一種含有海藻酸鈉的藥用組合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種含有海藻酸鈉的組合物及其制備方法，特別是一種可促進(jìn)骨軟骨 組織修復(fù)的含有海藻酸鈉的藥用組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 因創(chuàng)傷和關(guān)節(jié)炎等疾病導(dǎo)致的關(guān)節(jié)內(nèi)骨軟骨復(fù)合型損傷在臨床上十分常見，在關(guān) 節(jié)內(nèi)占據(jù)重要地位的軟骨組織一旦破壞便極大程度上影響關(guān)節(jié)功能的正常發(fā)揮。由此引發(fā) 的惡性循環(huán)造成關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境的進(jìn)一步紊亂，機(jī)械力學(xué)傳導(dǎo)異常導(dǎo)致正常關(guān)節(jié)軟骨的連鎖破 壞，最終導(dǎo)致自主運(yùn)動不同程度受限等后果，嚴(yán)重影響著廣大患者的身心健康，也給家庭和 社會造成沉重的負(fù)擔(dān)。
[0003] 由于軟骨損傷后修復(fù)能力十分有限，只能依賴于手術(shù)治療，如微骨折術(shù)、鉆孔術(shù)和 骨軟骨自體/異體移植等。但是這些治療方法都存在或多或少的不足之處，并不能達(dá)到理 想的治療效果，特別是對大面積軟骨損傷的治療，不足之處更為突出。
[0004] 目前，Mosaicplasty技術(shù)（自體骨軟骨鑲嵌移植術(shù)）是臨床應(yīng)用較為廣泛的解 決大面積骨軟骨復(fù)合損傷修復(fù)的方法，其采用自體非負(fù)重區(qū)骨軟骨柱進(jìn)行鑲嵌式移植修復(fù) 負(fù)重區(qū)骨軟骨缺損。鑲嵌的骨軟骨柱之間及其與周圍和基底部骨和軟骨組織的"整合"不 良，從而不可避免地導(dǎo)致許多缺損間隙即"死區(qū)"的存在。因此，單純依靠 Mosaicplasty技 術(shù)無法獲得一個完全平整、連續(xù)的關(guān)節(jié)面，難以達(dá)到更佳的關(guān)節(jié)功能改善和恢復(fù)。并且"供 區(qū)"（自體骨軟骨柱的取骨區(qū)）也有愈合不良，造成術(shù)后病人"供區(qū)"疼痛。因此，解決骨軟 骨柱之間的"死區(qū)"以及"供區(qū)"骨軟骨生長修復(fù)的問題成為治療大面積骨軟骨損傷的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對目前骨軟骨鑲嵌移植術(shù)在大面積骨軟骨損傷修復(fù)應(yīng)用中存在的不足，發(fā)明人 經(jīng)過大量科學(xué)的實(shí)驗研究，提供了一種可高效地促進(jìn)骨軟骨組織再生修復(fù)的含有海藻酸鈉 的藥用組合物，該組合物可使填充的骨柱之間、及其與周圍軟骨、軟骨下骨間的縫隙被新生 組織完全填平，且具備與正常軟骨相似的力學(xué)性能，實(shí)現(xiàn)了鑲嵌骨軟骨與周圍軟骨、軟骨下 骨的完全融合，更顯著地提高了術(shù)后患者關(guān)節(jié)功能的改善和恢復(fù)水平。
[0006] 本發(fā)明提供了一種用于骨軟骨組織修復(fù)的藥用組合物，該組合物的活性成分 為：細(xì)胞濃度不低于0.5XlOVml的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(BMP-4)轉(zhuǎn)染的脂肪來源干細(xì)胞 (ADSCs)，及含量為1~2% (w/v)的海藻酸鈉和0· 3~0· 5% (w/v)的氯化鈣。
[0007] 該組合物也可稱為一種用于骨軟骨組織修復(fù)的含有海藻酸鈉的組合物或一種用 于骨軟骨組織修復(fù)的含有海藻酸鈉的藥用組合物。
[0008] 為解決骨軟骨鑲嵌移植術(shù)在大面積骨軟骨損傷修復(fù)應(yīng)用中存在的問題，發(fā)明人曾 經(jīng)嘗試將海藻酸鈣凝膠與該法配合應(yīng)用，結(jié)果該配合對"死區(qū)"現(xiàn)象具有一定程度的改善， 但該部分的新生組織并非骨軟骨樣信號，類似纖維肉芽組織，其力學(xué)性能較正常軟骨相差 很多，無法滿足修復(fù)后關(guān)節(jié)的正常使用。在不斷的研究、改良過程中，發(fā)明人驚喜地發(fā)現(xiàn)，在 海藻酸鈣凝膠中復(fù)合BMP-4轉(zhuǎn)染的ADSCs，可顯著地提高移植骨軟骨與周圍軟骨、軟骨下骨 間的整合效果，生成透明軟骨樣組織，可使植入部分與體內(nèi)骨或軟骨融為一體。從而進(jìn)一步 提高對軟骨損傷的修復(fù)效果，降低繼發(fā)骨性關(guān)節(jié)炎的可能性。
[0009] 本發(fā)明組合物中還含有pH調(diào)節(jié)劑，所述pH調(diào)節(jié)劑為本領(lǐng)域常用pH調(diào)節(jié)劑，如IN 的鹽酸、IN氫氧化鈉等。
[0010] 眾所周知，海藻酸鈣通常是由水溶性海藻酸鹽與鈣離子制成，海藻酸鈣凝膠粘稠、 流動性差，其凝膠化速度、粘稠狀態(tài)與原料的種類、比例及PH值有關(guān)。而凝膠化速度及其強(qiáng) 度對與本發(fā)明應(yīng)用領(lǐng)域來說是至關(guān)重要的。一方面，交聯(lián)完畢的海藻酸鈣凝膠的粘稠狀態(tài) 使其無法滿足鑲嵌軟骨與自身骨/軟骨間的細(xì)小、復(fù)雜且不規(guī)則空間的填充要求。另一方 面，其強(qiáng)度不合要求會導(dǎo)致凝膠破碎，不能為攜帶目的基因的種子細(xì)胞提供生長的支架，也 難以很好的起到對植入骨柱的固定及支撐作用，會直接影響到手術(shù)效果。
[0011] 為兼顧交聯(lián)（凝膠）速度、凝膠的強(qiáng)度，及鈣離子過量對細(xì)胞的負(fù)面影響等因素， 發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)試驗，得到本發(fā)明組合物所述的海藻酸鈉與氯化鈣的配比，及適合的PH值 范圍，即，重量百分比為1~2 %的海藻酸鈉和0. 3~0. 5 %的氯化鈣，及調(diào)節(jié)組合物pH值至 7. 35~7. 45的pH調(diào)節(jié)劑。該比例的兩部分混合后凝膠化時間、凝膠強(qiáng)度適中，約20-30秒 時間即可交聯(lián)完成。而且，本發(fā)明所述組合物采用在臨用前將海藻酸鈉部分及氯化鈣部分 混合，并立即注入體內(nèi)的方式應(yīng)用，自混合至注射完成耗時約10-15秒，此時的混合物尚處 于比較稀薄的狀態(tài)，可實(shí)現(xiàn)該手術(shù)創(chuàng)口內(nèi)任何細(xì)小、深遠(yuǎn)的縫隙填充完全的目的，填充完畢 也無需刻意等待，組合物已成為具有一定強(qiáng)度的凝膠狀，便可進(jìn)行縫合。即使所有縫隙填充 完全又不延長傷口開放時間，且凝膠具備適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度，足以保護(hù)植入軟骨柱的位置及形狀， 較小外力不會致其變形，為細(xì)胞早期的生長提供支架及合適的生長環(huán)境。
[0012] BMP-4轉(zhuǎn)染的ADSCs在體內(nèi)可較長時間（約4-6周）持續(xù)分泌細(xì)胞因子，刺激其分 裂增殖，啟動并加速修復(fù)進(jìn)程，改善關(guān)節(jié)內(nèi)的病理環(huán)境，增強(qiáng)修復(fù)質(zhì)量；而ADSCs的雙向分 化潛能使其在關(guān)節(jié)腔與軟骨下骨床的不同微環(huán)境內(nèi)分化為相應(yīng)的軟骨細(xì)胞或骨細(xì)胞。
[0013] 復(fù)合BMP-4轉(zhuǎn)染的ADSCs的海藻酸鈣凝膠注入"死區(qū)"，凝膠在固定、保護(hù)植入軟骨 柱的同時，為植入的干細(xì)胞提供了類似生理狀態(tài)的三維生長環(huán)境，細(xì)胞在凝膠中均勻分布， 可進(jìn)行營養(yǎng)和代謝物質(zhì)的交換，受凝膠的應(yīng)變力刺激利于增生分化并形成細(xì)胞外基質(zhì)，最 終新生軟骨組織將"死區(qū)"完全填平，使植入部分于自體融合為一體，大大提高了一期完整 修復(fù)骨軟骨復(fù)合組織損傷的可操作性和成功率，更重要的是顯著提高了大面積軟骨損傷患 者的預(yù)后效果，提高了該類患者的生活質(zhì)量。
[0014] 本發(fā)明所述組合物與骨軟骨鑲嵌移植術(shù)配合應(yīng)用2-3個月，軟骨柱邊緣便會新生 軟骨樣組織，該凝膠部分有大量軟骨細(xì)胞，該部分與植入軟骨柱及自體軟骨結(jié)合牢固，關(guān)節(jié) 修復(fù)效果良好。此外，發(fā)明人還將本發(fā)明組合物直接應(yīng)用于小面積或微小面積軟骨損傷的 填充，同樣達(dá)到了很好的修復(fù)效果。
[0015] 需要說明的是，本發(fā)明所用的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4轉(zhuǎn)染的脂肪來源干細(xì)胞為制備 48小時內(nèi)的細(xì)胞，即，轉(zhuǎn)染步驟在組合物使用前的48小時內(nèi)完成，優(yōu)選24小時內(nèi)制備完成。
[0016] 為使本發(fā)明所述的組合物具備與肌體相適應(yīng)的滲透壓，及恒定的pH值，上述組合 物還含有以下含量的輔料：〇. 5~0. 7%的氯化鈉，和0. 3~0. 5%的4-羥乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES)。
[0017] 實(shí)驗結(jié)果顯示，所述組合物中海藻酸鈉的含量直接影響細(xì)胞（脂肪來源干細(xì)胞和 軟骨細(xì)胞）生長的效果，且，該影響并非簡單的正比、反比關(guān)系，而是在一個特定的范圍內(nèi)， 該組合物中海藻酸鈉的含量優(yōu)選為1. 4~1. 8%。
[0018] 所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4轉(zhuǎn)染的脂肪來源干細(xì)胞（即，BMP-4轉(zhuǎn)染的ADSCs)的濃 度優(yōu)選為（1~2) XlOVml。
[0019] 本發(fā)明所述的組合物，由細(xì)胞濃度為（1~I. 5) XioVml的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4 轉(zhuǎn)染的脂肪來源干細(xì)胞，含量為1. 6~1. 7%的海藻酸鈉、0. 35~0. 45%的氯化鈣、0. 5~ 〇. 7%的氯化鈉、0. 3~0. 5%的4-羥乙基哌嗪乙磺酸和適量pH調(diào)節(jié)劑制成。該組合物應(yīng) 用狀態(tài)為凝膠劑，即海藻酸鈉溶液部分與氯化鈣溶液部分混合后發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，生成海藻 酸鈣凝膠。
[0020] 組織學(xué)和生物力學(xué)檢測結(jié)果證明，本發(fā)明組合物與Mosaicplasty技術(shù)配合修復(fù) 軟骨缺損，再生組織無論在組織結(jié)構(gòu)還是功能性（生物力學(xué)）上都與正常關(guān)節(jié)軟骨沒有差 另IJ，達(dá)到了前所未有的修復(fù)效果，進(jìn)一步完善了大面積軟骨缺損修復(fù)技術(shù)。
[0021] 本發(fā)明的另一目的在于，提供所述組合物的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0022] ⑴提取并制備骨形態(tài)發(fā)生蛋白_4轉(zhuǎn)染的脂肪來源干細(xì)胞；
[0023] ⑵制備海藻酸鈉溶液；
[0024] ⑶制備氯化鈣溶液；