外膜囊泡的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 本申請(qǐng)請(qǐng)求2012年9月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)US61/702, 296和2013年3月 15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)US61/799, 311的權(quán)益，這兩項(xiàng)申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用納入本 文用于所有目的。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌的囊泡。囊泡包含存在其腔中的異源蛋白。該囊 泡特別有用于免疫原性組合物，例如疫苗。
【背景技術(shù)】
[0003] 由于細(xì)胞被膜的膨壓，革蘭氏陰性菌可在其生長(zhǎng)期間自發(fā)釋放外膜囊泡（OMV)。 可通過(guò)某些細(xì)菌組分的破壞來(lái)促進(jìn)這類OMV的形成，例參考文獻(xiàn)1和2中破壞了大腸桿菌 Tol-Pal系統(tǒng)以得到在生長(zhǎng)期間向培養(yǎng)基釋放囊泡的菌株。也可通過(guò)破壞完整的細(xì)菌來(lái)產(chǎn) 生0MV。已知的OMV生產(chǎn)方法包括使用去污劑處理（例如，用脫氧膽酸鹽）[3和4]，無(wú)去污 劑方法[5]或聲處理[6]等的方法。
[0004] OMV在免疫原性細(xì)胞表面相關(guān)的、周質(zhì)和分泌的抗原中富集，并且已經(jīng)用作例如針 對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitidis)血清組B的疫苗[7]。它們特別適于該用 途，因?yàn)槟遗莺邪l(fā)揮佐劑作用的化合物，這引發(fā)針對(duì)該抗原的強(qiáng)免疫應(yīng)答。從而對(duì)于免疫 系統(tǒng)而言，囊泡是比純化的抗原性蛋白質(zhì)或其他細(xì)菌組分更為接近的天然細(xì)菌模擬物。OMV 因此保持疫苗和其他免疫原性組合物的更具吸引力的靶標(biāo)。已經(jīng)提出，通過(guò)使用ClyA作為 融合伙伴對(duì)OMV進(jìn)行工程改造以在OMV表面上呈現(xiàn)多種抗原能夠增加一些蛋白質(zhì)抗原的免 疫原性[8]。
[0005] 已經(jīng)進(jìn)行了多次嘗試以使異源蛋白，尤其是異源抗原靶向0MV。然而，很大程度上 因?yàn)榕c異源蛋白質(zhì)向囊泡運(yùn)輸相關(guān)聯(lián)的挑戰(zhàn)，迄今為止，相對(duì)親本細(xì)菌而言外來(lái)的抗原仍 然在大部分OMV中顯著缺失[11]。大多數(shù)使異源蛋白靶向OMV的嘗試依賴于異源蛋白與整 合膜蛋白的共價(jià)連接。這類共價(jià)連接的異源蛋白的示例包括FLAG表位與OmpA (外膜蛋白 A)的全長(zhǎng)序列的融合物、FLAG表位與PagP (PhoPQ-激活基因 P)的全長(zhǎng)序列的融合物[9] 以及GFP與ClyA(溶細(xì)胞素）的融合物[10]。憑借它們與膜蛋白的共價(jià)連接，所得的融合 蛋白靶向外膜并且因此包含于OMV中。這些方法具有缺陷，尤其是由于難以在不對(duì)轉(zhuǎn)化的 細(xì)菌造成有害影響的情況下過(guò)表達(dá)大量的整合膜蛋白。
[0006] 還已證明，難以使周質(zhì)蛋白靶向OMV0GFP與Tat (雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體）信號(hào)序列的融 合導(dǎo)致靶向周質(zhì)的GFP的過(guò)表達(dá)，但是GFP熒光幾乎沒(méi)有超過(guò)OMV中的背景熒光水平[11]， 表明GFP沒(méi)有進(jìn)入OMV中或者由于錯(cuò)誤折疊而在OMV中沒(méi)有功能。
[0007] 仍然存在對(duì)開(kāi)發(fā)適于在OMV中表達(dá)異源蛋白的方法，尤其是在OMV中表達(dá)抗原性 蛋白質(zhì)的方法的需求。也仍然存在對(duì)替代或改良的OMV(尤其用于疫苗）的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使異源蛋白靶向OMV的腔克服了許多與使異源蛋白靶向OMV的膜 相關(guān)的問(wèn)題。令人驚訝地，發(fā)明人也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)給予哺乳動(dòng)物時(shí)，腔中含異源蛋白的OMV能 夠引發(fā)針對(duì)該蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。
[0009] 因此，本發(fā)明提供了來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜囊泡（OMV)，其中該OMV包含在其 腔中游離的至少一種異源蛋白，并且當(dāng)給予哺乳動(dòng)物時(shí)，該OMV能夠引發(fā)針對(duì)該異源蛋白 的免疫應(yīng)答。
[0010] 本發(fā)明也提供了制備本發(fā)明的OMV的方法，該方法包括在革蘭氏陰性細(xì)菌的周質(zhì) 中表達(dá)異源蛋白的步驟。本發(fā)明還提供通過(guò)該方法獲得的或可通過(guò)該方法獲得的0MV。 [0011] 本發(fā)明也提供包括（a)本發(fā)明的OMV和（b)藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體的藥物組合 物。
[0012] 本發(fā)明也提供了在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向該哺乳動(dòng)物給 予有效量的來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌的0MV，其中該OMV在其腔中包含至少一種異源蛋白，并且 其中該免疫應(yīng)答針對(duì)OMV中的異源蛋白。在本發(fā)明的這一方面的一些實(shí)施方式中，在OMV 的腔中，該蛋白質(zhì)是游離的。本發(fā)明也提供了在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括向該 哺乳動(dòng)物給予本發(fā)明的藥物組合物，其中該免疫應(yīng)答針對(duì)OMV中的異源蛋白。
[0013] OMV
[0014] 本發(fā)明提供了來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜囊泡（OMV)，其中該OMV包含在其腔中 游離的至少一種異源蛋白，并且當(dāng)給予哺乳動(dòng)物時(shí)，該OMV能夠引發(fā)針對(duì)該異源蛋白的免 疫應(yīng)答。
[0015] OMV為本領(lǐng)域所熟知并且由細(xì)菌自發(fā)分泌到培養(yǎng)基中。"天然0MV"("N0MV"[12])、 微囊泡（MV[13])、去污劑提取的OMV(DOMV)、突變體衍生的OMV(m-〇MV)和小泡（其在以MV 形式釋放之前是與細(xì)菌保持連接的外膜凸起）（[14] ;[15])，全部屬于本發(fā)明的部分并且 在本文中統(tǒng)稱為OMV蛋白。
[0016] 可從任何合適的革蘭氏陰性細(xì)菌中得到本發(fā)明的0MV。典型的革蘭氏陰性細(xì)菌是 大腸桿菌（E.coli)。然而，除了大腸桿菌，其可以是不同的革蘭氏陰性細(xì)菌。本發(fā)明所用 的優(yōu)選的革蘭氏陰性細(xì)菌包括在人體中非致病性的細(xì)菌。例如，該細(xì)菌可以在人體中是共 生的。然而，在一些實(shí)施方式中，所用的細(xì)菌一般不在人類宿主中出現(xiàn)。本發(fā)明所用的示 例性物種包括以下任何屬中的物種：大腸桿菌屬（Escherichia)、志賀氏菌屬（Shigella)、 奈瑟氏球菌屬（Neisseria)、莫拉氏菌屬（Moraxella)、博德特菌屬（Bordetella)JS 疏氏螺旋體屬（Borrelia)、布魯氏菌屬（Brucella)、衣原體屬（Chlamydia)、嗜血菌 屬（Haemophilus)、軍團(tuán)菌屬（Legionella)、假單胞菌屬（Pseudomonas)、耶爾森菌屬 (Yersinia)、螺桿菌屬（Helicobacter)、沙門(mén)菌屬（Salmonella)、弧菌（Vibrio)等。具 體地，細(xì)菌可以是志賀氏菌物種（如痢疾志賀氏菌（S. dysenteriae)、弗氏志賀氏菌 (S. flexneri)、鮑氏志賀氏菌（S. boydii)或索氏志賀氏菌（S. sonnei))?；蛘?，其可以是 奈瑟氏球菌物種，尤其是非致病性物種，如桿狀奈瑟氏球菌（N. bacilliformis)、灰色奈瑟 氏球菌（N. cinerea)、長(zhǎng)奈瑟氏球菌（N. elongata)、淺黃奈瑟氏球菌（N. f Iavescens)、乳糖 奈瑟氏球菌（N. Iactamica)、恒河猴瑟氏球菌（N.macacae)、粘液瑟氏球菌（N. mucosa)、多 糖瑟氏球菌（N. polysaccharea)、干燥瑟氏球菌（N. sicca)或微黃瑟氏球菌（N. subflava)， 并且尤其是乳糖奈瑟氏球菌（N. lactamica)。或者，可使用奈瑟氏球菌的致病物種，例如， 淋病奈瑟氏球菌（N.gonorrhoeae)或腦膜炎奈瑟氏球菌（N. meningitidis)。在其他示 例中，細(xì)菌可以是百日咳博德特菌（Bordetella pertussis)、布氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi)、山羊布魯氏菌（Brucella melitensis)、羊布魯氏菌（Brucella ovis)、嬰鳥(niǎo)鵡 熱衣原體（Chlamydia psittaci)、砂眼衣原體（Chlamydia trachomatis)、粘膜炎莫拉氏菌 (Moraxella catarrhalis)、流感嗜血菌（Haemophilus influenzae)(包括不可分型菌株）、 嗜肺軍團(tuán)菌（Legionellapneumophila)、綠胺假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、小腸 結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica)、幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori)、腸 沙門(mén)氏菌（Salmonella enterica)(包括傷寒沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌，以及副傷寒沙 門(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae)、變形桿菌（Proteus)、朽1檬酸桿菌 (Citrobacter)、沙雷氏菌（Serratia)、歐文氏菌（Erwinia)、巴斯德氏菌（Pasteurella) 等。也可使用光合型革蘭氏陰性細(xì)菌。細(xì)菌一般是感受態(tài)菌株。該特征便于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行遺 傳修飾。
[0017] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述革蘭氏陰性細(xì)菌是該細(xì)菌的"高發(fā)泡"菌株。 WO 02/062378中描述了在自然中更易于以較高產(chǎn)量產(chǎn)生較均勻小泡的高發(fā)泡革蘭氏 陰性細(xì)菌。例如，小泡可以衍生自選自下組的細(xì)菌：腦膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitidis)、乳糖奈瑟氏球菌（Neisseria lactamica)、淋病奈瑟氏球菌（Neisseria gonorrhoeae)、幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori)、傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhi)、 鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium)、霍亂弧菌（Vibrio cholerae)、志賀氏菌屬 (Shigella spp·)、流感嗜血菌（Haemophilus influenzae)、百日咳博德特菌（Bordetella pertussis)、綠胺假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)和粘膜炎莫拉氏菌（Moraxella catarrhal is)〇
[0018] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，細(xì)菌是大腸桿菌ompA突變體和/或大腸桿菌tolR突 變體。在一些實(shí)施方式中，細(xì)菌選自大腸桿菌BL21 (DE3) ΔοηιρΑ、大腸桿菌BL21 (DE3) ΔompAΔtolR、大腸桿菌BL21(DE3)ΔtolR、大腸桿菌ΔnlpI或大腸桿菌ΔdegP。本文所用 的Δ標(biāo)記是指一種菌株，其中刪除了在Λ標(biāo)記之后所列基因的編碼序列。因此，" AompA" 的細(xì)菌菌株并不包含ompA基因的編碼序列。同樣，" Λ tolR"的細(xì)菌菌株并不包含tolR基 因的編碼序列?？梢詣h除完整的編碼序列。然而，可以替代性地部分刪除所述編碼序列。例 如，可以刪除N-末端的那一半或C-末端的那一半?；蛘?，可以通過(guò)引入一個(gè)或多個(gè)取代和 /或插入來(lái)對(duì)ompA和/或tolR基因進(jìn)行突變。
[0019] 大腸桿菌AtolR突變株和大腸桿菌Δ ompA突變株相對(duì)于野生型大腸桿菌過(guò)量產(chǎn) 生0MV。因此，ompA基因和/或Tol-Pal復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)組分的突變產(chǎn)生突變體細(xì)菌， 該細(xì)菌產(chǎn)生與其相應(yīng)的攜帶野生型ompA基因和/或Tol-Pal復(fù)合物的野生型菌株相比增 多量的OMV。ompA是整合膜蛋白并且是大腸桿菌中外膜蛋白中豐度最大的。因此，令人驚 訝地發(fā)現(xiàn)缺少OmpA蛋白的大腸桿菌是有活力的。事實(shí)上，根據(jù)Murakami等[16]，大腸桿菌 ompA單一突變體不能促進(jìn)囊泡釋放。
[0020] 異源蛋白
[0021] 本發(fā)明的異源蛋白靶向并且在革蘭氏陰性細(xì)菌的周質(zhì)中表達(dá)，從而該異源蛋白在 OMV的腔內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，在OMV的腔中，異源蛋白是游離的。
[0022] 該蛋白可以是任意長(zhǎng)度的氨基酸聚合物。氨基酸聚合物可以是直鏈或支鏈的，其 可包含修飾的氨基酸并可被非氨基酸打斷。該術(shù)語(yǔ)也包括經(jīng)天然修飾或通過(guò)介入修飾的氨 基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、其他糖基化、部分或完全去糖基化、脂化、乙?；?、磷酸化或 任何其它操作或修飾，如與標(biāo)記組分偶聯(lián)。該定義還包括，例如，含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類 似物（包括例如，非天然氨基酸等），以及本領(lǐng)域已知的其它修飾的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可以單 鏈或結(jié)合鏈的形式出現(xiàn)。本
【發(fā)明內(nèi)容】
中的蛋白質(zhì)可以是天然或非天然糖基化的（即該多肽 的糖基化模式不同于相應(yīng)天然產(chǎn)生多肽的糖基化模式）。
[0023] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"異源"表示蛋白質(zhì)來(lái)自與獲得OMV的細(xì)菌物種不同的物種（異 源生物體）。該蛋白質(zhì)一般是來(lái)自與獲得OMV的細(xì)菌屬不同的病原體屬的抗原。
[0024] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，異源蛋白是可在受體中引發(fā)免疫應(yīng)答的免疫原性蛋 白質(zhì)。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，免疫原性蛋白質(zhì)，并且因而異源蛋白，包含抗原或由抗原組 成。該抗原可引發(fā)針對(duì)原生生物、細(xì)菌、病毒、真菌或任何其他病原體，包括多細(xì)胞病原體或 寄生蟲(chóng)（或者在一些實(shí)施方式中針對(duì)變應(yīng)原；并且在其它實(shí)施方式中針對(duì)腫瘤抗原）的免 疫應(yīng)答。所述免疫應(yīng)答可包括抗體應(yīng)答（通常包括IgG)和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。所 述多肽抗原通常會(huì)引發(fā)免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答識(shí)別對(duì)應(yīng)的細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲(chóng)（或 變應(yīng)原或腫瘤）多肽，但在一些實(shí)施方式中，所述多肽可作為模擬表位來(lái)引起識(shí)別細(xì)菌、病 毒、真菌或寄生蟲(chóng)糖類的免疫應(yīng)答。所述抗原通常是表面多肽，例如粘附素、血凝素、包膜糖 蛋白、突起糖蛋白等。
[0025] 在一些實(shí)施方式中，所述抗原引發(fā)針對(duì)下列細(xì)菌之一的免疫應(yīng)答：
[0026] 腦膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitidis):可用的抗原包括，但不限于，膜蛋 白如粘附素、自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、毒素、攝鐵蛋白（iron acquisition proteins)、H因子結(jié)合蛋 白（fHbp或741)、奈瑟氏球菌肝素結(jié)合抗原（NHBA或287)、NadA (或961)、953/936和腦膜 炎奈瑟氏球菌血清組B bp(fHbp)。三種有用多肽的組合公開(kāi)于參考文獻(xiàn)17中。
[0027] 肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae):有用的多肽抗原公開(kāi)于參考文獻(xiàn)18 中。其包括但不限于RrgB菌毛亞基、β -N-乙酰-己糖胺酶前體（spr0057)、spr0096、一般 應(yīng)激蛋白GSP-781 (spr2021、SP2216)、絲氨酸/蘇氨酸激酶StkP(SP1732)和肺炎球菌表面 粘附素 PsaA。
[0028] 釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes):可用的抗原包括但不限于，參考文獻(xiàn)19 和 20 中公開(kāi)的多肽，例如，GAS25-574,如 GAS 25(SEQ ID:41、SEQ ID:42)、GAS40(SEQ ID: 43、SEQ ID :44、SEQ ID :45、SEQ ID :46、SEQ ID :47、SEQ ID :48、SEQ ID :49、SEQ ID :50、 SEQ ID :51、SEQ ID :52、SEQ ID :53、SEQ ID :54、SEQ ID :55、SEQ ID :56、SEQ ID :57、SEQ ID :58、SEQ ID :59、SEQ ID :60、SEQ ID :61、SEQ ID :62、SEQ ID :63、SEQ ID :64、SEQ ID : 65、SEQ ID :66、SEQ ID :67、SEQ ID :68、SEQ ID :69、SEQ ID :70)、GAS57 (SEQ ID :39、SEQ ID :40、SEQ ID :71、SEQ ID :72、SEQ ID :73、SEQ ID :74、SEQ ID :75)、88、23、99、97、24、5、 208、193、67、64、101、205、268、68、189、165 或 201。
[0029] 粘膜炎莫拉氏菌（Moraxella catarrhalis):
[0030] 百日咳博德特菌（Bordetella pertussis):可用的百日咳抗原包括但不限于：無(wú) 細(xì)胞或全細(xì)胞百日咳抗原、百日咳全毒素或類毒素（PT)、絲狀血細(xì)胞凝集素（FHA)、百日咳 菌粘附素和凝集原2及3。
[0031] 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus