一種蓮葉細(xì)胞次生代謝物凍干粉的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物細(xì)胞培養(yǎng)和化妝品領(lǐng)域，具體涉及一種植物細(xì)胞培養(yǎng)法，通過剪 碎代替打漿減少對細(xì)胞的損失，采用果膠酶和纖維素酶聯(lián)合消化縮短消化時間的改進(jìn)，來 獲得蓮葉細(xì)胞的次生代謝物，制作成凍干粉，作為抗衰老化妝品。
【背景技術(shù)】
[0002] 蓮葉為睡蓮科植物蓮，又名荷葉，藕葉?！侗静菥V目》記載，"荷葉服之令人瘦劣。單 服可以消陽水浮之氣。能生發(fā)元?dú)?，裨助脾胃，澀精濁，散癖血，消腫痛，發(fā)痘瘡。蓮葉中化 學(xué)成分主要為黃酮類化合物和蓮葉堿，二者具有較高的生物活性，其中的黃酮類化合物作 為一種過氧化自由基的清除劑，能有效防止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對生物機(jī)體組織損傷，這種損 傷導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生和組織的衰老。而隨著年齡的增長，機(jī)體內(nèi)清除自由基的能力逐漸 下降，通過向機(jī)體組織添加這種自由基清除劑可以達(dá)到到抵延緩衰老的目的。目前蓮葉中 的化學(xué)成分提取及藥用價值研宄頗多，而很少將其抗衰老作用應(yīng)用于化妝品中。
[0003] 目前蓮葉中的黃酮類化合物均用化學(xué)提取法，主要步驟：蓮葉清洗干凈后烘干，粉 碎，置于70-80 %的乙醇中回流提取，將提取液濃縮至原體積1/3,過濾得到初提液，將初提 液用大孔樹脂吸附，然后經(jīng)過洗脫，抽濾，濃縮，萃取，靜置，過濾，干燥的步驟后，得到成品。 而植物細(xì)胞培養(yǎng)法目前并沒有應(yīng)用于蓮葉，該方法主要步驟（以人參為例）：將人參浸泡 在10%次氯酸鈉中20分鐘進(jìn)行滅菌，然后用無菌水洗人參至次氯化鈉無殘留，將潔凈后的 人參放入打漿機(jī)加入MS培養(yǎng)基，打漿。打漿液加入纖維素酶100mg/kg，放置3-5小時，用 50-80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液用低速離心機(jī)分離，去除上清液和雜志，蓮葉細(xì)胞轉(zhuǎn) 移至改良MS培養(yǎng)基中，調(diào)pH 5-6,90-120r/min攪拌，避光培養(yǎng)，獲得大量人參細(xì)胞培養(yǎng)液。 化學(xué)提取法要經(jīng)過預(yù)處理，初提，大孔吸附樹脂分離，有機(jī)溶劑純化，后處理五個環(huán)節(jié)，生產(chǎn) 工藝復(fù)雜；同時其安全性低，生產(chǎn)過程中使用大量有機(jī)溶劑，極易殘留在成品中，不利于身 體健康；會造成環(huán)境污染，生產(chǎn)過程中會對環(huán)境中排放大量有機(jī)溶劑；受限于蓮葉的生長 季節(jié)，影響成品的產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了全新的蓮葉細(xì)胞培養(yǎng)法，替代化 學(xué)提取法，通過纖維素酶和果膠酶的聯(lián)合作用，減少了細(xì)胞的培養(yǎng)時間，簡化了生產(chǎn)工藝， 同時產(chǎn)品安全性高還可長期穩(wěn)定生產(chǎn)；運(yùn)用于化妝品中具有抗衰老的作用。
[0005] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0006] -種蓮葉細(xì)胞次生代謝物凍干粉的制備方法，包括如下步驟：
[0007] (1)獲取蓮葉細(xì)胞株：在每0· 5g_3. Og無菌蓮葉中加入5_30mlMurashige and Skoog培養(yǎng)基及0. 025-0. 30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 2-0. 3 %纖維素酶溶液和0. 025-0. 30ml質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為0. 2-0. 3%果膠酶溶液進(jìn)行消化；將消化后所得消化液過濾、離心除去上清液后得 到蓮葉細(xì)胞株；
[0008] (2)大量培養(yǎng)蓮葉細(xì)胞：
[0009] 1)初步培養(yǎng)：采用I號滅菌培養(yǎng)基將蓮葉細(xì)胞株配制成（0. 5-5) X IO4個/ml密 度的蓮葉細(xì)胞液，將所述蓮葉細(xì)胞液置于旋轉(zhuǎn)式搖床上，在24-27°C的環(huán)境下和轉(zhuǎn)速為 15〇-180rpm/min的條件下培養(yǎng)；
[0010] 2)懸浮培養(yǎng)：將經(jīng)過初步培養(yǎng)后的蓮葉細(xì)胞培養(yǎng)液去除上清液，采用II號滅菌培 養(yǎng)基將蓮葉細(xì)胞配制成（0. 5-5) X IO5個/ml密度的蓮葉細(xì)胞液并置于發(fā)酵罐中，通入速率 為0. 01-0. 05m3/s的過濾空氣，在24-27°C的環(huán)境下和轉(zhuǎn)速為120-150rpm/min的條件下進(jìn) 行懸浮培養(yǎng)得到蓮葉細(xì)胞培養(yǎng)物；
[0011] (3)制備蓮葉細(xì)胞次生代謝物凍干粉：收集蓮葉細(xì)胞培養(yǎng)物對其過濾、濃縮和凍 干處理后得到蓮葉細(xì)胞次生代謝物凍干粉。
[0012] 優(yōu)選的，步驟（1)中選取新鮮蓮葉進(jìn)行消毒。
[0013] 優(yōu)選的，步驟（1)中將蓮葉在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15% -20%的次氯酸鈉溶液中消毒，消毒 后采用無菌去離子水清洗。
[0014] 優(yōu)選的，步驟（1)中所述無菌蓮葉在加入Murashige and Skoog培養(yǎng)基前為碎片， 且碎片面積大小< Imm2;所述纖維素酶溶液與果膠酶溶液體積為1:1。
[0015] 優(yōu)選的，步驟（1)中采用200目無菌網(wǎng)篩對消化液進(jìn)行過濾，將過濾液加入到 Countstar細(xì)胞計數(shù)器中，過濾液再250g的離心力下離心10min。
[0016] 優(yōu)選的，步驟（2)中初步培養(yǎng)時每100mL蓮葉細(xì)胞液培養(yǎng)14天。
[0017] 優(yōu)選的，步驟（3)所述蓮葉細(xì)胞培養(yǎng)物采用孔徑小于0. 45 μ M的濾膜過濾；濃縮上 清液至濃縮液中蛋白濃度為50±0. 5 μ g/ml ;濃縮上清液采用孔徑小于0. 22 μM的濾膜過 濾。所述凍干處理時凍干溫度為（_20°C )-(_35°C )，真空度為50-200Pa，凍干時間為24-36 小時，即得到蓮葉細(xì)胞次生代謝物凍干粉。
[0018] 本發(fā)明所述的蓮葉細(xì)胞次生代謝物凍干粉在抗衰老護(hù)膚品中應(yīng)用。
[0019] 所述抗衰老扶護(hù)品為面膜、爽膚水、面霜、乳液、眼霜、洗面乳。
[0020] 所述蓮葉細(xì)胞次生代謝物凍干粉在抗衰老扶護(hù)品中的添加量為300-800 μ g/ml。
[0021] 本發(fā)明采用植物細(xì)胞培養(yǎng)法，通過剪碎代替打漿減少對細(xì)胞的損失，采用果膠酶 和纖維素酶聯(lián)合消化縮短消化時間的改進(jìn)，來獲得蓮葉細(xì)胞的次生代謝物，制作成凍干粉， 作為抗衰老化妝品。
[0022] 有益效果：
[0023] 1.簡化生產(chǎn)工藝，提供工作效率。將對原料進(jìn)行預(yù)處理、初提、大孔吸附樹脂分離、 有機(jī)溶劑純化和后處理的五個環(huán)節(jié)簡化了獲取細(xì)胞株、細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)物收集凍干的 三個環(huán)節(jié)，大大簡化生產(chǎn)步驟。
[0024] 2.提高了蓮葉細(xì)胞培養(yǎng)效率和質(zhì)量。通過使用果膠酶和纖維素酶聯(lián)合消化，縮短 細(xì)胞培養(yǎng)時間，同時使用剪刀代替攪拌機(jī)對蓮葉進(jìn)行分解，提高原始蓮葉細(xì)胞株的質(zhì)量，減 少蓮葉細(xì)胞株的損傷。
[0025] 3.產(chǎn)品生產(chǎn)量不受限于原材料的生產(chǎn)地區(qū)和季節(jié)，可長期穩(wěn)定生產(chǎn)。
[0026] 4.產(chǎn)品安全性高。培養(yǎng)全過程為無菌操作，也不使用有機(jī)溶劑，凍干粉中不會殘留 任何化學(xué)物質(zhì)和病菌。
[0027] 5、產(chǎn)品具有抗衰老效果。收集蓮葉細(xì)胞培養(yǎng)液并進(jìn)行凍干制備，有效保存蓮葉細(xì) 胞的次生代謝物中的黃酮成分，改凍干粉可