一種脫細胞板層角膜基質(zhì)片的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學的組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種脫細胞板層角膜基質(zhì)片 的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 角膜病是常見的致盲性眼病之一，臨床上各種因素所致的角膜炎癥和角膜損傷 均可致角膜缺損、糜爛和潰瘍，若得不到有效治療，則將嚴重損傷患者的視功能和生活質(zhì) 量。據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，目前角膜病是引起視力喪失的第二位主要病因，僅次于白內(nèi)障， 每年因角膜潰瘍、眼外傷等造成的新增角膜盲為150萬至200萬，嚴重威脅著患者的健康。 治療角膜盲的唯一有效方法是角膜移植術(shù)。但是由于宗教信仰、風俗習慣的影響，身故后 捐獻角膜者甚少；加上人類免疫缺陷病毒（HIV)、乙肝病毒、狂犬病毒、克雅氏病毒可以通 過植片傳播、角膜屈光手術(shù)、人口老齡化等原因使角膜供體材料嚴重不足，極大地限制了角 膜盲患者脫盲。我國角膜移植的對象大部分為嚴重感染、化學傷等高危角膜移植患者，術(shù) 后的免疫排斥反應發(fā)生率高達60% -90%，由于角膜材料來源不足、免疫排斥反應、角膜移 植并發(fā)癥等因素嚴重限制了角膜移植技術(shù)的開展。隨著角膜外傷、腫瘤、化學燒傷（堿燒 傷）、血管化嚴重干眼癥、角膜緣干細胞缺乏、免疫性疾病、角膜移植排斥反應等患者人數(shù)的 增多，角膜材料的來源也就成為了目前眼科醫(yī)生存在的一個棘手的問題。如何高質(zhì)量長時 間維持板層角膜替代物在眼內(nèi)的功能，尋找一種能達到理想狀態(tài)的角膜替代物也就成了當 前眼科界研究的一個熱點。然而，目前國內(nèi)外研制的各種種子細胞支架材料在角膜曲率及 地形圖，生物相容性、強度、降解率、透明性、同源性、抗原性及病原性等性能方面均存在著 缺陷。而被認為最有研究前景的為經(jīng)過脫細胞處理的異種角膜基質(zhì)片，但是目前常用脫細 胞方法步驟煩瑣，過程復雜，易損傷組織結(jié)構(gòu)，嚴重影響了角膜的透明度而使效果欠佳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是要提供一種脫細胞板層角膜基質(zhì)片的制備方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比 制作過程簡單、時間較短，無需使用外源性酶，使得經(jīng)過本方法研制的角膜基質(zhì)片透明度 高、結(jié)構(gòu)破壞少、生物相容性好、性能與新鮮角膜接近，是一種脫細胞徹底的生物支架材料， 可用于角膜移植各種供體材料的替代物，取材方便，安全性強，能被廣大患者接受并長期應 用于臨床。
[0004] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0005] -種脫細胞板層角膜基質(zhì)片的制備方法，包括以下步驟：
[0006] 步驟一，取新鮮動物眼球進行消毒；
[0007] 步驟二，消毒后用蘸有酒精的濾紙?zhí)幚?，然后擦除去凈上皮細胞層?br>[0008] 步驟三，在手術(shù)顯微鏡下做角膜緣切口，伸入虹膜恢復器分離前層角膜，分離完全 后用角膜剪剪下前層角膜；
[0009] 步驟四，用角膜環(huán)鉆取出板層角膜；
[0010] 步驟五，將新鮮板層角膜經(jīng)過血清浸泡，然后將浸泡后的板層角膜基質(zhì)片進行漂 洗或冰浴電泳處理；
[0011] 步驟六，將漂洗或電泳處理完畢的板層角膜基質(zhì)片進行梯度脫水，即得到未干燥 板層組織工程角膜支架，采用環(huán)氧乙烷滅菌處理，保存?zhèn)溆茫?br>[0012] 步驟七，將未干燥角膜基質(zhì)片放于24孔板內(nèi)進行干燥，得到干燥脫細胞板層角 膜；
[0013] 步驟八，將干燥后的樣品進行鈷60消毒，進行復水處理，得到復水板層角膜基質(zhì) 片，即得所述的板層組織工程角膜基質(zhì)支架，保存?zhèn)溆谩?br>[0014] 進一步，在步驟一中，將新鮮動物眼球采用碘伏浸泡或含抗菌素的PBS浸泡的方 式進行消毒，浸泡后采用PBS沖洗三次，每次沖洗5min。
[0015] 進一步，在步驟三中，在手術(shù)顯微鏡下用寶石刀做角膜緣切口，伸入虹膜恢復器分 離前層角膜，分離完全后用角膜剪剪下前層角膜，角膜緣切口深約1/3,厚為0. 2-0. 8mm，長 為3mm，分離的板層厚度為0. 2-0. 8mm。
[0016] 進一步，在步驟五中，浸泡所用血清為人新鮮血清或人滅活血清，將板層角膜基質(zhì) 片放于裝有人新鮮血清或人滅活血清的密閉無菌培養(yǎng)皿或EP管內(nèi)浸泡，浸泡時間為12-30 小時。
[0017] 進一步，將板層角膜基質(zhì)片放于裝有人新鮮血清或人滅活血清的密閉無菌培養(yǎng)皿 或EP管內(nèi)浸泡的時間為16-24小時。
[0018] 進一步，在步驟五中，進行漂洗采用的漂洗液為等滲液，漂洗液選自PBS，林格氏液 或生理鹽水，漂洗時間為0. 5-5小時。
[0019] 進一步，在步驟五中，進行漂洗的時間為1-2小時。
[0020] 進一步，在步驟五中，冰浴電泳所用電泳液為TA電泳液，將整個電泳槽放于密閉 消毒盒內(nèi)進行冰浴電泳，3_5°C恒溫冰箱內(nèi)進行冰浴電泳，電泳的時間為I. 5_2hs,電泳的 電壓為為120-150V ;其中I X TA溶液配置方法：將4. 84g TrisBase溶于100mL雙蒸水中， 滴加 I. 142ml冰醋酸，然后加雙蒸水至1L。
[0021] 本發(fā)明通過單純使用物理及生物學方法來進行組織脫細胞，不使用任何有毒化學 試劑，同時完全保留了天然角膜基質(zhì)的膠原結(jié)構(gòu)。利用動物源性的角膜在人血清中引起的 體外急性排斥反應脫細胞方法去除基質(zhì)細胞的核酸及蛋白成分；利用漂洗或電泳的方法將 細胞殘留碎屑和帶電成分去除干凈，達到徹底去除了支架材料的抗原成分的目的，通過完 全電泳出殘留的核酸成分和C〇60消毒的方法去除了支架材料的病原性。為了能達到開發(fā) 產(chǎn)品的要求，在脫細胞處理的各個環(huán)節(jié)如時間、溫度、電壓、如何保證無菌及電解液、漂洗液 的配置等方面均經(jīng)過詳細周密的設(shè)計和反復嚴格的摸索；通過一系列制作過程的反復改良 和優(yōu)化，使本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0022] (1)采用本發(fā)明的技術(shù)方案，制作流程簡單可靠，時間短且易于實施；
[0023] (2)板層組織工程角膜支架來源廣泛，成本低，使用方便；
[0024] (3)采用本發(fā)明技術(shù)方案制作的板層組織工程角膜支架，經(jīng)過血清浸泡不含有對 人體有潛在危害的毒性物質(zhì)，如去污劑等，具有可加工性，便于根據(jù)需要加工成不同屈光 度；
[0025] (4)采用本發(fā)明的技術(shù)方案，脫細胞徹底，采用電泳方法能最小的減少角膜基質(zhì)骨 架細胞外基質(zhì)的破壞，不留有任何核酸物質(zhì)及可溶性蛋白成分，表面由IV型膠原構(gòu)成的前 彈力層以及基底膜得以保留，有利于自體細胞增殖爬行；
[0026] (5)采用本發(fā)明技術(shù)方案制作的板層組織工程角膜支架，具有良好的生物相容性 和極低的免疫原性，移植后不引起免疫排斥反應；生物學性質(zhì)檢測（透明度、含水量、膨脹 率、最大拉伸長度），顯微結(jié)構(gòu)觀察及視光學檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此種材料與人角膜基質(zhì)極其相 近；
[0027] (6)本發(fā)明方法不僅有利于優(yōu)化動物角膜基質(zhì)脫細胞條件，同時將為組織工程角 膜產(chǎn)業(yè)化提供重要的技術(shù)支持。
【附圖說明】
[0028] 圖1是本發(fā)明提供的脫細胞板層角膜基質(zhì)片的制備方法的實現(xiàn)流程圖；
[0029] 圖2是經(jīng)過本發(fā)明方法制作的未干燥脫細胞豬板層角膜基質(zhì)片的DAPI染色結(jié) 果；
[0030] 圖3是經(jīng)過浸泡于A型血清的板層角膜基質(zhì)片各時間點殘留細胞核數(shù)的比較結(jié) 果；
[0031] 圖4是經(jīng)過本發(fā)明方法制作的未干燥脫細胞豬板層角膜基質(zhì)片的DNA Gel結(jié)果；
[0032] 圖5是經(jīng)過本發(fā)明方法制作的未干燥豬板層角膜基質(zhì)片在兔角膜中央囊袋內(nèi)平 鋪術(shù)后2月后的裂隙燈照片；
[0033] 圖6是經(jīng)過本發(fā)明方法制作的未干燥豬板層角膜基質(zhì)片用于兔眼角膜移植術(shù)后 40天的裂隙燈照片。
【具體實施方式】
[0034] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明， 并不用于限定發(fā)明。
[0035] 圖1示出了本發(fā)明實施例提供的脫細胞板層角膜基質(zhì)片的制備方法的實現(xiàn)流程。 該方法包括以下步驟：
[0036] 在步驟SlOl中，取新鮮動物眼球進行消毒；
[0037] 在步驟S102中，消毒后用蘸有酒精的濾紙?zhí)幚恚缓蟛脸羯掀ぜ毎麑樱?br>[0038] 在步驟S103中，在手術(shù)顯微鏡下做角膜緣切口，伸入虹膜恢復器分離前層角膜， 分離完全后用角膜剪剪下前層角膜；
[0039] 在步驟S104中，用角膜環(huán)鉆取出板層角膜；
[0040] 在步驟S105中，將新鮮板層角膜經(jīng)過血清浸泡，然后將浸泡后的板層角膜基質(zhì)片 進行漂洗或冰浴電泳處理；
[0041] 在步驟S106中，將漂洗或電泳處理完畢的板層角膜基質(zhì)片進行梯度脫水，即得到 未干燥板層組織工程角膜支架，采用環(huán)氧乙烷