一種忍冬葉中咖啡酰奎寧酸類提取物及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種忍冬葉中咖啡?？鼘幩犷愄崛∥锛捌渲苽浞椒ê陀猛荆瑢儆谔烊?產物化學技術領域。
【背景技術】
[0002] 忍冬（LonicerajaponicaThunb.)為忍冬科（Caprifoliaceae)忍冬屬 (Lonicera)多年生常綠纏繞藤本植物，是我國傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、抗菌消炎等多種藥 用功效。忍冬藥用部位在歷史上經歷了莖葉-莖葉花-花的變迀歷程。目前，忍冬不同藥 用部位在《藥典》中區(qū)分開來，金銀花（Jinyinhua，LonicerajaponicafIos)，本品為忍冬 科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花。夏初花開放前采收，干 燥"。忍冬藤（Rendongteng，Lonicerajaponicacaulis)，本品為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥莖枝。秋、冬二季采割，曬干"。忍冬花因其產量有限，常供不應 求。而忍冬葉與花同株，為了保證花蕾的正常生長，忍冬需多次修剪整形，每年可得大量的 葉，而這些忍冬葉為忍冬傳統(tǒng)的廢棄部分，一直被視為非藥用部位而長期未得到利用，浪費 現(xiàn)象十分嚴重。
[0003]新城疫（Newcastledisease，ND)是由新城疫病毒（Newcastlediseasevirus， NDV)引起的主要侵害雞和火雞等禽類的一種急性、高度接觸性傳染病，被國際獸醫(yī)局列為 對動物危害最大的A類傳染病。盡管國內對ND采取了密集的預防措施，但是缺乏有效的防 治藥物，其發(fā)病率一直居高不下，仍是目前影響?zhàn)B雞業(yè)健康發(fā)展的主要傳染病之一。
[0004] 目前，國內、外關于忍冬及其提取物的藥用報道主要是關于艾滋病防治、抗癌、抗 炎和止痛等方面，未見有關于忍冬葉中咖啡?？鼘幩犷愄崛∥镉糜诜乐涡鲁且卟《镜膱?道。鑒于當前新城疫病毒疾病的發(fā)生和流行速度已經超過疫苗的研制速度，以及農業(yè)部 2012年發(fā)文的禁止將人類使用的抗病毒藥物，如金剛烷胺、金剛乙胺、阿昔洛韋、利巴韋林 等應用到家畜藥物中，以保障家畜產品安全；因此，將天然植物提取物開發(fā)成適合于新城疫 病毒防治的藥物勢在必行。

【發(fā)明內容】

[0005] 針對上述現(xiàn)有技術存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種忍冬葉中咖啡?？鼘幩?類提取物及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供該咖啡酸奎寧酸提取物在制備抗新城疫病毒藥物中的 應用。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術方案：
[0008] 一種忍冬葉中咖啡?？鼘幩犷愄崛∥铮鎏崛∥镏锌Х弱？鼘幩岬闹亓堪俜趾?量為 65-76%。
[0009] 本發(fā)明的忍冬葉中咖啡酰奎寧酸類提取物的制備方法，步驟如下：
[0010] (1)取忍冬葉，用8-10倍量（g/ml)的乙醇溶液回流提取，濾過，合并濾液，減壓濃 縮至相對密度為I.o-l.I(50°C測），得初提液；
[0011] (2)將步驟（1)制備的初提液，加入等體積的蒸餾水制成懸浮液，將懸浮液用正丁 醇進行萃取，正丁醇相減壓濃縮至相對密度為1. 2-1. 3 (50°C測），得正丁醇萃取物；
[0012] (3)將步驟（2)制備的正丁醇萃取物采用聚酰胺填料進行富集分離，洗脫溶劑為 乙醇-水，乙醇、水的體積比為10:90~20:80;
[0013] (4)合并步驟（3)洗脫后的溶液，濃縮，得浸膏，即為咖啡?？鼘幩犷愄崛∥?。
[0014] 經檢測，該方法制備的提取物中，咖啡?？鼘幩犷惢衔锏闹亓堪俜趾繛?65-76%，所述咖啡?？鼘幩犷惢衔镏饕ňG原酸、3, 4-0-二咖啡酰奎寧酸、3, 5-0-二 咖啡?？鼘幩?、4, 5-0-二咖啡?？鼘幩帷㈦[綠原酸和新綠原酸。
[0015] 本發(fā)明還提供了該忍冬葉中咖啡酰奎寧酸類提取物在制備抗新城疫病毒的藥物 中的應用。
[0016] 本發(fā)明還提供一種抗新城疫病毒的藥物制劑，該藥物制劑以含有藥學有效量的忍 冬葉中咖啡?？鼘幩犷愄崛∥餅橛行С煞?。
[0017] 該藥物制劑可以進一步與藥用輔料混合，以常規(guī)方法制成膠囊劑、片劑、顆粒劑、 粉劑或注射劑；給藥形式為口服給藥或注射給藥。
[0018] 所述的藥用輔料為甘露糖醇、淀粉、甜菊苷、山梨糖醇、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、 聚乙二醇或注射用溶劑中的一種或幾種；
[0019] 所述纖維素衍生物為結晶纖維素、羥丙基纖維素或羧甲基纖維素鈉；
[0020] 所述注射用溶劑為水、乙醇或甘油。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：
[0022] (1)本發(fā)明的咖啡?？鼘幩犷愄崛∥镏苽浞椒芎牡?、污染小、工藝簡單、適合進 行工業(yè)化生產。
[0023] (2)本發(fā)明制備方法得到的咖啡?？鼘幩犷愄崛∥镏校Х弱？鼘幩岬闹亓堪俜?含量為65-76%，可直接入藥，無需進一步純化。
[0024] (3)試驗證明本發(fā)明的咖啡酰奎寧酸類提取物具有較強的抗新城疫病毒的活性， 具有潛在的開發(fā)應用價值。
【具體實施方式】
[0025] 結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本 發(fā)明，并不對其內容進行限定。
[0026] 實施例1 :忍冬葉中咖啡?？鼘幩犷愄崛∥锏闹苽?br>[0027] (1)取干燥后的忍冬葉100克，用800mL乙醇溶液回流提取，濾過，合并濾液，減壓 濃縮至相對密度為I.I(50°C測），得初提液；
[0028] (2)將步驟⑴制備的初提液，加入等體積的蒸餾水制成懸浮液，將懸浮液用正丁 醇進行萃取，正丁醇相減壓濃縮至相對密度為I. 3 (50°C測），得正丁醇萃取物；
[0029] (3)將步驟⑵制備的正丁醇萃取物采用聚酰胺填料進行富集分離，洗脫溶劑為 乙醇-水，乙醇、水的體積比為10:90~20:80。
[0030] (4)合并步驟（3)洗脫后的溶液，減壓濃縮至相對密度為I. 3 (50°C測），得浸膏，即 為咖啡?？鼘幩犷愄崛∥?。
[0031] 該提取物的特征：提取物呈淡黃色，采用紫外可見分光光度法對提取物進行檢測， 對照品為綠原酸、3, 4-0-二咖啡?？鼘幩?、3, 5-0-二咖啡?？鼘幩?、4, 5-0-二咖啡?？鼘?酸、隱綠原酸和新綠原酸，檢測波長325nm。提取物中咖啡酰奎寧酸類化合物的重量百分含 量為72. 5%主要包括綠原酸、3, 4-0-二咖啡酰奎寧酸、3, 5-0-二咖啡酰奎寧酸、4, 5-0-二 咖啡?？鼘幩?、隱綠原酸和新綠原酸。
[0032] 實施例2:抗新城疫病毒的藥物制劑的制備
[0033] 藥物組方：忍冬葉中咖啡?？鼘幩犷愄崛∥?0份，黃芪多糖10份，甘露糖醇20 份，聚乙二醇15份。
[0034] 忍冬葉中咖啡?？鼘幩犷愄崛∥锏闹苽浞椒ㄍ瑢嵤├?。
[0035] 將上述藥物組方按常規(guī)方法制備成顆粒劑。
[0036] 實施例3 :忍冬葉中咖啡?？鼘幩犷愄崛∥锟剐鲁且卟《倦u胚試驗
[0037] 一、對雞胚的毒性試驗
[0038] (1)試驗藥物：本發(fā)明實施例1制備的咖啡?？鼘幩犷愄崛∥铮肞BS配成200、 100、50 和 25mg/mL;
[0039] (2)試驗方法：將制備的藥品在生物安全柜中采用絨毛尿囊腔接種法接種11日齡 SPF雞胚，接種量0. 2mL/胚，每個濃度接胚5枚雞胚，接種后石蠟封口，放于37°C溫箱中孵 育，每天翻胚2次，觀察雞胚生長情況并記錄雞胚死亡情況，棄去24h內的死胚，連續(xù)觀察 5d。將24h后死去的雞胚放入4°C冰箱，次日無菌收集尿囊液3000r/min離心15min，取各 雞胚尿囊液進行血凝試驗。5d后將所有雞胚放入4°C冰箱過夜，次日進行血凝試驗。
[0040] 血凝試驗的方法為：
[0041] ①取96孔V型血凝板，每孔加入25yL新配制的PBS;
[0042] ②吸取尿囊液25yL于第1孔中，充分混勻后從第1孔吸25yL于第2孔，以此類 推倍比稀釋，至第10孔；第11、12孔分別加入陰性尿囊液對照、和陽性病毒對照；
[0043] ③每孔加入25yL雞紅細胞懸浮液（1 % );
[0044] ④震蕩搖勻后，放入37°C溫箱中孵育15min，對照孔紅細胞將成明顯的鈕扣狀沉 到孔底。
[0045] ⑤結果判定：將板傾斜，觀察紅細胞有無呈淚滴狀流淌。完全血凝（不流淌）的病 毒最高稀釋倍數(shù)代表一個血凝單位（HAU)。
[0046] (3)試驗結果
[0047] 不同濃度的忍冬葉中咖啡?？鼘幩犷愄崛∥飳﹄u胚的毒性試驗結果見表1。
[0048] 表1不同濃度的咖啡?？鼘幩犷愄崛∥锝臃N雞胚的雞胚死亡數(shù)量（5枚/組）
[0049]
【主權項】
1. 一種忍冬葉中咖啡?？鼘幩犷愄崛∥锏闹苽浞椒?，其特征在于，步驟如下： (1) 取忍冬葉，用8-10倍量的乙醇溶液回流提取，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密 度為1.0-1. 1，得初提液； (2) 將步驟（1)制備的初提液，加入等體積的蒸餾水制成懸浮液，將懸浮液用正丁醇進 行萃取，正丁醇相減壓濃縮至相對密度為1. 2-1. 3,得正丁醇萃取物； (3) 將步驟（2)制備的正丁醇萃取物采用聚酰胺填料進行富集分離，洗脫溶劑為乙 醇-水，乙醇、水的體積比為10:90~20:80 ; (4) 合并步驟（3)洗脫后的溶液，濃縮，得浸膏，即為咖啡?？鼘幩犷愄崛∥铩?br>2. 權利要求1所述的制備方法得到的忍冬葉中咖啡?？鼘幩犷愄崛∥?，其特征在于， 所述提取物中咖啡酰奎寧酸的重量百分含量為65-76%。
3. 如權利要求2所述的忍冬葉中咖啡?？鼘幩犷愄崛∥?，其特征在于，所述咖啡?？?寧酸類化合物包括綠原酸、3, 4-0-二咖啡?？鼘幩?、3, 5-0-二咖啡?？鼘幩?、4, 5-0-二咖 啡酰奎寧酸、隱綠原酸和新綠原酸。
4. 權利要求2所述的忍冬葉中咖啡?？鼘幩犷愄崛∥镌谥苽淇剐鲁且卟《镜乃幬镏?的應用。
5. -種抗新城疫病毒的藥物制劑，其特征在于，該藥物制劑以含有藥學有效量的權利 要求2所述的忍冬葉中咖啡?？鼘幩犷愄崛∥餅橛行С煞帧?br>6. 如權利要求5所述的藥物制劑，其特征在于，該藥物制劑與藥用輔料混合，以常規(guī)方 法制成膠囊劑、片劑、顆粒劑、粉劑或注射劑。
7. 如權利要求6所述的藥物制劑，其特征在于，所述的藥用輔料為甘露糖醇、淀粉、甜 菊苷、山梨糖醇、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、聚乙二醇或注射用溶劑中的一種或幾種。
8. 如權利要求7所述的藥物制劑，其特征在于，所述纖維素衍生物為結晶纖維素、羥丙 基纖維素或羧甲基纖維素鈉。
9. 如權利要求7所述的藥物制劑，其特征在于，所述注射用溶劑為水、乙醇或甘油。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種忍冬葉中咖啡?？鼘幩犷愄崛∥锏闹苽浞椒ǎ襟E如下：(1)取忍冬葉，用8-10倍量的乙醇溶液回流提取，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度為1.0-1.1，得初提液；(2)將初提液加入等體積的蒸餾水制成懸浮液，將懸浮液用正丁醇進行萃取，正丁醇相減壓濃縮至相對密度為1.2-1.3，得正丁醇萃取物；(3)將正丁醇萃取物采用聚酰胺填料進行富集分離，洗脫溶劑為乙醇-水，乙醇、水的體積比為10:90～20:80；(4)合并步驟(3)洗脫后的溶液，濃縮，得浸膏，即為咖啡酰奎寧酸類提取物。本發(fā)明制備的提取物中咖啡?？鼘幩岬闹亓堪俜趾繛?5-76％。本發(fā)明的咖啡?？鼘幩犷愄崛∥锞哂休^強的抗新城疫病毒的活性，具有潛在的開發(fā)應用價值。
【IPC分類】A61K127-00, A61P31-14, A61K36-355
【公開號】CN104758340
【申請?zhí)枴緾N201510098630
【發(fā)明人】王曉, 耿巖玲, 王岱杰, 段文娟, 劉峰, 劉偉, 崔莉, 趙恒強, 劉建華
【申請人】山東省分析測試中心
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年3月5日