甘草次酸介導的姜黃素長循環(huán)納米脂質(zhì)載體及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，特別提供一種甘草次酸介導的姜黃素長循環(huán)納米脂質(zhì)載體 及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 姜黃素（curcumin，Cur)提取于植物姜黃（Curcuma longa L.)的干燥根莖，是一種 多酚類化合物，是姜黃色素中的主要活性成分。作為著色劑和色素染料廣泛應用于食品領 域。近年來，多項研究表明，姜黃素具有多樣的生物活性和藥理作用，可作為抗炎藥，抗氧 劑，抗腫瘤藥，保肝藥等，其毒性低，具有良好的臨床應用潛力。但是，姜黃素在水中溶解度 小且穩(wěn)定性差，導致在體內(nèi)生物利用度差，藥物很快在胃腸道內(nèi)代謝失活，而增大劑量和給 藥頻率又會增大藥物的副作用，限制了姜黃素的臨床應用。為了改善姜黃素的溶解度及穩(wěn) 定性，提高其生物利用度，目前已有姜黃素微乳、聚合物納米粒、脂質(zhì)體方面的相關研究。其 中脂質(zhì)體的研究較為廣泛，脂質(zhì)體在體內(nèi)具有良好的緩釋、靶向性和生物相容性等特點，但 脂質(zhì)體在體內(nèi)外不穩(wěn)定、藥物在存放過程中易泄漏；聚合物納米粒在制備過程會存在殘留 單體、有機溶劑、聚合物引發(fā)劑等毒性物質(zhì)，而且所用的生物降解性高分子材料在細胞吞噬 降解后也常產(chǎn)生細胞毒性；微乳存在物理穩(wěn)定性差，藥物在油相的溶解度低等問題限制了 其廣泛發(fā)展和應用。研究開發(fā)姜黃素的新劑型，增加其水溶性，避免被胃腸道代謝失活，提 高血藥濃度，延長體內(nèi)循環(huán)時間，提高生物利用度，更好的發(fā)揮姜黃素的藥理活性，對其臨 床應用具有重要意義及廣闊的發(fā)展前景。
[0003] 納米脂質(zhì)載體（nanostructured lipid carrier, NLC)是由固體脂質(zhì)納米粒 (solid lipid nanoparticles，SLN)發(fā)展而來的一種新型微粒給藥系統(tǒng)。以固態(tài)的天然或 合成的類脂如卵磷脂、三酰甘油等為載體，向固態(tài)脂質(zhì)中加入化學差異很大的液態(tài)油，使 納米粒結(jié)構(gòu)以結(jié)晶缺陷型或無定型存在，將藥物包裹或吸附于類脂核中經(jīng)制成的粒徑在 50-1000nm之間的固態(tài)膠粒給藥體系。NLC由固態(tài)脂質(zhì)和液態(tài)脂質(zhì)混合作為脂質(zhì)材料制備 而來，由于液態(tài)油的加入，擾亂了晶格結(jié)構(gòu)，形成無定型的結(jié)構(gòu)載體，避免藥物排擠出來，增 加了載藥量和包封率 [23]。也有報道認為，NLC固態(tài)脂質(zhì)包繞小的液態(tài)油形成納米室。當藥 物在液態(tài)脂質(zhì)中溶解度遠高于固態(tài)脂質(zhì)溶解度時，藥物被溶解于液態(tài)油中，大大提高載藥 量，而且所包繞的固態(tài)脂質(zhì)還起到了緩釋的作用 [24]。而且液態(tài)油的加入并未影響脂質(zhì)的晶 體結(jié)構(gòu)，仍以固態(tài)形式存在于分散液中。NLC既具備脂質(zhì)體、乳劑等良好的生理相容性和便 于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點，又具備了聚合物納米粒穩(wěn)定性高、藥物不易泄漏的特點，同時 優(yōu)化了 SLN (固體脂質(zhì)納米粒，Solid lipid nanoparticles)包封率低，放置藥物析出等缺 點，已被越來越多的研究學者關注，成為具有廣闊發(fā)展前途的藥物新型載體。
[0004] 目前，常用的NLC制備方法有溶劑揮發(fā)法、高壓乳勻法、微乳法、薄膜超聲法等。不 同的制備方法對納米脂質(zhì)載體的粒徑、包封率和穩(wěn)定性都會產(chǎn)生一定程度的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種具有高包封率及載藥量的甘草次酸介導的姜黃素長 循環(huán)納米脂質(zhì)載體及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明具體提供了一種甘草次酸介導的姜黃素長循環(huán)納米脂質(zhì)載體，其特征在 于：所述甘草次酸介導的姜黃素長循環(huán)納米脂質(zhì)載體是由姜黃素、單硬脂酸甘油酯、辛 酸/癸酸甘油三酯、甘草次酸-磷脂衍生物、注射用大豆卵磷脂以及Polyoxyethylene 40 Strearate制備得到的，其中，甘草次酸-磷脂衍生物的合成方法為：
[0007] 取GA、DCC、NHS三者溶于除水二氯甲烷中，常溫下反應活化3~4h ;另取 DSPE-PEG2qqq-NH2溶于二氯甲烷溶液，逐滴加入上述活化物中，室溫氮氣保護下反應48~ 50h;過濾除去反應的副產(chǎn)物，加入冰乙醚萃取，除去上清液中未反應的GA，沉淀物質(zhì)即為 目標產(chǎn)物，DMF復溶后裝入透析袋中透析72h，冷凍干燥得到甘草次酸-磷脂衍生物。
[0008] 本發(fā)明還提供了所述甘草次酸介導的姜黃素長循環(huán)納米脂質(zhì)載體的制備方法，其 特征在于，制備過程如下：
[0009] 將脂質(zhì)(單硬脂酸甘油酯和辛酸/癸酸甘油三酯)、甘草次酸-磷脂衍生物和 姜黃素水浴加熱至75°C，加入無水乙醇使其溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去無水乙醇作為油相；在 Polyoxyethylene 40 Strearate中加入注射用水，超聲攪拌均勻后水浴加熱至75±2-C，作 為水相；磁力攪拌下將水相滴加入同溫度油相中，恒溫攪拌5min，制得初乳，趁熱用超聲波 細胞粉碎機超聲分散5min，過0. 22 μ m微孔濾膜，室溫冰水浴冷卻固化，得甘草次酸介導的 姜黃素長循環(huán)納米脂質(zhì)載體分散液。
[0010] 本發(fā)明采用注射用大豆卵磷脂和硬脂酸聚氫氧40酯作復合乳化劑，由于姜黃素 脂溶性一般，直接加入油相中溶解度較差。而將注射用大豆卵磷脂加入油相中，大大增加了 在油相中的溶解度。但是磷脂長時間受熱容易氧化變質(zhì)，從而失去乳化能力并且其降解產(chǎn) 物易導致溶血等不良反應，所以應盡量縮短加熱時間。而硬脂酸聚氫氧40酯為水溶性乳化 劑，將其加入到水相中攪拌、超聲使之分散。
[0011] 制備納米脂質(zhì)載體的過程中，要控制操作溫度必須在脂質(zhì)的熔點以上，油相和水 相均須加熱到75°C后混合。室溫下將油相滴加或倒入水相時，由于脂質(zhì)粘度較大，此時溫度 低于脂質(zhì)熔點，油相會很快凝固，操作較困難。而選擇磁力攪拌下將熱的水相滴加入油相， 再快速分散成初乳，分散效果更均勻，操作簡單。
[0012] 本發(fā)明所述甘草次酸介導的姜黃素長循環(huán)納米脂質(zhì)載體的制備方法，其特征在 于：在用超聲波細胞粉碎機超聲分散的5min里，超聲ls，間歇Is。
[0013] 本發(fā)明所述甘草次酸介導的姜黃素長循環(huán)納米脂質(zhì)載體的制備方法，其特征在 于：將水相滴加入同溫度油相中時，滴加速度為IOmL iin'滴加速度過快時，脂質(zhì)相與水 相分層，難以得到均勻分散液。
[0014] 將水相滴入油相時，須進行高速攪拌。攪拌速度越高所得初乳粒徑越小，體系越穩(wěn) 定；但攪拌速度過高會使油相濺到瓶壁上,造成材料和藥物的損失。攪拌速度過慢會造成兩 相混合不勻，油相浮在水相上層，不能形成穩(wěn)定的初乳，影響下一步納米脂質(zhì)載體的制備。 經(jīng)反復實驗，選擇以3000r · rnirT1作為制備初乳的攪拌速度。
[0015] 在75°C、3000r · rnirT1攪拌5min條件下制備初乳后，趁熱將初乳進行探頭超聲處 理，以粒徑、包封率為指標，考察超聲功率及時間對NLC的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，超聲功率越大， 提供的破壞能力越強，納米脂質(zhì)載體的粒徑越小。但功率過大會導致納米粒的粒度分布不 均勻，體系表面自由能過大而不穩(wěn)定。而超聲功率過小，提供的破壞能力不足以破壞微乳， 得到足夠小的粒子。因此，選擇超聲功率為400W。
[0016] 超聲后的納米脂質(zhì)分散液需要立即降溫并且維持足夠長的冷卻時間才能使納米 粒得到足夠固化，穩(wěn)定。降溫速度太慢或冷卻時間過短會導致粒子聚集，粒徑增大，體系的 穩(wěn)定性降低，導致實驗失敗。本發(fā)明分別選擇室溫冰水浴冷卻和水浴冷卻兩種方式進行比 較。結(jié)果表明，室溫水浴下冷卻固化速度緩慢，粒徑較大且燈光下澄清度較差。因此優(yōu)選 0~2 °C冰水浴迅速冷卻固化。
[0017] 本發(fā)明所述甘草次酸介導的姜黃素長循環(huán)納米脂質(zhì)載體的制備方法，其特征在 于，所用原料的質(zhì)量比為姜黃素：單硬脂酸甘油酯：辛酸/癸酸甘油三酯：甘草次酸-磷脂 衍生物：注射用大豆卵憐脂：Polyoxyethylene 40 Strearate=I :28 ~30 :12 ~13 :6 ~7 : 9~10 :31~32。最優(yōu)選為姜黃素：單硬脂酸甘油酯：辛酸/癸酸甘油三酯：甘草次酸-磷 脂衍生物：注射用大豆卵磷脂：Polyoxyethylene 40 Strearate=I :29 :12. 5 :6. 2 :9. 1 :32。
[0018] 本發(fā)明所述甘草次酸介導的姜黃素長循環(huán)納米脂質(zhì)載體的制備方法，其特征在 于：所述甘草次酸-磷脂衍生物的合成方法中，GA、DCC、NHS三者的摩爾比為1. 5:1. 2:1. 2。
[0019] 本發(fā)明所述甘草次酸介導的姜黃素長循環(huán)納米脂質(zhì)載體的制備方法，其特征在 于：所述甘草次酸-磷脂衍生物的合成方法中，DSPE-PEG_-NH 2、GA、DCC、NHS的摩爾比為 1 :1· 5:1. 2:1. 2。
[0020] 本發(fā)明所述甘草次酸介導的姜黃素長循環(huán)納米脂質(zhì)載體的制備方法，其特征在 于：甘草次酸-磷脂衍生物的加入量為總脂質(zhì)用量的5~15%(W/W)，其中最優(yōu)選為10%(W/ W)，經(jīng)過大量實驗證明，當甘草次酸-磷脂衍生物的加入量為總脂質(zhì)用量的10%時，所得納 米脂質(zhì)載體具有最強的腫瘤細胞殺傷作用。
[0021] 本發(fā)明所述甘草次酸介導的姜黃素長循環(huán)納米脂質(zhì)載體的制備方法，其特征在 于，所述甘草次酸介導的姜黃素長循環(huán)納米脂質(zhì)載體的最優(yōu)制備工藝如下：
[0022] 原料； 姜黃素 IOmg 單硬脂酸廿油酯 290 mg 卡酸/癸酸It油5酯 125 mg 注射用大豆卵磷脂 tH mg Polyoxyethylene 40 Strearate 320 mg 注射坩水加至 WmL
[0023] 取GA、DCC、NHS三者溶于IOmL的除水二氯甲烷中，常溫下反應活化3h ;另取Immol DSPE-PEG2qqq-NH2溶于5mL的二氯甲烷溶液，逐滴加入上述活化物中，室溫氮氣保護下反應 48h;過濾除去反應的副產(chǎn)物，加入冰乙醚萃取，除去上清液中未反應的GA，沉淀物質(zhì)即為 目標產(chǎn)物，DMF復溶后裝入透析袋中透析72h，冷凍干燥得到甘草次酸-磷脂衍生物；
[0024] 稱取處方量的單硬脂酸甘油酯、辛酸/癸酸甘油三酯、甘草次酸-磷脂衍生物、注 射用大豆卵磷脂和姜黃素水浴加熱至75°C，加入5ml無水乙醇使其溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去無 水乙醇得到混合均勻的熔融相作為油相，其中甘草次酸-磷脂衍生物的加入量為總脂質(zhì)用 量的10%(w/w);稱取處方量的Polyoxyethylene 40 Strearate,加入注射用水，超聲攪拌均 勻后水浴加熱至75°C，作為水相；在3000r ^mirT1磁力攪拌下將水相滴加入同溫度油相中， 滴加速度控制在IOmL · mirT1 ;恒溫攪拌5min，制得初乳，趁熱將初乳用超聲波細胞粉碎機 再分散，超聲功率