輪狀病毒多糖-蛋白結(jié)合疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種疫苗，具體說，是涉及輪狀病毒多糖-蛋白結(jié)合疫苗疫苗及其制 備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 一、微生物對(duì)人體的危害及應(yīng)對(duì)措施
[0003] 微生物通常是指那些個(gè)體體積直徑一般小于Imm的生物群體，它們結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，大 多是單細(xì)胞，還有些甚至連細(xì)胞結(jié)構(gòu)也沒有，我們身邊無時(shí)無刻不存在著微生物，通常會(huì)借 助顯微鏡或者電子顯微鏡才能看清它們的形態(tài)和結(jié)構(gòu)；其中，致病微生物是指能夠引起人 類、動(dòng)物和植物的病害，具有致病性的微生物。一種病原體的致病性有賴于它的侵襲宿主并 在體內(nèi)繁殖和抵御宿主抵抗力而不被其消滅的能力。微生物致病性有種屬特征，致病能力 強(qiáng)弱的程度稱為毒力。感染性疾病的成立并非由微生物的毒力單方面決定，還要視宿主的 健康情況與免疫功能狀態(tài)。一般而言，毒力強(qiáng)的微生物感染未曾免疫過的機(jī)體，能引起病理 損害出現(xiàn)顯性感染等，而正常機(jī)體卻能抵抗許多低毒微生物（如條件致病菌）的損害，但當(dāng) 宿主抵抗力降低時(shí)則可對(duì)這些微生物易感而致病。病原體的毒力與宿主抵抗力兩者之間的 較量，引出感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸和預(yù)后，由于病原體和宿主之間適應(yīng)程度不同，雙 方抗衡的結(jié)局各異，產(chǎn)生各種不同的感染譜，即感染過程的不同表現(xiàn)。致病性是對(duì)特定宿主 而言，有的只對(duì)人類有致病性，有的只對(duì)某些動(dòng)物，而有的則屬人畜共患性微生物。而此時(shí) 宿主通常只能通過自身的免疫系統(tǒng)來對(duì)抗微生物的感染，死亡率非常高，致使各研宄學(xué)者 研宄出了疫苗來對(duì)抗致病性微生物對(duì)人體的侵害。
[0004] 而疫苗又分為治療性和預(yù)防性兩種，通過治療性疫苗治療疾病，并通過預(yù)防性疫 苗保護(hù)人體不受致病性微生物的侵害。通過接種預(yù)防性疫苗來預(yù)防疾病是人類在一個(gè)多世 紀(jì)的臨床實(shí)踐中，證明是行之有效的手段。經(jīng)過多年的努力，醫(yī)學(xué)界已經(jīng)開發(fā)出各種不同的 疫苗用以預(yù)防，諸如細(xì)菌、病毒和真菌等，感染造成的各種疾病，極大地提高了人類的健康 水平。生物技術(shù)的不斷發(fā)展，促進(jìn)了疫苗品種的多樣化。今天，用以預(yù)防病毒導(dǎo)致的傳染病 有滅活病毒技術(shù)開發(fā)出來的疫苗，如乙腦疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、流感疫苗等；用減毒病毒 技術(shù)開發(fā)出來的減毒活疫苗，如輪狀病毒疫苗、口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、麻瘆病毒疫苗、 腮腺炎病毒疫苗、風(fēng)瘆病毒疫苗和水痘疫苗等。預(yù)防細(xì)菌性傳染病的有用蛋白和多糖等生 物大分子純化技術(shù)開發(fā)出來的細(xì)菌類疫苗，如破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、百日咳類毒素及 其亞細(xì)胞組分、流行性腦膜炎球菌多糖和23價(jià)肺炎球菌多糖等。用基因重組蛋白技術(shù)開 發(fā)出來的疫苗，如乙肝表面抗原（預(yù)防乙型肝炎）、人類乳頭狀類病毒顆粒病毒（預(yù)防子宮 頸癌）等。用半化學(xué)結(jié)合技術(shù)開發(fā)出來的預(yù)防腦膜炎和肺炎的細(xì)菌疫苗，如流行性嗜血桿 菌b型多糖-蛋白結(jié)合疫苗、7價(jià)或10價(jià)肺炎球菌多糖-蛋白結(jié)合疫苗以及4價(jià)腦膜炎球 菌多糖-蛋白結(jié)合疫苗。由此可見，醫(yī)學(xué)生物技術(shù)的發(fā)展，是疫苗產(chǎn)品不斷發(fā)展的原動(dòng)力， 通過對(duì)生物技術(shù)的不斷改進(jìn)，能夠開發(fā)出更多的新型疫苗產(chǎn)品來應(yīng)付不同的傳染病對(duì)人類 健康的挑戰(zhàn)。
[0005] 二、結(jié)合疫苗概述
[0006] 多糖是病原菌中的一種重要免疫有效成分，有菌體多糖（OPS)和莢膜多糖（CPS) 之分。當(dāng)病原體侵入機(jī)體后，它們作為免疫原，能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。但是，多 糖分子屬于T細(xì)胞不依賴性抗原（Ti-Ag)，免疫原性較弱，接種嬰幼兒后免疫效果尤其不 理想，而目前許多危害嚴(yán)重的疾病如流感嗜血桿菌（Hib)引起的腦膜炎、E. Coli 0 157:H7 引起的小兒出血性腹瀉脫水等在嬰幼兒中高發(fā)且臨床無有效的治療辦法，病死率高（王燕 等，結(jié)合疫苗概述[J]，微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2000,28(1):60-63)。為了提高多糖疫苗的 免疫原性，國(guó)外于本世紀(jì)20年代初興起了多糖和蛋白的化學(xué)結(jié)合疫苗，即綴合疫苗，結(jié)合 (以蛋白為載體的細(xì)菌多糖類）疫苗采用化學(xué)方法將多糖共價(jià)結(jié)合在蛋白載體上制備成多 糖-蛋白結(jié)合疫苗，用于提高細(xì)菌疫苗多糖抗原的免疫原性，如b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫 苗、腦膜炎球菌結(jié)合疫苗和肺炎球菌結(jié)合疫苗等，短短幾十年其發(fā)展相當(dāng)迅速，已取得顯著 成果。
[0007] 三、肺炎球菌的危害及其流行病學(xué)研宄
[0008] 由肺炎球菌（肺鏈）所引起的感染是全世界發(fā)病率和死亡率的主要起因。肺炎、 發(fā)熱性菌血癥和腦膜炎是侵入性肺炎球菌性疾病的最常見表現(xiàn)形式，而呼吸道內(nèi)的細(xì)菌擴(kuò) 散可導(dǎo)致中耳感染、竇炎或復(fù)發(fā)性支氣管炎。與侵入性疾病相比，非侵入性的表現(xiàn)形式通常 不那么嚴(yán)重，但更多見。由于抗生素耐藥性傳染病的擴(kuò)散，以及肺炎球菌肺炎經(jīng)常在流感感 染之后出現(xiàn)，肺炎球菌疾病在流感期間發(fā)作的可能性進(jìn)一步增加。
[0009] 由肺炎鏈球菌引發(fā)的疾病已成為全球一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。肺炎球菌已成為 全球兒童的頭號(hào)殺手。我國(guó)肺炎的病死率為16. 4%，其中50歲以上中老年人及1歲以下 嬰幼兒分別高達(dá)28. 6%和22. 0%。我國(guó)肺炎球菌在健康兒童中的攜帶率較高，資料統(tǒng)計(jì)顯 示，在北方地區(qū)健康兒童中的攜帶率為24. 2 %，南方地區(qū)為31. 3 %。而所述病是導(dǎo)致5歲以 下兒童死亡的重要原因。主要原因在于嬰幼兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育尚不完善，免疫力較弱。并 且年齡越小的嬰兒，免疫力越弱。肺炎球菌大約有90種血清型（菌株），我國(guó)的統(tǒng)計(jì)資料 顯示肺炎球菌感染菌株前幾個(gè)血清型依次為：5、6、19、23、14、2、4型。據(jù)一項(xiàng)收集了 860株 肺炎球菌分離株的研宄顯示，有109株（12. 7% )表現(xiàn)為血清群6,在中國(guó)肺炎球菌血清型 6的紅霉素耐藥性達(dá)100%，其中的6A、6B和6C型分別為62株（56. 9% )、38株（34. 9% ) 和 9 株（8. 2% )。
[0010] 從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來看，以上病原體擁有一個(gè)細(xì)胞表面莢膜多糖（Capsular polysaccharide，CPS)或脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS)殼，或者兩者兼有，其功能是 幫助病原體感染宿主。莢膜多糖能夠屏蔽細(xì)菌細(xì)胞表面功能成分免于被宿主免疫系統(tǒng)識(shí) 另IJ，防止補(bǔ)體系統(tǒng)被細(xì)菌表面蛋白激活和免疫細(xì)胞吞噬，如果細(xì)菌被吞噬，莢膜多糖能夠防 止細(xì)菌被殺滅。大多數(shù)病原菌中，不同的菌株表達(dá)不同結(jié)構(gòu)的莢膜多糖和脂多糖，產(chǎn)生多種 不同的血清型菌株。肺炎球菌所致的肺炎和腦膜炎是由已知的90種血清型中的很大一部 分菌株感染所導(dǎo)致的。
[0011] 由此可見，大多數(shù)細(xì)菌多糖類疫苗必需含有多種不同種類的細(xì)菌多糖以提高致病 菌株覆蓋率，優(yōu)化和選擇包含何種細(xì)菌或者血清型多糖在疫苗中是一個(gè)非常復(fù)雜的流行病 學(xué)問題。一旦明確何種多糖抗體具有保護(hù)作用，則可用這種多糖作為免疫原來生產(chǎn)疫苗。 [0012] 中國(guó)生物技術(shù)集團(tuán)成都生物制品研宄所生產(chǎn)的23價(jià)肺炎球菌疫苗是選取了 23種 最常見的致病菌（1，2,3,4,5,6B，7F，8,9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20， 22F，23F，33F)，分別發(fā)酵培養(yǎng)并分離提純肺炎球菌莢膜上的各型多糖，按等比例混合制成 疫苗。細(xì)菌的多糖是一種胸腺非依賴性抗原，這種抗原與胸腺依賴性抗原的主要區(qū)別在于 前者不需要T淋巴細(xì)胞的輔助來產(chǎn)生抗體。臨床使用證明，莢膜多糖制作的疫苗明確有效， 并在多個(gè)國(guó)家廣泛使用。但是這類多糖疫苗存在以下問題：（1)在幼小動(dòng)物或嬰幼兒體內(nèi) 只能產(chǎn)生微弱的免疫反應(yīng)，甚至不產(chǎn)生免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)隨年齡的增長(zhǎng)而增強(qiáng)；（2)產(chǎn)生 低親和力的抗體；（3)只產(chǎn)生短暫的免疫反應(yīng)，不具備反復(fù)接種時(shí)的免疫記憶和免疫增強(qiáng) 效應(yīng)；(4)容易產(chǎn)生免疫耐受；（5)普通的佐劑對(duì)這種抗原不易起到免疫增強(qiáng)的作用，23價(jià) 多糖疫苗對(duì)于侵入型肺鏈感染的保護(hù)率為50-70%，而且只能用于2歲以上的人群接種，而 肺炎的高峰發(fā)病年齡為6-12月齡；(6)具有重復(fù)結(jié)構(gòu)的多糖是T細(xì)胞獨(dú)立型2類的免疫 原，沒有T細(xì)胞的參與，它們是無法誘導(dǎo)免疫記憶效應(yīng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體主要是IgM和 IgG2,不能夠有效地激活補(bǔ)體系統(tǒng)。
[0013] 半化學(xué)結(jié)合技術(shù)（也稱結(jié)合技術(shù)）開發(fā)疫苗的方法是從20世紀(jì)80年 代出現(xiàn)的開發(fā)細(xì)菌疫苗的技術(shù)。John Robbins通過將流行性嗜血桿菌b型 (Haemophilusinfluenzaetype b，Hib)莢膜多糖（Polyribosylribitolphosphate，PRP)， 用共價(jià)鍵的形式連接到蛋白載體（破傷風(fēng)類毒素）合成出了流行性嗜血桿菌b型多糖 PRP-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合疫苗（PRP-TT)，在免疫動(dòng)物后，能夠產(chǎn)生殺菌的保護(hù)性抗體，從而 開創(chuàng)了新一代細(xì)菌疫苗開發(fā)技術(shù)。特別有意義的是，對(duì)于年齡小于2歲的嬰幼兒來說，由 于免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，多糖對(duì)于嬰幼兒是屬于一種非T細(xì)胞依賴性抗原，不能夠刺激機(jī) 體如成人一樣產(chǎn)生長(zhǎng)效的針對(duì)于所述多糖來源的細(xì)菌特異性保護(hù)IgG抗體。因此，多糖對(duì) 于小于2歲的嬰幼兒是一種半抗原，不能夠作為疫苗來接種小于2歲的兒童。當(dāng)將細(xì)菌多 糖以共價(jià)鍵的形式連接到蛋白載體，如破傷風(fēng)類毒素 （Tetanus Toxoid，TT)，由于蛋白質(zhì)是 一種T細(xì)胞依賴性抗原，能夠?qū)⒐矁r(jià)鍵連接的多糖轉(zhuǎn)變成T細(xì)胞依賴性抗原，從而刺激機(jī) 體產(chǎn)生針對(duì)于所述多糖的特異性IgG抗體，保護(hù)機(jī)體不受細(xì)菌的感染。流行性嗜血桿菌b 型多糖-破傷風(fēng)類毒素（PRP-TT)結(jié)合疫苗開發(fā)的成功，開創(chuàng)了一個(gè)開發(fā)細(xì)菌疫苗的技術(shù) 平臺(tái)，即將細(xì)菌多糖，如莢膜多糖、0-特異性多糖（O-specificpolysaccharide)、或寡聚糖 (Oligosaccharide)，以共價(jià)鍵連接到蛋白載體上而制成的結(jié)合疫苗?；谶@一概念的成 功，醫(yī)學(xué)生物研宄界通過采用同一種化學(xué)合成方法開發(fā)出了不同細(xì)菌的結(jié)合疫苗；同樣也 用不同的合成技術(shù)開發(fā)出同一種細(xì)菌的結(jié)合疫苗。
[0014] 莢膜多糖能夠屏蔽細(xì)菌細(xì)胞表面功能成分，使其免于被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別，防止 補(bǔ)體系統(tǒng)被細(xì)菌表面的蛋白激活和免疫細(xì)胞吞噬。如果細(xì)菌被免疫細(xì)胞吞噬，莢膜多糖也 能夠避免細(xì)菌被殺滅。莢膜多糖是腦膜奈瑟氏菌的主要抗原成分之一，作為疫苗對(duì)較大的 兒童有一定的保護(hù)力。然而，莢膜多糖對(duì)2歲以下嬰幼兒、老年人以及B細(xì)胞免疫缺陷的人 群免疫效果差，接種劑不能達(dá)到抗體保護(hù)水平，且抗體很快消失。所述多糖疫苗與其它多糖 疫苗一樣，屬T細(xì)胞非依賴性抗原，具有年齡相關(guān)的免疫原性，且不誘生T細(xì)胞依賴性的加 強(qiáng)應(yīng)答。通過將多糖與某種蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，可使多糖轉(zhuǎn)化成T細(xì)胞依賴性抗原，從而刺激 嬰幼兒的T細(xì)胞依賴性抗體的合成，并可產(chǎn)生加強(qiáng)應(yīng)答，同時(shí)還能提高免疫球蛋白（IgG)的 抗體比例。這種多糖結(jié)合疫苗不僅能夠保護(hù)嬰幼兒（2歲以下兒童），還能夠大大地增強(qiáng)抵 抗力差的病人對(duì)細(xì)菌感染的抵抗力，因此具有十分廣闊的應(yīng)用前景。1980年，JohnRobbins 用溴化氰來隨機(jī)活化Hib莢膜多糖，然后，將己二酰二肼（Adipic Dihydrazide，ADH)作 為連接物（linker)加到活化的多糖上，最后以EDC法將衍化后的多糖共價(jià)鍵地連接到 載體蛋白破傷風(fēng)類毒素上，合成出了流行性嗜血桿菌b型多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合疫苗 (PRP-TT)。由于在每個(gè)多糖鏈上有多個(gè)活化點(diǎn)，蛋白載體上同樣的有多個(gè)連接點(diǎn)，形成的 結(jié)合物是一種多糖和蛋白交叉連接的大分子，平均分子量約為5X 106Da。1980年，Harold Jennings在美國(guó)專利4356170里，陳述了用牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA)為 載體，將腦膜炎球菌的A，C群多糖通過還原胺法共價(jià)鍵地連接到BSA上，合成出了流行性腦 膜炎多糖-BAS結(jié)合疫苗。1987年和1990年，Porter Anderson分別在美國(guó)專利4673574 和4902506里，描述了用變異無毒株白喉毒素197 (Cross reaction material subl97， CRM197)作為載體蛋白，以還原胺法合成了流行性嗜血桿菌b型寡聚糖-變異無毒株白喉毒 素197 (HbOC-CRM197)結(jié)合疫苗。具體的方法是用高碘酸鈉氧化Hib莢膜多糖，產(chǎn)生在兩末 端為醛基的寡聚糖，通過還原劑氰基硼氫化鈉（sodiumcyanoborohydride)，將寡聚糖共價(jià) 鍵連接到蛋白載體上。形成分子量約為90kDa的脂多糖結(jié)合物，制成了含有30%的多糖和 每一個(gè)蛋白上帶有6個(gè)糖分子的結(jié)合疫苗。隨后，美國(guó)默克（Merck，Sh