胞用 poly (I:C) (10mg/ml)、LPS(100ng/ml)、PGN(25 μ g/ml)、Η5Ν1 (Μ0Ι =1)或NDV (MOI = 1)刺激一段指定的時間。
[0083] RT-PCR 分析:
[0084] 首先,這些細胞在無血清的情況下孵化12小時。用DMSO或m-3M3FBS (IOmM)預(yù) 孵化30分鐘之后,這些細胞用p〇ly(I:C) (10mg/ml)刺激一段指定的時間。根據(jù)廠商說 明書(Invitrogen)的指示,用Iml TRIzol試劑提取總RNA。然后,使用ReverTra Ace? qPCR RT Kit(Toyobo, FSQ-101),根據(jù)廠商說明書指示,將1 μ g總RNA逆轉(zhuǎn)錄。 LightCycler (Roche, LC480)和 SYBR RT-PCR kit (Toyobo,QPK-212)被用于定量實時 RT-PCR分析。表達值被標準化為那些用各自基因 Gapdh (編碼GAPDH)獲得的表達值。
[0085] 雙焚光素酶報告基因試驗:
[0086] 哺乳類動物293T細胞系被用于雙熒光素酶報告基因試驗。細胞在DMEM(高葡萄 糖含量;Bibco,Life Technologies,Grand Island,NY,USA)中用 10% FBS 培養(yǎng)。在轉(zhuǎn) 染前,將細胞接入96孔細胞培養(yǎng)板中。24小時后,使用Lipofectamine? 2000轉(zhuǎn)染試劑 (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY, USA)將報告質(zhì)粒(每孔總共 IOng) 和表明質(zhì)粒(每孔IOOng)共同轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后大約48小時后,按照廠商說明書的指示,在 Modulus?單管多功能酶標儀(Turner Biosystems, Sunnyvale, CA, USA)上使用 Luciferase Assay Reagent II (LAR II) (Promega, Madison, WI, USA),定量 Renilla 和螢火蟲焚光素酶 的活性。轉(zhuǎn)染一式三份。配對t檢驗被用于確定顯著性差異。
[0087] 免疫印跡試驗和免疫共沉淀反應(yīng):
[0088] 為發(fā)生免疫沉淀反應(yīng),使用磷酸鈣-DNA共傳染方法在=293T細胞中瞬時轉(zhuǎn)染。48 小時后,用PBS洗滌細胞,并隨后在裂解緩沖液(20mM Tris(pH7. 5),150mM NaCl,l%Triton X-100,焦磷酸鈉,β-甘油磷酸酯,EDTA,Na3VO4,亮抑酶肽)中細胞裂解,加入I %蛋白酶抑 制劑混合物(Sigma,P8340)、ImM NaF和ImM Na3V0449。放置于冰上30分鐘后,將溶解產(chǎn)物 以13523 Xg的速度、在4°C下離心分離15分鐘,以除去碎片。將細胞裂解產(chǎn)物用抗Flag M2 親和凝膠、在4°C下過夜孵化。為發(fā)生內(nèi)生免疫沉淀反應(yīng),腹腔巨噬細胞用p〇ly(I:C)刺激 一段指定的時間。細胞隨后被裂解,并將溶解產(chǎn)物用PLC β 2抗體和Protein G S印harose? 4Fast Flow、在4°C下過夜孵化。離心分離瓊脂糖樣品,用細胞裂解緩沖液洗滌三次,并用 SDS上樣緩沖液煮沸8分鐘。
[0089] GST融合蛋白和沉淀試驗:
[0090] 通過PCR擴增TAKl和PLC β 2蛋白,并分別亞克隆至pGEX-4Tl (Amersham)和 pET28a (Novagen)載體中。按照廠商說明書指示,將His和GST融合蛋白表達在BL-21 (DE3) 細菌(Invitrogen)中。按照上述方法溶解RAW264. 7細胞中。將溶解產(chǎn)物或提純的 His-PLCf3 2蛋白用等量的適當?shù)娜诤系鞍?、?°C下孵化4小時,結(jié)合到谷胱甘肽珠上。將 肽珠離心分離、洗滌、用SDS上樣緩沖液煮沸8分鐘,并隨后通過免疫印跡分析。
[0091] 細胞染色和共焦顯微鏡:
[0092] 按照廠商說明書指不,用 Lipofectamine? 2000 (11668-019,Invitrogen)轉(zhuǎn)染 HeLa細胞。轉(zhuǎn)染48小時后,在25°C下用4%甲醛固定細胞30分鐘。細胞被染色,并使用裝 配有分析軟件的Leica共焦顯微鏡進行檢測。
[0093] 動物實驗:
[0094] 用注射器將10 μ I CVA16 (每鼠4X IO5PUF)腹腔注射無特定病原體的14天大WT 或ΡΙΧβ2基因敲除小鼠。每天觀察1次小鼠的臨床癥狀和死亡數(shù),觀察14天。將DMSO或 m-3M3FBS (5mg/kg)注射到CVA16感染的小鼠中,注射3次(感染1天前、感染2天后和感染 5天后)。
[0095] 臨床疾病按下列評分:
[0096] 0,健康;
[0097] 1,折邊皮毛和駝背的外觀;
[0098] 2,消耗的;
[0099] 3,四肢乏力;
[0100] 4,四肢癱瘓;
[0101] 5,垂死的和死亡。
[0102] 感染5天后,從WT或PLC β 2基因剔除小鼠中采集肺、肌肉、脾臟組織樣本,并固定 在10%中性的緩沖福爾馬林(Sigma-Aldriich)中。這些組織被用石蠟包埋、切開、用伊紅 染劑(Η&Ε)染色。獲得X 100或Χ200放大倍率的明視場顯微鏡照片。所有動物研宄經(jīng)過 同濟大學的機構(gòu)動物管理與使用小組批準。
[0103] 統(tǒng)計分析:
[0104] 兩組間的統(tǒng)計顯著性通過雙尾學生t檢驗和雙向方差分析(ANOVA)確定。當ρ < 0. 05時,被認為是有顯著差別。
[0105] 倫理學聲明:
[0106] 本發(fā)明工作接受來自上海交通大學藥學院附屬新華醫(yī)院的臨床倫理委員會的批 準,符合國家政府的指導方針和制度性政策。獲得來自參與到本發(fā)明研宄中的未成年人/ 兒童參與者在親戚、監(jiān)護人或看護人的陪同下簽署的書面知情同意書。倫理委員會明確批 準了這份同意書的程序。
[0107] 人體樣本:
[0108] 從小于10歲大的兒童獲得全血樣本。根據(jù)中國衛(wèi)生部HFMD診斷標準(2008) (http://www. moh. gov. cn/mohbgt/s9503/200812/38494. shtml)臨床診斷出 6 名兒童患有 HFMD。除此之外,5歲匹配的沒有HFMD史的健康兒童被包括作為空白對照組。為進行免疫 印跡試驗,根據(jù)廠商說明書的指示,用紅血細胞裂解緩沖液(eBioscience)處理全血樣本; 然后,剩余的細胞被溶解在裂解緩沖液中。
[0109] 試驗結(jié)果分析:
[0110] 從5個沒有HFMD史的健康對照組和6個臨床診斷患有HFMD的病患采集血液樣本, 并隨后用免疫印跡試驗分析這些樣本。發(fā)現(xiàn)磷脂酶C(phospholipase C,PLC) β2的蛋白質(zhì) 水平(一種被用于有效的信號轉(zhuǎn)換和白血球活化的關(guān)鍵的酶)在HFMD患者中大大高于對 照組(圖IA和圖1Β)。然后,將血液樣本的采集擴展至30個HFMD病患,并分析轉(zhuǎn)化生長因 子 β 激活激酶 I (transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAKl)、調(diào)節(jié)核因 子-κ B (nuclear factor, NF-κ B)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的細胞內(nèi)中心分子的活性,它們標記著對產(chǎn)生促炎細胞因子起關(guān)鍵作用的路 徑。
[0111] 根據(jù)TAKl磷酸化的水平,將前12個樣本分為兩組。第二組病患比第一組具有更 高水平的TAKl活性、然而更低表達的PLC β 2 (圖1E)。而且,在一組30個HFMD臨床樣本中 發(fā)現(xiàn)TAKl活性和PLCβ 2蛋白水平存在反相關(guān)(圖IF)。而且,第二組HFMD病患產(chǎn)生顯著 更低的IL-6(圖IC和圖1D)。這些結(jié)果顯示,ΡΙΧβ 2會抑制TAKl活性,這樣就減少了 IL-6 的產(chǎn)生。
[0112] 然后,確定PLC β 2是否是由CVA16病毒的感染而誘發(fā)的。實際上,感染CVA16會誘 發(fā)PLC β 2的表達(圖1G)。在病毒感染過程中通常會產(chǎn)生dsRNA (Weber, R,V. Wagner, S. B. Rasmussen, R. Hartmann, and S. R. Paludan. 2006. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. J Virol. 80:5059-5064)。用聚肌苷酸胞苷酸poly(I:C)刺 激也提高了 PLC β 2的產(chǎn)生(圖1H)。然而,在TLR3+巨噬細胞或野生型(wild-type, WT)巨 噬細胞中,由P〇ly(I:C)刺激ΡΙΧβ 2的上調(diào)會被減弱,用SB203580處理(圖II和圖1J)。 這些結(jié)果顯示,PLC β 2會被dsRNA通過TLR3-p38路徑誘發(fā)。
[0113] 為檢查PLC β 2是否對CVA16誘發(fā)的促炎細胞因子的產(chǎn)生起作用,用poly (I:C)刺 激來自PLC β 2+ (PLC β 2-不足)小鼠或WT小鼠的巨噬細胞,并用定量RT-PCR分析法分析 促炎細胞因子的產(chǎn)生。當用P〇ly(I:C)刺激后,ΡΙΧβ2+的巨噬細胞顯示出比WT巨噬細 胞產(chǎn)生更高的促炎細胞因子TNF和IL-6(圖2Α和圖2Β)。為調(diào)查PLCβ 2在體內(nèi)的功能作 用,將兩周大的WT小鼠或PLC β 2V_小鼠用CVA16病毒感染5天,促炎細胞因子的表達水平 用定量RT-PCR分析法分析。PLC β 2〃-小鼠的肌肉具有比WT小鼠顯著更高的TNF (圖2C)、 IL-6(圖2D)、IL-12(圖2Ε)的mRNA水平,說明了 ΡΙΧβ2負向調(diào)節(jié)體內(nèi)促炎因子的病毒誘 發(fā)表達。通過兩周大的WT小鼠或PLC β 2