口服六價重配輪狀病毒活疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于疫苗制劑領(lǐng)域，具體而言，涉及一種口服六價重配輪狀病毒活疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 人輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，為無包膜RNA病毒，顆粒直徑約75nm， 由三層二十面體蛋白衣殼組成。其基因組為包含11個節(jié)段的雙鏈RNA，編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白 (VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和5個非結(jié)構(gòu)蛋白（呢？1、呢？2、呢？3、呢？4、呢卩5)，外層蛋白 為VP4和VP7,內(nèi)殼蛋白為VP6,核蛋白為VP1、VP2和VP3。同一個組的病毒之間能夠發(fā)生基 因重配。根據(jù)病毒內(nèi)殼蛋白VP6抗原性不同，HRV可分為7組（A?G)，導致人類腹瀉的僅有 A、B、C三組。A組即嬰幼兒腹瀉的最主要原因，本項目的輪狀病毒疫苗也是根據(jù)A組設(shè)計； B組即成人腹瀉輪狀病毒，曾在我國爆發(fā)流行；C組感染遍布全世界，多為散發(fā)。HRV外殼 蛋白VP7(糖蛋白或G蛋白）決定G血清型，外殼蛋白VP4(蛋白酶敏感蛋白或P蛋白）決 定P血清型，常見的人A組輪狀病毒G血清型為G1、G2、G3、G4、G8、G9,P血清型為P4、P8。 不同地區(qū)流行株不同，歐洲的流行病監(jiān)測表明：毒株血清型分別為G1 (63% )、G2(8% )、 63(5%)、64(15%)和未分型（8%)，印度流行株為69，巴西為65，近年來68逐漸成為非 洲優(yōu)勢流行株。我國2008年在全國11個地區(qū)的HRV流行病學監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，其毒株血清 型依次為Gl(32.4% )、G2(10% )、G3(44.8% )、G4(0.5% )、G5(0.4% )和G9(11.9% )，優(yōu) 勢流行株由1999年的G1血清型逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)?007年的G3血清型，2013年以G9也成為優(yōu)勢 流行株。
[0003] 輪狀病毒感染是波及全球的一種常見疾病，常發(fā)生于6-24月齡嬰幼兒，也可感染 成人，主要引起輪狀病毒腸炎（RotavirusEnteritis)，導致脫水性腹瀉。因發(fā)病高峰在秋 季，故又名"秋季腹瀉"。輪狀病毒主要通過糞口途徑密切接觸感染，潛伏期2-4天后出現(xiàn)水 樣腹瀉和嘔吐，繼而導致脫水癥狀，并伴有發(fā)熱和腹痛，發(fā)病后3-9天糞便中有病毒排出， 第3天病毒排出達到高峰。
[0004] 幾乎所有兒童在出生后3?5年都感染過輪狀病毒。全球輪狀病毒每年導致5歲 以下兒童大約1. 1億人次胃腸炎疾病需要進行家庭護理，2. 5億人次門診治療，2百萬人次 住院治療，60萬人死亡。如今發(fā)達國家雖然腹瀉發(fā)病常見，但病死率很低，超過85%的死亡 發(fā)生在低收入的亞、非國家。我國94. 5%的2歲以內(nèi)嬰幼兒感染過輪狀病毒，0-5月齡嬰兒 糞便中輪狀病毒檢出率為34%，6-11月齡嬰兒檢出率為53 %，12-23月齡為57. 7 %，24-35 月齡為39%，36-59月齡為15%。輪狀病毒腹瀉患兒中男女性別比為1.77:1。輪狀病毒以 其廣泛、頻繁、能導致重癥腹瀉而位居世界范圍內(nèi)致2歲以下嬰幼兒嚴重腹瀉之病原排行 榜首位。我國每年10月份到次年1月份為發(fā)病高峰期，呈現(xiàn)季節(jié)性分布特點。近年研宄發(fā) 現(xiàn)輪狀病毒還可引起腸道外其他系統(tǒng)感染。
[0005] 公共衛(wèi)生條件的改善并不能減少輪狀病毒腹瀉的發(fā)病率。輪狀病毒的感染目前尚 無特效防治辦法，主要是控制傳染源，切斷傳播途徑，嚴密消毒可能污染的物品。臨床治療 方面，主要是及時輸液，糾酸及糾正水電解質(zhì)平衡等支持療法，以減少嬰兒的死亡率。在世 界范圍內(nèi)，通過對輪狀病毒研宄的日趨深入，普遍認為研制輪狀病毒疫苗是人類預防輪狀 病毒嚴重感染的最有效途徑。
[0006] 目前國內(nèi)外上市的輪狀病毒疫苗主要包括蘭州生物制品有限責任公司的單價羊 株減毒活疫苗羅特威、Merck公司五價人-牛重配減毒活疫苗Rotateq以及GSK公司單價 人株減毒活疫苗Rotarix。
[0007] 輪狀病毒流行株多樣性的特點，決定了多價疫苗才是最有效預防輪狀病毒腹瀉的 方法，然而目前市場上的主要輪狀病毒疫苗，蘭州生物制品研宄所的羅特威以及GSK公司 的Rotarix均為單價血清型輪狀病毒疫苗，血清型涵蓋范圍小，Merck公司的Rotateq雖然 為五價輪狀病毒疫苗，但血清型中不含有G8、G9血清型，對主要血清型流行株囊括范圍小， 其在非洲馬拉維（G8血清型為優(yōu)勢流行株）的臨床試驗結(jié)果顯示，對重癥輪狀病毒腹瀉的 保護率僅為40%。
[0008] 因此，需要一個更為全面的多價輪狀疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明為口服六價重配輪狀病毒活疫苗，含有六種主要流行株血清型Gl、G2、G3、 G4、G8及G9,涵蓋了A群輪狀病毒99. 6%的G血清型病毒，預計對輪狀病毒腹瀉有很好的 預防保護效果。
[0010] 本發(fā)明的目的旨在提供一種口服接種的、由六價輪狀病毒血清型組成的活疫苗， 用以預防因輪狀病毒導致的嬰幼兒腹瀉，屬于疫苗生產(chǎn)制備領(lǐng)域范疇。本發(fā)明提供各血清 型原液的制備方法，口服輪狀病毒保護劑的研發(fā)以及輪狀病毒疫苗的配制方法。
[0011] 根據(jù)輪狀病毒的感染及免疫學機制，本發(fā)明所述的輪狀病毒疫苗免疫采用口服給 藥途徑，與病毒感染途徑一致，相較于注射給藥，口服給藥疫苗更加快捷方便，利于操作。
[0012] 本發(fā)明所述的六價重配口服輪狀病毒疫苗成分為，
[0013] (1)G1、G2、G3、G4、G8及G9血清型活疫苗，各血清型原液滴度為1?5X106FFU/ ml；
[0014] (2)保護劑：枸櫞酸0? 5?2g/L、枸櫞酸鈉50?150g/L、蔗糖250?450g/L、氯化 鋅5?10mM、氯化鈣10?20mM;
[0015] 所述的G1血清型活病毒NIH編號為：MVS-BRV-1 ;
[0016] 所述的G2血清型活病毒NIH編號為：MVS-BRV-2 ;
[0017] 所述的G3血清型活病毒NIH編號為：MVS-BRV-3 ;
[0018] 所述的G4血清型活病毒NIH編號為：MVS-BRV-4 ;
[0019] 所述的G8血清型活病毒NIH編號為：1290XUK;
[0020] 所述的G9血清型活病毒NIH編號為：MVS-BRV-10。
[0021] 本發(fā)明還涉及所述的六價重配口服輪狀病毒疫苗的制備方法，所述方法包括如下 步驟：
[0022] (1)制備各血清型單價病毒原液，并按照目標滴度配置各個血清型病毒原液，并將 各原液依次加入同一提前滅菌的容器中，充分混合并除菌，即得六價混合液；
[0023] (2)配制保護劑母液并除菌；
[0024] (3)將保護劑母液及步驟（1)配制的六價混合液混合，并將其按照2ml/瓶規(guī)格進 行分裝，即得到成品。
[0025] 所述的除菌為0. 2ym除菌過濾器過濾除菌。
[0026] 所述的制備各血清型單價病毒原液的步驟為：
[0027] (1)細胞傳代：各血清型病毒的培養(yǎng)基質(zhì)為Vero細胞，首先復蘇Vero細胞工作種 子，37°C條件下培養(yǎng)3-5天后，按照一定比例進行傳代擴增培養(yǎng)，培養(yǎng)容器依次分別為T25、 I75、T175細胞培養(yǎng)瓶、10層細胞工廠、40層細胞工廠，在40層細胞工廠中培養(yǎng)3-5代后即 可分別接種Gl、G2、G3、G4、G8、G9血清型輪狀病毒；
[0028] (2)病毒培養(yǎng)：細胞工廠內(nèi)細胞匯合度達到90%以上后，進行病毒接種操作。病 毒接種前，選擇一個細胞工廠進行細胞計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，按照病毒感染復數(shù)〇. 005? 0.2進行計算，得出需要的病毒量；用胰蛋白酶對病毒激活，激活條件為37°C、胰蛋白酶濃 度10?20yg/ml，激活15?60min;將激活的病毒接種于細胞工廠內(nèi)，接種后的各血清型 病毒培養(yǎng)于35?37°C條件下2?5天；
[0029] (3)病毒收獲：待細胞病變完全（細胞脫落達到75 %以上）將各細胞工廠內(nèi)的液 體收集于一容器內(nèi)，進行下游處理；
[0030] (4)下游操作：首先進行細胞破碎處理，采用凍融或高壓均質(zhì)方式破碎細胞，凍融 溫度為_30°C?37°C，高壓均質(zhì)壓力范圍為100?lOOObar，高壓均質(zhì)處理完后，進行細胞碎 片澄清過濾操作，采用兩級過濾，第一級為1. 0ym?0. 5ym深層過濾器，第二級為0. 2ym 除菌過濾器，澄清過濾完成后，對病毒液進行超濾濃縮，采用300K孔徑超濾膜，對處理后的 病毒收獲液進行10倍濃縮，即得到單價血清型疫苗原液。
[0031] 本發(fā)明還涉及所述六價重配口服輪狀病毒疫苗在制備口服輪狀病毒疫苗中的應 用。
【具體實施方式】
[0032] 材料與方法
[0033] 1 ?主要材料：
[0034] 1.IVero細胞細胞來源于ATCC(Americantypeculturecollection美國標準菌 種保藏中心），123代，ATCC編號：TL-CCL-81. 4 ;
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