、60℃30秒、72℃150秒擴增35個循環(huán)，最后于72℃反應10分鐘。通過0.8％瓊脂糖電泳及溴乙錠染色確認擴增的產物。
實施例2 將上述PCR產物亞克隆至質粒載體并通過對已插入的cDNA區(qū)的堿基序列解碼來確定擴增cDNA的序列將實施例1的PCR產物用0.8％低熔點瓊脂糖凝膠分離，將染色帶用刀片切下后，切碎用苯酚、苯酚·氯仿抽提以及乙醇沉淀濃縮，回收這些DNA。按PCR-ScriptTMAmp SK(+)克隆試劑盒(ストラタヅ-ン公司產品)說明書將回收的DNA亞克隆到質粒載體PCR-Script Amp SK(+)。再導入大腸桿菌(Escherichia coli)XL-1 Blue(ストラタヅ-ッ公司產品)，經過轉化后，攜帶所述插入cDNA片段的克隆在含氨芐青霉素和X-gal的LB瓊脂平板上進行篩選。用滅菌牙簽挑取白色的克隆，得到轉化體大腸桿菌E.coli XL-1 Blue/大鼠SLC-1。得到的克隆在含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上過夜培養(yǎng)，用QIAprep8mini prep(Quiagen公司產品)制備質粒DNA。取一份該DNA用Sal I以及Spe I切割以檢驗插入受體cDNA片段的大小。用DyeDeoxy終止子循環(huán)測序試劑盒(Terminator Cycle Sequencing Kit)(Perkin-Elmer公司產品)進行測序，用熒光自動序列分析儀解讀該DNA的密碼。分析所得3個克隆序列時，證實所有的序列與報道的編碼大鼠SLC-1蛋白質(SEQ ID NO5)基因序列相一致，即在其cDNA序列的5′端區(qū)附加Sal I識別序列，在其3′端區(qū)附加Spe I識別序列(SEQ ID NO6)。
實施例3 建立能表達大鼠SLC-1的CHO細胞在實施例2已確定了大鼠腦SLC-1的全長氨基酸序列并將編碼此氨基酸序列的基因導入到附有Sal I識別序列的5′端區(qū)、附有Spe I識別序列的3′端區(qū)質粒上，進而用該質粒轉化的E.coli克隆，再用Plasmid midi試劑盒(Quiagen公司)建立質粒。用限制性內切酶Sal I及Spe I切割插入部分。插入DNA電泳后，用刀片從瓊脂糖凝膠切割下來，切碎用苯酚、苯酚·氯仿抽提以及乙醇沉淀濃縮，回收這些DNA。將這段插入DNA重組到用于表達動物細胞的載體質粒pAKKO-111H(與Hinuma，S.et al.Biochim.Biophys.Acta，Vol.1219，PP.251-259(1994)發(fā)表的pAKKO1.11H載體質粒一樣)上，該載體質粒用限制性內切酶Sal I及Spe I切割，再使用T4連接酶(寶酒造公司產品)進行連接反應，建立了用于表達蛋白的質粒pAKKO-SLC-1。
培養(yǎng)由pAKKO-SLC-1轉化形成的轉化體E.coliDH5( ト-ョ-ボ-)，然后用Plasmid midi試劑盒(Quiagen公司)建立pAKKO-SLC-1的質粒DNA。用CellPhect轉染試劑盒(Amerham Pharmacia Biotech公司產品)按照所附說明書將其導入到CHO-dhfr-細胞。將10μg的質粒DNA與磷酸鉀形成協(xié)同沉淀懸浮液，加入到在24小時前已播種5×105或1×106個CHO-dhfr-細胞的玻璃皿(10cm)上。在含有10％胎牛血清的MEMα培養(yǎng)基上培養(yǎng)1天之后，傳代培養(yǎng)，在選擇性培養(yǎng)基即含有10％透析胎牛血清而不含核酸MEMα培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在選擇培養(yǎng)基上能夠表達SLC-1的CHO細胞逐漸增殖形成菌落，即選擇菌落轉化細胞中克隆56。
實施例4 篩選具有高效表達水平的全部大鼠SLC-1受體蛋白mRNA的CHO/SLC-1細胞系用Cytostar T Plate(Amerham Pharmacia Biotech公司產品)按照所附說明書，將實施例3構建的CHO/SLC-1細胞系克隆56再將其全部大鼠SLC-1受體蛋白mRNA的表達水平進行測定。將CHO/SLC-1細胞系每個克隆以2.5×104個細胞密度播種于Cytostar T Plate的每個孔內，培養(yǎng)24小時，然后用10％的福爾馬林固定液固定。每孔添加0.25％的Triton X-100以提高細胞的通透性，然后加標記的35S SEQ ID NO7的核糖核酸探針(riboprobe)使之雜交。各孔內加20mg/ml RNaseA，消化游離的核糖核酸探針(riboprobe)，充分洗滌平板，然后用Topcounter測定已雜交的riboprobe放射活性。放射活性高的細胞系其mRNA的表達水平高。在以下實驗中使用了3個mRNA表達水平高的克隆(#3，6及44)，尤其選擇了克隆編號44(圖4)。
實施例5 通過MCH的刺激來檢測能表達大鼠SLC-1CHO細胞的cAMP合成抑制活性將合成的MCH(ペニンスラ公司產品)稀釋為不同濃度，用下述方法來檢測能表達大鼠SLC-1CHO細胞的cAMP合成抑制活性。以每孔為5×104個細胞密度將實施例4選擇好的CHO/SLC-1細胞播種于24孔平板上，培養(yǎng)48小時。用含有0.2mM 3-異丁基甲基黃嘌呤和0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s緩沖液(pH7.4)洗滌細胞(以下，將0.2mM 3-異丁基甲基黃嘌呤和0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s緩沖液(pH7.4)稱為反應緩沖液)。然后，加0.5ml的反應緩沖液于培養(yǎng)箱保溫30分鐘。再除去反應緩沖液，換新的反應緩沖液0.25ml，然后再添加各種濃度的MCH和含有2μM毛喉素的0.25ml反應緩沖液，于37℃反應24分鐘。加100μl的20％高氯酸停止反應，置于冰上1個小時，提取細胞內的cAMP。用cAMP免疫測定試劑金(Amerham Pharmacia Biotech)測定提取液中的cAMP。在0.1mMMCH的濃度下，其結果明顯地使細胞內cAMP水平降低，若增加肽濃度，則細胞內cAMP的量隨著用量增加而減少(圖5)。圖中，cAMP合成抑制活性是這樣表示的自添加含毛喉素的反應緩沖液時細胞內cAMP之量減去添加反應緩沖液時細胞內cAMP的量作為100％，自加有MCH時細胞內cAMP之量減去添加反應緩沖液時細胞內cAMP的量作為0％。
實施例6 由MCH引起表達大鼠SLC-1的CHO細胞釋放花生四烯酸代謝物及其活性由不同濃度的合成MCH(公司產品)顯示對能表達大鼠SLC-1的CHO細胞釋放花生四烯酸代謝物及其活性，根據(jù)以下方法進行測定。以每孔為5×104個細胞密度將實施例4選擇好的CHO/SLC-1細胞播種于24孔平板上，培養(yǎng)24小時，然后添加[3H]花生四烯酸使每孔為0.25μCi。16個小時后，用0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s緩沖液(pH7.4)洗滌細胞，各孔內添加500μl的不同濃度的合成大鼠MCH，該合成MCH溶于0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s緩沖液(pH7.4)。以下將0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s緩沖液(pH7.4)稱為反應緩沖液。在37℃下保溫60分鐘，然后將400μl的反應液加入到閃光劑中，[3H]花生四烯酸代謝物釋放到反應液中，用閃爍計數(shù)器測定[3H]花生四烯酸代謝物的量。在合成大鼠MCH3nM的濃度下釋放花生四烯酸代謝物明顯，若增加肽濃度，則培養(yǎng)基中花生四烯酸代謝物的量隨著用量增加而增加釋放(圖6)。圖中，花生四烯酸代謝物釋放活性是這樣表示的沒有添加合成大鼠MCH反應緩沖液而釋放于培養(yǎng)基中產生的[3H]花生四烯酸代謝物的量作為100％時，而添加合成大鼠MCH反應緩沖液而釋放于培養(yǎng)基中產生的[3H]花生四烯酸代謝物的量用相對值表示。
實施例7 分離人SLC-1的cDNA質粒按照Genetrapper cDNA positive selection system(GIBCOBRL公司產品)說明書的要求，使用噬菌體F1核酸內切酶將來自人胎兒腦的cDNA(SUPERSCRIPTTMcDNA Library，GIBCOBRL公司產品)切割形成切口，再用大腸桿菌核酸外切酶III消化，故得到一條人胎兒腦的cDNA文庫鏈。
根據(jù)Kolakowski Jr.等(Kolakowski Jr.，et al(1996)FEBS Lett.Vol.398，PP.253-258)的報告制備了SEQ ID NO8的合成寡核苷酸(相當于accessionNo.U71092的1434-1451)，在其3′末端用脫氧核苷酰末端轉移酶(TerminalDeoxynucleotidyl Transferase)附加biotin(生物素)-14-dCTP得到生物素寡核苷酸。反應液的組成及反應時間均按照說明書的要求進行。
在95℃下使4μg的一條人胎兒腦cDNA文庫鏈保溫1分鐘之后，在冰上迅速冷卻，加20ng的生物素寡核苷酸，在37℃下用雜交緩沖液雜交1個小時。再加鏈親和素珠，用MAGNA-SEP Magnetic PaaarticleSepparator(GIBCOBRL公司產品)，分離與生物素寡核苷酸雜交的一條人胎兒腦的cDNA文庫鏈，根據(jù)Kolakowski Jr.等的報告(Kolakowski Jr.，etal(1996)FEBS Lett.Vol.398，PP.253-258)制備了SEQ ID NO9的合成寡核苷酸(相當于accession No.U71092的1011-1028)，將50ng的該合成寡核苷酸作為引物，按照說明書的要求合成其互補鏈，則得到雙鏈的質粒。
實施例8 測定經分離得到的含有人SLC-1 cDNA質粒的堿基序列用電穿孔法將實施例7得到的質粒導入到ELECTROMAXTMDH10BTMCells內進行轉化，之后攜帶所述插入cDNA片段的克隆在含氨芐青霉素和X-gal的LB瓊脂平板上進行篩選。用滅菌牙簽挑取白色的克隆，繼續(xù)進行分離，得到轉化體大腸桿菌E.coli DH10B/hSLC-1。得到的克隆在含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上過夜培養(yǎng)，用QIA prep8mini prep(Quiagen公司產品)制備純化的質粒DNA。用DyeDeoxy終止子循環(huán)測序試劑盒(TeriminatorCycle Sequencing Kit)(Perkin-Elmer公司產品)進行測序，用熒光自動序列分析儀解讀該DNA的密碼。得到SEQ ID NO10的序列。用該序列編碼氨基酸序列(SEQ ID NO11)與Lakaye等報道(Lakaye，B.et al.(1998)Biochem.Biophys.Acta，.vol.1401，PP.216-220)的人SLC-1氨基酸序列有差異，他們推測的序列為以含有人SLC-1序列的染色體DNA序列(accessionNo.Z86090)為基礎，根據(jù)大鼠SLC-1序列而推導出來的。同時編碼得到的氨基酸序列還顯示了在推導序列上又進一步在69或64位氨基酸的上游，有一個起始密碼子ATG存在于mRNA之上。經過含有編碼這樣序列的DNA質粒的轉化而形成轉化體Escherichia coli DH10B/phSLClL8，并將該轉化體保藏于IFO及NIBH。
實施例9 測定MCH誘導的、與能表達大鼠SLC-1的CHO細胞膜級分結合的GTPγS結合活性用以下方法測定由MCH誘導的、與能表達大鼠SLC-1的CHO細胞膜級分結合的[35S]-Guanosine 5′-(γ-thio)triphosphate結合促進活性。首先說明膜級分的制備方法。加10ml的勻漿緩沖液(10mM NaHCO3，5mM EDTA，0.5mM PMSF，1μg/ml pepstatin，4μg/ml E64，20μg/ml leupeptin)于1×108個CHO/SLC-1細胞，用Polytron(12,000rpm，1分鐘)勻漿器破碎細胞。離心細胞破碎液(1,000g，15分鐘)獲得上清液。再將這個上清液超速離心(Beckman Type 30轉子，30,000rpm，1小時)得到能表達大鼠SLC-1的CHO細胞膜級分的沉淀物。
GTPγS結合活性的測定如下進行。用稀釋緩沖液(50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)，5mM MgCl2，150mM NaCl，1μM GDP)稀釋能表達大鼠SLC-1的CHO細胞膜級分，制備蛋白質濃度為30mg/ml的測定用細胞膜級分溶液，向測定用細胞膜級分溶液中加入2μl的51.5nM濃度的[35S]-Guanosine 5′-(γ-thio)triphosphate(NEN公司產品)和2μl的各種濃度的MCH(ペニンスラ公司產品)，在25℃下其混合液保溫1個小時。用濾膜過濾混合液，進一步用洗滌緩沖液1.5ml(50mM Tris鹽酸緩沖液(pH7.4)，5mM MgCl2，1mMEDTA，0.1％BSA)沖洗濾膜2次，然后用液閃計數(shù)器測定濾膜的放射活性。MCH隨著其濃度的增加使結合到膜級分的[35S]-Guanosine 5′-(γ-thio)triphosphate的量增大。另外約在0.5nM濃度的MCH達到了最大的結合為50％。
實施例10 根據(jù)使用來自人胎兒腦cDNA的PCR法對人SLC-1cDNA進行擴增根據(jù)基因捕獲法而克隆的含有人SLC-1DNA序列的質粒，以該質粒為模板，根據(jù)PCR法，使用SEQ ID NO12及13的合成DNA引物和SEQ IDNO14及15的合成DNA引物分別進行擴增。將前者擴增的DNA命名為人SLC-1(S)，后者擴增的DNA命名為人SLC-1(L)。合成DNA引物構建用于擴增受體蛋白翻譯區(qū)基因，但是為了在基因的5′端區(qū)附加有限制性內切酶Sal I識別序列，在其3′端區(qū)附加有限制性內切酶Spe I識別序列，而分別在5′端區(qū)和3′端區(qū)附加限制性內切酶的識別序列。增的人SLC-1(S)反應液的組成為，含有人SLC-1DNA序列的質粒模板為5μl，合成DNA引物各為0.4mM，dNTPs為0.2mM，pfuDNA聚合酶為0.5μl，以及酶緩沖液，總反應體積為50μl。擴增周期使用熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer公司產品)94℃60秒加熱后，以94℃60秒、57℃60秒、72℃150秒擴增25個循環(huán)，最后于72℃保溫10分鐘。擴增的人SLC-1(L)反應液的組成為，含有人SLC-1DNA序列的質粒模板為5μl，合成DNA引物各為0.4mM，dNTPs為0.2mM，pfuDNA聚合酶為0.5μl，以及酶緩沖液，總反應體積為50μl。擴增周期使用熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer公司產品)94℃60秒加熱后，以94℃60秒、60℃60秒、72℃3分擴增25個循環(huán)，最后于72℃保溫10分鐘。擴增產物要在0.8％瓊脂糖凝膠電泳之后，根據(jù)溴乙錠染色進行確定。
實施例11 將上述PCR產物亞克隆至質粒載體并通過插入cDNA區(qū)的堿基序列解碼來確定擴增cDNA的序列將實施例10的PCR產物用0.8％低熔點瓊脂糖凝膠分離，將染色帶用刀片割下后，切碎用苯酚、苯酚·氯仿抽提以及乙醇沉淀濃縮，回收這些DNA。按PCR-ScriptTMAmp SK(+)克隆試劑盒(ストラタヅ-ン公司產品)說明書將回收的DNA亞克隆到質粒載體PCR-Script Amp SK(+)。再導入大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態(tài)細胞(competent cell)(ト-ョ-ボ-公司產品)，經過轉化后，攜帶所述插入cDNA片段的克隆在含氨芐青霉素和X-gal的LB瓊脂培養(yǎng)基上進行篩選。用滅菌牙簽挑取白色的克隆，得到人SLC-1(S)轉化體大腸桿菌E.coli DH5α/hSLC-1(S)和人SLC-1(L)轉化體大腸桿菌E.coli DH5α/hSLC-1(L)。得到的克隆在含氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，用QIA prep8 mini prep(Quiagen公司產品)制備質粒DNA。取一份該DNA用Sal I以及Spe I切割以檢驗插入受體cDNA片段的大小。用DyeDeoxy終止子循環(huán)測序試劑盒(Terminator Cycle Sequencing Kit)(Perkin-Elmer公司產品)進行測序，用熒光自動序列分析儀解讀該DNA的密碼。分析所得克隆序列時，證實與兩種DNA序列(SEQ ID NO16及17)相一致，即SEQ ID NO16的DNA序列是以人SLC-1基因為模板，用SEQ ID NO12及13的合成DNA引物擴增而成，SEQ ID NO17的DNA序列是以人SLC-1基因為模板，用SEQ ID NO14及15的合成DNA引物擴增而成。
實施例12建立能表達人SLC-1(S)的CHO細胞和表達人SLC-1(L)的CHO細胞在實施例11中已確定人SLC-1(S)和SLC-1(L)序列，該序列被導入到質粒上，根據(jù)質粒轉化形成的轉化體E.coli，用Plasmid midi試劑盒(Quiagen公司)，對克隆轉化體E.coli建立質粒。用限制性內切酶Sal I及Spe I切割插入部分。該插入DNA電泳后，用刀片從瓊脂糖凝膠切割下來，切碎用苯酚、苯酚·氯仿抽提以及乙醇沉淀濃縮，回收DNA。將插入DNA重組到用于表達動物細胞的載體質粒pAKKO-111H(與Hinuma，S.et al.Biochim.Biophys.Acta，Vol.1219，pp.251-259(1994)發(fā)表的pAKKO1.11H載體質粒一樣)上，用T4連接酶(寶酒造公司產品)進行連接反應，建立了用于表達蛋白的質粒pAKKO-hSLC-1(S)和pAKKO-hSLC-1(L)。
培養(yǎng)由pAKKO-hSLC-1(S)和pAKKO-hSLC-1(L)轉化形成的轉化體E.coli DH5α(ト-ョ-ボ-)，然后用Plasmid midi試劑金(Quiagen公司產品)制備pAKKO-hSLC-1(S)和pAKKO-hSLC-1(L)的質粒DNA。用CellPhect轉染試劑盒(Amerham Pharmacia Biotech公司產品)按照所附說明書將質粒DNA導入到CHO dhfr-細胞。將10μg的質粒DNA與磷酸鈣形成協(xié)同沉淀懸浮液，加入到在24小時前已播種5×105或1×106個CHO dhfr-細胞的玻璃皿(10cm)上。在含有10％胎牛血清的MEMα培養(yǎng)基上培養(yǎng)1天之后，傳代培養(yǎng)，在選擇性培養(yǎng)基即含有10％透析胎牛血清而不含核酸的MEMα培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在選擇培養(yǎng)基上含有人SLC-1(S)基因和含有人SLC-1(L)的CHO細胞逐漸增殖，將這兩種細胞轉化形成轉化細胞菌落，即各自選擇菌落克隆56和菌落克隆61。
實施例13 篩選具有高效表達水平的人SLC-1(S)和人SLC-1(L)mRNA的基因轉導細胞系用Cytostar T Plate(Amerham Pharmacia Biotech公司產品)按照所附說明書，將實施例12構建的CHO/hSLC-1(S)細胞系克隆56以及構建的CHO/hSLC-1(L)細胞系克隆61的mRNA表達水平如下進行測定。將CHO/hSLC-1(S)細胞系及CHO/hSLC-1(L)細胞系每種克隆以2.5×104個細胞密度播種于Cytostar T Plate的每個孔內，培養(yǎng)24小時，然后用10％的福爾馬林固定液固定。每孔添加0.25％的Triton X-100以提高細胞的通透性，加35S標記的SEQ ID NO18的核糖核酸探針(riboprobe)使之雜交。各孔內加20mg/ml RNaseA，消化游離的核糖核酸探針(riboprobe)，充分洗滌平板，然后用Topcounter測定雜合體riboprobe放射活性。放射活性高的細胞系其mRNA的表達水平高。
實施例14 通過MCH的刺激來檢測能表達人SLC-1的CHO細胞中的cAMP合成抑制活性將合成的MCH(ペニンスラ公司產品)稀釋為各種濃度，用下述方法來檢測能表達人SLC-1的CHO細胞中cAMP合成抑制活性。以每孔為5×104個細胞密度將實施13選擇好的能表達人SLC-1的CHO細胞即CHO/hSLC-1(S)細胞系或CHO/hSLC-1(L)細胞系播種于24孔平板上，培養(yǎng)48小時。用含有0.2mM 3-異丁基甲基黃嘌呤和0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s緩沖液(pH7.4)洗滌細胞(以下，將含有0.2mM 3-異丁基甲基黃嘌呤和0.05％的BSA和20mM的HEPES Han k′s緩沖液(pH7.4)稱為反應緩沖液)。然后，加0.5ml的反應緩沖液于培養(yǎng)箱保溫30分鐘。除去反應緩沖液，更換新反應緩沖液0.25ml，然后再添加各種濃度的MCH和含有2μM毛喉素的0.25ml反應緩沖液，于37℃使之反應24分鐘。加100μl的20％高氯酸停止反應，置于冰上1個小時，提取細胞內的cAMP。用cAMP免疫測定試劑盒(AmerhamPharmacia Biotech)測定提取液中的cAMP。其結果是，隨著MCH濃度的增大，卻使能表達人SLC-1的細胞內cAMP水平降低。
實施例15 由MCH引起的、能表達人SLC-1的CHO細胞釋放花生四烯酸代謝物的活性由不同濃度的合成MCH(ペニンスラ公司產品)顯示對能表達人SLC-1的CHO細胞釋放花生四烯酸代謝物的活性，根據(jù)以下方法進行測定。以每孔為5×104個細胞密度將實施例13選擇的能表達人SLC-1的CHO細胞即CHO/hSLC-1(S)細胞系或CHO/hSLC-1(L)細胞系播種于24孔平板上，培養(yǎng)24小時，然后添加[3H]花生四烯酸使每孔為0.25μCi。16個小時后，用0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s緩沖液(pH7.4)洗滌細胞，各孔內添加500μl的每種濃度的合成MCH，該合成MCH已溶于0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s緩沖液(pH7.4)。在37℃下保溫60分鐘，然后將400μl的反應液加入到閃光劑中，[3H]花生四烯酸代謝物釋放到反應液中，用閃爍計數(shù)器測定[3H]花生四烯酸代謝物的量。其結果是，合成的MCH依賴于使用量的情況，從而顯示能表達人SLC-1的細胞釋放花生四烯酸代謝物的活性。
實施例16 測定與能表達人SLC-1的CHO細胞膜級分結合的GTPγS結合活性用以下方法制備能表達人SLC-1的CHO細胞膜級分。使能表達人SLC-1的CHO細胞(1×108個)浮游于磷酸緩沖生理鹽水(pH7.4)中，該鹽水包含5mM EDTA(乙二胺四乙酸)，離心。給細胞切片加10ml的勻漿緩沖液(10mMNaHCO3、5mM EDTA、pH7.5)，用Polytron(12,000rpm，1分鐘)勻漿器勻漿。以400×g離心15分鐘，上清液再用100,000×g離心1個小時得到膜組分的沉淀物。將該沉淀物懸浮于2ml的測定緩沖液[50mM Tris-鹽酸(pH7.5)、1mM EDTA、0.1％的BSA(牛血清白蛋白)、10mM MgCl2、100mMNaCl、1mM GDP(鳥苷5′-二磷酸)、0.25mM PMSF(苯甲基磺酰氟)、1μg/ml胃蛋白抑制素、20μg/ml亮肽素、10μg/ml磷酰胺]，用100,000×g離心1個小時。將回收的膜組分沉淀物再次懸浮于20ml的測定緩沖液中，分注后于-80℃保存，使用時，解凍后再用。
GTPγS結合活性的測定如下進行。在聚丙烯性96孔平板上分注用分析緩沖液稀釋的能表達人SLC-1的CHO細胞膜級分173μl，然后同時添加2μ1的、溶解了不同濃度的MCH(Bachem公司產品)以及[35S]-Guanosine 5′-(γ-thio)triphosphate(第一化學藥品公司產品)25μl(細胞膜終濃度為20μg/ml、[35S]-Guanosine 5′-(γ-thio)triphosphate終濃度為0.33nM)。在25℃下其反應液保溫1個小時，邊攪拌邊反應，然后用玻璃過濾膜(GF-C)吸引過濾，再用300μl(50mM Tris鹽酸緩沖液(pH7.5))沖洗3次。向玻璃過濾膜加50μl的液閃劑，用液閃計數(shù)器測定留在濾膜上的放射活性。
MCH隨著其濃度的增加使結合到膜級分的[35S]-Guanosine 5′-(γ-thio)triphosphate的量增大。另外該膜級分的ED50值為0.2nM。
實施例17 通過手工埃德曼降解法來制備MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)及MCH(7-19)(SEQ ID NO19-24)將0.1mg的MCH(Sigma公司產品)溶于30μl的50％吡啶中，再加1μl的異硫氰酸苯酯(和光純藥公司產品)，置換氮之后，45℃下保溫。每隔10分鐘攪拌一次經過1個小時的時候停止保溫，在氮氣流下干燥使之固化。再次溶解于20μl的乙醇中，氮氣流下減壓蒸餾溶劑，干燥使之固化。將反應產物苯基硫代氨基甲酰衍生物溶于20μl的三氟乙酸(和光純藥公司產品)置換氮45℃下保溫20分鐘，把肽的氨基酸末端切割為苯胺基噻唑啉衍生物。在氮氣流下除去三氟乙酸，之后加30μl的水和100μl的醋酸正丁酯，用醋酸正丁酯萃取并除去過剩的試劑和苯胺基噻唑啉衍生物。反復3次進行醋酸正丁酯萃取。氨基末端減少了1個殘基即MCH(2-19)，將包含該MCH(2-19)的水相于氮氣流下減壓干燥使之固化。
由于只進行了1次這樣的分解過程，得到氨基末端僅缺少1個殘基的MCH(2-19)。將同樣的分解過程反復進行2、3、4、5、6次，則分別得到N末端氨基逐次缺少1個殘基，從而得到MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)及MCH(7-19)。
把上面分解反應得到的MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)及MCH(7-19)依照下面純化方法，根據(jù)質譜分析和氨基酸分析來確定構造。下面有關MCH(4-19)詳細闡述，但其它的衍生物幾乎用同樣的操作過程。表1顯示了MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)及MCH(7-19)的分析值。
表1 MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)及MCH(7-19)的質譜分析值和氨基酸分析值


下面用HPLC純化MCH(4-19)。首先以流速300μl/min將A液(0.1％三氟乙酸)過柱，該柱為Spheri-5 RP-18反相高效液體用層析柱(ブラゥンリ-公司產品，2.1mm×30mm)，于25℃下平衡柱子，使反應物溶于270μl的0.1％三氟乙酸，1次上樣50μl柱，然后保持300μ1/min的流速，30分鐘后使B液(0.1％三氟乙酸/70％乙肼)濃度提高到70％。將洗脫液置于210nm的波長下進行監(jiān)測，手工收集吸收峰。在17.1分處洗脫出MCH(4-19)。再濃縮干燥并將MCH(4-19)集中一個試管里，再溶解100μl的DMSO。
質譜分析所使用的儀器為日本電子JMS-HX110，根據(jù)LSIMS法進行。即在探針芯片上1μl的3-硝基苯醇和甘油以3∶2組成矩陣與1μl的標樣混合，輸入離子源。將銫離子加速為15kV并進行照射，再將產生的正二次離子加速為10kV插入檢測器。
為了進行氨基酸分析加水分解，取5μl的標樣于玻璃管內，減壓干燥，裝入反應瓶內，其瓶的底部有200μl的6N共沸鹽酸(ピァス公司產品，Sequenal Grade)，用Waters公司產品Pico-Tag工作臺(ヮ-クステ-ッョン)，按照Waters公司推薦的方法除氣，110℃保溫24小時。
用真空泵真空抽氣除去反應瓶中的鹽酸，再用150μl的20mM鹽酸稀釋試驗材料，將其注入分析瓶內，插入氨基酸分析儀提供100μl用于分析。氨基酸分析采用日立L-8500高速氨基酸分析儀，按照熒光分析法進行分析，其熒光分析法將鄰苯二甲醛試劑(和光純藥公司產品)用于衍生化反應。熒光分析用緩沖液的制備法、反應液的制備法、分析條件均按照L-8500氨基酸分析儀操作說明書實施。當以亮氨酸為基準時測定的摩爾比如表1所示。
另外，MCH或MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)以及MCH(5-19)也可根據(jù)實施例24至實施例28所闡述的固相合成法合成。
實施例18 由非同位素波德棟-亨特試劑(ボルトン-ハンタ-試劑)進行的MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)以及MCH(5-19)衍生化由非同位素波德棟-亨特試劑(ボルトン-ハンタ-試劑)對MCH及在實施例17中得到的MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)以及MCH(5-19)進行衍生化。下面以MCH(4-19)為例闡述其衍生化過程。
1nmol的MCH(4-19)溶于二甲基磺酰胺50μl，再加入非同位素波德棟-亨特試劑(ボルトン-ハンタ-試劑)即[3-(4-羥基-3-碘代苯基)丙酸N-琥珀酰亞胺](和光純藥公司產品)100nmol以及N，N-二異丙基乙胺(和光純藥公司產品)100nmol，使之在37℃反應4個小時。
在該混合物中加入含有0.1％三氟乙酸的450μl的10％乙肼，用HPLC純化。層析柱條件如下。柱子為Wakosil-II 5C18HG(4.6×150mm)，流速為1.0ml/min。洗脫液用含有0.1％三氟乙酸的乙肼溶液，乙肼溶液濃度2分鐘內保持10％，5分時則達到20％，20分時則達到50％。由非同位素波德棟-亨特試劑(ボルトン-ハンタ-試劑)衍生化的MCH(4-19)形成衍生物即[N-(3-(4-羥基-3-碘代苯基)丙基)-Met4]-MCH(4-19)在22.9分時洗脫，手工收集。關于MCH或MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(5-19)及MCH(6-19)通過同樣方法在氨基酸N末端的氨基上導入3-(4-羥基-3-碘代苯基)丙基衍生化，用HPLC收集。將這些衍生物如實施例17所闡述的方法加酸分解，進行氨基酸分析。其結果如表2所示。
表2 衍生化的MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)的氨基酸分析值

實施例19 制備放射性同位素標記的MCH(4-19)在實施例17中制備得到MCH的氨基酸N末端3個殘基缺陷體即MCH(4-19)，用非同位素波德棟-亨特試劑法進行放射性同位素標記。在試管中溶于苯的[125I]-非同位素波德棟-亨特試劑[3-(4-羥基-3-碘代苯基)丙酸N-琥珀酰亞胺]9.25MBq(0.11nmol)(NENラィフサィェンスプ口ダクッ公司產品81.4TBq，與其充入干燥氮氣，蒸餾苯。向試管中添加18μl的150mM磷酸緩沖液(pH7.5)和溶于1.5μl的二甲基亞砜2.3hmol MCH(4-19)以及0.5μl的二甲基亞砜，再充分混和。將混合液于37℃下保溫2小時，然后用反相HPLC收集。非同位素波德棟-亨特試劑衍生化形成MCH(4-19)放射性衍生物即[125I]-[N-(3-(4-羥基-3-碘代苯基)丙基-Met4)-MCH(4-19)(結構式已在上面的(4)中敘述)。[125I]-[N-(3-(4-羥基-3-碘代苯基)丙基-Met4)-MCH(4-19)從ODS(ト-ソ-ODS-80TM(4.6×150mm))柱上在乙肼濃度為43.6％附近洗脫。
同樣，根據(jù)[125I]-非同位素波德棟-亨特試劑在N末端的氨基上導入[125I]-3-(4-羥基-3-碘代苯基)-丙基可以合成MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)以及MCH(7-19)的放射性同位素衍生物((1)-(3)、(5)-(7))。
實施例20 制備放射性碘標記的MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)以及MCH(7-19)同位素標記的MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)以及MCH(7-19)如下將氨基酸序列中的Tyr13標記放射性碘，從而可以制備。關于MCH(4-19)已經舉例說明，用同樣方法可以合成放射性碘標記的MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)以及MCH(7-19)。
在25μl的0.4M乙酸鈉(pH5.6)中溶解5μgMCH(4-19)，對此加入200ng的乳過氧化物酶(和光純藥公司產品)，再加1mCi的[125I]碘化鈉(AmerhamPharmacia Biotech)和200ng的過氧化氫(10μl)。室溫靜止10分鐘。再加200ng的過氧化氫(10μl)，靜止10分鐘。根據(jù)HPLC法純化，其柱為TSKgelODS-80Ts(4.6mm×25cm，ト-ソ-)，從而得到[125I]標記的MCH(4-19)。
實施例21 利用MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)以及MCH(7-19)與GTPγS結合測定法進行激動劑活性的測定根據(jù)以下方法制備能表達大鼠SLC-1的CHO細胞膜級分。使能表達大鼠SLC-1的CHO細胞(1×108個)浮游在含有5mM EDTA(乙二胺四乙酸)的磷酸緩沖生理鹽水(pH7.4)中，離心。加10ml的勻漿緩沖液(10mMNaHCO3，5mM EDTA，pH7.5)，用Polytron勻漿器破碎細胞。以400×g15分鐘離心，將上清液再以100,000×g，離心1小時，獲得細胞膜級分的沉淀物。將該膜級分懸浮于2ml的測定緩沖液(50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)，1mM EDTA，0.1％BSA(牛血清白蛋白)，10mM MgCl2，100mM NaCl，1μM GDP(鳥苷-5′-二磷酸)，0.25mM PMSF(苯甲基磺酰氟)，1μg/ml胃蛋白抑制素，20μg/ml亮肽素，10μg/ml磷酰胺)，以100,000×g速度離心1小時。將回收的沉淀物膜級分再次懸浮于20ml的測定緩沖液中，分注后于-80℃保存，使用時。解凍后再用。
MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)以及MCH(7-19)的激動劑活性的測定如下。先用測定緩沖液稀釋能表達大鼠SLC-1的CHO細胞膜級分，取其173μl分注到聚丙烯性96孔平板上。然后同時添加用DMSO稀釋成不同濃度的MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)以及MCH(7-19)它們各自為2μl以及25μl的[35S]Guanosine 5′-(γ-thio)triphosphate(第一化學藥品公司產品)(細胞膜終濃度為20μg/ml，[35S]-Guanosine 5′-(γ-thio)triphosphate終濃度為0.33nM)。在25℃下將混合液攪拌1個小時，用玻璃過濾膜(GF-C)吸引過濾，再用300μl的洗滌液(50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5))洗滌3次。在玻璃過濾膜上添加50μl的液閃劑，用液閃計數(shù)器測定殘留的放射活性。
MCH(6-19)及MCH(7-19)的激動劑活性與MCH比較時，各自比MCH低10倍及200倍，而MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)以及MCH(5-19)幾乎與MCH具有同等大小的活性。
實施例22 由非同位素波德棟-亨特試劑衍生的MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)以及MCH(5-19)與GTPγS結合，利用結合測定對激動劑活性進行測定實施例18中得到的非同位素波德棟-亨特試劑衍生的MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)以及MCH(5-19)的激動劑活性同實施例21一樣利用GTPγS結合測定進行分析。
分析證明所衍生形成的MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)以及MCH(5-19)與MCH一樣隨著配體濃度的增加，結合到能表達人SLC-1的CHO細胞膜級分的[35S]Guanosine 5′-(γ-thio)triphosphate結合量增大，通過由非同位素波德棟-亨特試劑衍生形成的不同濃度MCH具有激動劑活性(圖8)。圖中，BH-MCH、BH-MCH(2-19)、BH-MCH(3-19)、BH-MCH(4-19)以及BH-MCH(5-19)分別表示由非同位素波德棟-亨特試劑衍生形成的MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)以及MCH(5-19)。
實施例23 用非同位素波德棟-亨特試劑制備的[125I]-標記MCH(4-19)受體結合實驗用實施例19中所用非同位素波德棟-亨特試劑制備的[125I]-標記的MCH(4-19)(化學結構式如所述(4))及從能表達人SLC-1的CHO細胞制備膜級分來進行受體結合實驗。
用測定緩沖液(25mM Tris-鹽酸，1mM EDTA(乙二胺四乙酸)，0.1％BSA(牛血清白蛋白)，0.25mM PMSF(苯甲基磺酰氟)，1μg/ml胃蛋白抑制素，20μg/ml亮肽素，10μg/ml磷酰胺，pH7.5)，將實施例16制備的能表達人SLC-1的CHO細胞的膜級分稀釋為不同濃度，然后在96孔平板上各自注入173μl。為了測定最大結合(TB)，將2μl的DMSO和25μl的100pM[125I]-標記MCH(4-19)，又，為了測定非特異結合(NSB)，將100μM MCH的DMSO 2μl和25μl的100pM[125I]-標記MCH(4-19)加入到膜級分溶液中。25℃反應60分鐘，使用經過聚乙烯亞胺處理的沃特曼玻璃過濾膜(GF-C)吸引過濾。之后，用γ-計數(shù)器測定殘留于濾紙上的[125I]-標記MCH(4-19)放射活性。如圖9所示證明了[125I]-標記MCH(4-19)特異結合(SB)依賴于膜級分的濃度。
設膜級分的濃度為2.5μg/ml，從抑制率(％)中求出MCH的50％抑制濃度(IC50值)時，IC50值為0.2nM(圖10)。
用能表達大鼠SLC-1的CHO細胞的膜級分和[125I]-標記MCH(4-19)同樣可以進行結合實驗。
實施例24 MCH(Asp-Phe-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)的制備將市售Boc-Val-OCH2PAM樹脂(0.77mmol/g樹脂)0.5mmol分放入肽合成儀ABI 430A的反應罐中，按照Boc-strategy肽合成法(NMP-HOBt)依次將Boc-Gln、Boc-Trp(CHO)、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Try(Br-Z)、Boc-Val、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gly、Boc-Leu、Boc-Met、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Leu、Boc-Met、Boc-Asp(OcHex)、Boc-Phe、Boc-Asp (OcHex)導入該樹脂，獲得按要求保護的肽樹脂。將得到的該樹脂0.6g與2g的p-甲酚、1.2ml的1，4丁二硫醇一起于無水氟化氫10ml中，0℃攪拌60分鐘，減壓蒸餾氟化氫，其中加入二乙醚，過濾沉淀。加50％乙酸溶液并抽提，除去不溶部分，充分濃縮抽提液，上樣G-25柱(2.0×80cm)，該柱Sephadex(商品名)用50％乙酸溶液充填，用同一溶劑展樣，收集主要級分，上樣反相層析柱(2.6×60cm)，其柱用LiChroprep(商品名)RP-18充填，用0.1％TFA水溶液200ml洗滌，進行線性密度梯度洗脫，其中洗脫液使用了0.1％TFA水溶液300ml和含0.1％TFA的40％乙腈溶液300ml，收集主要級分進行濃縮。將該濃縮部分溶解于約4ml乙酸中，再用蒸餾水稀釋到240ml后，再用銨水調整pH，使pH為7.5，緩慢充氣攪拌。用HPLC進行追蹤反應，證明SH體肽的峰值已變化SS體后，加乙酸將溶液的pH調整為3，上樣所述LiChroprep(商品名)RP-18柱。用0.1％TFA水溶液200ml洗柱，然后進行線性密度梯度洗脫，其中使用了0.1％TFA水溶液300ml和含0.1％TFA的40％乙腈溶液300ml，收集主要級分，凍干得到目的肽。
質譜(M+H)+2387.3(理論值2387.9)HPLC洗脫時間20.9分鐘柱條件柱子Wakosil-II 5C18HG(4.6×150mm)洗脫劑按A/B＝20/80-80/20進行線性密度梯度洗脫，其中A液為含0.1％TFA的10％乙腈溶液，B液為含0.1％TFA的60％乙腈溶液(20分鐘)流速1.0ml/min實施例25 Des-Asp1-MCH(MCH(2-19)、Phe-Asp-Met-Leu-ArgCys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)的制備將市售Boc-Val-OCH2PAM樹脂(0.77 mmol/g樹脂)0.5mmo1分放入肽合成儀ABI 430A的反應罐中，按照Boc-strategy肽合成法(NMP-HOBt)依次將Boc-Gln、Boc-Trp(CHO)、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Try(Br-Z)、Boc-Val、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gly、Boc-Leu、Boc-Met、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Leu、Boc-Met、Boc-Asp(OcHex)、Boc-Phe導入該樹脂，獲得按要求保護的肽樹脂。用實施例24的方法將該樹脂去除保護基，再進行環(huán)化作用并純化從而獲得目的肽。
質譜(M+H)+2272.3(理論值2272.1)HPLC洗脫時間20.6分鐘柱條件柱子Wakosil-II 5C18HG(4.6×150mm)洗脫劑按A/B＝20/80-80/20進行線性密度梯度洗脫，其中A液為含0.1％TFA的10％乙腈溶液，B液為含0.1％TFA的60％乙腈溶液(20分鐘)流速1.0ml/min實施例26 Des-[Asp1、Phe2]-MCH(MCH(3-19)、Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)的制備將市售Boc-Val-OCH2PAM樹脂(0.77mmol/g樹脂)0.5mmol分放入肽合成儀ABI 430A的反應罐中，按照Boc-strategy肽合成法(NMP-HOBt)依次將Boc-Gln、Boc-Trp(CHO)、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Try(Br-Z)、Boc-Val、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gly、Boc-Leu、Boc-Met、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Leu、Boc-Met、Boc-Asp(OcHex)導入該樹脂，獲得按要求保護的肽樹脂。用實施例24的方法將該樹脂去除保護基，再進行環(huán)化作用并純化從而獲得目的肽。
質譜(M+H)+2124.8(理論值2125.0)HPLC洗脫時間19.2分鐘柱條件柱子Wakosil-II 5C18HG(4.6×150mm)洗脫劑按A/B＝20/80-80/20進行線性密度梯度洗脫，其中A液為含0.1％TFA的10％乙腈，B液為含0.1％TFA的60％乙腈(20分鐘)流速1.0ml/min實施例27 Des-[Asp1、Phe2、Asp3]-MCH(MCH(4-19)、Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)的制備將市售Boc-Val-OCH2PAM樹脂(0.77 mmol/g樹脂)0.5mmol分放入肽合成儀ABI 430A的反應罐中，按照Boc-strategy肽合成法(NMP-HOBt)依次將Boc-Gln、Boc-Trp(CHO)、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Try(Br-Z)、Boc-Val、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gly、Boc-Leu、Boc-Met、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Leu、Boc-Met導入該樹脂，獲得按要求保護的肽樹脂。用實施例24的方法將該樹脂去除保護基，再進行環(huán)化作用并純化從而獲得目的肽。
質譜(M+H)+2009.9(理論值2010.0)HPLC洗脫時間17.9分鐘柱條件柱子Wakosil-II 5C18HG(4.6×150mm)洗脫劑按A/B＝20/80-80/20進行線性密度梯度洗脫，其中A液為含0.1％TFA的10％乙腈溶液，B液為含0.1％TFA的60％乙腈溶液(20分鐘)流速1.0ml/min實施例28 Des-[Asp1、Phe2、Asp3、Met4]-MCH(MCH(5-19)、Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val-OH)的制備將市售Boc-Val-OCH2PAM樹脂(0.77 mmol/g樹脂)0.5mmol分放入肽合成儀ABI 430A的反應罐中，按照Boc-strategy肽合成法(NMP-HOBt)依次將Boc-Gln、Boc-Trp(CHO)、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Try(Br-Z)、Boc-Val、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gly、Boc-Leu、Boc-Met、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Leu導入該樹脂，獲得按要求保護的肽樹脂。用實施例24的方法將該樹脂去除保護基，再環(huán)化并純化從而獲得目的肽。
質譜(M+H)+1878.9(理論值1878.9)HPLC洗脫時間17.4分鐘柱條件柱子Wakosil-II 5C18HG(4.6×150mm)洗脫劑按A/B＝20/80-80/20進行線性密度梯度洗脫，其中A液為含0.1％TFA的10％乙腈溶液，B液為含0.1％TFA的60％乙腈溶液(20分鐘)流速1.0ml/min(非主題序列表)SEQ ID NO1有關其它序列第7和第16位2個Cys殘基形成分子內二硫鍵。
SEQ ID NO2有關其它序列第7和第16位2個Cys殘基形成分子內二硫鍵。
SEQ ID NO19
有關其它序列第6和第15位2個Cys殘基形成分子內二硫鍵。
SEQ ID NO20有關其它序列第5和第14位2個Cys殘基形成分子內二硫鍵。
SEQ ID NO21有關其它序列第4和第13位2個Cys殘基形成分子內二硫鍵。
SEQ ID NO22有關其它序列第3和第12位2個Cys殘基形成分子內二硫鍵。
SEQ ID NO23有關其它序列第2和第11位2個Cys殘基形成分子內二硫鍵。
SEQ ID NO24有關其它序列第1和第10位2個Cys殘基形成分子內二硫鍵。
工業(yè)利用使MCH或其衍生物或其鹽和SLC-1或其鹽之間的結合特性改變的化合物或其鹽的篩選方法，其特征為，該篩選方法使用本發(fā)明MCH或其衍生物或其鹽及SLC-1或其鹽，適用于篩選SLC-1激動劑和SLC-1拮抗劑，該激動劑可以用作治療或預防藥物等如，除了促進食欲(攝食)藥物外，還有微弱陣痛、弛緩性出血、胎盤娩出前后、子宮復舊不全、剖腹產、人工流產、乳汁淤積等；而拮抗劑可以用作治療或預防藥物等如，除了治肥胖病的制劑(藥物)、促進食欲(攝食)藥物外，還有過強陣痛、強直性子宮收縮、胎兒窒息、子宮破裂、頸管裂傷、早產、普-威綜合征等。
權利要求
1.一種化合物或其鹽的篩選方法，該化合物或其鹽能使黑色素凝集激素(MCH)或其鹽與SLC-1或其鹽之間的結合特性發(fā)生改變，其特征包括應用MCH或其衍生物或其鹽以及SLC-1或其鹽。
2.一種用于篩選化合物或其鹽的試劑盒，該化合物或其鹽能使MCH或其鹽與SLC-1或其鹽之間的結合特性發(fā)生改變，其特征為，試劑盒包含MCH或其衍生物或其鹽以及SLC-1或其鹽。
3.這種能使MCH或其鹽與SLC-1或其鹽之間的結合特性發(fā)生改變的化合物或其鹽，通過權利要求1所述篩選方法或權利要求2所述篩選試劑盒獲得。
4.一種藥物，它包含權利要求3所述化合物或其鹽。
5.權利要求4所述藥物，為一種治肥胖病的藥物。
6.一種含有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的蛋白質或其鹽。
7.一種DNA，它所具有的堿基，為編碼權利要求6所述的蛋白質。
8.權利要求1所述篩選方法或權利要求2所述篩選試劑盒，其中MCH為一種肽，其肽包含與SEQ ID NO2所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。
9.權利要求1所述篩選方法或權利要求2所述篩選試劑盒，其中衍生物為一種肽，在SEQ ID NO2所示氨基酸序列中其肽包含從N末端第5位至第19位的序列。
10.權利要求1所述篩選方法或權利要求2所述篩選試劑盒，其中衍生物為一種肽，其肽包含通過波德棟-亨特試劑衍生形成的MCH或通過波德棟-亨特試劑衍生形成的SEQ ID NO2所示氨基酸序列中從N末端第5位至第19位的序列。
11.一種肽或其鹽，它包含通過波德棟-亨特試劑衍生形成的MCH或通過波德棟-亨特試劑衍生形成的SEQ ID NO2所示氨基酸序列中從N末端第5位至第19位的序列。
12.一種化合物或其鹽，它用 化學式表示。
全文摘要
本發(fā)明提供一種化合物或其鹽的篩選方法,篩選的化合物或其鹽能使MCH或其鹽與SLC－1或其鹽之間的結合特性發(fā)生改變,其特征包括應用MCH或其衍生物或其鹽以及SLC－1或其鹽。上面所述本發(fā)明的篩選化合物或其鹽的方法,即,篩選的化合物或其鹽能使MCH或其鹽與SLC－1或其鹽之間的結合特性發(fā)生改變,其特征包括應用MCH或其衍生物或其鹽以及SLC－1或其鹽。該方法有利于篩選激動劑SLC－1和拮抗劑SLC－1,其中激動劑SLC－1可用于預防·治療的藥物,其中包括除了提高食欲(攝食)的藥物外,還有,與微弱陣痛、弛緩性出血、胎盤娩出前后、子宮復舊不全、剖腹產、人工流產、乳汁淤積等有關的藥物;而拮抗劑SLC－1可用于預防·治療的藥物,其中包括除了治肥胖病的制劑(藥物)、調節(jié)食欲(攝食)藥物外,還有,與激烈陣痛、強直性子宮收縮、胎兒窒息、子宮破裂、頸管裂傷、早產、普－威綜合征等有關的藥物。
文檔編號A61P3/10GK1344321SQ99816370
公開日2002年4月10日 申請日期1999年12月27日 優(yōu)先權日1998年12月28日
發(fā)明者森正明, 下村行生, 竹河志郎, 周鄉(xiāng)司, 石橋祥弘, 北田千惠子, 鈴木伸宏 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社