一種雞壞死性腸炎的a、c型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素和菌體二價(jià)兩類抗原疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種雞壞死性腸炎的A、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素和菌體二價(jià)兩類抗原疫苗的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]壞死性腸炎(Necrotic Enteritis，簡稱NE)主要由A型或C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起，但C型不普遍。產(chǎn)生腸黏膜壞死等特征性病變，病死禽以肝腫大、腸道出血和腸黏膜有麩皮樣壞死灶為特征。多種禽類可發(fā)生此病，已證實(shí)壞死性腸炎在肉雞、蛋雞、火雞和鵪鶉中都有發(fā)生。隨著對(duì)抗生素類促生長劑的禁用，該病在全世界主要養(yǎng)禽的國家和地區(qū)都有發(fā)生，全球經(jīng)濟(jì)損失達(dá)20億美元。
[0003]產(chǎn)氣莢膜梭菌是厭氧、產(chǎn)孢子、革蘭氏陽性大桿菌。它是脊椎動(dòng)物腸道共棲菌，但在正常宿主腸道內(nèi)數(shù)量較低。它也是一種條件致病菌，如果條件適宜，會(huì)在腸道大量繁殖。產(chǎn)氣莢膜梭菌致病主要是其產(chǎn)生的外毒素引起?？僧a(chǎn)生至少17種毒素或潛在毒性的外源蛋白，根據(jù)起主要致病作用的α、β、ε、I毒素可將其分為A、B、C、D、E 5個(gè)產(chǎn)毒素型。
[0004]目前研宄，肉用種母雞免疫A型和C型類毒素可產(chǎn)生較強(qiáng)的IgY血清抗體反應(yīng)，并可傳遞給后代，雖然A型抗體應(yīng)答高于C型，但免疫C型類毒素對(duì)亞臨床壞死性腸炎和肝炎的肉雞保護(hù)效果更為顯著。2010年Crouch等運(yùn)用NetvaxTM公司的A型類毒素與輕質(zhì)礦物油乳化成苗，肌肉注射免疫接種肉種母雞安全，精神狀態(tài)和生產(chǎn)性能無全身副反應(yīng)，可明顯減少由NE引起的后代仔雞的死亡和腸道損傷。2011年，Saleh等運(yùn)用當(dāng)?shù)亓餍卸局曛苽銩型、C型及A+C型類毒素，皮下注射免疫7日齡商品肉雞，0.5ml/只，21日齡以同樣劑量及途徑加免一次，在35日齡進(jìn)行混喂(2L產(chǎn)氣莢膜梭菌肉湯培養(yǎng)物+Ikg飼料或IL產(chǎn)氣莢膜梭菌肉湯培養(yǎng)物+2L水)攻毒，結(jié)果證明免疫雞，特別免疫A+C型類毒素的雞腸道損傷明顯下降，但是上述方法中采用的是直接以類毒素免疫肉雞，具有較多的局限性，如免疫期短，需要多次加強(qiáng)免疫等缺陷。因此如何克服上述缺陷，對(duì)于疫苗的研制具有很重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種雞壞死性腸炎的A、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素和菌體二價(jià)兩類抗原疫苗的制備方法，該方法以A型、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌增菌液各4ml接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，在43°C厭氧環(huán)境下(88% N2,7% H2,5% CO2)振蕩培養(yǎng)5h。經(jīng)甲醛滅活，加入佐劑乳化獲得A、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素和菌體二價(jià)兩類抗原疫苗。通過上述方法獲得的疫苗，含有α、β兩種主要毒素抗原，且類毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌菌體抗原成分俱全，對(duì)于產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的家禽的壞死性腸炎有著極佳的免疫效果，免疫商品雞攻毒后其保護(hù)率達(dá)到100%，證明該類毒素和菌體抗原復(fù)合疫苗，既能針對(duì)細(xì)菌的感染致病作用，也能夠針對(duì)細(xì)菌毒素的致病作用對(duì)家禽產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)效果。
[0006]發(fā)明人在本發(fā)明中所采用的A、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌采用現(xiàn)有菌種，特別選自標(biāo)準(zhǔn)菌種 A 型 NCTC528、C 型 NCTC3180 (均保藏于 Nat1nal Collect1n of Type Cultures 英國微生物菌種保藏中心)，可通過現(xiàn)有渠道直接獲得，故而該生物材料屬于現(xiàn)有技術(shù)中可直接獲得的材料，不需進(jìn)行單獨(dú)的生物保藏。
[0007]本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下:具體步驟如下:
[0008](I).菌種的復(fù)蘇及增菌
[0009]將產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌種A型NCTC528、C型NCTC3180分別接種于血瓊脂平板，39°C在厭氧箱中培養(yǎng)24h復(fù)蘇；挑取一個(gè)典型菌落接種于7ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中39°C厭氧增菌培養(yǎng)12h ；
[0010](2).菌液的制備
[0011]上述獲得的A型、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌增菌培養(yǎng)液均以4ml接種于10ml產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，43°C厭氧箱中160r/min振蕩培養(yǎng)5h獲得菌液；
[0012](3).菌液的滅活
[0013]將制取的菌液用IMNaOH調(diào)pH至7.2，然后加入甲醛溶液使甲醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.3%進(jìn)行滅活，充分振蕩混勻置于37°C搖床，4天后滅活完全；
[0014](4).疫苗的制備
[0015]滅活檢驗(yàn)合格的菌液與滅菌的白油佐劑按體積比I '2的比例充分乳化，并按照每100毫升上述乳化混合液加入0.01克硫柳汞的比例加入硫柳汞即可獲得疫苗；
[0016]其中所述的產(chǎn)毒培養(yǎng)基，其獲得方法如下:2.5克蛋白胨、2克酵母提取物、1.5克糊精、1.4克L-精氨酸溶于10mlPBS緩沖液，以IM HCl調(diào)pH至7.4即得；
[0017]所述的酵母提取為是試劑YEAST EXTRACT，市場直接購得。
[0018]上述培養(yǎng)基為發(fā)明人針對(duì)本發(fā)明的產(chǎn)氣莢膜梭菌設(shè)計(jì)的全新培養(yǎng)基，較之現(xiàn)有的培養(yǎng)基可以更好的符合產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)產(chǎn)毒的需要，具有明顯的針對(duì)性和有效性，且配制工藝簡便、節(jié)約生產(chǎn)成本且穩(wěn)定性好，能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)之要求。
[0019]其中所述厭氧箱內(nèi)氣體組成按體積分?jǐn)?shù)如下:88% N2, 7% H2, 5% CO2;
[0020]所述的血瓊脂為Ig葡萄糖和3.Sg豆瓊脂粉溶于10ml蒸餾水滅菌后，加入5ml綿羊血獲得。
[0021]其中，為了獲得A型和C型菌的最佳接種比例，發(fā)明人在步驟菌液的制備時(shí)，將A型、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌增菌培養(yǎng)液接種體積比分為2ml:6ml、4ml:4ml、6ml:2ml三組分別進(jìn)行了對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)試驗(yàn)，之后利用常規(guī)的雙夾心ELISA試劑盒測定各組產(chǎn)毒素量，測定結(jié)果接種比例為4ml:4ml時(shí)，產(chǎn)毒素量最大，故而選擇該體積比。
[0022]為了驗(yàn)證上述疫苗的效果，發(fā)明人對(duì)其進(jìn)行了效力檢測，具體方法如下:
[0023]9日齡健康易感雞10只，其中5只皮下注射上述疫苗0.1ml，另5只雞不接種作對(duì)照，21日后各肌肉注射致死量的A、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，觀察10日，對(duì)照組全部死亡，免疫組全部存活，表明該疫苗對(duì)雞的保護(hù)率為100 %。
[0024]綜上所述，本發(fā)明所獲得的疫苗與現(xiàn)有弱毒疫苗、基因工程疫苗相比，具有如下有益效果:(1)本發(fā)明疫苗含有α毒素和β毒素兩種與雞壞死性腸炎相關(guān)的毒素抗原，并通過雙夾心ELISA方法測定A型和C型菌的接種比例，結(jié)果表明接種比例在4ml:4ml時(shí)達(dá)到最高產(chǎn)毒素量；(2)由于產(chǎn)毒素量高，疫苗中每單位所含的類毒素抗原高，機(jī)體相應(yīng)產(chǎn)生抗毒素抗體高，動(dòng)物保護(hù)率高。疾病發(fā)生時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生的抗毒素抗體可直接中和產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的外毒素，達(dá)到良好的免疫預(yù)防效果。
【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1
[0026]一種雞壞死性腸炎的A、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素和菌體二價(jià)兩類抗原疫苗的制備方法，具體步驟如下:
[0027](I).菌種的復(fù)蘇及增菌
[0028]將產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌種A型NCTC528、C型NCTC3180分別接種于血瓊脂平板，39°C在厭氧箱中培養(yǎng)24h復(fù)蘇；挑取一個(gè)典型菌落接種于7ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中39°C厭氧增菌培養(yǎng)12h ；
[0029](2).菌液的制備
[0030]上述獲得的A型、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌增菌培養(yǎng)液均以4ml接種于10ml產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，43°C厭氧箱中160r/min振蕩培養(yǎng)5h獲得菌液；
[0031](3).菌液的滅活
[0032]將制取的菌液用IMNaOH調(diào)pH至7.2，然后加入甲醛溶液使甲醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到
0.3%進(jìn)行滅活，充分振蕩混勻置于37°C搖床，4天后滅活完全；
[0033](4).疫苗的制備
[0034]滅活檢驗(yàn)合格的菌液與滅菌的白油佐劑按體積比I '2的比例充分乳化，并按照每100毫升上述乳化混合液加入0.01克硫柳汞的比例加入硫柳汞即可獲得疫苗；
[0035]其中所述的產(chǎn)毒培養(yǎng)基，其獲得方法如下:2.5克蛋白胨、2克酵母提取物、1.5克糊精、1.4克L-精氨酸溶于10mlPBS緩沖液，以IM HCl調(diào)pH至7.4即得；
[0036]所述的酵母提取為是試劑YEAST EXTRACT，市場直接購得。
[0037]其中所述厭氧箱內(nèi)氣體組成按體積分?jǐn)?shù)如下:88% N2, 7% H2, 5% CO2;
[0038]所述的血瓊脂為Ig葡萄糖和3.Sg豆瓊脂粉溶于10ml蒸餾水滅菌后，加入5ml綿羊血獲得。
[0039]實(shí)施例2
[0040]疫苗效力檢驗(yàn)，具體方法如下:
[0041]9日齡健康易感雞10只，其中5只皮下注射實(shí)施例1中獲得的疫苗0.1ml，另5只雞不接種作對(duì)照，21日后各肌肉注射致死量的A、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，觀察10日，對(duì)照組全部死亡，免疫組全部存活，表明該疫苗對(duì)雞的保護(hù)率為100%，證明該類毒素和菌體抗原復(fù)合疫苗，既能針對(duì)細(xì)菌的感染致病作用，也能夠針對(duì)細(xì)菌毒素的致病作用對(duì)家禽產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)效果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種雞壞死性腸炎的A、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素和菌體二價(jià)兩類抗原疫苗的制備方法，具體步驟如下: (1).菌種的復(fù)蘇及增菌 將產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌種A型NCTC528、C型NCTC3180分別接種于血瓊脂平板，39°C在厭氧箱中培養(yǎng)24h復(fù)蘇；挑取一個(gè)典型菌落接種于7ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中39°C厭氧增菌培養(yǎng)12h ； (2).菌液的制備 上述獲得的A型、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌增菌培養(yǎng)液均以4ml接種于10ml產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，43 °C厭氧箱中160r/min振蕩培養(yǎng)5h獲得菌液； (3).菌液的滅活 將制取的菌液用IMNaOH調(diào)pH至7.2，然后加入甲醛溶液使甲醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.3%進(jìn)行滅活，充分振蕩混勻置于37°C搖床，4天后滅活完全； (4).疫苗的制備 滅活檢驗(yàn)合格的菌液與滅菌的白油佐劑按體積比1:2的比例充分乳化，并按照每100毫升上述乳化混合液加入0.01克硫柳汞的比例加入硫柳汞即可獲得疫苗； 其中所述的產(chǎn)毒培養(yǎng)基，其獲得方法如下:2.5克蛋白胨、2克酵母提取物、1.5克糊精、1.4克L-精氨酸溶于10mlPBS緩沖液，以IM HCl調(diào)pH至7.4即得； 所述的酵母提取物是試劑YEAST EXTRACT。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于:所述厭氧箱內(nèi)氣體組成按體積分?jǐn)?shù)如下:88% N2, 7% H2, 5% C02。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于:所述的血瓊脂為Ig葡萄糖和3.Sg豆瓊脂粉溶于10ml蒸餾水滅菌后，加入5ml綿羊血獲得。
【專利摘要】本發(fā)明涉及動(dòng)物細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域，提供了一種雞壞死性腸炎的A、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素和菌體二價(jià)兩類抗原疫苗制備方法，該方法以A型、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌增菌液接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，在43℃厭氧環(huán)境下振蕩培養(yǎng)5h產(chǎn)毒素。經(jīng)甲醛滅活，加入佐劑乳化獲得A、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素和菌體二價(jià)兩類抗原疫苗。通過上述方法獲得的疫苗免疫商品雞，攻毒后其保護(hù)率達(dá)到100％，證明該類毒素和菌體抗原復(fù)合疫苗，既能針對(duì)細(xì)菌的感染致病作用，也能夠針對(duì)細(xì)菌毒素的致病作用對(duì)家禽產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)效果。
【IPC分類】A61K39-116, A61P1-00, A61P31-04, A61K39-114
【公開號(hào)】CN104623652
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510098504
【發(fā)明人】柴同杰, 郭夢嬌, 王海榮
【申請(qǐng)人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年3月6日