一種鐵皮石斛提取物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥保健食品領(lǐng)域，具體涉及一種鐵皮石斛提取物及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura. et Migo)是蘭科石斛屬多年生草本 植物，其主要藥用部位是新鮮或干燥莖，主要分布于安徽、浙江、廣西、湖南、云南、貴州等 地，是傳統(tǒng)名貴中藥材。鐵皮石斛含有石斛多糖、黃酮、蛋白質(zhì)、17種氨基酸及無機(jī)元素等， 具有益胃生津，滋陰清熱之功效。《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，道家養(yǎng)生經(jīng)典《道藏》將它 譽(yù)為"中華九大仙草"之首。民間稱鐵皮石斛為"救命仙草"、"寸金草"，作為養(yǎng)生保健的極 品，歷代醫(yī)家推崇信至。
[0003] 目前文獻(xiàn)報(bào)道的鐵皮石斛提取物的制備方法大多圍繞多糖開展研宄，活性成分單 一，提取方式主要有加熱浸提法、酶解法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法等，且都采用水 作為提取溶劑，存在有效成分利用不充分，提取效率低等弊端。
[0004] 此外，鐵皮石斛的成分研宄主要圍繞多糖含量，并未對(duì)其組成成分開展深入研宄， 也顯有對(duì)其它成分進(jìn)行分析，存在物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，質(zhì)量不可控等弊端。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種鐵皮石斛提取物，所述的提取物中鐵皮石斛多糖的含 量為70. 0%~90. 0% (重量比），其中，鐵皮石斛多糖中甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖 的含量分別為40. 0%~50. 0%、15. 0%~25. 0%、L 5%~5. 0%、L 5%~5. 0% ;鐵皮石 斛總黃酮的含量為0.5~1.0% (重量比），其中柚皮素的含量為0.05%~0.1%。另外， 鐵皮石斛中總黃酮還含有3'，5, 5'，7-四羥基二氫黃酮。
[0006] 作為優(yōu)先的，進(jìn)一步限定所述鐵皮石斛提取物中鐵皮石斛多糖含量為 80. 0% -90. 0% (重量比），其中，鐵皮石斛多糖中甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的含 量分別為45. 0% -50. 0%、20. 0-25. 0%、3. 0% -5. 0%、3. 0-5. 0% ;鐵皮石斛總黃酮含量為 0.8% -1.0% (重量比），其中柚皮素的含量為0.08-0. 1%。
[0007] 更進(jìn)一步限定所述鐵皮石斛提取物中鐵皮石斛多糖含量為85.0% -90.0% (重量比），其中，鐵皮石斛多糖中甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的含量分別為 48. 0% -50. 0%、23. 0% -25. 0%、4. 0% -5. 0%、4. 5% -5. 0% ;鐵皮石斛總黃酮含量為 0.9% -1.0% (重量比），其中柚皮素的含量為0.08% -0.09%。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種鐵皮石斛提取物制備方法，其包括脫脂、閃提、除蛋白和脫色 四步驟，具體如下：
[0009] (1)脫脂：取鐵皮石斛飲片，加5~10倍體積量有機(jī)溶劑浸泡0. 5~2h，回流1~ 3次，每次2h，過濾，揮干有機(jī)溶劑得藥渣；
[0010] (2)閃提：取上述藥渣，加5~20倍體積量5 %~30 %乙醇溶液浸泡0? 5~lh，閃 提時(shí)間1~3min，閃提轉(zhuǎn)速3500~5000rpm，過濾，藥澄再重復(fù)閃提1~2次，合并閃提所 得濾液，濃縮至無醇味，濃縮液每ml相當(dāng)于含生藥0. 5~1.0 g ;
[0011] ⑶除蛋白：取上述濃縮液，加濃縮液1/5~1/3倍體積量的Sevage試劑，劇烈振 搖lOmin，靜置lOmin，以4000~6000r/min離心10min，溶液分三層，收集上層溶液，上層溶 液再重復(fù)上述步驟除蛋白2~5次并收集上層溶液；
[0012] (4)脫色：向上述除蛋白后的溶液中加入活性炭，攪拌，過濾，濾液減壓濃縮得鐵 皮石斛提取物。
[0013] 其中，作為優(yōu)選的，進(jìn)一步限定步驟（1)中所述的有機(jī)溶劑選用石油醚、正己烷、 乙酸乙酯中的一種或兩種混合物，更進(jìn)一步限定步驟（1)中所述的有機(jī)溶劑為正己烷、乙 酸乙酯中的一種。
[0014] 其中，作為優(yōu)選的，進(jìn)一步限定步驟（2)中所述閃提條件為6~10倍體積量8%~ 15 %乙醇溶液浸泡lh，閃提時(shí)間2~3min，閃提轉(zhuǎn)速4500~5000rpm ;更進(jìn)一步限定步 驟（2)中所述的閃提條件為8倍體積量10%乙醇溶液浸泡lh，閃提時(shí)間2min，閃提轉(zhuǎn)速 5000rpm〇
[0015] 其中，作為優(yōu)選的，進(jìn)一步限定步驟（3)中所述的Sevage試劑選用體積比為5:2 的氯仿：正丁醇。
[0016] 其中，作為優(yōu)選的，進(jìn)一步限定步驟（4)中所述的活性炭用量為1~2% (g/ml)。
[0017] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述的鐵皮石斛提取物的新應(yīng)用，本發(fā)明人意外發(fā) 現(xiàn)，本發(fā)明所提供的鐵皮石斛提取物具有明顯的抗血小板凝集活性，可用于制備預(yù)防、治療 栓塞性心腦血管疾病的藥物或保健食品；還可明顯降低血糖、升高肝糖原，可用于制備預(yù) 防、治療腎性糖尿病的藥物或保健食品。
[0018] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明取得如下有益效果：
[0019] 1、相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的鐵皮石斛提取物不僅含有豐富的多糖，而且還含 有柚皮素、3'，5, 5'，7-四羥基二氫黃酮類成分，其主要活性成分明確，鐵皮石斛多糖的含量 為85. 0%~90. 0% (重量比），其中，鐵皮石斛多糖中甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的 含量分別為 48.0% _50.0%、23.0% _25.0%、4.0% _5.0%、4.5% -5.0% ;鐵皮石斛總黃 酮含量為0.9% -1.0% (重量比），其中柚皮素的含量為0.08% -0.09%。
[0020] 2、本發(fā)明提供了一種鐵皮石斛提取物的制備方法，其分離純化工藝設(shè)計(jì)合理，尤 其是其提取過程采用8倍體積量10%乙醇溶液浸泡lh，閃提時(shí)間2min，閃提轉(zhuǎn)速5000rpm， 該閃提方法不但能保護(hù)鐵皮石斛有效成分不會(huì)受熱破壞，最大限度同時(shí)有效提取鐵皮石斛 多糖與黃酮，得率可達(dá)到35~40% ;而且該制備方法溶劑用量小，提取時(shí)間短，提高產(chǎn)品質(zhì) 量，降低生產(chǎn)成本。
[0021] 3、本發(fā)明提供的鐵皮石斛提取物預(yù)防、治療栓塞性心腦血管疾病、腎性糖尿病的 藥理藥效活性顯著，與鐵皮石斛多糖提取物（多糖含量達(dá)到95% )相比，其藥效作用更快、 量效范圍更大，效果更顯著，為鐵皮石斛的精深加工開拓了新的途徑。
【附圖說明】：
[0022] 圖1 :為鐵皮石斛提取物多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為濃度ug/ml，縱坐標(biāo)為吸光度，線 性方程為 Y = 0? 0687X+0. 0194, R2 = 0? 9990。
[0023]圖2:為鐵皮石斛提取物多糖組成成分的液相色譜圖，2為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（鹽酸氨基葡 萄糖），其保留時(shí)間為11. 242min ;1為甘露糖，相對(duì)保留時(shí)間為0. 67 ;3為葡萄糖，相對(duì)保留 時(shí)間為1. 19 ;4為半乳糖，相對(duì)保留時(shí)間為1. 59 ;5為阿拉伯糖，其相對(duì)保留時(shí)間為1. 88。
[0024] 圖3 :為鐵皮石斛提取物總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為濃度ug/ml，縱坐標(biāo)為吸光度， 線性方程為 Y = 0? 0187X+0. 0066, R2 = 0? 9995。
[0025]圖4 :為鐵皮石斛提取物柚皮素成分的液相色譜圖，1為柚皮素，其保留時(shí)間為 40. 750min〇
【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)施例1含量測(cè)定方法
[0027] (1)多糖的含量測(cè)定
[0028] 對(duì)照品溶液的制備取無水葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每Iml含90yg 的溶液，即得。
[0029] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對(duì)照品溶液0. 2ml、0. 4ml、0. 6ml、0. 8ml、l. 0ml，分別置 10ml具塞試管中，各加水補(bǔ)至L 〇ml，精密加入5%苯酚溶液lml (臨用配制），搖勻，再精密 加硫酸5ml，搖勻，置沸水浴中加熱20分鐘，取出，置冰浴中冷卻5分鐘，以相應(yīng)試劑為空白， 照紫外-可見分光光度法，在488nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐 標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0030] 供試品溶液的制備取本品約0. lg，精密稱定，置250ml量瓶中，加水溶解，稀釋至 刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2ml，置15ml離心管中，精密加入無水乙醇IOml，搖勻，冷 藏1小時(shí)，取出，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn)）20分鐘，棄去上清液（必要時(shí)濾過），沉淀 加80 %乙醇洗滌2次，每次8ml，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中， 放冷，加水至刻度，搖勻，即得。
[0031] 測(cè)定法精密量取供試品溶液1ml，置IOml具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方 法，自"精密加入5%苯酚溶液lml"起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中 無水葡萄糖的量，計(jì)算，即得。
[0032] (2)甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的含量測(cè)定
[0033] 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙 腈-0. 02mol/L的乙酸銨溶液（20 :80)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm。理論板數(shù)按甘露糖峰 計(jì)算應(yīng)不低于4000。
[0034] 校正因子測(cè)定取鹽酸氨基葡萄糖適量，精密稱定，加水制成每1ml含12mg的溶液， 作為內(nèi)標(biāo)溶液。另取甘露糖對(duì)照品約l〇mg，葡萄糖糖對(duì)照品約10mg，半乳糖對(duì)照品約5mg， 阿拉伯糖對(duì)照品約5mg，精密稱定，置100mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液lml，加水適量使溶 解并稀釋至刻度，搖勻，吸取400 y 1，加0. 5mol/L的PMP (1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲 醇溶液與〇? 3mol/L的氫氧化鈉溶液各400 y 1，混勻，70°C水浴反應(yīng)100分鐘。再加0? 3mol/ L的鹽酸溶液500 y 1，混勻，用三氯甲烷洗滌3次，每次2ml，棄去三氯甲烷液，水層離心后， 取上清液10 U 1，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算校正因子。
[0035]測(cè)定法取本品約0. lg，精密稱定，置索氏提取器中，加80%乙醇適量，加熱回流提 取4小時(shí)，棄去乙醇液，藥渣揮干乙醇，濾紙筒拆開置于燒杯中，加水250ml，再精密加入內(nèi) 標(biāo)溶液5ml，煎煮1小時(shí)并時(shí)時(shí)攪拌，放冷，加水補(bǔ)至約250ml，混勻，離心，吸取上清液lml， 置安瓿瓶或頂空瓶中，加3. Omol/L的鹽酸溶液0. 5ml，封口，混勻，110°C水解1小時(shí)，放冷， 用3. Omol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，吸取400 y 1，照校正因子測(cè)定方法，自"加 0. 5mol/L的PMP甲醇溶液"起，依法操作，取上清液10 y 1，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
[0036] (3)總黃酮的含量測(cè)定
[0037] 對(duì)照品溶液的制備取柚皮素對(duì)照品適量，精密稱定，加70 %乙醇制成每1ml含 0? 2mg的溶液，即得。
[0038] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取柚皮素對(duì)照品溶液0、l、2、3、4、5ml，分別置25ml量瓶 中，各加水至6. Oml，加5 %亞硝酸鈉溶液Iml，搖勻，放置6分鐘，再加10 %硝酸鋁溶液Iml， 搖勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉試液IOml，加水至刻度，搖勻，放置15min。照紫外-可見分 光光度法，在372nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0039] 供試品溶液制備取本品約0.2g，精密稱定，置燒杯中，加水適量超聲使溶解，轉(zhuǎn)移 置IOml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勾，即得。
[0040] 測(cè)定法精密移取供試品溶液2-5ml至25ml量瓶中，自"加水至6. Oml……"起，按 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法，372nm測(cè)定供試品吸