錦燈籠宿萼皂苷在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及以錦燈籠宿萼皂苷在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 錦燈籠（Physalis alkekengi, L. var. francheti (Mast. ) Makino )又名紅姑娘、 掛金燈、紅燈籠、燈籠果，為爺科（Solanaceae)酸楽屬植物，廣泛分布于歐亞大陸，如俄 羅斯、中國(guó)、日本以及朝鮮等國(guó)家。錦燈籠為帶果實(shí)的宿萼，秋季果實(shí)成熟，果實(shí)球形、味 甘、微酸，可作水果，營(yíng)養(yǎng)豐富；宿萼微苦，成熟時(shí)呈紅色或橙紅色。錦燈籠果實(shí)不僅可 以食用，而且是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥。錦燈籠含有內(nèi)酯類(lèi)、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、生物堿類(lèi)、留醇類(lèi)、氨 基酸類(lèi)及無(wú)機(jī)元素等幾大類(lèi)化學(xué)成分。已有的研究表明，錦燈籠有多方面的藥理作用，如 酸漿苦素B是錦燈籠的主要抗炎成分，常用于上呼吸道感染疾病的治療；木犀草素對(duì)心血 管系統(tǒng)、祛痰及體外抗柯薩奇均具較好療效。然而有關(guān)錦燈籠宿萼皂苷抗腫瘤活性的研究 尚未見(jiàn)報(bào)道，我們發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤作用明顯，是一種有開(kāi)發(fā)前途的抗腫瘤藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供了錦燈籠宿萼皂苷在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明提供的化合物的制備方法為：將干燥的成熟錦燈籠宿萼粉碎，乙醇浸泡過(guò) 夜；水浴回流提取，過(guò)濾，取上清，共提取3次；將3次的濾液合并，離心，取上清棄沉 淀；將上清水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并回收乙醇.將上述上清液與配制好的水飽和正丁醇在分液漏斗 上反復(fù)充分震蕩混合，過(guò)夜；然后將下層水層放入燒杯中，正丁醇層保留，將水層重復(fù)上 述萃取步驟兩次；合并上層正丁醇層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收正丁醇至黏稠狀；用少量甲醇溶解沉 淀，加入乙醚洗滌，離心，洗滌數(shù)次至上清無(wú)色；沉淀物在真空干燥箱中干燥過(guò)夜得粗皂 苷；將錦燈籠宿萼粗皂苷配制成10 mg/mL的水溶液，充分溶解、離心后，將上清液上樣于 大孔樹(shù)脂層析柱洗脫：首先用蒸餾水洗脫，將洗脫液進(jìn)行薄層層析（TLC)檢測(cè)，直至硅膠 G薄層層析檢驗(yàn)沒(méi)有顯色反應(yīng)為止，洗脫至無(wú)寡糖存在；然后以乙醇溶液進(jìn)行洗脫，將洗脫 液進(jìn)行三氯醋酸顯色，直至無(wú)顏色反應(yīng)，將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一定體積，水浴蒸發(fā)去 除存留的少量乙醇后，將濃縮液冰凍干燥，即得分離純化后的錦燈籠宿萼皂苷。
[0005] 本發(fā)明提供的含有化合物的藥物，可以通過(guò)將化合物添加藥學(xué)上可接受的輔料或 可選的其它成分而制成適于臨床使用的藥物組合物。
[0006] 本發(fā)明的化合物在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，是通過(guò)以下的藥效實(shí)驗(yàn)得到證實(shí) 的。
【具體實(shí)施方式】
[0007] 制備例1:錦燈籠宿萼皂苷的制備 取600g干燥的成熟錦燈籠宿萼粉碎，加入70%的乙醇，浸泡過(guò)夜；60°C水浴回流提取 2 h，過(guò)濾，取上清，共提取3次；將3次的濾液合并，3 500 r/min離心10 min，取上清 棄沉淀；將上清水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并回收乙醇.將上述上清液與配制好的水飽和正丁醇在分液 漏斗上反復(fù)充分震蕩混合，過(guò)夜；然后將下層水層放入燒杯中，正丁醇層保留，將水層重 復(fù)上述萃取步驟兩次；合并上層正丁醇層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收正丁醇至黏稠狀；用少量甲醇溶 解沉淀，加入5倍乙醚洗漆，3 OOO r/min離心15 min,洗漆數(shù)次至上清無(wú)色；沉淀物在 真空干燥箱中干燥過(guò)夜得粗皂苷；將錦燈籠宿萼粗皂苷配制成10 mg/mL的水溶液，充分溶 解、離心后，將上清液上樣于D-101大孔樹(shù)脂層析柱（4 cmX40 cm)，靜止0.5 h后進(jìn)行洗 脫.洗脫：首先用蒸餾水洗脫，將洗脫液進(jìn)行薄層層析（TLC)檢測(cè)，直至硅膠G薄層層析 檢驗(yàn)沒(méi)有顯色反應(yīng)為止（薄層層析方法：用正丁醇-甲酸-水（4 : 6 : 1，體積比）為展 開(kāi)劑，5%硫酸乙醇溶液為顯色劑，KKTC條件下2 min即可顯色），洗脫至無(wú)寡糖存在；然 后以60%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，將洗脫液進(jìn)行三氯醋酸顯色，直至無(wú)顏色反應(yīng)，將洗脫液 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一定體積，水浴蒸發(fā)去除存留的少量乙醇后，將濃縮液冰凍干燥，即得分 離純化后的錦燈籠宿萼皂苷。
[0008] 實(shí)驗(yàn)例1:錦燈籠宿萼皂苷對(duì)體外腫瘤細(xì)胞的抑制作用 材料和試劑 藥物及試劑： 錦燈籠宿萼皂苷，白色粉末，按照制備例1方法制備； 注射用硫酸長(zhǎng)春新堿，上海華聯(lián)制藥有限公司，規(guī)格Img/支； RPMI1640培養(yǎng)基：GIBC0公司生產(chǎn)； 新生牛血清(超級(jí))，杭州四季青生物工程材料有限公司； 胰蛋白酶，Sigma公司生產(chǎn)； 橫基羅丹明B(sulforhadamineB,SRB)，Sigma公司； 注射用鏈霉素，山東瑞陽(yáng)制藥有限公司，Ig (100萬(wàn)單位）/支； 注射用青霉素鈉，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，80萬(wàn)單位/支； 其它常用化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。
[0009] 細(xì)胞株：人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、Bel-7402、人卵巢癌細(xì)胞株H08910、人前列腺 癌胞PC-3M、人肺腺癌細(xì)胞株A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8、人食管癌細(xì)胞株CaEs-17、人腦 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、人胃癌細(xì)胞株BGC-823、人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901，均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科 學(xué)院北京腫瘤研究所藥理室。
[0010] 儀器：C02培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，酶標(biāo)儀，倒置顯微鏡，細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Costar，USA)， 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Costar，USA)。
[0011]軟件：MicrosoftExcel7. 0 統(tǒng)計(jì)分析軟件；MicrocalOrigin6. 0 數(shù)據(jù)處理軟 件。
[0012] 實(shí)驗(yàn)方法 藥物及試劑配制： RPMI1640培養(yǎng)基一袋加水一升，補(bǔ)加2克碳酸氫鈉，10萬(wàn)單位青霉素和IOOmg鏈霉素， 調(diào)節(jié)pH值至7. 4,用0. 22Mm除菌濾膜過(guò)濾除菌。90ml培養(yǎng)基加滅活新生牛血清IOml即為 完全培養(yǎng)液。胰蛋白酶用D-hanks緩沖液配成0. 25%溶液后過(guò)濾除菌。
[0013] 準(zhǔn)確稱(chēng)取錦燈籠宿萼皂苷20.0 mg于滅菌離心管中，加入DMSO 1ml，配成20 mg/ ml原液。取10 W原液加到IOml的完全培養(yǎng)液中，即成為20呢/ml應(yīng)用液，再分別用完全 培養(yǎng)液稀釋為l〇、5、2. 5和I. 25吒/ml的應(yīng)用液。
[0014] 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代： 所有細(xì)胞均貼壁培養(yǎng)于含IOml完全培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37°C、5%C02、飽合濕度下 培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底后用滅菌D-hanks液洗兩次，加0. 25%胰蛋白酶消化細(xì)胞2分鐘，倒掉 胰蛋白酶，待輕搖細(xì)胞能完全脫落后，加完全培養(yǎng)液30ml后，用移液管吹散細(xì)胞，分裝于3 個(gè)新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0015] 上述實(shí)驗(yàn)均在嚴(yán)格無(wú)菌條件下進(jìn)行。
[0016] 結(jié)果測(cè)定：將對(duì)照用培養(yǎng)板取出于含細(xì)胞孔中輕輕加入25ul 50%預(yù)冷的三氯醋 酸溶液于培養(yǎng)液面上，靜置5分鐘后，在4°C冰箱放置1小時(shí)，棄去上層液體，用去離子水洗 5遍，置空氣中干燥后留待與加藥培養(yǎng)板一并染色分析。
[0017] 細(xì)胞加藥培養(yǎng)48小時(shí)后，取出培養(yǎng)板，于每孔加入50ul預(yù)冷的50%三氯醋酸，靜 置5分鐘后移入4°C冰箱中靜置1小時(shí)，取出用去離子水洗5遍，空氣中干燥，待完全干燥 后每孔加入1%的乙酸配制的〇. 4%的SRB lOOul，染色20分鐘后倒掉染液，用1%乙酸洗5 次，去除未結(jié)合的染料?？諝庵懈稍锖笥胮H 10. 5的lOmmol/L的非緩沖Tris堿液150ul 溶解，在平板振蕩器上振蕩5分鐘，在BioRad酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在490nm的光吸收。本底 對(duì)照板的細(xì)胞同樣處理測(cè)定0D490。
[0018] 根據(jù)各孔0D490計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率： 根據(jù)藥物濃度對(duì)數(shù)與抑制率，用Microcal Origin軟件作直線(xiàn)回歸，得到直線(xiàn)方程，計(jì) 算抑制率在50%時(shí)對(duì)應(yīng)的藥物濃度即為錦燈籠宿萼皂苷對(duì)腫瘤細(xì)胞的半抑制濃度（IC5tlX
[0019] 于上述同樣條件下測(cè)定每株細(xì)胞的IC5Q。
[0020] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，錦燈籠宿萼皂苷對(duì)多種人源腫瘤細(xì)胞株，包括：肝癌、肺癌、前列腺 癌、胃癌、卵巢癌細(xì)胞、前列腺癌、結(jié)腸癌、食管癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等均有較強(qiáng)的抑制其增殖作 用，IC5tl 均小于 10Mg/ml。
[0021] 實(shí)驗(yàn)例2 :錦燈籠宿萼皂苷對(duì)體外腫瘤細(xì)胞的抑制作用 材料和試劑： 錦燈籠宿萼皂苷，按照制備例1制備。
[0022] 昆明種小鼠，體重18 - 22g，雄性；C57BL/6小鼠，體重18 - 22g，雄性。
[0023] S180肉瘤、H22肝癌、U14宮頸癌和Lewis肺癌瘤株，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京藥 物所。
[0024] 實(shí)驗(yàn)方法：S180肉瘤、H22肝癌和U14宮頸癌接種：取于昆明鼠腹腔內(nèi)接種傳代七 天的上述荷瘤小鼠，消毒腹部皮膚后，抽取腹水，加入三倍體積的注射用生理鹽水稀釋?zhuān)?毒昆明鼠腋下皮膚，每只小鼠于腋下注射瘤細(xì)胞懸液〇. 2 ml，各瘤株分別接種50只小鼠。
[0025] Lewis肺癌接種：取已接種10天的Lewis肺癌、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的小鼠，脫頸處死， 用酒精消毒皮膚后，剝?nèi)∧[瘤組織，加入五倍重量的生理鹽水后用組織勻漿器研磨成勻漿， 100目滅菌不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾。消毒每只小鼠左側(cè)腋皮膚，接種瘤液0.2ml。接種50只小鼠。
[0026] 接瘤后第二天隨機(jī)分為5組，分別為模型組、環(huán)磷酰胺對(duì)照組（80mg/kg)、錦燈籠 宿萼皂苷高（50mg/kg)、錦燈籠宿萼皂苷中（5mg/kg體重）和錦燈籠宿萼皂苷低（0.5mg/ kg)組。環(huán)磷酰胺用生理鹽水配成4mg/ml，錦燈籠宿萼皂苷用聚乙二醇做助溶劑，配成 2. 5、0. 25和0.025mg/ml，給藥量0. 2ml/10g體重。環(huán)磷酰胺接瘤后第二天給藥一次，錦 燈籠宿萼皂苷各組于接瘤后第二天給藥，隔日一次，共5次。貝萼皂苷元末次給藥后第三 天處死小鼠，剝?nèi)×鼋M織稱(chēng)重。計(jì)算抑瘤率。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 錦燈籠宿萼皂苷在制備藥物方面的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于錦燈籠宿萼皂苷在制備抗腫瘤藥物方面的 應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，起特征在于錦燈籠宿萼皂苷在制備治療抗肝癌、卵巢 癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、食管癌的藥物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了以錦燈籠宿萼皂苷為活性成分的藥物，其可單獨(dú)與藥用輔料或與其它藥物聯(lián)合制備成藥物，本發(fā)明還提供了其在制備藥物方面的應(yīng)用，具體地提供了其在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
【IPC分類(lèi)】A61P35-00, A61K36-81
【公開(kāi)號(hào)】CN104740063
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310725525
【發(fā)明人】黃映琪
【申請(qǐng)人】青島百草匯中草藥研究所
【公開(kāi)日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2013年12月25日