一種透明質(zhì)酸共價(jià)連接靶向性穿膜肽和活性藥物的水溶性前藥及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種靶向性水溶性前藥及其制備方法，尤其涉及一種透明質(zhì)酸共價(jià)連 接靶向性穿膜肽和活性藥物的水溶性前藥及其制備方法，屬于藥物制劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 水溶性前藥應(yīng)用具有生物降解性的高分子材料，通過共價(jià)鍵連接疏水部分和親水 部分，由于水溶性部分比例較大，且能夠?qū)⑹杷幬锓肿游锢戆谳d體中，使得整體具 有良好親水性。腫瘤血管通透性高又缺乏有效的淋巴引流，大分子結(jié)構(gòu)能夠進(jìn)入腫瘤組 織，又被腫瘤組織截留。這種使大分子在腫瘤組織增強(qiáng)滲透和滯留的效應(yīng)稱為EPR效應(yīng) (enhanced permeability and retention effect)。自組裝形成的藥物遞送系統(tǒng)能夠利用 高分子載體的EPR效應(yīng)達(dá)到被動靶向的作用。
[0003] 透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA)是一種大分子糖胺聚糖，是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì) (ECM)和細(xì)胞間質(zhì)（ICM)的主要成分，塵物相容性好。HA基本上為化學(xué)惰性物質(zhì)，同大多數(shù) 化學(xué)物質(zhì)具有相容性。且細(xì)胞膜HA結(jié)合蛋白（膜表面受體）CD44在腫瘤細(xì)胞表面的含量 比正常細(xì)胞高出多倍，因此HA有一定的靶向腫瘤細(xì)胞的功能。HA作為載體材料，能夠控制 藥物釋放速度，起到緩釋的效果。
[0004] 穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs)是一類具有高效穿過細(xì)胞膜而不損 傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)的多肽。一般具有水溶性，故性質(zhì)比較穩(wěn)定。多數(shù)研宄證明CPPs 在常規(guī)的用量范圍內(nèi)基本沒有毒性。CPPs可以攜帶多種活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，已經(jīng)在介導(dǎo) 基因、蛋白質(zhì)、多肽、小分子、納米顆粒和脂質(zhì)體等穿透各種細(xì)胞膜方面發(fā)揮了巨大作用。 tLyP-Ι為水溶性穿膜肽，具有良好的穿透細(xì)胞膜的能力，在介導(dǎo)載藥脂質(zhì)體、納米粒等穿透 細(xì)胞膜治療疾病方面均有相關(guān)研宄應(yīng)用。其序列為CGNKRTR。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種透明質(zhì)酸共價(jià)連接靶向性穿膜肽和活性藥物的水溶性前藥，它 主要是由以下重量份比例的原料所制成：
[0006] 1份活性藥物、7. 5-15份透明質(zhì)酸、0. 375-0. 75份靶向性穿膜肽。
[0007] 優(yōu)選地，上述靶向性水溶性前藥主要是由以下重量份比例的原料所制成：
[0008] 1份活性藥物、7. 5-15份透明質(zhì)酸、0. 375-0. 75份靶向性穿膜肽。
[0009] 優(yōu)選地，所述的活性藥物為紫杉醇。
[0010] 優(yōu)選地，所述的靶向性穿膜肽為tLyP-1。
[0011] 優(yōu)選地，所述的透明質(zhì)酸為分子量為5000、9000、12000透明質(zhì)酸中的一種。
[0012] 本發(fā)明還提供了上述靶向性水溶性前藥的制備方法，它主要是由如下步驟所組 成：
[0013] (1)用甲酰胺溶液溶解透明質(zhì)酸，加入4-二甲氨基吡啶催化，加入用N，N-二甲基 甲酰胺溶解的活性藥物，55-60°C下反應(yīng)6h ;
[0014] (2)透析除去雜質(zhì)；凍干后水復(fù)溶，加入靶向性穿膜肽，加入1-(3-二甲氨基丙 基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺催化，25 °C反應(yīng)4h ;
[0015] (3)透析，過濾；凍干，即得。
[0016] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所得的靶向性水溶性前藥，由于采用透明質(zhì)酸作為主要 載體材料、采用靶向性穿膜肽修飾、連接活性藥物成前藥：（1)載體材料生物相容性好；（2) 水溶性好，結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定；（3)冷凍干燥不需要添加凍干保護(hù)劑，所得凍干粉，再溶解后，與 冷凍干燥前相比，溶解性、載藥量變化很??；(4)具有對于腫瘤細(xì)胞的靶向性，且穿透細(xì)胞 膜的能力增強(qiáng)。
【附圖說明】
[0017] 圖1透明質(zhì)酸的核磁共振氫譜圖；
[0018] 圖2水溶性前藥的核磁共振氫譜圖；
[0019] 圖3透明質(zhì)酸的紅外光譜圖；
[0020] 圖4不含有靶向穿膜肽的水溶性前藥的紅外光譜圖；
[0021] 圖5連接靶向穿膜肽的水溶性前藥的紅外光譜圖 具體實(shí)施方案：
[0022] 實(shí)施例1
[0023] 處方：lmg紫杉醇、15mg分子量9000透明質(zhì)酸、0· 75mg tLyP-1。
[0024] 制備工藝：
[0025] (1)用3ml甲酰胺溶液溶解透明質(zhì)酸，加入5mg 4-二甲氨基吡啶催化，加入用50ul N，N-二甲基甲酰胺溶解的活性藥物，55-60°C下反應(yīng)6h ;
[0026] (2)透析除去雜質(zhì)；凍干后水復(fù)溶，加入I. 5mg tLyP-1，加入6mg 1-(3-二甲氨基 丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和I. 2mg N-羥基琥珀酰亞胺催化，25°C反應(yīng)4h ;
[0027] (3)透析，0.22Um微孔濾膜過濾；凍干，即得。
[0028] 實(shí)施例2
[0029] 處方：lmg紫杉醇、7. 5mg分子量9000透明質(zhì)酸、0· 75mg tLyP-1。
[0030] 制備工藝：
[0031] (1)用3ml甲酰胺溶液溶解透明質(zhì)酸，加入5mg 4-二甲氨基吡啶催化，加入用50ul N，N-二甲基甲酰胺溶解的活性藥物，55-60°C下反應(yīng)6h ;
[0032] (2)透析除去雜質(zhì)；凍干后水復(fù)溶，加入I. 5mg tLyP-1，加入6mg 1-(3-二甲氨基 丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和I. 2mg N-羥基琥珀酰亞胺催化，25°C反應(yīng)4h ;
[0033] (3)透析，0· 22um微孔濾膜過濾；凍干，即得。
[0034] 實(shí)施例3
[0035] 處方：lmg紫杉醇、7. 5mg分子量9000透明質(zhì)酸、0· 325mg tLyP-1。
[0036] 制備工藝：
[0037] (1)用3ml甲酰胺溶液溶解透明質(zhì)酸，加入5mg 4-二甲氨基吡啶催化，加入用50ul N，N-二甲基甲酰胺溶解的活性藥物，55-60°C下反應(yīng)6h ;
[0038] (2)透析除去雜質(zhì)；凍干后水復(fù)溶，加入I. 5mg tLyP-1，加入6mg 1-(3-二甲氨基 丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和I. 2mg N-羥基琥珀酰亞胺催化，25°C反應(yīng)4h ;
[0039] (3)透析，0.22Um微孔濾膜過濾；凍干，即得。
[0040] 實(shí)施例4
[0041] 處方：lmg紫杉醇、15mg分子量5000透明質(zhì)酸、0· 75mg tLyP-1。
[0042] 制備工藝：
[0043] (1)用3ml甲酰胺溶液溶解透明質(zhì)酸，加入5mg 4-二甲氨基吡啶催化，加入用50ul N，N-二甲基甲酰胺溶解的活性藥物，55-60°C下反應(yīng)6h ;
[0044] (2)透析除去雜質(zhì)；凍干后水復(fù)溶，加入I. 5mg tLyP-1，加入6mg 1-(3-二甲氨基 丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和I. 2mg N-羥基琥珀酰亞胺催化，25°C反應(yīng)4h ;
[0045] (3)透析，0· 22um微孔濾膜過濾；凍干，即得。
[0046] 實(shí)施例5
[0047] 處方：lmg紫杉醇、15mg分子量12000透明質(zhì)酸、0· 75mg tLyP-1。
[0048] 制備工藝：
[0049] (1)用3ml甲酰胺溶液溶解透明質(zhì)酸，加入5mg 4-二甲氨基吡啶催化，加入用50ul N，N-二甲基甲酰胺溶解的活性藥物，55-60°C下反應(yīng)6h ;
[0050] (2)透析除去雜質(zhì)；凍干后水復(fù)溶，加入I. 5mg tLyP-1，加入6mg 1-(3-二甲氨基 丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和I. 2mg N-羥基琥珀酰亞胺催化，25°C反應(yīng)4h ;
[0051] (3)透析，0· 22um微孔濾膜過濾；凍干，即得。
[0052] 實(shí)驗(yàn)例
[0053] 按照市售紫杉醇注射劑制備方法制備紫杉醇注射液，設(shè)為市售對照組；按照本發(fā) 明處方和制備方法制備不含有靶向穿膜肽的水溶性前藥，即除不含有靶向穿膜肽，所有處 方和制備方法均按照本發(fā)明所記載，所得納米粒設(shè)為無穿膜肽對照組；取市售制劑、無穿膜 肽水溶性前藥和水溶性前藥制劑配置成PTX濃度為lmg/ml的5%葡萄糖溶液。
[0054] 1、結(jié)構(gòu)表征
[0055] I. 1核磁共振氫譜表征1H-NMR
[0056] 分別取適量透明質(zhì)酸、不含有靶向穿膜肽的水溶性前藥溶于D20,500MHz頻率照 射，20°C下Bruker (AVACE) AV-500型核磁共振儀記錄圖譜。以12000分子量透明質(zhì)酸為例， 其核磁共振氫譜圖如圖2和圖3所示：透明質(zhì)酸（D2O)的特征峰出現(xiàn)在2. Olppm和3. 28~ 4. 75ppm，與透明質(zhì)酸圖譜相比，不含有靶向穿膜肽的水溶性前藥（D20)氫譜中，在7.0~ 8. 2ppm處出現(xiàn)的紫杉醇苯環(huán)特征峰，說明HA-PTX偶聯(lián)物水溶性前藥的形成。
[0057] L 2、紅外光譜表征FT-IR
[0058] 分別取透明質(zhì)酸、不含有靶向穿膜肽的水溶性前藥、水溶性前藥適量，采用KBr 壓片法，用FT-IR Nicolet 2000型紅外光譜儀記錄紅外光譜。以12000分子量透明質(zhì)酸 tLyP-Ι為例，其紅外譜圖如圖3、圖4和圖5所示：
[0059] 當(dāng)PTX通過酯鍵與HA偶聯(lián)后，1690CHT1處出現(xiàn)新的伸縮振動峰，這是山于引入的 紫杉醇中PTX的2'-OH同HA之間生成酯鍵（-(CO)-O-)的原因；另外，1415和709cm- 1處出 現(xiàn)特征峰為PTX的苯環(huán)上雙鍵（-C = C-)的伸縮振動所致。所有結(jié)果說明PTX成功偶合到 HA骨架上。
[0060] 當(dāng)穿膜肽通過酰胺鍵與HA偶聯(lián)后，HA羧基的伸縮振動峰（0)0-,1613(31^1)消 失，而在1654CHT 1處出現(xiàn)一個新的吸收峰，這是由于新形成了酰胺鍵（-NHC0-)的結(jié)構(gòu)；而 1690CHT1處出現(xiàn)新的伸縮振動峰，這是由于引入的紫杉醇中PTX的2'-OH同HA之間生成酯 鍵（-(CO)-O-)的原因；另外，1415和709CHT 1處出現(xiàn)特征峰為PTX的苯環(huán)上雙鍵（-C = C-) 的伸縮振動所致。所有結(jié)果說明穿膜肽成功偶合到HA骨架上。
[0061] 2、穩(wěn)定性比較結(jié)果見表1
[0062] 放置條件：4 °C冷藏放置。
[0063] 表1本發(fā)明所得水溶性前藥在溶液中穩(wěn)定性考察
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種透明質(zhì)酸共價(jià)連接靶向性穿膜肽和活性藥物的水溶性前藥，其特征在于，其分 子結(jié)構(gòu)式如下：
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向性水溶性前藥，其特征在于，它的分子結(jié)構(gòu)式中，紫杉醇 與透明質(zhì)酸通過酯鍵相連，透明質(zhì)酸與穿膜肽通過酰胺鍵相連。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向性水溶性前藥，其特征在于，它主要是由以下重量份比 例的原料所制成： 1份活性藥物、7. 5-15份透明質(zhì)酸、0. 375-0. 75份靶向性穿膜肽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向性水溶性前藥，其特征在于，所述的活性藥物為紫杉醇。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向性水溶性前藥，其特征在于，所述的靶向性穿膜肽為 tLyP-1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向性水溶性前藥，其特征在于，所述的透明質(zhì)酸為分子量 為5000、9000、12000透明質(zhì)酸中的一種。
7. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述靶向性水溶性前藥的制備方法，其特征在于，它主要是由 如下步驟所組成： (1) 用甲酰胺溶液溶解透明質(zhì)酸，加入4-二甲氨基吡啶催化，加入用N，N-二甲基甲酰 胺溶解的活性藥物，55-60°C下反應(yīng)6h ; (2) 透析除去雜質(zhì)；凍干后水復(fù)溶，加入靶向性穿膜肽，加入1-(3-二甲氨基丙 基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺催化，25 °C反應(yīng)4h ; (3) 透析，過濾；凍干，即得。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種透明質(zhì)酸共價(jià)連接靶向性穿膜肽和活性藥物的水溶性前藥及其制備方法，它是由以下重量份比例的原料所制成：1份活性藥物、7.5-15份透明質(zhì)酸、0.375-0.75份靶向性穿膜肽。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所得的靶向性水溶性前藥，由于采用透明質(zhì)酸作為主要載體材料、采用靶向性穿膜肽修飾、連接活性藥物成前藥：(1)載體材料生物相容性好；(2)水溶性好，且溶液中更加穩(wěn)定；(3)冷凍干燥不需要添加凍干保護(hù)劑，所得凍干粉，再溶解后，與冷凍干燥前相比，溶解性、載藥量變化很小；(4)具有對于腫瘤細(xì)胞的靶向性，且穿透細(xì)胞膜的能力增強(qiáng)。
【IPC分類】A61K31-337, A61P35-00, A61K47-48, A61K9-19
【公開號】CN104721831
【申請?zhí)枴緾N201510053234
【發(fā)明人】周建平, 王蔚芹, 呂慧俠
【申請人】中國藥科大學(xué)
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年1月28日