植物萃取物和治療肝臟纖維化與肝癌的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及石蓮花 Graptopetalum paraguayense (N. E. Br. ) E. Walther 的活性級 分，尤其石蓮花萃取物和其生產(chǎn)的方法與其用途的領域。
【背景技術】
[0002] 石蓮花（GP)是外觀類似蓮花（蓮座叢）的藥用植物。但是，其葉子具有抗旱性。 因此，其稱為石蓮花（stone lotus)或風車草（Cyperus alternifolius)。其屬于景天科 風車草屬（Crassulaceae Graptopetalum)。其是多年生肉質(zhì)植物。所述植物光滑并且厚 實。顏色為粉白色且葉子聚集于莖的頂端；葉子不含莖，其中倒卵形的配置類似蓮花（蓮座 叢），給予其名稱石蓮花。植物在春季和秋季偶爾開出小白花?？沙鲇谟^賞目的或出于藥用 用途栽培GP。
[0003] 認為GP在減輕肝臟功能障礙、降低血壓、增白皮膚、緩解疼痛和感染、抑制炎癥和 改善大腦功能方面具有潛在有益的效果。
[0004] GP富含灰物質(zhì)和各種養(yǎng)分，如膳食纖維、鈉、鈣、鉀、鎂、鐵、維生素C、維生素B1、維 生素B2、維生素B6、葉酸、煙酸以及0-胡蘿卜素。其是可食用植物。其藥理活性包括復原 肝細胞、改善免疫功能、減輕脆弱血管和異常滲透性、預防如高血壓、動脈硬化、慢性肝炎以 及肝硬化等各種疾病。
[0005] 研宄GP作為食品補充劑用于控制患有高脂血癥的人中的脂質(zhì)含量（食品農(nóng)業(yè)科 學雜志（J Sci Food Agric. )2011年5月；91 (7) :1230-5)。在臨床試驗中，每日給予18位高 脂血癥個體100g的新鮮GP。在八周之后，評估測試個體的血清指標和血液分析。結(jié)果顯示 GP攝取可實質(zhì)上增加身體中的抗氧化劑活性（血液中的抗壞血酸和a -生育酚的含量增加 并且丙二醛的含量降低；紅血球中的麩胱甘肽濃度增加；麩胱甘肽過氧化酶和過氧化氫酶 活性也增加）。已發(fā)現(xiàn)，來自GP的50%乙醇萃取物的乙酸乙酯再萃取的產(chǎn)物在患有中風的 大鼠中具有神經(jīng)保護作用（美國中醫(yī)藥雜志（Am. J. Chin. Med. )，2010, 38(3) :495-516)。
[0006] 臺灣研宄人員還發(fā)現(xiàn)GP可抑制肝炎和由二甲基亞硝氨（dimethylnitrosamine ; DMN)或四氯化碳（CCl4)誘發(fā)的肝臟纖維化。在肝臟纖維化的活體外細胞研宄中已發(fā)現(xiàn)： (1) GP-W可抑制肝臟星狀細胞（h印atic stellate cell ;HSC)的生長或誘發(fā)其細胞凋亡； (2) GP萃取物與對照組相比可延遲庫普弗（Kupffer)細胞的老化；（3) GP萃取物可抑制庫普 弗細胞中的脂多糖（1丨口(^〇1788(^1^1^(16;1^5)誘發(fā)的炎癥，導致1即-€ [和11-6的較低表 達。
[0007] GP活性成分一直是若干專利申請案的主題，所述申請案包括TW專利申請公 開案第TW200616655號（風車草屬和相關植物的醫(yī)藥用途（Pharmaceutical use of Graptopetalum and related plants))，其對應于美國專利第7, 364, 758號；美國專利 申請公開案第US 2012/259004A1號（抗癌萃取物和化合物（Anti-cancer extract and compounds));臺灣專利申請公開案第TW201219047號（抗癌萃取物和化合物）；以及中國 專利申請公開案第CN103269706號（抗癌萃取物和化合物）。
[0008] 在美國專利第7, 364, 758號（"風車草屬和相關植物的醫(yī)藥用途"）中，使用水、乙 醇、丙酮、甲醇或其混合物作為溶劑來獲得GP花萃取物，而醫(yī)藥用途是用于治療或預防選 自由肝炎癥、肝臟脂肪變性、肝纖維化、肝臟硬化及B型肝炎組成的群組的疾病。使用極性 溶劑獲得' 758專利中所披露的萃取物。
[0009] 專利申請案"抗癌萃取物和化合物"主要涉及風車草屬（Graptopetalum sp.)、紅 景天屬（Rhodiola sp.)或擬石蓮花屬（Echeveria sp.)。在這些申請案中，使用Sephadex LH20管柱色譜法進一步純化DMSO萃取物以分離HH-F3, HH-F3為具有約18kD的分子重量 的原花青素化合物。但是，使用管柱色譜法使得具有大規(guī)模生產(chǎn)變得不切實際。另外，管柱 溶離需要大量有機溶劑，并且用于濃縮溶離份的必要方法也是昂貴的。
[0010] 雖然這些先前技術披露內(nèi)容顯示GP萃取物具有有益的藥用用途并且先前技術方 法可產(chǎn)生具有良好活性的GP萃取物，但仍需要用于制備GP萃取物的較好方法，尤其適用于 經(jīng)濟的大規(guī)模生產(chǎn)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的實施例涉及新的藥劑，即，GP活性成分的萃取物，以及其制備方法與用 途。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可通過有機溶劑萃取、隨后使用切向流過濾（tangential flow filtration ;TFF)系統(tǒng)純化來獲得GP萃取物。TFF純化方法依賴于透析，與特定透析溶液 一起使用以制備活性植物萃取物。這種方法與管柱純化相比較適用于大規(guī)模生產(chǎn)，并且其 因為其避免較大體積的溶劑的成本以及在使用管柱色譜法時與濃縮溶劑相關的成本而較 經(jīng)濟。
[0012] 本發(fā)明的一些實施例涉及用于分離和純化的化學制備方法的用途以及用于保護 肝功能與預防肝損害、肝纖維化、肝臟硬化和用于治療肝癌的天然產(chǎn)物。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，一種制備活性萃取物級分的方法可包括用甲醇萃取以移除 可溶組分，并且接著用30% DMSO萃取殘余物以獲得活性萃取物。接著使用適合的分子量截 斷膜（例如5kD截斷值）使活性萃取物經(jīng)歷超濾，如切向流過濾（TFF)。濃縮由過濾膜截留 的活性級分以獲得被部分純化的活性級分，其可用于保護肝功能并且用于預防和治療肝損 害、肝纖維化、肝（肝臟）硬化、術后肝纖維化復發(fā)以及術后肝癌復發(fā)。
[0014] 活性級分含有聚合鞣酸，所述聚合鞣酸包含一或多種選自由（-)_表兒茶素、 (_) _表沒食子兒茶素、（_)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯、以及（_) _表兒茶素-3-0-沒食子 酸酯組成的群組的酚類化合物，以及一或多種選自由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、葡 糖醛酸以及半乳糖醛酸等組成的群組的糖。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，主要組分包括由具有（-)-表沒食子兒茶素沒食子酸 酯作為終端單元的化合物或具有（-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯作為主要單元的化合物 組成的聚合鞣酸。
[0016] 在一個方面中，本發(fā)明的實施例涉及制備石蓮花萃取物的方法。根據(jù)本發(fā)明的一 個實施例的方法可包括以下步驟：用酒精溶劑（例如甲醇或乙醇）萃取石蓮花（GP)起始物 質(zhì)以產(chǎn)生酒精萃取物和殘余物；使所述殘余物與所述酒精萃取物分離；用二甲亞砜（DMSO) 水溶液溶劑萃取所述殘余物以產(chǎn)生DMSO萃取物；使用具有選定的分子量截斷值的過濾器 使所述DMSO萃取物經(jīng)歷超濾；干燥由所述過濾器截留的級分以獲得所述石蓮花萃取物。GP 起始物可以是GP的葉子的粉末。二甲亞砜（DMSO)水溶液溶劑含有約30% DMSO。在超濾 之前用水將DMSO萃取物稀釋到約10% DMS0。超濾可使用切向流過濾系統(tǒng)來進行。選定的 分子量截斷值可為約5kD。所述方法可進一步包含在超濾之前過濾DMSO萃取物。
[0017] 在本發(fā)明的另一方面中，本發(fā)明的實施例涉及石蓮花萃取物的用途，其用于治療 或預防肝纖維化、肝臟硬化、肝癌、術后肝纖維化復發(fā)或術后肝癌復發(fā)。
[0018] 鑒于附圖和以下描述，本發(fā)明的其它方面將是顯而易見的。
【附圖說明】
[0019] 圖1顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的GP活性萃取物的制備方法的流程圖。
[0020] 圖2顯示與標準品相比的GP-T萃取物的HPLC概況。
[0021] 圖3顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的GP-T活性級分的MALDI-T0F質(zhì)譜。
[0022] 圖4顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的GP-T活性級分的13C-NMR譜。
[0023] 圖5A顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的GP-T活性級分的LC/MS分析。
[0024] 圖5B顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的GP-T活性級分的MS/MS分析。
[0025] 圖5C顯示GP-T活性級分的MS/MS分析的概述。
[0026] 圖6A顯示陰離子色譜中的標準碳水化合物的概況。
[0027] 圖6B顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的GP-T的碳水化合物分析的概況。
[0028] 圖7A顯示根據(jù)本發(fā)明的實施例的GP-T萃取物的肝癌細胞抑制。
[0029] 圖7B顯示根據(jù)本發(fā)明的實施例的GP-T萃取物的腫瘤蛋白表達抑制。
[0030] 圖7C顯示圖7A和圖7B的測試的概述結(jié)果。
[0031] 圖8A顯示使用生物分析系統(tǒng)研宄GP-T制備方法的結(jié)果。
[0032] 圖8B顯示根據(jù)本發(fā)明的實施例使用生物分析來確認制備方法。
[0033] 圖9A顯示根據(jù)本發(fā)明的實施例的在用GP-T治療期間的體重變化。
[0034] 圖9B顯示根據(jù)本發(fā)明的實施例的GP-T萃取物抑制腫瘤形成的結(jié)果。
[0035] 圖IOA顯示根據(jù)本發(fā)明的實施例使用各種藥劑治療的血清玻尿酸含量。
[0036] 圖IOB顯示根據(jù)本發(fā)明的實施例使用各種藥劑治療的血清層粘連蛋白含量。
[0037] 圖IOC顯示根據(jù)本發(fā)明的實施例的使用各種藥劑治療的血清原膠原-3N端肽 (procollagen-3N-terminal peptide ;P3NP)含量。
[0038] 圖IlA顯示根據(jù)本發(fā)明的實施例通過用GP-T治療的組織病理學評分的降低。
[0039] 圖IlB顯示病變的各個階段的病理染色。
[0040] 圖12A顯示病理切片的a -SMA染色。
[0041] 圖12B顯示a -SMA染色的定量和GP-T治療的效果。
[0042] 圖13A顯示病理切片的H/E染色。
[0043] 圖13B顯示各個治療組的肝病理癥狀的概述。
[0044] 圖14A為各個治療組的體重變化。
[0045] 圖14B顯