Plekha5在制備腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，PLEKHA5在制備腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用，具體的本發(fā)明 涉及PLEKHA5在制備骨肉瘤診斷試劑中的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] PLEKHA5 是PLEKHA((pleckstrinhomologydomain-containingprotein familyA)家族的一員，目前關(guān)于該基因的研宄非常少。Kenichiro等（Identification andcharacterizationofsplicingvariantsofPLEKHA5(Plekha5)duringbrain development，Gene，Volume492，Issuel，15January2012,270_275)對(duì)該基因進(jìn)行研宄后 發(fā)現(xiàn)，其mRNA有兩種表達(dá)形式，較長(zhǎng)的mRNA鏈（L-PLEKHA5)有32個(gè)外顯子，編碼1282個(gè)氨 基酸，在腦組織中表達(dá)較高，而較短的（S-PLEKHA5)有26個(gè)外顯子，編碼1116個(gè)氨基酸，在 機(jī)體的各個(gè)部位都有表達(dá)。這兩種形式的mRNA編碼的蛋白質(zhì)均具有Wff及PH結(jié)構(gòu)域，主要 位于細(xì)胞質(zhì)中。在小鼠E13. 5時(shí)PLEKHA5表達(dá)量最多，其中S-PLEKHA5占主要部分，隨后開 始出現(xiàn)PLEKHA5總量下降，但是L-PLEKHA5的表達(dá)量卻逐漸增力P，直到E17. 5時(shí)，L-PLEKHA5 的表達(dá)量達(dá)到最大，并一直維持在小鼠的整個(gè)成年期，提示PLEKHA5的表達(dá)量可能與小鼠 的年齡呈依賴性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在這個(gè)轉(zhuǎn)變過程中PLEKHA5的PH結(jié)構(gòu)域可以特異性的 與PI3P，PI4P，PISP及PI(3,5)P2結(jié)合。這些均提示PLEKHA5可能通過與特異的磷酸肌醇 連接完成從短鏈到長(zhǎng)鏈轉(zhuǎn)變，這在大腦發(fā)育的過程中起著重要的作用。
[0003] 骨肉瘤（Oseteosarcoma)是除漿細(xì)胞瘤外最常見的惡性骨原發(fā)性腫瘤，其組織學(xué) 特點(diǎn)是在多數(shù)情況下腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生骨樣或不成熟骨。骨肉瘤易于侵及生長(zhǎng)迅速的干髓端， 其典型的位置是在長(zhǎng)管狀骨，股骨遠(yuǎn)端及脛骨、朧骨的近端是最常見的發(fā)病部位，全部病人 的50% -70%病變發(fā)生在膝關(guān)節(jié)周圍。骨肉瘤起病時(shí)無明顯的臨床癥狀，極易與外傷混淆， 且惡性程度高早期即可能發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，故其危害性大死亡率很高。臨床骨科工作者一直致 力于對(duì)其防治的研宄，希望尋找到骨肉瘤精確有效治療的靶點(diǎn)。
[0004] 發(fā)明人對(duì)5例骨肉瘤病例樣本及3例正常對(duì)照進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)合生物信息 學(xué)方法進(jìn)行基因篩選，挑選出候選基因PLEKHA5。近來還有研宄發(fā)現(xiàn)，在先天性攣縮綜合 癥及神經(jīng)肌肉疾病中，磷酸肌醇與PI(3、5)P2代謝異常被認(rèn)為是導(dǎo)致該疾病的可能原因。 PLEKHA5蛋白可能通過內(nèi)吞作用與細(xì)胞膜上的PI(3,5)P2連接，從而激活細(xì)胞膜上的信號(hào) 通路導(dǎo)致代謝異常。但是并沒有研宄表明PLEKHA5與骨肉瘤之間的關(guān)系，進(jìn)一步，本發(fā)明進(jìn) 行了分子細(xì)胞生物學(xué)方法證實(shí)了PLEKHA5與骨肉瘤的關(guān)系：PLEKHA5與骨肉瘤具有很好的 相關(guān)性，骨肉瘤細(xì)胞的增殖及侵襲中具有重要的作用，可用于制備骨肉瘤輔助診療制劑，具 有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供PLEKHA5基因和/或蛋白抑制劑在制備抗骨肉瘤制劑中的 應(yīng)用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先通過高通量測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)方法篩選到候選基 因PLEKHA5,今兒通過分子細(xì)胞生物學(xué)方法驗(yàn)證了PLEKHA5與骨肉瘤的關(guān)系：PLEKHA5與骨 肉瘤具有很好的相關(guān)性，PLEKHA5在骨肉瘤細(xì)胞的增殖及侵襲中具有重要的作用，可用于制 備骨肉瘤輔助診療制劑，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0007] 進(jìn)一步，所述抗骨肉瘤制劑是指可以抑制骨肉瘤細(xì)胞中PLEKHA5基因的表達(dá)的制 劑。本領(lǐng)域人員熟知抑制基因的表達(dá)通?？梢圆捎孟率龇椒ㄖ械囊环N和/或幾種：通過 激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表達(dá)的蛋白、采用RNA干擾技術(shù)抑制 目的基因表達(dá)、激活促進(jìn)目的基因mRNA降解的microRNA、導(dǎo)入促進(jìn)目的基因編碼蛋白降 解的分子、抑制促進(jìn)目的基因表達(dá)的因子及蛋白的表達(dá)。即通過激活PLEKHA5基因的抑制 基因、激活抑制PLEKHA5基因表達(dá)的蛋白、導(dǎo)入抑制PLEKHA5基因表達(dá)的siRNA、激活促進(jìn) PLEKHA5mRNA降解的microRNA、導(dǎo)入促進(jìn)PLEKHA5蛋白降解的分子、抑制促進(jìn)PLEKHA5基因 表達(dá)的因子及蛋白的表達(dá)。
[0008]RNA干擾（RNAi)是指外源性和內(nèi)源性雙鏈RNA在生物體內(nèi)誘導(dǎo)同源靶基因的 mRNA特異性降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象，是一種使用小的雙鏈RNA高效、特異地阻斷 體內(nèi)某種特定基因的表達(dá)，促使mRNA降解，使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型的技術(shù)。siRNA 設(shè)計(jì)完成后可以采用直接合成法或者構(gòu)建siRNA表達(dá)載體，制備好的siRNA可以通過磷酸 媽共沉淀法、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、顯微注射或基因槍等機(jī)械法、陽離子 脂質(zhì)體試劑法等途徑轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0009] 進(jìn)一步，所述抑制PLEKHA5基因表達(dá)的siRNA序列選自下列序列中的一種和/或 幾種：SEQIDNO. 1、SEQIDN0.2、SEQIDN0.3、SEQIDN0.4、SEQIDN0.5、SEQIDN0.6。 優(yōu)選siRNA序列為SEQIDNO.I和SEQIDNO. 2。
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗骨肉瘤制劑，所述抗骨肉瘤制劑抑制骨肉瘤細(xì)胞中 PLEKHA5基因的表達(dá)。進(jìn)一步，所述的抗骨肉瘤制劑中含有抑制PLEKHA5基因表達(dá)的siRNA。 [0011]本發(fā)明的目的在于提供PLEKHA5基因在制備骨肉瘤診療制劑中的應(yīng)用。
[0012] 進(jìn)一步，所述的骨肉瘤的診療制劑包括用熒光定量PCR方法、基因芯片方法檢測(cè) 骨肉瘤組織中PLEKHA5基因的表達(dá)。
[0013] 熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo) 記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板 的初始濃度。熒光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡(jiǎn)化了定量檢測(cè)的過程，而且真正實(shí)現(xiàn)了絕對(duì)定 量。多種檢測(cè)系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實(shí)驗(yàn)的選擇性更強(qiáng)。自動(dòng)化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、 重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰。
[0014] 基因芯片又稱為DNA微陣列（DNAmicroarray)，可分為三種主要類型：1)固定在 聚合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記 的靶基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。2)用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針 陣列，通過與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測(cè)。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷 酸探針陣列，與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測(cè)?；蛐酒鳛橐环N先進(jìn)的、大規(guī)模、高通 量檢測(cè)技術(shù)，應(yīng)用于疾病的診斷，其優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面：一是高度的靈敏性和準(zhǔn)確性；二 是快速簡(jiǎn)便；三是可同時(shí)檢測(cè)多種疾病。
[0015] 所述的用于熒光定量PCR方法檢測(cè)骨肉瘤中PLEKHA5基因的產(chǎn)品含有一對(duì)特異性 擴(kuò)增PLEKHA5基因的引物；所述的基因芯片包括與PLEKHA5基因的核酸序列雜交的探針。
[0016] 進(jìn)一步，所述的骨肉瘤的診療制劑包括用免疫方法檢測(cè)肺腺癌中PLEKHA5蛋白的 表達(dá)。優(yōu)選所述免疫檢測(cè)方法檢測(cè)骨肉瘤中PLEKHA5蛋白表達(dá)的為westernblot和/或ELISA和/膠體金檢測(cè)方法。
[0017] 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo) 記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測(cè)大分子抗原和特異性抗體 等，具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。ELISA檢測(cè)試劑盒根據(jù)檢測(cè)目的和操作 步驟可分為間接法、雙抗夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、雙位點(diǎn)一步法、捕獲法測(cè)IgM抗體、應(yīng)用親和素和 生物素的ELISA。ELISA檢測(cè)試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶（HRP)或者堿性磷 酸酶（AP)。
[0018] 常用的免疫膠體金檢測(cè)技術(shù)：（1)免疫膠體金光鏡染色法細(xì)胞懸液涂片或組織切 片，可用膠體金標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，也可在膠體金標(biāo)記的基礎(chǔ)上，以銀顯影液增強(qiáng)標(biāo)記， 使被還原的銀原子沉積于已標(biāo)記的金顆粒表面，可明顯增強(qiáng)膠體金標(biāo)記的敏感性。（2)免疫 膠體金電鏡染色法可用膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體與負(fù)染病毒樣本或組織超薄切片結(jié)合， 然后進(jìn)行負(fù)染?？捎糜诓《拘螒B(tài)的觀察和病毒檢測(cè)。（3)斑點(diǎn)免疫金滲濾法應(yīng)用微孔濾膜 作載體，先將抗原或抗體點(diǎn)于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標(biāo)記的抗體檢測(cè)相 應(yīng)的抗原或抗體。（4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠 體金標(biāo)記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本 墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，當(dāng)移動(dòng)至固 定的抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留， 聚集在檢測(cè)帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方 便。
[0019] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)PLEKHA5蛋白的ELISA法為使用ELISA檢測(cè)試劑盒。所述試劑 盒中的抗體可采用市售的PLEKHA5單克隆抗體。進(jìn)一步，所述的試劑盒包括：包被PLEKHA5 單克隆抗體的固相載體，酶標(biāo)二抗，酶的底物，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照品，稀釋液，洗滌液，酶 反應(yīng)終止液等。
[0020] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)PLEKHA5蛋白的膠體金法為使用檢測(cè)試劑盒，所述的抗體可采 用市售的PLEKHA5單克隆抗體。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒采用膠體金免疫層析技 術(shù)或膠體金滲濾法。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)（T)噴點(diǎn) 有抗PLEKHA5單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)（C)噴點(diǎn)有免疫球蛋白IgG。
[0021] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)骨肉瘤的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒檢測(cè)基因PLEKHA5,采用特