用于改善角蛋白表面的細(xì)胞中的選擇性分解代謝的方法和組合物的制作方法
【專利說(shuō)明】用于改善角蛋白表面的細(xì)胞中的選擇性分解代謝的方法和 組合物
[0001] 相關(guān)申請(qǐng) 本申請(qǐng)要求2012年9月14日提交的臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/701，130的優(yōu)先權(quán)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明處于增強(qiáng)皮膚細(xì)胞中的選擇性分解代謝（catabolysis)的用于施用于皮 膚的組合物的領(lǐng)域中。
【背景技術(shù)】
[0003] 眾所周知，應(yīng)激和環(huán)境侵害因素諸如UV光、污染和香煙煙霧可對(duì)皮膚非常有害， 并且加速衰老的出現(xiàn)。暴露于應(yīng)激和環(huán)境侵害因素經(jīng)常引起對(duì)細(xì)胞DNA、線粒體和細(xì)胞蛋 白、脂質(zhì)和組織的損害。細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的受損細(xì)胞物質(zhì)，例如，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器碎片可以通過(guò) 阻止其正常代謝過(guò)程對(duì)細(xì)胞施加毒性作用。
[0004] 健康細(xì)胞具有正常的清潔過(guò)程，其消除受損的細(xì)胞材料和碎片。此類解毒經(jīng) 常通過(guò)被稱為自體吞噬的吞噬過(guò)程發(fā)生，其中細(xì)胞碎片被吞噬在液泡內(nèi)，并且用細(xì)胞酶 諸如溶菌酶降解。自體吞噬和皮膚細(xì)胞中自體吞噬活化的機(jī)制描述于美國(guó)專利公開(kāi)號(hào) 2011/0243983 A1，其以其整體通過(guò)引用并入本文。存在很大興趣配制皮膚處理組合物以含 有刺激細(xì)胞自體吞噬的成分，因?yàn)榧?xì)胞自身清潔和解毒碎片的能力得到改善，所述碎片否 則妨礙健康的代謝功能。通過(guò)自體吞噬的清潔為細(xì)胞功能生成新的能量來(lái)源，因?yàn)榻到猱a(chǎn) 物釋放可以由細(xì)胞再循環(huán)的構(gòu)建塊（building blocks)，諸如氨基酸。改善的細(xì)胞代謝功 能進(jìn)而意指改善的細(xì)胞健康和長(zhǎng)壽，和對(duì)衰老的不期望的副作用（諸如細(xì)紋、皺紋、皮膚斑 駁、色素沉著、松弛等）的更大抗性。
[0005] 蛋白酶體是細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的大蛋白復(fù)合物。蛋白酶體的主要功能是通過(guò)蛋 白水解（打斷肽鍵的化學(xué)反應(yīng)）降解受損蛋白。促進(jìn)降解的酶被稱為蛋白酶。蛋白酶能夠 實(shí)現(xiàn)蛋白濃度的細(xì)胞調(diào)節(jié)以及錯(cuò)誤折疊的蛋白的降解。此類降解產(chǎn)生短肽，所述短肽進(jìn)而 可以進(jìn)一步降解成氨基酸，所述氨基酸可以在細(xì)胞中再循環(huán)，且用于新蛋白的合成。當(dāng)細(xì)胞 通過(guò)UV暴露或環(huán)境侵害而變得被破壞時(shí)，蛋白酶體失去有效性。這進(jìn)而意味著，細(xì)胞不以 及時(shí)模式解毒受損細(xì)胞蛋白。此類污染的細(xì)胞表現(xiàn)出降低的代謝功能，這進(jìn)而加劇與老化 皮膚相關(guān)的狀況，諸如細(xì)紋、皺紋、色素不均、松弛等。
[0006] 因此，有利地影響正常細(xì)胞清潔過(guò)程的任何成分都促進(jìn)細(xì)胞的健康和長(zhǎng)壽，且最 大限度地減少皮膚上的環(huán)境、UV光、污染和其它環(huán)境損害的不利影響。
[0007] 因此，感興趣的是，通過(guò)用刺激自然細(xì)胞修復(fù)過(guò)程的成分處理它們通過(guò)，例如，消 除細(xì)胞碎片和毒素，最大限度地增加細(xì)胞健康和細(xì)胞（特別是皮膚細(xì)胞諸如角質(zhì)細(xì)胞或成 纖維細(xì)胞）的長(zhǎng)壽，并且另外，通過(guò)確保解毒機(jī)制的最大數(shù)量是可操作的而最大限度地增 加此類細(xì)胞解毒的有效性。還感興趣的是，刺激解毒過(guò)程，其中細(xì)胞碎片和毒素的降解導(dǎo)致 產(chǎn)生可以被細(xì)胞再循環(huán)的氨基酸或其它生物分子。
[0008] 因此，有必要通過(guò)刺激細(xì)胞中的選擇性分解代謝而最大限度地增加細(xì)胞的健康和 長(zhǎng)壽，使得去除細(xì)胞碎片和毒素且可以再循環(huán)此類降解的副產(chǎn)物。更優(yōu)選地，選擇性分解代 謝是由于增強(qiáng)蛋白酶體活性、增強(qiáng)自體吞噬活性和/或增強(qiáng)其它細(xì)胞清潔和/或解毒過(guò)程 導(dǎo)致的。
[0009] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，含有至少一種自體吞噬活化劑和至少一種蛋白酶體活化劑的組合物表 現(xiàn)出選擇性細(xì)胞分解代謝的最大有效性，即，通過(guò)將廢產(chǎn)物降解為在正常代謝功能中由細(xì) 胞再循環(huán)和使用的分子而清潔細(xì)胞的毒性廢產(chǎn)物。
[0010] 發(fā)明概沐 本發(fā)明涉及用于處理角蛋白表面以刺激選擇性分解代謝的組合物，其包含至少一種蛋 白酶體活化劑和至少一種自體吞噬活化劑。
[0011] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)將包含至少一種蛋白酶體活化劑和至少一種自體吞噬活 化劑的組合物施用于角蛋白表面而刺激此類表面的細(xì)胞中的選擇性分解代謝的方法。
[0012] 詳沭 I.宙義 本文提及的所有百分率是重量百分率，除非另有說(shuō)明。
[0013] 本文提及的所有文件都以其整體通過(guò)引用并入。
[0014] "自體吞噬"意指細(xì)胞通過(guò)在碎片周圍形成膜、將其與細(xì)胞的剩余部分分離、且將 形成的液泡與細(xì)胞溶酶體接合而自身清潔毒素和碎片的過(guò)程，所述細(xì)胞溶酶體是含有酸水 解酶的細(xì)胞器，所述酸水解酶降解液泡中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞碎片和廢物。
[0015] "自體吞噬活化劑"意指刺激正常細(xì)胞自體吞噬過(guò)程的成分。
[0016] "CLOCK基因活化劑"意指活化角質(zhì)細(xì)胞中存在的一種或多種CLOCK基因的成分。
[0017] 術(shù)語(yǔ)"DNA修復(fù)酶"意指可操作修復(fù)DNA堿基誘變損傷的酶。此類酶經(jīng)常通過(guò)其修 復(fù)的DNA損傷的類型分類，例如，BER(堿基切除修復(fù)）酶、核苷酸切除修復(fù)（NER)酶；錯(cuò)配 修復(fù)（MMR)酶；DNA解旋酶；DNA聚合酶等。例如，突變諸如8-氧代-7, 8-二氫-2' -脫氧 鳥(niǎo)苷可以通過(guò)OGGl (8-氧代鳥(niǎo)嘌呤糖基化酶）修復(fù)；可以通過(guò)（核苷酸切除修復(fù)（NER)光 解酶）修復(fù)的T-T二聚體；6-4光產(chǎn)物（其可以通過(guò)NER修復(fù)）；和06-甲基鳥(niǎo)嘌呤（其可 以通過(guò)06-烷基鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移酶（AGT)修復(fù)）。
[0018] "PER1基因活化劑"意指活化角質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種或多種PERl基因的成分。 [0019] "蛋白酶體"意指通常位于細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中的蛋白復(fù)合物，其通過(guò)蛋白水 解成較小亞單位、所述較小亞單位然后可以進(jìn)一步消化成單個(gè)氨基酸而可操作降解受損細(xì) 胞蛋白。這些再循環(huán)氨基酸可以在新蛋白的合成中由細(xì)胞使用。
[0020] "蛋白酶體活化劑"意指刺激角蛋白表面的細(xì)胞（諸如角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等） 中的蛋白酶體的活性的活性成分。
[0021] "再循環(huán)"意指，關(guān)于細(xì)胞碎片和毒素的降解，該碎片和毒素可被降解成分子，諸如 蛋白、脂質(zhì)、氨基酸或由細(xì)胞在其正常健康代謝過(guò)程中可用的其它生物材料。
[0022] "修復(fù)"意指，關(guān)于皮膚細(xì)胞，細(xì)胞的受損部分諸如DNA、線粒體、蛋白、脂質(zhì)或其它 細(xì)胞材料得到減少或消除。
[0023] "選擇性分解代謝"意指，關(guān)于角蛋白表面的細(xì)胞，該細(xì)胞能夠選擇性自身清潔碎 片、廢物和毒素，而不損害健康的細(xì)胞成分，且優(yōu)選通過(guò)機(jī)制諸如活化細(xì)胞的自體吞噬或活 化細(xì)胞的蛋白酶體過(guò)程中的一者或兩者而實(shí)現(xiàn)。
[0024] II.自體吞噬活化劑 本發(fā)明的組合物含有至少一種成分，所述成分可操作活化正常細(xì)胞的自體吞噬過(guò) 程。所述自體吞噬活化劑以范圍為約0.00001 % -20%、優(yōu)選0.0001 % -5%、更優(yōu)選約 0. 001%-1%的量存在。通常，細(xì)胞的自體吞噬過(guò)程包含四個(gè)一般步驟。步驟1是液泡形成 的起始；步驟2,初始液泡或自體吞噬體（其隔離待降解的細(xì)胞質(zhì)材料）的形成。步驟3是 自體吞噬體成熟為降解的液泡。步驟4是隔離材料的實(shí)際降解。
[0025] 具有自體吞噬活化活性的成分可以通過(guò)其刺激或抑制各種細(xì)胞代謝途徑的能力 來(lái)鑒定。例如，刺激MAP-LC3、ATG5-12、蛋白p53、AMPK或DRAM的表達(dá)的成分是合適的自體 吞噬活化劑。抑制mTOR的表達(dá)的成分也是合適的自體吞噬活化劑。
[0026] 基因 MAP-LC3編碼微管相關(guān)蛋白1輕鏈3,即起始自體吞噬體的形成的蛋白。 ATG5-12還刺激自體吞噬體的形成。mTOR，也被稱為雷帕霉素的哺乳動(dòng)物目標(biāo)，也被稱為雷 帕霉素或FK506結(jié)合蛋白12-雷帕霉素相關(guān)蛋白I(FRAPl)的機(jī)械目標(biāo)。FRAPl由FRAP基 因編碼。抑制mTOR的表達(dá)且參與自體吞噬體生成的任何成分將具有自體吞噬活化特性。 也適合作為自體吞噬活化劑的是刺激角質(zhì)細(xì)胞中的蛋白p53、AMPK和/或DRAM(損害補(bǔ)救 自體吞噬調(diào)節(jié)蛋白）的表達(dá)的成分。蛋白 P53,也被稱為腫瘤抑制蛋白，由p53基因編碼。 AMPK意指AMP活化蛋白激酶和DRAM，損害相關(guān)的自體吞噬調(diào)節(jié)劑。兩者都已知刺激角質(zhì)細(xì) 胞中的自體吞噬活化。
[0027] 因此，對(duì)所述基因具有上述作用的任何成分可以是合適的自體吞噬活化劑。在自 體吞噬過(guò)程期間，細(xì)胞碎片諸如氧化蛋白和過(guò)氧化脂質(zhì)被降解。此類細(xì)胞碎片經(jīng)常影響正 常的代謝功能。篩選成分以通過(guò)刺激或抑制細(xì)胞、優(yōu)選角化細(xì)胞、上述基因和/或蛋白的能 力測(cè)定效力可以根據(jù)如美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)2011/0243983或本領(lǐng)域中已知的其它方法記載的 方法來(lái)進(jìn)行。
[0028] 例如，用于鑒定可以是自體吞噬活化劑的成分的一種通用方法是通過(guò)首先在培養(yǎng) 細(xì)胞諸如角質(zhì)細(xì)胞中誘導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激。例如，細(xì)胞首先在具有生長(zhǎng)因子的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 持續(xù)約24小時(shí)。然后去除培養(yǎng)基，并且用非營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（例如，不含有生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基） 替換。細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激狀態(tài)中培養(yǎng)約30分鐘至約25小時(shí)。然后，去除非營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，并且 用完全培養(yǎng)基替換以促進(jìn)細(xì)胞回收率。此后，通過(guò)在那些細(xì)胞中測(cè)量MAP-LC3 ;ATGS-12 ;磷 酸化的mTOR ;磷酸化的p53 ;DRAM ;或磷酸化的AMPK中的一種或多種的表達(dá)評(píng)價(jià)細(xì)胞的自 體吞噬活性。此類表達(dá)的測(cè)量可以通過(guò)免疫熒光測(cè)量發(fā)生。此外，該表達(dá)可以通過(guò)與表達(dá) 的基因相關(guān)的磷酸化蛋白的Western印跡分析來(lái)驗(yàn)證。
[0029] 已知對(duì)上面提及的基因施加刺激或抑制作用（其進(jìn)而刺激自體吞噬）的成 分的實(shí)例是酵母提取物，所述酵母提取物包括但不限于來(lái)自諸如以下的屬的那些：石 枝藻屬（Zi從〇 腫)、草木樨屬植物JrO ?)、柑橘屬植物（CY tras)、念珠菌屬 (CaWiiZa)、尊麻屬（Criica)、楊桃屬、苦瓜屬ca)、耶氏酵 母屬（7ar/wia)、白花丹屬植物等。進(jìn)一步的具體實(shí)例包括嗜1?石枝藻 {Lithothamniumn calcareum) {Melilotus officinalis) {Citrus 、saitoana 念珠菌(Candida saitoana) > Lens culinaria^ ^ j# {Urtica t/ioica)、楊桃（JFerrAoa caraffi/w/a)、苦瓜ca 、解脂耶氏酵母 {Yarrowia Iipolyticd)UjIumbag