小分子抑制劑及在抑制鳥氨酸脫羧酶(odc)上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種鳥氨酸脫羧酶（ODC)的小分子抑制劑及其應(yīng) 用；具體涉及人源鳥氨酸脫羧酶的小分子抑制劑及其在抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)是生物體的主要組成成分之一，是完成各種生命活動(dòng)的主要物質(zhì)。在各種 蛋白質(zhì)中，蛋白酶對(duì)生命活動(dòng)至關(guān)重要，幾乎所有生物體內(nèi)的生化反應(yīng)過程都由蛋白酶進(jìn) 行催化。生物體內(nèi)各種蛋白酶的活性具有嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制，一旦其調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)問題，造成 蛋白酶的活性過高、過低或者是完全失活，都會(huì)造成相應(yīng)的各類疾病。因此，通過藥物來調(diào) 控蛋白酶的活性，使其恢復(fù)和保持在正常水平，具有非常重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。以結(jié) 構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計(jì)，是設(shè)計(jì)以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的藥物的一個(gè)非常重要的手段。
[0003] 多胺（polyamines)是一類從氨基酸代謝產(chǎn)生的帶正電的陽離子小分子，在所有 生物體中都存在，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、存活及正常生物學(xué)功能等都不可缺少。多胺帶多正電 荷的特性，使它們能通過與帶負(fù)電荷的生物大分子（DNA、RNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜等）形成靜 電作用，從而調(diào)控非常廣泛的生物學(xué)過程，包括染色體結(jié)構(gòu)形成、DNA合成與穩(wěn)定、DNA復(fù) 制、轉(zhuǎn)錄和翻譯、蛋白質(zhì)磷酸化、核糖體生成、離子通道和膜表面受體的調(diào)控、自由基清除 等。天然的多胺有很多種。在哺乳動(dòng)物中，天然存在的有三種，即腐胺（putrescine)，精脒 (spermidine),精胺（spermine),它們對(duì)哺乳動(dòng)物正常生長(zhǎng)和發(fā)育必不可少。由于多胺具有 重要的生物學(xué)功能，其細(xì)胞內(nèi)水平受到嚴(yán)格的調(diào)控。在快速繁殖的細(xì)胞中，如腫瘤細(xì)胞，多 胺水平及ODC表達(dá)水平也會(huì)上升和失調(diào)。多胺水平升高，伴隨著細(xì)胞增殖加快、凋亡減少、 以及腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)水平升高等。因此，多胺的調(diào)控，成為腫瘤治療和藥物 研發(fā)中的一個(gè)重要手段。
[0004] 多胺代謝的起始底物是鳥氨酸（ornithine)，它是精氨酸在尿素循環(huán)（urea cycle)中被精氨酸酶（arginase)催化的反應(yīng)產(chǎn)物。ODC是多胺合成途徑的第一個(gè)酶，催化 從鳥氨酸（ornithine)到腐胺的反應(yīng)，該步催化反應(yīng)也是多胺合成途徑的一個(gè)限速步驟。 因此，合成ODC抑制劑，抑制腐胺的生成，是目前很受關(guān)注的一個(gè)腫瘤治療途徑。同時(shí)，由于 病原微生物也需要正常的多胺水平，ODC抑制劑也成為針對(duì)病原微生物（如導(dǎo)致非洲錐蟲 病的布氏錐蟲）的重要靶標(biāo)。
[0005] 當(dāng)前，ODC的抑制劑DFM0(a-二氟甲基鳥氨酸）已經(jīng)被用于臨床，輔助癌癥的化 療。但其與ODC的結(jié)合能力較弱，作用濃度很高，且由于是與ODC形成共價(jià)鍵的自殺性抑制 劑，毒副作用非常大。因此，非常有必要開發(fā)出具有更好效果的ODC新型抑制劑。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的目的是通過計(jì)算機(jī)輔助的高通量藥物篩選，提供一種針對(duì)ODC的新型小 分子抑制劑，將其應(yīng)用于鳥氨酸脫羧酶的抑制劑，可能可以用作制備治療腫瘤、病原微生物 感染的藥物。具體為：
[0007] -種小分子抑制劑，其特征在于，該小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種小分子抑制劑，其特征在于，該小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：
I
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子抑制劑，其特征在于，該小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：
3. 權(quán)利要求1所述的小分子抑制劑在抑制鳥氨酸脫羧酶（ODC)上的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求1中所述的小分子抑制劑在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求1中所述的小分子抑制劑在制備治療病原微生物感染藥物中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1-5所述的任一小分子抑制劑抑制鳥氨酸脫羧酶（ODC)的方法，其特征在 于，包括如下步驟： 1. ODC原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將ODC的基因序列，通過BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)，插入到pET28a質(zhì)粒中，構(gòu)建出 pET28a_h0DC質(zhì)粒，經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證； 2. ODC蛋白的表達(dá) 將步驟1)構(gòu)建的pET28a-h0DC質(zhì)粒通過CaCl2法，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株中，通過 卡那霉素進(jìn)行篩選，然后將在含有卡那霉素的Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)板上生長(zhǎng)的菌株， 接種至含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、250rpm培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，再添加異丙 基硫代半乳糖苷（IPTG)至0. 5mM，在28°C誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)，最后，離心收集細(xì)菌； 3. ODC蛋白的純化 將步驟2)中收集的細(xì)菌，用裂解液重新懸浮，然后通過超聲方法進(jìn)行細(xì)胞裂解，再將 裂解液在4°C、12000轉(zhuǎn)/min，離心后，保留上清；最后將上清利用Ni-NTA His標(biāo)簽蛋白結(jié) 合填料進(jìn)行結(jié)合和純化，得到ODC蛋白，ODC蛋白的洗脫緩沖液為50mM三羥甲基氨基甲烷 (Tris)/HCl，pH 8.0, 300mM NaCl，ImM DTT，IOOmM 咪唑（imidazole); 4. ODC蛋白的活性檢測(cè) 在EP管中，加入400uL底物反應(yīng)混合物、50ug的ODC蛋白，混勻后將EP管放置在37°C 水浴中30min ;加入400uL 10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，室溫離心5000rpm、5min，然后取出 IOOuL上清，與200uL 4mol/L的NaOH溶液混合，加入400uL正戊醇，充分混合，2000rpm離 心5min，再將上層液200uL轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入200uL0.1mol/LpH為8. O的四硼酸鈉 混合均勻、加入200uL10mmol/L三硝基苯磺酸混合充分、加入400uL DMS0,充分混合lmin， 3000rpm離心5min ;最后取出上層液到96孔板中，用酶標(biāo)儀檢測(cè)426nm處的吸光值，得到未 加酶的OD值 5)抑制劑對(duì)ODC蛋白的抑制活性的檢測(cè) 根據(jù)步驟4)中所述的方法，在加入400uL底物反應(yīng)混合物后，隨即加入鳥氨酸脫羧酶 的小分子抑制劑，后續(xù)操作同步驟4); 通過以下公式計(jì)算出ODC抑制率： 對(duì)照差=加小分子抑制劑對(duì)照組平均OD值-未加小分子抑制劑對(duì)照組平均OD值，其 中對(duì)照組在步驟5)中加入的抑制劑為DFMO抑制劑； 實(shí)驗(yàn)差=加小分子抑制劑實(shí)驗(yàn)組平均OD值-未加小分子抑制劑實(shí)驗(yàn)組組平均OD值； ODC抑制率=[(對(duì)照差-實(shí)驗(yàn)差）/對(duì)照差]X 100 %。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：步驟3)中所述的裂解液為50mM三羥甲 基氨基甲烷（Tris)/HCl，pH 8.0, 300mM NaCl，ImM DTT，ImM PMSF，5mM 咪唑（imidazole)的 混合液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6中所述的方法，其特征在于：步驟4)中的底物反應(yīng)混合物為在 150mM pH為7. 1的磷酸鹽緩沖液（PBS)中溶解17. 57ul β -巰基乙醇，55. 84mg I. 5mM EDTA 二鹽鈉，75nM磷酸吡哆醛（PLP)儲(chǔ)液，2mM鳥氨酸鹽酸鹽。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述的鳥氨酸脫羧酶為人源鳥氨酸脫羧 酶、非人源鳥氨酸脫羧酶或與人源鳥氨酸脫羧酶的腐胺底物及磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)高度同 源的蛋白質(zhì)。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種鳥氨酸脫羧酶(ODC)的小分子抑制劑及其應(yīng)用；通過計(jì)算機(jī)輔助的高通量藥物篩選，發(fā)現(xiàn)針對(duì)鳥氨酸脫羧酶(ODC)的新型小分子抑制劑，驗(yàn)證其效果，發(fā)現(xiàn)對(duì)ODC具有良好的抑制作用，尤其可用于抑制人源ODC，預(yù)防、治療和診斷腫瘤疾病、病原微生物感染，研發(fā)制備腫瘤藥物或病原微生物感染類藥物。
【IPC分類】A61K31-53, A61P35-00, C12N9-88, C12Q1-527, A61P31-00, C12N15-70
【公開號(hào)】CN104739838
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410522192
【發(fā)明人】劉森, 占景瓊, 王艷林
【申請(qǐng)人】三峽大學(xué)
【公開日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2014年9月30日