一種雙重原位雜化制備的具有磁響應(yīng)性多重梯度載藥微球的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種根據(jù)雙重原位雜化原理和納米自組裝技術(shù)研制的多重梯度載藥復(fù)合微球及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]因腫瘤、結(jié)核、外傷和代謝性骨病等原因造成的骨缺損的修復(fù)，一直是生物醫(yī)藥領(lǐng)域的難題之一。目前常用的異體骨移植、自體骨移植等方法在不同程度上存在一些問題。如自體骨來源極為有限，不能用于大面積骨缺損；異體骨存在免疫排斥反應(yīng)，且可能造成病原體感染。近年來，隨著生物醫(yī)學(xué)工程的發(fā)展，藥物釋放體系作為一種優(yōu)良的骨修復(fù)材料越來越受到人們的重視。作為藥物釋放體系的重要組成部分，理想的藥物載體包括下面幾個特點(diǎn):(I)優(yōu)良的生物相容性、親水性和生物降解性，并且降解產(chǎn)物無毒無害，可迅速排出體夕卜。(2)良好的藥物負(fù)載能力和緩釋能力。藥物負(fù)載量大可以減少藥物攝入次數(shù)和輸送損失，緩釋性能的好壞直接影響到藥物釋放的濃度和釋放穩(wěn)定性。(3)載體材料來源廣泛，制備簡單，具備靶向輸送能力，對磁、電等物理信號響應(yīng)，具備定向輸送能力。
[0003]磁場通過影響電荷微粒的運(yùn)動、膜系統(tǒng)的通透性和生物高分子的磁矩取向等，從而使細(xì)胞的過程發(fā)生變化。研宄發(fā)現(xiàn)，黏附有磁性粒子的整合素和內(nèi)化磁性粒子的機(jī)械刺激，能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣信號的改變，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。結(jié)合電磁場的這種功能，利用雙重原位雜化的原理將鐵鹽和亞鐵鹽原位生成超順磁Fe3O4,作為復(fù)合微球的原料之一。該方法相較于水熱合成法，反應(yīng)條件更加溫和，有效降低有機(jī)與無機(jī)界面的界面能，引導(dǎo)納米四氧化三鐵在有機(jī)基質(zhì)上原位結(jié)晶，使得納米顆粒分散更加均勻。采用同樣的原理，再次運(yùn)用原位雜化法由外到內(nèi)逐層形成多梯度的納米羥基磷灰石，通過有機(jī)基質(zhì)與無機(jī)物離子在界面處的相互作用，從分子水平調(diào)控?zé)o機(jī)礦物相的析出，從而使無機(jī)相具有特殊的多級結(jié)構(gòu)和組裝方式。有機(jī)基質(zhì)對無機(jī)物納米羥基磷灰石和納米四氧化三鐵的結(jié)晶起到模板作用，利用兩者之間的晶格匹配、靜電作用、立體化學(xué)互補(bǔ)以及空間定位作用，引導(dǎo)納米羥基磷灰石和納米四氧化三鐵在有機(jī)基質(zhì)上原位結(jié)晶形成均勻分散的納米顆粒，使無機(jī)礦物具有一定的形狀、尺寸、取向和結(jié)構(gòu)。
[0004]殼聚糖作為一種帶正電荷的天然聚多糖，其結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分一糖胺聚糖十分類似，優(yōu)良的生物相容性、親水性和生物降解性，并且降解產(chǎn)物無毒無害，可迅速排出體外，能促進(jìn)傷口愈合和骨組織的形成。國內(nèi)外將中藥與生物材料的結(jié)合，應(yīng)用于骨組織修復(fù)領(lǐng)域的研宄尚處于初步階段。淫羊藿是一味傳統(tǒng)的具有補(bǔ)腎壯陽、防治骨質(zhì)疏松的中藥，其黃酮類化合物的主體成分-淫羊藿苷，對骨質(zhì)疏松起到良好的拮抗作用，可作為一種新型成骨誘導(dǎo)活性因子用于骨再生研宄。磁性材料與中藥-淫羊藿苷的聯(lián)合使用，不僅能改良中藥劑型，增強(qiáng)中藥療效，而且可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)中藥的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種雙重原位雜化制備的多重梯度載藥復(fù)合微球及其制備方法，根據(jù)雙重原位雜化原理和納米自組裝技術(shù)研制一種納米粒均勻分散，生物磁響應(yīng)性良好，以及具有控緩釋能力的多梯度載藥微球。該方法的制備程序簡單，工藝條件溫和，成本較低，生物相容性和生物可降解性能良好，獨(dú)特的生物磁力導(dǎo)向性以及多重梯度性使得藥物的控制緩釋的能力明顯增強(qiáng)。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種雙重原位雜化制備的多重梯度載藥復(fù)合微球及其制備方法，根據(jù)雙重原位雜化原理和納米自組裝技術(shù)，以殼聚糖為有機(jī)基體，鐵鹽-亞鐵鹽為無機(jī)相Fe3O4的先軀物，鈣-磷鹽溶液為無機(jī)相羥基磷灰石的前驅(qū)體；含中藥-淫羊藿苷的殼聚糖溶液，首先與鐵鹽、亞鐵鹽充分混合均勻，再與可溶性鈣鹽均勻混合，通過高壓靜電微囊成型裝置，將其逐滴噴入含有可溶性磷酸鹽的堿液中，模仿生物礦化采取有機(jī)大分子調(diào)控?zé)o機(jī)相生長的方式，在有機(jī)基質(zhì)上雙重原位雜化成核結(jié)晶，洗滌冷凍干燥，制備一種多重梯度載藥微球。
[0007]所述的制備方法的具體步驟如下:
步驟一:微球前驅(qū)體混合液的制備
(1)將淫羊藿苷溶解于無水乙醇中，殼聚糖溶解于體積分?jǐn)?shù)為I?2%的乙酸溶液中，磁力攪拌下，往殼聚糖的乙酸溶液中加入淫羊藿苷的醇溶液，攪拌使各組分混合均勻；
(2)按四氧化三鐵的化學(xué)計量比n(Fe3+):n( Fe2+) =2: 1，向(I)得到的混合液中依次加入濃度為0.1?0.3mol/L的可溶性鐵鹽溶液，濃度為0.05?0.15mol/L的可溶性亞鐵鹽溶液；
(3)配制1.5?3mol/L可溶性鈣鹽溶液，將其加入到(2)得到的混合液中，持續(xù)攪拌使其充分混合均勻，得到微球前驅(qū)體混合液；最終混合液中殼聚糖的質(zhì)量百分比為2?4% ;淫羊藿苷的質(zhì)量百分比為0.03?0.08% ;雜化形成的Fe3O4的理論百分比為2?4% ；
步驟二:凝膠浴的制備
(1)配制I?3mo I/L KOH或NaOH的乙醇/水溶液，其中乙醇與水的體積比為I?
2:1 ；
(2)配制0.6?1.8mol/L的可溶性磷酸鹽溶液，使最終體系中鈣-磷摩爾比為1.67:1 ；
(3)將上述(1)、(2)的物料以不同的配比混合得到不同濃度的混合物，即凝膠?。? 步驟三:多重梯度載藥微球的成型
(1)利用高壓靜電微囊成型裝置，將步驟一所制備的混合液逐滴噴入步驟二所制備的凝膠浴中成型，然后置于37°C搖床中搖晃8?12 h，雙重原位雜化，使其充分結(jié)晶；
(2)將成型的微球用去離子水反復(fù)浸洗至中性，-10°C?_80°C超低溫冰箱冷凍后，再轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，即獲得一種雙重原位雜化制備的具有磁響應(yīng)性的多重梯度載藥微球。
[0008]所述可溶性鐵鹽是氯化鐵、硝酸鐵或硫酸鐵，可溶性亞鐵鹽是氯化亞鐵、硫酸亞鐵中的一種或幾種；
所述鈣鹽為硝酸鈣或氯化鈣；所述的磷酸鹽為磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀中的一種或幾種。
[0009]最終Ca/P前驅(qū)體溶液理論形成HAP量為3?5%。
[0010]本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于:殼聚糖是一種含有大量氨基的天然陽離子多糖，該有機(jī)基體中含有的羧基、羥基和氨基等基團(tuán)不僅可促進(jìn)細(xì)胞的粘附和生長，而且是無機(jī)相四氧化三鐵和羥基磷灰石的成核位點(diǎn)。本發(fā)明正是利用這些基團(tuán)在有機(jī)基體上有規(guī)律的分布，雙重原位雜化和納米自組裝技術(shù)，誘導(dǎo)納米四氧化三鐵和納米羥基磷灰石的成核結(jié)晶，從而制備出納米顆粒高度分散、獨(dú)特的生物磁力導(dǎo)向性以及多重梯度性的具有良好的控緩釋的能力的載藥復(fù)合微球。本發(fā)明根據(jù)雙重原位雜化原理以及納米自組裝技術(shù)，制備程序簡單，工藝條件溫和，生物相容性和生物可降解性能良好。
[0011]制備所得的微球相對于其他復(fù)合微球有以下優(yōu)點(diǎn):
(1)該復(fù)合微球獨(dú)特的表面性能(比表面積大、表面能高、表面粗糙度及表面潤濕性增加)有利于生長因子的吸附，促進(jìn)細(xì)胞的粘附、增殖、分化；
(2)根據(jù)雙重原位雜化原理以及納米自組裝技術(shù)研制一種納米顆粒高度分散、生物磁性導(dǎo)向性良好的控緩釋載藥微球，由于微球結(jié)構(gòu)的多梯度性，藥物控緩釋的能力明顯增強(qiáng)；
(3)采用乳鼠成骨細(xì)胞建立復(fù)合微球材料的體外評價模型，結(jié)果表明該材料細(xì)胞相容性好；
(4)該納米復(fù)合微球的制備程序簡單，工藝條件溫和，操作簡便，成本較低。
【附圖說明】
[0012]圖1是一種雙重原位雜化制備的具有磁響應(yīng)性的多重梯度載藥微球的掃描電子顯微鏡圖。
[0013]圖2是一種雙重原位雜化制備的具有磁響應(yīng)性的多重梯度載藥微球的X射線衍射圖。
[0014]圖3是一種雙重原位雜化制備的具有磁響應(yīng)性的多重梯度載藥微球的降解曲線圖。
[0015]圖4是一種雙重原位雜化制備的具有磁響應(yīng)性的多重梯度載藥微球與乳鼠成骨細(xì)胞體外復(fù)合培養(yǎng)的MTT圖。
[0016]圖5-6是一種雙重原位雜化制備的具有磁響應(yīng)性的多重梯度載藥微球的對照組與乳鼠成骨細(xì)胞體外復(fù)合培養(yǎng)第3，5天的AO/EB染色圖。
[0017]圖7-8是一種雙重原位雜化制備的具有磁響應(yīng)性的多重梯度載藥微球與乳鼠成骨細(xì)胞體外復(fù)合培養(yǎng)第3，5天的AO/EB染色圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1
(1)將淫羊藿苷溶解于無水乙醇中，殼聚糖溶解于體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液中，磁力攪拌下，往殼聚糖的乙酸溶液中加入淫羊藿苷的醇溶液，攪拌使各組分混合均勻，按質(zhì)量百分比計算殼聚糖、淫羊藿苷的含量分別為2%、0.05% ;
(2)按照η(Fe3+):n( Fe2+) =2:1的比例將一定量的可溶性鐵鹽，可溶性亞鐵鹽分別加入到上述混合液中，兩者分別持續(xù)攪拌30min，理論形成的Fe3O4質(zhì)量配比為2% ;
(3)配制1.5mol/L可溶性鈣鹽溶液，將其加入到(2)得到的混合液中，持續(xù)攪拌使其充分混合均勻，得到微球前驅(qū)體混合液； (4)配制0.5mol/L NaOH的乙醇/水溶液，其中乙醇與水的體積比為I?2: 1，并配制1.8mol/L的可溶性磷酸鹽溶液，使最終體系中鈣-磷摩爾比為1.67:1 ;將上述物料以不同的配比混合得到不同濃度的混合物，即凝膠浴；
(5)利用高壓靜電微囊成型裝置，將步驟(3)所制備的混合液逐滴噴入步驟(4)所制備的凝膠浴中成型，然后置于37°C搖床中搖晃8 h，雙重原位雜化，使其充分結(jié)晶；
(6)將成型的微球用去離