一種家蠅復(fù)合抗菌肽制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及提供一種家蠅復(fù)合抗菌肽制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗生素在醫(yī)學(xué)上一直發(fā)揮著重要的作用，是西醫(yī)治療感染疾病的核心藥物。但隨 著抗生素的廣泛和長(zhǎng)期使用，以及濫用抗生素的情況日益嚴(yán)重，造成許多具耐藥性的突變 菌株出現(xiàn)，使現(xiàn)用抗生素失效。
[0003] 抗菌肽是生物體內(nèi)產(chǎn)生的一種具有抗菌功能的小分子多肽，在低等和高等生物體 系中都顯示出先天性免疫功能。研宄表明，家蠅體內(nèi)含有豐富的抗菌肽，這類活性多肽具 有分子量小(大部分抗菌肽都在20Kda以下)、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、水溶性好、抗菌譜廣、殺菌活力高 及原料來(lái)源豐富等優(yōu)點(diǎn)，特別是其能殺死耐藥菌株，而且殺菌機(jī)制使病原菌不易產(chǎn)生耐藥 性突變，使其成為傳統(tǒng)抗生素的理想替代物，引起生物學(xué)界和醫(yī)藥界的廣泛重視。
[0004] 目前關(guān)于家蠅抗菌肽提取的報(bào)道，基本方法是通過(guò)醋酸溶解的方法提取家蠅體內(nèi) 的蛋白質(zhì)，再通過(guò)100°c加熱沉淀熱不穩(wěn)定蛋白，進(jìn)一步通過(guò)吸附法將剩余的溶解在醋酸中 的熱穩(wěn)定蛋白吸附在海藻糖上，通過(guò)對(duì)吸附的蛋白進(jìn)行洗脫、濃縮(凍干或沉淀法）后獲得 復(fù)合抗菌肽。但是海藻糖的成本高，不能重復(fù)使用，影響此方法的工業(yè)化應(yīng)用。Hou等人 還通過(guò)直接凍干酸提取液的方法獲得濃縮的復(fù)合抗菌肽，但凍干后由于大量的灰粉無(wú)法去 除，進(jìn)而會(huì)降低復(fù)合抗菌肽的溶解度，影響復(fù)合抗菌肽的進(jìn)一步分離和純化。
[0005] 切向流超濾技術(shù)是指液體流動(dòng)方向與過(guò)濾方向呈垂直方向的過(guò)濾形式，切向流過(guò) 濾時(shí)，待過(guò)濾的液體的流動(dòng)方向和過(guò)濾膜平面的方向平行，液體就會(huì)垂直于膜表面穿過(guò)膜 孔。超濾時(shí)，過(guò)濾較大規(guī)模的料液就需要采用切向流過(guò)濾方式，它會(huì)產(chǎn)生湍流(二次流)，由 于有了湍流，液體流動(dòng)在過(guò)濾介質(zhì)表面（即超濾膜表面）產(chǎn)生剪切力，減小了濾餅層或凝膠 層在膜表面的堆積，使沉淀從膜表面剝離，降低膜污染，保證穩(wěn)定的過(guò)濾速度，超濾膜截留 分子量的差異，可以使切向流超濾技術(shù)應(yīng)用于分離不同分子量的蛋白，在大規(guī)模的蛋白質(zhì) 濃縮及分離中廣泛應(yīng)用。
[0006] 抗菌肽在常溫下具有較高的穩(wěn)定性，不容易失活，但也存在隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，抗 菌活性減退的問(wèn)題。海藻糖的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有不同于其它雙糖的獨(dú)特特性，對(duì)抗菌小肽 的保護(hù)作用未見(jiàn)研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種家蠅復(fù)合抗菌肽制劑，該制劑通過(guò)常規(guī)醋酸溶解法提取家蠅體內(nèi) 的蛋白質(zhì)，提取液離心取上清液，上清液置于100°c加熱沉淀熱不穩(wěn)定蛋白，離心，上清液濾 膜抽濾，濾液采用IOKda和5Kda膜兩次分子截留，獲得分子量為5Kda~10Kda之間的復(fù)合抗 菌肽溶液，在復(fù)合抗菌肽溶液中添加海藻糖，使溶液中海藻糖終濃度為0.1mol/L~0. 2mol/ L，混合均勻后真空冷凍干燥，制得家蠅復(fù)合抗菌肽制劑。
[0008] 所述濾液采用IOKda和5Kda膜包切向流超濾方法進(jìn)行分子截留。
[0009] 本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果： 本發(fā)明制劑為分子量呈連續(xù)分布的由多種抗菌肽組成的復(fù)合抗菌肽，其不僅對(duì)枯草芽 孢桿菌有抑菌效果，還對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌有抗菌作用，其抗 菌譜不僅能抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，也能抑制革蘭氏陰性細(xì)菌，添加海藻糖作為保護(hù)劑還能 提尚抗菌狀的活性和穩(wěn)定性。
[0010] 鑒于切向流超濾法一次可以處理大體積抗菌肽酸提取液，濃縮效率高，并且可以 重復(fù)使用，不需要昂貴的設(shè)備，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)抗菌肽來(lái)說(shuō)，此法更加便捷可靠。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為復(fù)合抗菌肽溶液的抑菌效果圖，其中1為金黃色葡萄球菌S. atfrew5ATCC6538 ; 2 為枯草芽孢桿菌 B. CMCC(B)63501 ; 3 為大腸桿菌 E. co/i Rosetta ;4 為大腸桿菌 E. Cb/i0157N0TC12900 ;5 為沙門(mén)氏菌 S. CMCC (B) 50335 ;6 為志賀氏菌 S?辦seateriae A7CC10231); 圖2為含有不同濃度海藻糖的復(fù)合抗菌肽制劑對(duì)金黃色葡萄球菌（S. atfr<9W5ATCC6538)抑菌結(jié)果不意圖； 圖3為含有不同濃度海藻糖的復(fù)合抗菌肽制劑對(duì)大腸桿菌（E. 0157N0TC12900) 抑囷結(jié)果不思圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明方法的保護(hù)范圍不局 限于所述內(nèi)容。
[0013] 實(shí)施例1:本家蠅復(fù)合抗菌肽制劑，具體制備如下： (1) 將400g蠅蛆粉末（20目）溶解于2L 0? 5mol/L的醋酸溶液中，在4°C下過(guò)夜提??； (2) 提取液以7000rpm離心15min收集上清液，上清液在100°C的中水浴IOmin以 沉淀大分子熱不穩(wěn)定性蛋白，7000rpm離心15min去除熱不穩(wěn)定性蛋白沉淀，上清液利用 0. 22 y m的濾膜進(jìn)行真空抽濾，收集濾液； (3) 將步驟（2)得到的濾液通過(guò)截留分子量為IOKda膜包切向流系統(tǒng)進(jìn)行超濾濃縮，收 集透過(guò)液，再將上述透過(guò)液通過(guò)截留分子量為5Kda膜包切向流系統(tǒng)進(jìn)行超濾濃縮，收集濃 縮液50ml，得到切向流濃縮法濃縮的抗菌肽溶液。
[0014] (4)將步驟（2)得到的濾液凍干后，再用50ml 0. lmol/L的醋酸溶解，獲得凍干法 濃縮的抗菌肽溶液。
[0015] (5)利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定不同濃縮法得到的抗菌肽溶液可溶性蛋白的濃度，結(jié) 果見(jiàn)表1。
[0016]表1 :
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種家蠅復(fù)合抗菌肽制劑，其特征在于：通過(guò)常規(guī)醋酸溶解法提取家蠅體內(nèi)的蛋白 質(zhì)，提取液離心取上清液，上清液置于l〇〇°C加熱IOmin沉淀熱不穩(wěn)定蛋白，離心，上清液濾 膜抽濾，濾液采用IOKda和5Kda膜兩次分子截留，獲得分子量為5Kda~10Kda之間的復(fù)合抗 菌肽溶液，在復(fù)合抗菌肽溶液中添加海藻糖，使溶液中海藻糖終濃度為0.1mol/L~0. 2mol/ L，混合均勻后真空冷凍干燥，制得家蠅復(fù)合抗菌肽制劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述家蠅復(fù)合抗菌肽制劑，其特征在于：濾液采用IOKda和5Kda膜 包切向流超濾方法進(jìn)行分子截留。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種家蠅復(fù)合抗菌肽制劑，該方法通過(guò)常規(guī)醋酸溶解法提取家蠅體內(nèi)的蛋白質(zhì)，提取液離心取上清液，上清液置于100℃加熱10min沉淀熱不穩(wěn)定蛋白，離心，上清液濾膜抽濾，濾液采用10Kda和5Kda膜兩次分子截留，獲得分子量為5Kda~10Kda之間的復(fù)合抗菌肽溶液，在復(fù)合抗菌肽溶液中添加海藻糖，使溶液中海藻糖終濃度為0.1mol/L~0.2mol/L，混合均勻后真空冷凍干燥，制得家蠅復(fù)合抗菌肽制劑；此復(fù)合抗菌肽制劑具有廣譜殺菌能力，且保質(zhì)期較長(zhǎng)。
【IPC分類】A61K38-00, A61K47-36, A61P31-04
【公開(kāi)號(hào)】CN104740599
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510094256
【發(fā)明人】林連兵, 雷琎, 孫宇杰, 國(guó)洪旭, 鄧先余
【申請(qǐng)人】昆明理工大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2015年3月3日