一種跨膜蛋白3包裝的外泌體在制備抗登革病毒感染藥物中的應(yīng)用
【專利說(shuō)明】一種跨膜蛋白3包裝的外泌體在制備抗登革病毒感染藥物 中的應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種跨膜蛋白3包裝的外泌體 在制備抗登革病毒感染藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 外泌體（exosome)又稱胞外體，是由細(xì)胞內(nèi)的多泡體（multivesicularbody, MVB) 與細(xì)胞膜融合后，釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的一種膜性囊泡（vesicles)。exosome這個(gè)術(shù)語(yǔ)最 初由Johnstone等報(bào)道提出并命名，他們?cè)谘绣尘W(wǎng)織紅細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變過(guò)程中，從 體外培養(yǎng)羊網(wǎng)織紅細(xì)胞的上清液中，分離純化了這種小囊泡狀物質(zhì)，它可以帶走成熟紅細(xì) 胞不需要的質(zhì)膜蛋白，如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和乙酰膽堿脂酶等。外泌體起源于細(xì)胞內(nèi)吞過(guò)程中 的內(nèi)體（endosome)，內(nèi)體的外膜向其腔內(nèi)出芽，形成一個(gè)膜包裹的結(jié)構(gòu)，其基部逐漸與內(nèi)涵 體的膜分離，脫落后就形成了內(nèi)體內(nèi)的小囊泡（40?100 nm大小)，同時(shí)可有多個(gè)小囊泡形 成，而含有多個(gè)小囊泡的內(nèi)體又稱為多泡體（500 nm大小)。多泡體的代謝途徑一般有兩種： 一是與質(zhì)膜融合，將其中的小囊泡以胞吐的方式排到細(xì)胞外環(huán)境，即成為外泌體：另一種是 在胞內(nèi)與溶酶體（lysosome)融合，導(dǎo)致其內(nèi)容物的降解。隨后研宄報(bào)道外泌體又從其他類 型細(xì)胞的培養(yǎng)基與體液中被分離出來(lái)。
[0004] 外泌體參與機(jī)體的多種功能，包括參與清除細(xì)胞冗余成分、介導(dǎo)細(xì)胞粘附及信號(hào) 傳遞、抗原提呈、細(xì)胞間傳遞遺傳物質(zhì)；另外，外泌體具有促病毒感染與抑制病毒感染雙重 功能：1.外泌體傳遞病毒顆粒一一介導(dǎo)病毒的感染；2.外泌體傳遞病毒結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)蛋 白--參與病毒逃避機(jī)體免疫監(jiān)視；3.外泌體傳遞宿主細(xì)胞抗病毒蛋白--參與宿主天然 抗病毒免疫調(diào)節(jié)。
[0005] 既然外泌體能夠包裝各種蛋白，那么在病毒感染時(shí)，如果宿主細(xì)胞將干擾素誘導(dǎo) 的抗病毒蛋白包裝成外泌體形式，進(jìn)行抗病毒蛋白的細(xì)胞間傳遞，直接使宿主形成更強(qiáng)的 抗病毒免疫狀態(tài)，這將提出宿主天然免疫調(diào)節(jié)新型模式。Khatua等科學(xué)家研宄發(fā)現(xiàn)包裝了 AP0BEC3G蛋白的外泌體可直接傳遞到宿主細(xì)胞而具極強(qiáng)的抗HIV-I病毒感染的功效。作為 一種機(jī)體天然抗病毒因子，AP0BEC3G是一種胞嘧啶脫氨基酶家族成員，近年來(lái)因其獨(dú)特的 抗病毒作用機(jī)制受到了廣泛的關(guān)注。HIV-I在宿主細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中，AP0BEC3G可以大量包 裝進(jìn)入新生成的病毒顆粒內(nèi)部，誘導(dǎo)病毒負(fù)鏈cDNA胞嘧啶（cytimidine，C)脫氨基突變?yōu)?尿嘧啶（uracil，U)，導(dǎo)致病毒基因組高度突變而喪失活性。但是，HIV編碼的Vif蛋白能拮 抗AP0BEC3G的脫氨基酶作用，二者形成動(dòng)態(tài)平衡，所以HIV最終還是能夠逃脫AP0BEC3G的 抗病毒作用。而AP0BEC3G外泌體不但直接參與了宿主抵抗HIV入侵的防御機(jī)制，而且可以 避免HIV的Vif蛋白的拮抗作用，具體分子機(jī)制未明。外泌體傳遞宿主細(xì)胞抗病毒蛋白，為 新型抗病毒藥物的開(kāi)發(fā)和機(jī)體天然免疫機(jī)制的研宄開(kāi)拓了新的方向，可對(duì)未來(lái)的病毒性病 原體所致的疾病的防治提供新的線索與思路。本研宄通過(guò)探索包裝抗病毒蛋白的外泌體， 是否可以直接代替干擾素的抗病毒作用，如此可拓展人體天然抗病毒蛋白的臨床應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明人通過(guò)研宄發(fā)現(xiàn)，跨膜蛋白3作為外泌體的新型生物活性形式，外泌體傳 遞宿主細(xì)胞抗病毒蛋白，打破了現(xiàn)有技術(shù)中采用干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病毒蛋白的思路，為新 型抗病毒藥物的開(kāi)發(fā)和機(jī)體天然免疫機(jī)制的研宄開(kāi)拓了新的方向。
[0007] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 本發(fā)明提供了一種IFITM3(跨膜蛋白3)包裝的外泌體在制備抗登革病毒感染藥物中 的應(yīng)用，所述外泌體的制備方法為收集高表達(dá)IFITM3的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基上清，將 上清采用蔗糖密度梯度超速離心法即得所述外泌體。
[0008] 優(yōu)選地，所述高表達(dá)IFITM3重組質(zhì)粒的制備方法為： SI:根據(jù)IFITM3的基因序列，設(shè)計(jì)正向引物，如SEQ ID NO :1所示，設(shè)計(jì)反向引物，如 SEQ ID NO : 2 所示； S2:根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)條件如下：94 °C預(yù)變性5 min;94 °C變性30 s，55 °C 30 s，72 °C 60 s，30個(gè)循環(huán)；72 °C延伸7 min，然后將所有擴(kuò)增產(chǎn)物用I. 5 %瓊脂糖凝膠電泳 并切膠回收純化； S3:利用QIAprep spin miniprep kit抽提質(zhì)粒，將pMSCV質(zhì)粒DNA與IFITM3基因片段 PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切反應(yīng)和連接，測(cè)序比對(duì)后，利用氯化銫梯度離心法提取pMSCV- IFITM3 重組質(zhì)粒DNA。
[0009] 優(yōu)選地，所述IFITM3包裝的外泌體的產(chǎn)量鑒定方法為采用IFITM3包裝的外泌體 處理HeLa受體細(xì)胞后，檢測(cè)HeLa細(xì)胞中IFITM3的蛋白水平。
[0010] 優(yōu)選地，所述IFITM3包裝的外泌體的活性鑒定方法為應(yīng)用real time RT-PCR檢 測(cè)細(xì)胞內(nèi)感染的登革病毒RNA和培養(yǎng)基上清中病毒RNA。
[0011] 本研宄首先證明了登革病毒感染可誘發(fā)宿主細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)IFITM，繼而分別通過(guò) 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒和磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建IFITM外源性穩(wěn)定及瞬時(shí)高表達(dá)體系，應(yīng)用 western blotting技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)來(lái)證明IFITM3蛋白的抗登革病毒感染的活性。同時(shí)， 還將應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默IFITM表達(dá)，以明確其是否能增強(qiáng)登革病毒感染，用以探討宿主 細(xì)胞的內(nèi)源性IFITM蛋白是否具有抗登革病毒感染能力。另一方面，本實(shí)驗(yàn)利用逆轉(zhuǎn)錄病 毒系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)IFITM3蛋白的293T細(xì)胞系，并且利用超速分級(jí)離心技術(shù)成功獲得 了 293T-IFITM3細(xì)胞系上清中的外泌體，應(yīng)用透射電鏡技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)等方法證明上清中 的IFITM蛋白是外泌體形式，應(yīng)real time RT-PCR技術(shù)證明IFITM3蛋白的外泌體形式的 高效抗登革病毒活性。由此提出了以IFITM3包裝的新型內(nèi)源性外泌體應(yīng)用于抗登革病毒 治療的新策略。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明所提供的外泌體可以傳遞宿主細(xì)胞抗病毒蛋白，從而為新型抗病毒藥物的開(kāi)發(fā) 和機(jī)體天然免疫機(jī)制的研宄開(kāi)拓了新的方向，可對(duì)未來(lái)的病毒性病原體所致的疾病的防治 提供新的線索與思路。同時(shí)，抗病毒蛋白外泌體是否可以代替干擾素直接應(yīng)用于抗病毒藥 物研發(fā)，這將開(kāi)拓人源性抗病毒蛋白在抗病毒防治的臨床應(yīng)用新領(lǐng)域。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1是一系列易感細(xì)胞感染登革病毒后E蛋白的表達(dá)情況以及感染后IFITM3蛋 白的表達(dá)變化情況的電泳圖； 圖2是穩(wěn)定高表達(dá)外源性IFITM1，2, 3的U937-IFITM1，2, 3細(xì)胞的建立并經(jīng)電泳證實(shí) 的結(jié)果圖； 圖3是流式細(xì)胞儀檢測(cè)外源性穩(wěn)定高表達(dá)IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白對(duì)U937細(xì)胞的 抗登革病毒感染作用的結(jié)果圖； 圖4是IFITM內(nèi)源性高表達(dá)的HUVEC的培養(yǎng)基上清中存在IFITM3蛋白的電泳鑒定圖； 圖5是所述外泌體的透射電子電鏡觀察鑒定結(jié)果圖； 圖6是所述外泌體中存在IFITM3蛋白的電泳結(jié)果圖； 圖7是所述外泌體中存在IFITM3蛋白質(zhì)譜技術(shù)鑒定結(jié)果圖； 圖8是所述IFITM3外泌體處理HeLa細(xì)胞內(nèi)的IFITM3蛋白變化電泳結(jié)果圖； 圖9是所述IFITM3外泌體處理后HeLa細(xì)胞內(nèi)的IFITM3蛋白變化的時(shí)間-效應(yīng)電泳 結(jié)果圖； 圖10是Real time RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)感染的DENV RNA結(jié)果圖； 圖11是Real time RT-PCR方法檢測(cè)培養(yǎng)基上清中的DENV RNA結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合一些【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步解釋和說(shuō)明。具體實(shí)施例為進(jìn)一步 詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，非限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015] 實(shí)施例1 :pMSCV-IFITM重組質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定及提取 從 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)下載 IFITMl、IFITM2、IFITM3 基因序列，利用 Primer Premier 5. 0 軟件自行設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增全長(zhǎng)IFITM1/2/3基因，引物由上海英俊生物公司合成，引物系 列如下：正向引物序列如下：GGAAGATCTGCCATGAATCACACTGTCCAAACCTTC ;反向引物序列如 下：CCGGAATTCCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATCCATAGGCCTGGAAGATCAG 〇
[0016] 利用Trizol法提取細(xì)胞總RNA后，以核酸蛋白定量?jī)x分別測(cè)定RNA濃度，根據(jù)所 測(cè)得的濃度，將全部RNA用無(wú) RNA酶的水稀釋成終濃度為1 μ g/μ 1。我們利用提取到的細(xì) 胞RNA得到IFITM1/2/3基因的cDNA產(chǎn)物，再根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)條件如下：94 °C預(yù)變 性 5 min;94 °C變性 30 s，55 °C 30 s，72 °C 60 s，30 個(gè)循環(huán)；72 °C延伸 7 min。將所有 擴(kuò)增產(chǎn)物用I. 5 %瓊脂糖凝膠(含終濃度為0. 5 μ g/ml的EB)電泳并切膠回收純化。
[0017] 利用 QIAprep spin miniprep kit 抽提質(zhì)粒，將 pMSCV 質(zhì)粒 DNA 與 IFITM1/2/3 基 因片段PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切反應(yīng)和連接，在200 μ I DH5a感受態(tài)細(xì)菌中加入10 μ 1連接 產(chǎn)物中，37 °C培養(yǎng)箱中，倒置平板培養(yǎng)12?16 h至長(zhǎng)出菌落。最后挑取單菌落接種于3 ml含氨芐青霉素（50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)液中，37 °C 300 rpm搖菌過(guò)夜。