大麻素修飾的核酸分子的制作方法
【專利說明】大麻素修飾的核酸分子

【發(fā)明內(nèi)容】

[0001] 本發(fā)明涉及包含至少一個(gè)多不飽和脂肪酸殘基，特別是花生四烯酸殘基，更特別 是大麻素（花生四烯酸乙醇胺）殘基，以及與其共價(jià)結(jié)合的至少一個(gè)核苷組分，所述核苷組 分選自核酸、核苷和核苷酸。該綴合物適合于高效率的細(xì)胞轉(zhuǎn)染，所述細(xì)胞例如哺乳動物細(xì) 胞包括人細(xì)胞。因此，提供了用于治療性分子包括反義分子、siRNA分子、miRNA分子、詰抗 劑或者這些分子的前體、以及治療性核苷或核苷酸的新遞送媒介物。
[0002] RNA干擾是一個(gè)功能強(qiáng)大的工具，其利用短RNA雙鏈來抑制細(xì)胞中的特定蛋白質(zhì) 的形成（1-3)。在自然界中，沉默RNA分子由更大的轉(zhuǎn)錄物被Dicer復(fù)合物切割而產(chǎn)生（4)。 然而對于生物技術(shù)應(yīng)用，RNA分子（siRNA)是化學(xué)制備并施用的。將siRNA用作治療劑的 想法（5)在過去十年里被強(qiáng)烈地追求，但最主要的障礙是RNA雙鏈體的差細(xì)胞攝取不能被 克服（6)。目前，集中研宄RNA遞送系統(tǒng)，不同的如納米粒子（7,8)、脂質(zhì)體（9，10)或聚陽 離子聚合物（11)。盡管在該領(lǐng)域有重大進(jìn)展，然而，經(jīng)常仍然是高毒性（12-14)和低細(xì)胞特 異性，這代表未解決的問題。
[0003] 最近，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用已演變?yōu)樵试SSiRNA靶向特定細(xì)胞類型的備選遞送策 略（16-25)。該方法需要將siRNA連接至與細(xì)胞類型特異性受體結(jié)合的配體。這啟動內(nèi)化 過程，導(dǎo)致RNA-配體綴合物的吸收。目前，該策略在膽固醇修飾的RNA(24)時(shí)最成功地執(zhí) 行。
[0004] 在這里，我們報(bào)告此類受體介導(dǎo)的策略可成功用于解決敏感的細(xì)胞如神經(jīng)細(xì)胞 (26,27)和免疫細(xì)胞（28)至今很難被轉(zhuǎn)染的問題。我們發(fā)現(xiàn)，存在于這兩種細(xì)胞類型（29) 上的大麻素受體可以用花生四烯酸乙醇酰胺（30, 31)(大麻素）修飾的siRNA進(jìn)行有效地 革巴向。
[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)方面是包含多不飽和脂肪酸殘基和與其共價(jià)結(jié)合的核苷組分的 綴合物，其中所述核苷組分選自核酸、核苷和核苷酸。
[0006] 術(shù)語"綴合物"還包括鹽，特別是藥學(xué)上可接受的鹽，如具有無機(jī)或有機(jī)酸或者堿 的加成鹽，如本領(lǐng)域所已知的。
[0007] 綴合物包含至少一個(gè)多不飽和脂肪酸殘基，特別是1-10,更特別是1-5個(gè)脂肪酸。 甚至更特別的是，綴合物包含1或2個(gè)多不飽和脂肪酸殘基。最特別的是，綴合物包含1個(gè) 多不飽和脂肪酸殘基。
[0008] 在特定的實(shí)施例中，多不飽和脂肪酸殘基是花生四烯酸（AA)殘基，更特別是花生 四烯酸乙醇酰胺（大麻素）酸殘基。
[0009] 在進(jìn)一步的【具體實(shí)施方式】，附著至多不飽和脂肪酸殘基的核苷組分是核酸分子， 更特別的是RNA分子。
[0010] 綴合物包含至少一個(gè)核苷組分，特別是1-25,更特別是2-20或2-10,和甚至更特 別是2-8,即2、3、4、5、6、7或8個(gè)核苷組分。如果綴合物包含多于一個(gè)核苷組分，核苷組分 可以是相同的或不同的。
[0011] 在進(jìn)一步的【具體實(shí)施方式】中，綴合物包含1個(gè)多不飽和脂肪酸殘基，例如大麻素 殘基和2-20,特別是2-8,即2、3、4、5、6、7或8個(gè)核苷組分。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方式中，綴合物可以具有線性結(jié)構(gòu)。因此，核苷組分可以連接在線性鏈 中，其中多不飽和脂肪酸殘基可以存在于鏈中，在鏈的一端或鏈的兩端。
[0013] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，綴合物具有分枝的結(jié)構(gòu)，其中通過分枝的連接體將核苷組 分結(jié)合至多不飽和脂肪酸殘基，所述連接體例如樹枝狀連接體。
[0014] 術(shù)語"多不飽和脂肪酸殘基"包括游離脂肪酸殘基，但也包括脂肪酸衍生物殘基， 特別是脂肪酸酯殘基，或脂肪酸酰胺殘基，脂肪酸磺酸酯殘基，脂肪酸硫酸酯殘基、脂肪酸 膦酸酯殘基、脂肪酸磷酸酯殘基等。提供多不飽和脂肪酸殘基具有至少一個(gè)核苷組分可以 共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)。功能基團(tuán)可以是脂肪酸的羧基或另一種功能基團(tuán)，如存在于酯殘基 的醇上的功能基團(tuán)或存在于胺殘基的酰胺上的功能基團(tuán)，如OH或NH 2基團(tuán)。酯殘基的醇部 分可以例如為具有其他功能基團(tuán)的q_5醇，如乙二醇、丙二醇或甘油。酰胺殘基的胺部分可 是具有其他功能基團(tuán)的Q_ 5胺，如乙醇胺、丙醇胺或乙二胺。
[0015] 在綴合物中存在的多不飽和脂肪酸殘基優(yōu)選地是多不飽和C16_C24脂肪酸殘基，特 別是C 18、C19、C2(l、C21或C 22脂肪酸殘基，更特別是C 2(|脂肪酸殘基。多不飽和脂肪酸殘基具 有至少2個(gè)C = C鍵，特別是3、4、5或6個(gè)并且更特別是4個(gè)C = C鍵。至少1-5,特別是 4個(gè)C = C鍵是以Z構(gòu)型。更特別地，所有的雙鍵是以Z構(gòu)型。
[0016] 多不飽和脂肪酸殘基的具體例子選自順-5, 8, 11，14-二十碳四烯酸（花生四烯 酸）殘基，順-5, 8, 11，14, 17-二十碳五烯酸（EPA)殘基，順-4, 7, 10, 13, 16, 19-二十二碳 六烯酸（DHA)殘基、順-6, 9, 12-十八碳三烯酸（GLA)殘基和順-8, 11，14-二十碳三烯酸 (DGLA)殘基。更特別的是，脂肪酸殘基是花生四烯酸殘基。在一個(gè)特別優(yōu)選的具體實(shí)施方 式中，脂肪酸殘基是花生四烯酸乙醇酰胺（大麻素）。
[0017] 脂肪酸殘基共價(jià)結(jié)合至至少一個(gè)核苷組分。優(yōu)選地，脂肪酸殘基通過連接體結(jié)合 至至少一個(gè)核苷組分。連接體可以是線性的或分枝的連接體，并通常具有2-50個(gè)原子的鏈 長度，原子包括碳原子和特別是如S、N和/或0原子的雜原子。
[0018] 例如，連接體可以是線性的連接體，例如連接體包括至少一個(gè)，例如1-10,特別是 2_5和更特別是3個(gè)Ci_C 3環(huán)氧燒基團(tuán)，特別是環(huán)氧乙燒基團(tuán)。
[0019] 備選地，連接體可以是分枝的，例如樹枝狀連接體。
[0020] 可以通過已知的連接體技術(shù)將多不飽和脂肪酸殘基連接至至少一個(gè)核苷組分。 然而優(yōu)選地，附著包括Click反應(yīng)，例如疊氮化物與炔烴基團(tuán)之間，在受限的烯烴之間， 例如降冰片烯和腈亞胺、氧化腈或四嗪，從而產(chǎn)生通過Click反應(yīng)形成的環(huán)基團(tuán)，特別是 1，2, 3-三氮唑基團(tuán)。
[0021] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，多不飽和脂肪酸殘基是受體配體，優(yōu)選地是真核細(xì)胞的膜 中存在的受體的配體，特別是哺乳動物細(xì)胞如人細(xì)胞的膜中存在的受體的配體。更優(yōu)選地， 多不飽和脂肪酸殘基是大麻素受體的配體，如（48)所描述的，其內(nèi)容并入本文。
[0022] 在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的綴合物表示為通式（la)或（lb)
[0023] Fn一(Lm-N) r (la)
[0024] Fn-(Lm-N) r-Lm-Fn (lb)
[0025] 其中
[0026] F是多不飽和脂肪酸殘基，
[0027] L是連接體，
[0028] N是選自核酸、核苷和核苷酸的核苷組分，
[0029] n是1-10,優(yōu)選地1-5,更優(yōu)選地1的整數(shù)，
[0030] m 是 0 或 1，
[0031] r是1-25,優(yōu)選地2-20和更優(yōu)選地2-8的整數(shù)。
[0032] 在這個(gè)實(shí)施方式中，綴合物可以由例如如下結(jié)構(gòu)表示：
[0033] F-L-N
[0034] F- (L-N) r
[0035] 其中F、L、N和r是如上文所定義的，
[0036] F-L*- (N)r
[0037] 其中I；是分枝的連接體并且F、N和r是如上文所定義的，
[0038] F- (L-N)r-L-F
[0039] 其中F、L、N和r是如上文所定義的。
[0040] 在另一個(gè)實(shí)施例中，綴合物可包含其他受體配體，其共價(jià)結(jié)合至至少一個(gè)核苷組 分。其他受體配體是不同于多不飽和脂肪酸殘基的化合物，如葉酸、膽固醇或激素。
[0041] 在該【具體實(shí)施方式】中，綴合物可由具有通式（II)的結(jié)構(gòu)表示
[0042] Fn-(Lm-N) r-Lm-Zs (II)
[0043] 其中
[0044] F是多不飽和脂肪酸殘基，
[0045] L是連接體，
[0046] n是1-10,優(yōu)選地1-5,更優(yōu)選地1的整數(shù)，
[0047] m 是 0 或 1，
[0048] N是選自核酸、核苷和核苷酸的核苷組分，
[0049] r是1-25,優(yōu)選地2-20和更優(yōu)選地2-8的整數(shù)
[0050] Z是其他受體配體，和
[0051] s是1-10,優(yōu)選地1-5,更優(yōu)選地1的整數(shù)。
[0052] 在該實(shí)施方式中，綴合物可由如下結(jié)構(gòu)表示：
[0053] F-L-N-Z
[0054] F- (L-N)r-L-Z
[0055] 其中F、L、N、Z和r是如上文所定義的，
[0056] F-L*- (N)r-L-Z
[0057] I；是分枝的連接體并且F、L、N、Z和r是如上文所定義的。
[0058] 本發(fā)明的綴合物包含選自核酸、核苷和核苷酸的至少一個(gè)核苷組分。
[0059] 術(shù)語"核酸"包括單股單鏈和雙鏈核酸分子，如DNA分子或RNA分子和及其類似物。 核酸類似物是包含如下所描述的至少一個(gè)經(jīng)修飾的構(gòu)建區(qū)塊的核酸分子。
[0060] 在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸分子是其包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的構(gòu)建區(qū)塊的DNA分子。 術(shù)語"DNA分子"包括單鏈或雙鏈DNA分子。在雙鏈DNA分子中，各鏈可以以單獨(dú)的分子存 在或者通過單鏈環(huán)或通過異源連接體而共價(jià)連接。
[0061] 術(shù)語"DNA分子"包括由天然DNA構(gòu)建區(qū)塊即2' -脫氧核苷酸構(gòu)建區(qū)塊構(gòu)成的分 子，和包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的構(gòu)建區(qū)塊的分子。
[0062] 在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，核酸分子是RNA分子，其可包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的構(gòu)建 區(qū)塊。術(shù)語"RNA分子"包括單鏈或雙鏈RNA分子，其中雙鏈RNA分子具有至少一個(gè)突出，例 如至少一個(gè)3' -突出。在雙鏈RNA分子，各鏈可以以單獨(dú)的分子存著或者通過單鏈環(huán)或通 過異源連接體而共價(jià)連接。
[0063] 術(shù)語"RNA分子"包括由天然RNA構(gòu)建區(qū)塊即2' -核糖核苷酸構(gòu)建區(qū)塊組成的分 子，和包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的構(gòu)建區(qū)塊的分子。
[0064] 經(jīng)修飾的構(gòu)建區(qū)塊可以選自糖_、主干-和/或核堿基-修飾的構(gòu)建區(qū)塊。糖-修 飾的脫氧核糖核苷酸包含與脫氧核糖不同的糖基團(tuán)，例如經(jīng)修飾脫氧核糖基團(tuán)，其中2'-H 基團(tuán)被選自〇H、R、OR、鹵素、SH、SR、NH2、NHR，殿2或CN的基團(tuán)取代，其中R是C「C6烷基或 烷氧基，或者(：2-(：6烯基或炔基，并且鹵素是？、(：