對小鼠結(jié)腸癌細胞MC38生長的抑制在較低濃度(100 μΜ)時就具有較明顯的作用，細胞存活率下降到65%左右；隨著4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷濃度的增加，細胞存活率繼續(xù)下降，但下降趨勢變緩；在500 μΜ時細胞存活率接近最低值，超過該劑量的處理不再使細胞存活率繼續(xù)降低，維持在一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)。
[0031](2)4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷對人結(jié)腸癌細胞HT29生長的抑制作用
[0032]藥物處理人結(jié)腸癌細胞HT29細胞48小時后，采用MTT法檢測細胞生長情況。以未加藥的對照組細胞數(shù)為100，對各組數(shù)據(jù)作統(tǒng)計學分析。
[0033]如圖4所示4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷對人結(jié)腸癌細胞HT29細胞的生長具有抑制作用；且呈現(xiàn)劑量梯度依賴性，活細胞數(shù)目隨4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷劑量的增大而減少。4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷對人結(jié)腸癌細胞HT29細胞生長的抑制在較低濃度(10uM)時并不十分明顯，細胞存活率保持在92%左右；但是隨著4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷濃度的增加，細胞存活率下降趨勢變得更為明顯；在5001^時細胞存活率接近最低值(約為43%)超過該劑量的處理不再使細胞存活率繼續(xù)降低，維持在一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)。
[0034]與不加藥的對照組相比，從200uM劑量開始，4-硫_5_ (2_噻吩基)尿苷對人結(jié)腸癌細胞HT29細胞的生長具有極顯著的抑制效果(P < 0.001)。相鄰低劑量組的數(shù)據(jù)對比顯示，從200uM開始，4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷對人結(jié)腸癌細胞HT29細胞生長的抑制作用隨劑量增加顯著增強(P <0.01)。值得注意的是，400uM劑量例外，顯示出一次下降速度變緩的趨勢；但隨著4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷劑量繼續(xù)增大到500uM，細胞存活率再度明顯降低。
[0035]實施例2 4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷抑制HT29有絲分裂并誘導細胞凋亡作用
[0036]為了研宄4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷抑制HT29增生的作用機理，發(fā)明人進一步檢測了 4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷對HT29細胞的細胞周期影響。用不同濃度梯度的4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷(O, 10uM, 200uM, 300uM, 400uM，500uM)處理 HT29 細胞 24 小時，流式細胞術檢測細胞周期變化情況。
[0037]1、細胞周期檢測
[0038]將HT29接種于6孔細胞培養(yǎng)板，5 X 15細胞/孔，培養(yǎng)過夜。次日，加入含不同濃度的4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷的培養(yǎng)液，2ml/孔，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，收集培養(yǎng)液(含有懸浮死細胞)于15ml離心管中。用0.25%胰蛋白酶消化各孔殘留的貼壁細胞，并將細胞與對應的已收集的培養(yǎng)上清合并。離心沉淀細胞，用70%冷乙醇固定細胞，RNA酶消化去除細胞內(nèi)RNA，加入碘化丙啶(50 μ g/ml)染色，流式細胞儀檢測細胞周期。
[0039]結(jié)果如圖5和圖6所示:低劑量的4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷10uM作用細胞24小時未能引起細胞周期的改變。但更高劑量的4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷即可導致G2期和有絲分裂期阻滯，并且這種阻滯作用呈劑量依賴性，從200uM劑量的10.85%上升至500uM的36.76 %。4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷對Gl期和S期的人結(jié)腸癌細胞HT29細胞數(shù)未見明顯影響。由于G2/M期的細胞已經(jīng)完成DNA復制，進行有絲分裂的細胞群體(含4nDNA)，所以該時期細胞的累積表明4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷對人結(jié)腸癌細胞HT29的細胞周期的影響是阻止細胞有絲分裂進程，從而發(fā)揮抑制腫瘤細胞增生的作用。
[0040]數(shù)據(jù)還顯示，人結(jié)腸癌細胞HT29經(jīng)4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷處理后，細胞內(nèi)DNA含量低于Gl期(亞Gl期)細胞群體逐漸增加，分別為:10.3% (對照組)、20.54% (10uM)、31.47% (200uM) ,40.46% (300uM) ,23.93% (400uM) ,44.63% (500uM)。Gl 期細胞 DNA 尚未進行復制，為正常的2nDNA，如果細胞DNA含量低于Gl期細胞，表示細胞內(nèi)有DNA降解發(fā)生，這是細胞凋亡的重要特征。因此亞Gl期細胞的增加顯示4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷誘導了人結(jié)腸癌細胞HT29的凋亡作用，并且這種作用低劑量的4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷(10uM)即可引起。本次實驗數(shù)據(jù)雖然隨著4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷劑量的增加，凋亡作用的總體趨勢是增強的；但并不呈嚴格的劑量依賴性，在400uM劑量時，細胞凋亡作用有所降低。
[0041 ] 綜上所述，流式細胞術檢測4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷對人結(jié)腸癌細胞HT29細胞周期的影響提示通過阻斷細胞有絲分裂和誘導細胞凋亡發(fā)生是4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷抑制結(jié)腸癌細胞增生的機制之一。實施例34-硫-5-(2-噻吩基)尿苷對正常人成纖維細胞增殖的影響
[0042]理想的抗腫瘤藥物應具有腫瘤特異性強，副作用小的特征。該類藥物能否影響正常組織細胞的增生和存活往往是決定該藥腫瘤特異性和副作用的關鍵因素。因此，發(fā)明人在證實了 4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷抑制人結(jié)腸癌腫瘤細胞HT29和小鼠結(jié)腸癌細胞MC38增生的基礎上，進一步探討對正常人細胞增生的影響。從正常成纖維細胞，加入不同濃度(OuM, 100uM、200uM、300uM、400uM、500uM)的 4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷處理成纖維細胞 48小時，做MTT摻入試驗。測定各組細胞的OD值并計算細胞增生率。
[0043]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常人成纖維細胞對4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷的敏感性低于腫瘤細胞，不同濃度的4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷對成纖維母細胞都沒有明顯的抑制作用，如圖7所示，4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷的抗腫瘤作用具有相對特異性。
[0044]綜上所述，4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷分別作用于MC38和HT2924h和48h后，4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷對結(jié)腸癌細胞生長的抑制作用隨劑量增加顯著增強。其對細胞的生長抑制率分別對濃度、時間依賴性；流式細胞術檢測4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷對HT29的結(jié)果表明4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷對人結(jié)腸癌細胞HT29的細胞周期的影響是阻止細胞有絲分裂進程，從而發(fā)揮抑制腫瘤細胞增生的作用。同時發(fā)現(xiàn)4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷對正常人成纖維細胞其敏感性低于腫瘤細胞，不同濃度的4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷對成纖維母細胞都沒有明顯的抑制作用。
【主權項】
1.4-硫-5-噻吩基尿苷在抗結(jié)腸癌細胞中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于:所述的4-硫-5-噻吩基尿苷可阻斷HT29細胞的有絲分裂抑制其增生，誘導細胞凋亡。
【專利摘要】本發(fā)明涉及4-硫-5-噻吩基尿苷在抗結(jié)腸癌細胞中的應用，屬于生物醫(yī)藥領域，4-硫-5-噻吩基尿苷的一種新用途即在抗結(jié)腸癌細胞中的應用，所述的4-硫-5-噻吩基尿苷可阻斷HT29細胞的有絲分裂抑制其增生，誘導細胞凋亡。4-硫-5-噻吩基尿苷可發(fā)揮抑制腫瘤細胞增生的作用，4-硫-5-噻吩基尿苷對正常人成纖維細胞其敏感性低于腫瘤細胞，具有相對特異性，有潛在的臨床應用價值，在人抗結(jié)腸癌細胞方面有很好的應用前景。
【IPC分類】A61P35-00, A61K31-7072
【公開號】CN104706652
【申請?zhí)枴緾N201510083456
【發(fā)明人】張曉輝, 馬克東, 李德鵬, 赫靈爽
【申請人】大連大學
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年2月16日