一種可逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的線粒體靶向膠束遞藥系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種兼具腫瘤主動(dòng)靶向、線粒體定位及逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥功能的膠束遞藥 系統(tǒng)的處方組成及應(yīng)用方案，此遞藥系統(tǒng)為包裹阿霉素/阿霉素-三苯基膦復(fù)合物OOX/ TPP-DOX)的葉酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸膠束。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤發(fā)病率逐年上升，致死率極高，嚴(yán)重威脅人類健康。化療是腫瘤的常用治療手 段，阿霉素（DOX)為一線化療藥物，療效確切、價(jià)格低廉，但阿霉素對(duì)正常組織的毒副作用 及易耐藥的特點(diǎn)限制了其臨床應(yīng)用。腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥是化療失敗的首要原因。阿霉素的 主要作用靶點(diǎn)為細(xì)胞核，若腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，阿霉素在到達(dá)作用靶點(diǎn)前被泵出細(xì)胞而 失活。因此，找尋其它作用靶點(diǎn)，提高阿霉素在胞內(nèi)的有效濃度是逆轉(zhuǎn)耐藥的手段之一。研 宄發(fā)現(xiàn)阿霉素可分作用于線粒體，引起細(xì)胞凋亡。因此，設(shè)計(jì)線粒體靶向的阿霉素復(fù)合物或 遞藥系統(tǒng)可逆轉(zhuǎn)耐藥。陽(yáng)離子脂質(zhì)化合物（3-丙羧基）三苯基溴化膦（TPP)對(duì)線粒體具有 很高的親和力，若將TPP與DOX或載體材料連接可得到線粒體靶向的TPP-DOX連接物，從而 改變DOX的胞內(nèi)分布，并逆轉(zhuǎn)耐藥。但是游離TPP-DOX在體內(nèi)無(wú)腫瘤靶向性，需將其裝載于 遞藥系統(tǒng)中，才能實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞線粒體靶向。
[0003] 聚合物膠束是由兩親性嵌段共聚物在水中自組裝形成的一種熱力學(xué)穩(wěn)定的膠體 溶液，多為核-殼結(jié)構(gòu)，可提高難溶性藥物溶解度、保護(hù)被包裹藥物，且具有腫瘤靶向性和 緩釋特性。許多腫瘤細(xì)胞表面葉酸受體高表達(dá)，而且腫瘤細(xì)胞內(nèi)溶酶體環(huán)境呈酸性。因此， 將DOX和TPP-DOX同時(shí)包封于修飾有葉酸的酸敏膠束中，構(gòu)建兼具腫瘤主動(dòng)靶向和逆轉(zhuǎn)耐 藥功能的新型遞藥系統(tǒng)，增加阿霉素在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核和線粒體的富集，降低其在正常 組織的分布，逆轉(zhuǎn)耐藥，得到高效低毒的新型腫瘤靶向遞藥系統(tǒng)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種可逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的線粒體靶向膠束遞藥系統(tǒng)，兼具腫瘤 主動(dòng)靶向、線粒體定位及逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥功能。通過(guò)遞藥系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，可提高阿霉素在腫瘤細(xì) 胞的細(xì)胞核和線粒體有效濃度，降低藥物在正常組織的分布，逆轉(zhuǎn)耐藥，從而得到高效、低 毒、逆轉(zhuǎn)耐藥的遞藥系統(tǒng)，為抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)提供新思路。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種可逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的線粒體靶向膠束遞藥系統(tǒng)，其特征 是由嵌段化合物葉酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸（FA-PEG-PASP)同時(shí)包裹阿霉素（D0X)和阿 霉素-三苯基膦（TPP-DOX)，自組裝得到聚合物納米膠束，其中
[0006] (1)葉酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物（FA-PEG-hyd-PASP)的制備方法是：
[0007] 將葉酸溶于二甲基亞砜（DMS0)中，加入NHS(N-羥基琥珀酰亞胺）和 EDCI(1-(3_二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亞胺），上述反應(yīng)液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)12h， 隨后將其滴入H2N-PEG-Niy^DMS0溶液中，混合液繼續(xù)室溫反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后，加入5 倍反應(yīng)液量的水，過(guò)濾，濾液置于透析膜（MWl〇〇〇Da)中透析3天，凍干即得葉酸-聚乙二 醇-nh2(fa-peg-nh2);
[0008] 將對(duì)乙?；郊姿幔琋HS，EDCI依次加入DMSO中充分溶解，混合液室溫?cái)嚢璺磻?yīng) 5h后加入FA-PEG-NH2，室溫條件下氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng)過(guò)夜；反應(yīng)結(jié)束后，加入10倍反應(yīng)液量 的水，并置于透析膜（MWl〇〇〇Da)中透析3天，凍干即得葉酸-聚乙二醇-對(duì)乙酰氨基酸 (FA-PEG-ABA)；
[0009] 稱取適量聚天冬氨酸溶于DMS0中，加入10 %的水合肼，室溫?cái)嚢?h后，加入 FA-PEG-ABA，室溫繼續(xù)反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，加入10倍反應(yīng)液量的水，并置于透析膜（MW 8000Da)中透析3天，凍干即得具有酸敏特性的葉酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物 (FA-PEG-hyd-PASP)；
[0010] (2)阿霉素-三苯基膦（TPP-D0X)的制備方法是：
[0011] 稱取（3-丙羧基）三苯基溴化膦（TPP)、NHS、EDCI溶于二氯甲烷中，另將適量阿霉 素〇)〇x)溶于二氯甲烷中，三乙胺處理后將D0X二氯甲烷溶液緩慢滴加至TPP反應(yīng)液中，室 溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，目標(biāo)產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱層析純化即得TPP-D0X;
[0012] (3)FA-PEG-hyd-PASP聚合物膠束的制備方法是：
[0013] 稱取適量的FA-PEG-hyd-PASP聚合物溶于DMS0中，加入D0X和TPP-DOX(W/W， 1:1)，室溫?cái)嚢?h后，加入10倍量的去離子水，置于透析袋（MW35000Da)中透析2天，收 集透析液，凍干即得載D0X/TPP-D0X的FA-PEG-hyd-PASP聚合物膠束。
[0014] 本發(fā)明構(gòu)建了一種新型納米遞藥系統(tǒng)，此遞藥系統(tǒng)為聚合物納米膠束，膠束材料 為葉酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸連接物（FA-PEG-hyd-PASP)，包裹阿霉素（D0X)與阿霉 素-三苯基膦（TPP-D0X)得載藥膠束。該膠束可發(fā)揮主動(dòng)靶向作用，遞送更多的藥物至葉 酸高表達(dá)腫瘤細(xì)胞。進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，根據(jù)線粒體/溶酶體微環(huán)境偏酸的特性（pH=5)， 呈酸敏特性的聚合物膠束可釋放出包裹藥物，使具有線粒體靶向作用的TPP-D0X到達(dá)線粒 體，逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1是共同包封D0X/TPP-D0X的FA-PEG-hyd-PASP聚合物膠束在不同pH溶液中 的D0X和TPP-D0X釋藥曲線圖，其中n= 3。
[0016] 圖 2 是載藥（DOX/TPP-DOX)FA-PEG-hyd-PASP膠束在KB細(xì)胞（A)、A549 細(xì)胞（B)、 Hela細(xì)胞（C)和MDA-MB-231/ADR細(xì)胞（D)上的細(xì)胞毒性。其中n= 6, ##P〈0.Olvs載D0X 膠束組，**P〈〇. 〇lvs載TPP-D0X膠束組。
[0017] 圖 3 是DOX(E)和載藥（DOX/TPP-DOX)FA-PEG-hyd-PASP膠束（F)在MDA-MB-231/ ADR細(xì)胞中的攝取和定位示意圖。
[0018] 圖4是D0X和載藥（DOX/TPP-DOX)FA-PEG-hyd-PASP膠束對(duì)荷瘤裸鼠（移植耐藥 細(xì)胞MDA-MB-231/ADR)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
[0019] 圖5是荷瘤裸鼠靜脈注射給予D0X和載藥（DOX/TPP-DOX)FA-PEG-hyd-PASP膠束 后，阿霉素（X*ox)在裸鼠體內(nèi)的分布圖。
【具體實(shí)施方式】
[002