關節(jié)鏡沖洗液來源間充質干細胞在再生修復中應用
【專利說明】關節(jié)鏡沖洗液來源間充質干細胞在再生修復中應用 所屬技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種關節(jié)鏡沖洗液來源間充質干細胞在再生修復中應用，并提供了一 種關節(jié)鏡沖洗液來源間充質干細胞的分離方法和再生修復治療上的應用，屬于醫(yī)學技術領 域。
【背景技術】
[0002] 關節(jié)鏡是一種觀察關節(jié)內部結構的直徑5_左右的棒狀光學器械，是用于診治關 節(jié)疾患的內窺鏡。該器械從1970年開始推廣應用。關節(jié)鏡在一根細管的端部裝有一個透 鏡，將細管插入關節(jié)內部，關節(jié)內部的結構便會在監(jiān)視器上顯示出來。因此，可以直接觀察 到關節(jié)內部的結構。關節(jié)鏡不僅用于疾病的診斷，而且已經廣泛用于關節(jié)疾病的治療。關 節(jié)鏡手術是一種微創(chuàng)手術，開始主要應用于膝關節(jié)，后相繼應用于髖關節(jié)，肩關節(jié)，踝關節(jié)， 肘關節(jié)及手指等小關節(jié)等。
[0003] 隨著內鏡技術在我國逐漸普及，關節(jié)鏡手術已成為骨關節(jié)外科常規(guī)診療手段。至 今在全身各系統內鏡中，關節(jié)鏡功能最全面、應用最廣泛，并由此形成獨立的關節(jié)鏡外科。 關節(jié)鏡手術業(yè)務成為醫(yī)院和科室績效的增長點。
[0004] 2008年，中國共有790個醫(yī)院擁有關節(jié)鏡系統設施，可以實施關節(jié)鏡手術，這些醫(yī) 院主要集中在三甲醫(yī)院；到了 2012年，中國共有2640個醫(yī)院擁有關節(jié)鏡系統設施，可以實 施關節(jié)鏡手術，平均年增長率35%，覆蓋幾乎所有的三級醫(yī)院和約30%的二甲醫(yī)院。醫(yī)院 采購關節(jié)鏡系統的預算并未受到經濟危機和中國經濟減速的影響。在北京、上海等一些發(fā) 達城市其關節(jié)鏡技術水平已經能夠和發(fā)達國家媲美。關節(jié)鏡手術已經開始從城市三級醫(yī)院 轉向基層，適合我國國情，最大限度的覆蓋了人群。
[0005] 關節(jié)鏡手術可治療關節(jié)內各種炎癥.如骨性關節(jié)炎滑膜炎、創(chuàng)傷性關節(jié)炎、類風 濕性關節(jié)炎、結核性關節(jié)炎、化膿性關節(jié)炎，剝脫性骨軟骨炎等，以及滑膜軟骨瘤病；髕骨軟 化癥；骨贅（骨刺），游離體，滑膜皺壁，關節(jié)紊亂癥，半月板損傷，關節(jié)囊粘連，各種關節(jié)內 骨折，各部關節(jié)粘連及關節(jié)活動受限，各種不明原因的關節(jié)痛。
[0006] 關節(jié)鏡手術和關節(jié)切開術相比，具有下列優(yōu)點：切口小，美觀，可避免晚期因關節(jié) 表面和運動部位的瘢痕而引起的刺激癥狀；屬于微創(chuàng)手術，痛苦小，術后反應較小，患者易 于接受；術后早期即可活動和使用肢體，避免長期臥床并發(fā)癥，減少護理人員和費用；并發(fā) 癥相對較少；基本不影響關節(jié)周圍肌肉結構，術后可早期進行功能鍛煉，防止關節(jié)長期固定 引起的廢用和并發(fā)癥；可以在近乎生理環(huán)境下對關節(jié)內病變進行觀察和檢查，有"把眼睛和 手指放入關節(jié)內"之稱，可對關節(jié)進行動力性檢查，提高了診斷能力，某些疾病如滑膜皺襞 綜合征，是通過關節(jié)鏡才確立的；關節(jié)鏡可施行以往開放性手術難以完成的手術，如半月板 部分切除術等。禁忌癥少，如身體條件差不能行常規(guī)手術，但不一定禁忌關節(jié)鏡手術。
[0007] 關節(jié)鏡也具有一些缺點，一是并非每個醫(yī)生均有耐心進行關節(jié)鏡手術，因為需經 小切口用精細和易損的器械進行操作。二是在緊張的關節(jié)間隙內操作器械可能對關節(jié)軟骨 產生明顯磨損和劃痕，尤其是沒有經驗的醫(yī)生。三是在最初使用關節(jié)鏡操作時可能很費時 間。四是專用器械繁雜而昂貴。
[0008][0009][0010][0011] 以上文獻資料表明，對關節(jié)各組織如軟骨組織、滑膜、滑液等，進行關節(jié)鏡手術時 所產生的大量沖洗液并沒有充分利用，在手術過程中直接丟棄，而手術所需的干細胞通過 其它方式獲得，雖然所獲得的干細胞排異低，還是會造成手術費用較高。
【發(fā)明內容】
[0012] 本發(fā)明采用的技術方案包括：取經關節(jié)鏡手術獲得大量來自關節(jié)各組織（軟骨組 織、滑膜、滑液）的間充質干細胞液，采用分段收集、膜過濾等程序，富集其中細胞成分進行 培養(yǎng)與擴增；富集的細胞經過貼壁生長、增殖、分化以及外源微生物污染檢測等程序后，參 照國際ISCT推薦的間充質干細胞標準對富集的干細胞純度和均一性的鑒定分析，最后分 別儲存于主細胞庫與工作細胞庫用于細胞治療。
[0013] 因此，本發(fā)明提供關節(jié)鏡沖洗液來源間充質干細胞在再生修復中應用，步驟包 括：
[0014] (1)關節(jié)液收集：用無菌的收集管對關節(jié)鏡手術過程中沖洗液進行分段收集沖洗 液，保存?zhèn)溆茫?br>[0015] (2)干細胞分離制備：將分段收集沖洗液通過陶瓷膜過濾，進行細胞富集，所得細 胞分別加入培養(yǎng)液后重新懸浮，按3X105/ml濃度接種到培養(yǎng)瓶及事先放置有消毒蓋玻片 的12孔板中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含15%FBS的L-DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)5~7d去除未貼壁的 細胞后，獲得貼壁細胞；
[0016] (3)合格供體材料檔案：參照國際間充質干細胞標準對貼壁細胞進行純度和均一 性的鑒定分析，確定合格的間充質干細胞，建立相關檔案，同時對合格的干細胞進行傳代， 4~5d傳代一次；
[0017] (4)間充質干細胞的成軟骨分化：將培養(yǎng)傳代3次以上的干細胞，制成濃度為 4XIO5Ail的懸液，取Iml細胞懸液于15ml塑料離心管中，500g離心15min，使其形成細胞微 團，小心吸去培養(yǎng)液，加入2ml無血清軟骨誘導培養(yǎng)液，然后置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 天后首次換液，以后隔2天換液，在培養(yǎng)21天后取出培養(yǎng)的細胞團，檢測成軟骨分化效果；
[0018] (5)植入再生修復效果：將合格的間充質干細胞按一定濃度植入患者關節(jié)處，觀 察關節(jié)再生修復效果。
[0019] 在一個具體實施方案中，步驟（1)所述保存條件是在無菌條件下，4°C儲存小于4 小時，運輸過程中維持在4°C環(huán)境下。
[0020] 在一個具體實施方案中，步聚（2)和（4)中所述細胞培養(yǎng)環(huán)境條件為37°C、5% CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0021] 在一個具體實施方案中，步聚（4)中所述無血清軟骨誘導培養(yǎng)液是指高糖 DMEM(H-DMEM)含TGF-ellng/mL、地塞米松 10 -7mmol/L、維生素C50mg/L，胰島素 6. 25ng/ L，轉鐵蛋白6. 25ug/mL，牛血清白蛋白I. 25ug/mL。
[0022] 所述間國際充質干細胞標準是指參照國際細胞治療學會（ISCT)推薦的間充質干 細胞標準如CD44、CD90、CD105、CD147、CD271、CD166 等。
[0023] 在一個具體實施方案中，步聚（5)中所述植入干細胞濃度在50~4X107/ml。
[0024] 技術效果
[0025] 1、本發(fā)明充分利用丟棄的關節(jié)鏡沖洗液中的間充質干細胞，用于針對關節(jié)軟骨病 變的再生修復治療。
[0026] 2、通過廢棄物再利用能獲得大量干細胞，這將大大滿足患者對干細胞的需要，也 減少了動用患者其它部分干細胞的機率，免受二次手術傷害。
[0027] 3、通過大規(guī)模培養(yǎng)通過關節(jié)鏡沖洗液中的間充質干細胞，能大大降低了患者的醫(yī) 療成本，提高了手術的成功率。
[0028] 4、采用