TNF- α的釋放，及血清中IL-4的濃度(圖8)。以上結(jié)果表明HAMI 3379及普魯司特對大鼠局灶性腦缺血損傷后有關(guān)炎癥因子的釋放有抑制作用。
[0159]4.神經(jīng)元密度
[0160]大鼠腦缺血再灌注24h后，10 μ m冠狀切片甲苯胺藍(lán)染色顯示，缺血側(cè)皮層神經(jīng)元尼氏小體減少、胞體固縮并且染色加深。缺血側(cè)皮層中心區(qū)及周邊區(qū)NeuN陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低(圖9A-D)，缺血再灌注72h后，神經(jīng)元丟失與損傷進一步加重(圖9E)，HAMI 3379及普魯司特能顯著減少缺血再灌注24?72h缺血中心區(qū)和缺血周邊區(qū)神經(jīng)元丟失，保護神經(jīng)元損傷(圖9)。
[0161]5.神經(jīng)元壞死
[0162]Fluoro-Jade B染色顯示發(fā)生變性壞死的神經(jīng)元，胞體和軸突或樹突呈綠熒光(圖10A)，在大鼠局灶性腦缺血再灌注24?72h，缺血周邊區(qū)及中心區(qū)Fluoro-Jade B染色陽性細(xì)胞數(shù)呈減少趨勢，HAMI 3379及普魯司特能夠顯著減少缺血再灌注24，72h皮層缺血中心區(qū)及周邊區(qū)Flu0r0-Jade B染色陽性的變性神經(jīng)元數(shù)目(圖10)。以上結(jié)果表明腹腔注射HAMI 3379對大鼠局灶性腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷有保護作用。
[0163]6.星形膠質(zhì)細(xì)胞
[0164]腦缺血誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生。與對照組相比，GFAP免疫染色陽性細(xì)胞數(shù)在再灌注24h內(nèi)并沒有明顯改變(圖11B)，再灌注3d后缺血周邊區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞開始顯著增多，并呈現(xiàn)激活后的肥大形態(tài)，胞體變大，突起變長變多。普魯司特(0.1 mg/kg)能顯著抑制再灌注3d缺血周邊星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，HAMI 3379則作用不明顯(圖11)。
[0165]7.小膠質(zhì)細(xì)胞
[0166]缺血后，Iba-1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞被迅速激活，并向損傷區(qū)域迀移。再灌注24h內(nèi)，缺血中心區(qū)和周邊區(qū)皮層Iba-1陽性細(xì)胞數(shù)目無明顯變化，但細(xì)胞形狀變得不規(guī)則，突起減少(圖12B);再灌注72h，缺血皮層中心區(qū)和周邊區(qū)Iba-1陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多，并且細(xì)胞形狀也發(fā)生變化(圖12A，12C)。HAMI 3379(0.lmg/kg)能明顯改善缺血周邊區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞增生，普魯司特對Iba-1陽性細(xì)胞數(shù)目無明顯影響(圖12)。
[0167]ED-1用以檢測激活的小膠質(zhì)細(xì)胞，假手術(shù)組皮層幾乎沒有ED-1陽性的吞噬細(xì)胞分布；缺血再灌24h，中心區(qū)以及周邊區(qū)皮層有少量激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分布(圖13B);缺血再灌72h，缺血皮層中心區(qū)和周邊區(qū)ED-1陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多，但周邊區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)亦同步增加，但相對較少。與Iba-1相似，HAMI 3379(0.lmg/kg)能明顯抑制再灌72h缺血中心區(qū)及周邊區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活，普魯司特對此無明顯作用(圖13)。
[0168]8.中性粒細(xì)胞
[0169]假手術(shù)組腦組織內(nèi)無中性粒浸潤，缺血再灌24、72h，腦缺血小鼠缺血側(cè)皮層梗死區(qū)內(nèi)，MPO免疫染色陽性的中性粒細(xì)胞浸潤顯著增加，HAMI 3379和普魯司特(0.01,0.1mg/kg)能夠顯著減少缺血再灌72h皮層缺血區(qū)中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)目(圖14)。
[0170]實施效果:HAMI 3379對大鼠局灶性腦缺血急性期損傷的保護作用具有劑量及時間依賴性。HAMI 3379對大鼠缺血再灌注24，72h的損傷均具有改善作用，即可減少神經(jīng)功能損傷、減輕腦梗死、腦水腫及缺血側(cè)神經(jīng)元丟失與壞死。HAMI 3379可減少MCAO術(shù)后24h血清、腦脊液中IL-1 β，IFN- γ，TNF- α的釋放。HAMI 3379還可抑制MCAO術(shù)后72h缺血側(cè)半球MPO的浸潤，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，但對該時間點星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生無明顯抑制作用。HAMI 3379腹腔注射的有效劑量0.1?0.4mg/kg，HAMI 3379腹腔注射的作用時間窗是lh。上述結(jié)果表明腹腔注射給藥對大鼠局灶性腦缺血再灌注后24?72h損傷具有保護作用，故CysLT2R可作為腦缺血治療的新靶點。
[0171]實施例3XysLLR選擇性拮抗劑HAMI 3379腹腔注射給藥對大鼠局灶性腦缺血■慢性損傷的保護作用
[0172]1.行為學(xué)改變
[0173]MCAO術(shù)后14d內(nèi)，在第l、3、5、7、10、14d評價神經(jīng)癥狀及感覺運動功能缺損。假手術(shù)組大鼠術(shù)后14d內(nèi)無神經(jīng)癥狀。生理鹽水組腦缺血大鼠，MCAO術(shù)后24h神經(jīng)癥狀評分值最高，在7d內(nèi)逐步下降，1d后基本達到最低水平并維持至14d，HAMI 3379和普魯司特連續(xù)6d的治療可顯著降低大鼠MCAO術(shù)后7d內(nèi)神經(jīng)癥狀評分(圖15A)。在斜板實驗中，假手術(shù)組大鼠術(shù)后14d內(nèi)斜板角度相對穩(wěn)定，生理鹽水組斜板角度變化趨勢同神經(jīng)癥狀評分保持一致，HAMI 3379和普魯司特的治療提高了術(shù)后I?7d的斜板角度，改善了神經(jīng)功能損傷(圖15B)。術(shù)后10?14d，各組間神經(jīng)癥狀評分及斜板角度均無顯著差異(圖15)。
[0174]2.腦萎縮
[0175]除假手術(shù)組之外，缺血14d后的大鼠缺血區(qū)腦表面都呈現(xiàn)萎縮改變(圖16)。全腦大體攝影和冠狀腦片TTC染色顯示，腦缺血對照組大鼠的腦表面萎縮較為嚴(yán)重，而HAMI3379及普魯司特組梗死灶萎縮明顯減輕，損傷側(cè)與對側(cè)腦體積比例升高，HAMI 3379亦能顯著縮小梗死體積(圖16)。
[0176]3.神經(jīng)元密度
[0177]大鼠腦缺血再灌注14d后，10 μ m冠狀切片甲苯胺藍(lán)染色顯示，缺血側(cè)皮層神經(jīng)元尼氏小體減少、胞體固縮并且染色加深(圖17A)。缺血側(cè)皮層中心區(qū)神經(jīng)元消失，周邊區(qū)神經(jīng)元密度(NeuN陽性細(xì)胞)明顯降低，HAMI 3379及普魯司特能明顯改善缺血周邊區(qū)神經(jīng)元損傷，提高存活密度(圖17)。
[0178]4.小膠質(zhì)細(xì)胞
[0179]缺血后，Iba-1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞被迅速激活，并向損傷區(qū)域迀移。再灌注14d后，缺血中心區(qū)及周邊區(qū)Iba-1陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞顯著增多，普魯司特明顯減少缺血中心區(qū)Iba-1陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞但對周邊區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞增生無影響，HAMI 3379則可改善周邊區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞增生而對中心區(qū)Iba-1陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞無作用(圖18)。
[0180]用ED-1檢測激活的小膠質(zhì)細(xì)胞，再灌注14d后，缺血中心區(qū)及周邊區(qū)ED-1陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞顯著增多，HAMI3379與普魯司特均可抑制中心區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞增生而對周邊區(qū)ED-1陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞無作用(圖19)。
[0181]5.星形膠質(zhì)細(xì)胞
[0182]MCAO術(shù)后14d，缺血側(cè)半球可見膠質(zhì)疤痕形成。慢性腦缺血性損傷區(qū)，腦組織液化形成組織空洞，周圍被疤痕組織包裹。GFAP陽性星形膠質(zhì)纖維胞體肥大，排列于空洞邊緣，形成膠質(zhì)疤痕壁。大量增生肥大的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞聚集于膠質(zhì)疤痕內(nèi)。HAMI3379及普魯司特顯著減少皮層聚集的星形膠質(zhì)細(xì)胞密度及灰度(圖20)。
[0183]實施效果:HAMI 3379(0.lmg/kg, 1.p.)術(shù)后連續(xù)給藥6d，能顯著減少大鼠MCAO術(shù)后O?7d的神經(jīng)癥狀評分，提高斜板角度，減輕大鼠MCAO術(shù)后14d的腦萎縮，減少缺血周邊區(qū)的神經(jīng)元丟失，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生。以上結(jié)果提示HAMI3379對大鼠局灶性腦缺血慢性損傷有保護作用。
[0184]以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。
【主權(quán)項】
1.一種半胱氨酰白三烯受體-2選擇性拮抗劑HAMI 3379在治療局灶性腦缺血損傷中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的半胱氨酰白三烯受體-2選擇性拮抗劑HAMI3379在治療局灶性腦缺血損傷中的用途，其特征在于，所述用途具體為在治療局灶性腦缺血急性損傷中的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的半胱氨酰白三烯受體-2選擇性拮抗劑HAMI3379在治療局灶性腦缺血損傷中的用途，其特征在于，所述用途具體為在治療局灶性腦缺血亞急性期有關(guān)炎癥的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的半胱氨酰白三烯受體-2選擇性拮抗劑HAMI3379在治療局灶性腦缺血損傷中的用途，其特征在于，所述用途具體為在治療局灶性腦缺血慢性損傷中的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的半胱氨酰白三烯受體-2選擇性拮抗劑HAMI3379在治療局灶性腦缺血損傷中的用途，其特征在于，所述用途具體為恢復(fù)腦缺血后神經(jīng)功能損傷的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求1?5任一項所述的半胱氨酰白三烯受體-2選擇性拮抗劑HAMI3379在治療局灶性腦缺血損傷中的用途，其特征在于，所述用途中半胱氨酰白三烯受體-2選擇性拮抗劑HAMI 3379的使用方式為腹腔注射給藥。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的半胱氨酰白三烯受體-2選擇性拮抗劑HAMI3379在治療局灶性腦缺血損傷中的用途，其特征在于，所述腹腔注射給藥的有效劑量是0.1?0.4mg/kg。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的半胱氨酰白三烯受體-2選擇性拮抗劑HAMI3379在治療局灶性腦缺血損傷中的用途，其特征在于，所述腹腔注射給藥的治療時間窗為術(shù)后lh。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種受體拮抗劑在治療局灶性腦缺血損傷中的用途，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體包括在大鼠局灶性腦缺血模型中，HAMI 3379側(cè)腦室給藥對該腦缺血模型的急性損傷具有保護作用；HAMI 3379腹腔注射給藥對急性、亞急性損傷亦有保護作用，并可減輕炎癥反應(yīng)，尤其能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活；HAMI 3379腹腔注射給藥對腦缺血慢性損傷仍具有保護作用，可促進神經(jīng)功能恢復(fù)。
【IPC分類】A61P9-10, A61P7-10, A61K31-196, A61P29-00, A61P25-00
【公開號】CN104800198
【申請?zhí)枴緾N201510029985
【發(fā)明人】石巧娟, 李巍, 盧領(lǐng)群, 樓琦, 郭紅剛, 黃河儒, 劉月環(huán), 應(yīng)華忠, 魏爾清
【申請人】浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年1月21日