一種磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑在Joubert 綜合征中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] Joubert綜合征是一種多基因常染色體隱性遺傳疾病，是一類由于纖毛缺陷 導(dǎo)致的"纖毛缺陷疾病"（ciliopathies)，其發(fā)病率約為1/1，000,000。臨床表現(xiàn)主 要有小腦蚓部發(fā)育不良、視網(wǎng)膜萎縮、腎囊腫、多指（趾）畸形等。inpp5e(In〇Sit〇l polyphosphate5-phosphataseE)是2009年被確定的Joubert綜合征的致病基因 之一，其蛋白產(chǎn)物INPP5E是一種磷酸肌醇的水解酶。體外酶活性主要表現(xiàn)為分別將 PI(3, 4, 5)P3 (phosphoinositol-3, 4, 5-triphosphate)和PI(4, 5)P2(phosphoinositol -4,5-triphosphate)水解為PI(3,4)P2(phosphoinositol-3,4_biphosphate)和PI(4) P(phosphoinositol-4_phosphate)，體內(nèi)可能只水解PI(3, 4, 5)P3。Joubert綜合征病人相 關(guān)染色體研宄發(fā)現(xiàn)，如果突變導(dǎo)致INPP5E在細(xì)胞內(nèi)的定位改變或者酶活性缺失，其病人均 可出現(xiàn)Joubert綜合征表型。由于發(fā)病機制尚不清楚，臨床上Joubert綜合征目前無特效 治療方法，主要靠康復(fù)治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種磷脂酰肌醇 3-激酶抑制劑的應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0005] 利用Morpholino-寡核苷酸反義技術(shù)在斑馬魚胚胎中抑制inpp5e的表達(dá)，3天 (daypostfertilization,dpf)的胚胎中觀察到腎管膨大和腎囊腫的表型，其結(jié)果與 Joubert綜合征的臨床表現(xiàn)一致。免疫熒光標(biāo)記顯示在腎囊腫表型的胚胎中腎管表皮細(xì)胞 中的基體（basalbodies)存在定位缺陷。PI(4, 5)PjPPI(3, 4, 5)P3可通過影響細(xì)胞極性 從而影響纖維型肌動蛋白（F-Actin,FibrousActin)以及基體的定位。進(jìn)一步研宄表明， 通過應(yīng)用磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol-3_Kinase，PI3K)抑制劑或顯性失活 PI3K(dominantnegativePI3K)抑制PI3K的活性可以緩解由于inpp5e缺失造成的纖毛缺 陷和多囊腎等表型。
[0006] Joubert綜合征的藥物靶點為細(xì)胞內(nèi)PI3K酶。因此本發(fā)明提供一種磷脂酰肌醇 3-激酶抑制劑在Joubert綜合征中的應(yīng)用。
[0007] -種磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的應(yīng)用，用于制備治療Joubert綜合征的藥物。
[0008] 所述的磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑抑制磷脂酰肌醇3-激酶的活性，緩解由于 inpp5e缺失造成的Joubert綜合征表型。
[0009] 所述的磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑為小分子化合物及其衍生化合物，中藥、植物藥 提取物、有效部位或有效成分，核酸類、多肽類或蛋白質(zhì)類藥物?？梢詥为毷褂没蚵?lián)合其他 藥物使用。
[0010] 作為優(yōu)選，所述的磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑為LY294002。
[0011] 作為另一種實施方式，還可以通過過表達(dá)dnPI3K來顯性抑制磷脂酰肌醇3-激酶 活性，所述的dnPI3K為磷脂酰肌醇3-激酶的顯性抑制突變形式。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是，利用磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑，可有效 地改善Joubert綜合征模式動物的多囊腎等表型，對改善Joubert綜合征病人的預(yù)后具有 潛在的臨床應(yīng)用價值。本發(fā)明既進(jìn)一步闡明了Joubert綜合征的發(fā)病機制，又為Joubert 綜合征的治療提供了新的治療靶點。
【附圖說明】
[0013] 圖1為抑制inpp5e導(dǎo)致多囊腎生成及纖毛發(fā)生缺陷結(jié)果；
[0014] 圖2為LY294002緩解因inpp5e缺失而形成的多囊腎和纖毛缺陷統(tǒng)計結(jié)果；
[0015] 圖3為過表達(dá)dnPI3K抑制inpp5emorphant的囊腫發(fā)生統(tǒng)計結(jié)果。
【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0017] 實施例
[0018] LY294002和dnPI3K用于挽救下調(diào)inpp5e導(dǎo)致的多囊腎表型的研宄
[0019] 第一步：注射inpp5e嗎啉寡聚核苷酸導(dǎo)致斑馬魚胚胎產(chǎn)生多囊腎表型
[0020] 在發(fā)育時期處于1 一 2個細(xì)胞期的斑馬魚胚胎中分別注射由GeneTools公司合成 的inpp5emorpholinob' -GCTCACTCATCCTAITGGCGGGCTT-3'，序列如SEQIDN0.1 所 示）6pg和對照組Ctrl嗎啉寡聚核苷酸CCCTCTTACCTCAGTTACAAITTATA-3 ^，序列如 SEQIDNO. 2 所示）6pg。在 72 小時（hourpostfertilization,hpf)時，相比于正常的 ctrl組，在注射了inpp5emorpholino的胚胎中（inpp5emorphant)有70%左右產(chǎn)生腎囊 腫。在inpp5emorphant中共注inpp5e的mRNA可以挽救腎囊腫的表型。Dent's固定胚 胎后進(jìn)行免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)inpp5emorphant胚胎的中段腎管出現(xiàn)腫大并且多纖毛和單纖 毛都缺失，見圖1。
[0021] 圖1表示抑制inpp5e導(dǎo)致多囊腎生成及纖毛發(fā)生缺陷結(jié)果。在72hpf時，相比于 正常的對照組（見圖a)，在注射了inpp5e嗎啉寡聚核苷酸的胚胎中（inpp5e嗎啡啉突變 體）有70 %左右產(chǎn)生腎囊腫（見圖b右上放大圖，c的實驗組）。在inpp5e嗎啡啉突變體 中共注inpp5e的mRNA可以挽救腎囊腫的表型（見圖c的挽救組）。Dent's固定胚胎后進(jìn) 行免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)inpp5e嗎啡啉突變體胚胎的中段腎管出現(xiàn)腫大（圖e)并且多纖毛和 單纖毛都存在缺失（見圖e，g'）。aPKC染腎管內(nèi)徑，acetub染纖毛。比例尺為10納米， ***，p〈0.OOl0
[0022] 第二步：LY294002能夠緩解inpp5e缺失造成的多囊腎
[0023] LY294002,CAS#154447-36-6,SelleckChemicals公司，溶于DMSO配成I. 5mM溶 液。
[0024] 待inpp5emorphant和ctrlmorphant發(fā)育至胚盾期，每種morphant分為兩組， 將培養(yǎng)液分別替換為含15M的LY294002的培養(yǎng)液和含1%DMSO的培養(yǎng)液，在第3天觀察胚 胎發(fā)現(xiàn)，Ctrlmorphant組中分別加I%DMSO和LY294002的胚胎都能正常發(fā)育且無異常表 型。在inpp5emorphant中加1%DMSO培養(yǎng)液的胚胎中發(fā)現(xiàn)有76%胚胎存在腎囊腫，但在 加有LY294002的inpp5emorphant組胚胎中只存在35 %的胚胎仍存在腎囊腫，3次重復(fù)操 作后統(tǒng)計見圖2。
[0025]inpp5e嗎啡啉突變體用LY294002處理后與DMSO組相比腎囊腫發(fā)生比例由75% 下降至35% (圖2左列）。纖毛畸形比例也由85%下調(diào)至40% (圖2右列）。*#，p〈0. 001。
[0026] 第三步：dnPI3K挽救實驗
[0027] dnPI3K是PI3K的dominantnegative形式，在胚胎中過表達(dá)dnPI3K能起到顯性 抑dnPI3K是PI3K的顯性抑制突變形式，在胚胎中過表達(dá)dnPI3K能起到顯性抑制PI3K活 性的作用。
[0028] 取400枚1細(xì)胞期的胚胎注射inpp5e嗎啉寡聚核苷酸后，從中隨機取200枚胚胎 加注250pg的dnPI3K。第三天觀察表型時發(fā)現(xiàn)，單注inpp5e嗎啉寡聚核苷酸的胚胎中有 80%都存在腎囊腫，但在加注dnPI3K的胚胎中只含有38%的胚胎存在腎囊腫，3次重復(fù)操 作后統(tǒng)計見圖3。單注inpp5e嗎啉寡聚核苷酸的胚胎中有80%都存在腎囊腫（柱3)，加注 dnPI3K的胚胎腎囊腫發(fā)生率小降至38% (柱4)。*#，p〈0. 001。
[0029] 過表達(dá)dnPI3K或者LY294002藥物處理后的inpp5e嗎啡啉突變體胚胎都存在 40 %左右的腎囊腫表型降低，證明通過PI3K酶活性的抑制可有效地改善Joubert綜合征模 式動物的多囊腎表型。
[0030] 上述的對實施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。 熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般 原理應(yīng)用到其他實施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于上述實施例，本領(lǐng) 域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0031]
【主權(quán)項】
1. 一種磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的應(yīng)用，用于制備治療Joubert綜合征的藥物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的應(yīng)用，其特征在于，所述的 磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑抑制磷脂酰肌醇3-激酶的活性，緩解由于inpp5e缺失造成的 Joubert綜合征表型。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的應(yīng)用，其特征在于，所述的 磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑為小分子化合物及其衍生化合物，中藥、植物藥提取物、有效部 位或有效成分，核酸類、多肽類或蛋白質(zhì)類藥物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的應(yīng)用，其特征在于，所述的 磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑為LY294002。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的應(yīng)用，其特征在于，通過過 表達(dá)dnPI3K來顯性抑制磷脂酰肌醇3-激酶活性，所述的dnPI3K為磷脂酰肌醇3-激酶的 顯性抑制突變形式。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的應(yīng)用，用于制備治療Joubert綜合征的藥物，所述的磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑抑制磷脂酰肌醇3-激酶的活性，緩解由于inpp5e缺失造成的Joubert綜合征表型。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑，可有效地改善Joubert綜合征模式動物的多囊腎等表型，對改善Joubert綜合征病人的預(yù)后具有潛在的臨床應(yīng)用價值。
【IPC分類】A61K45-00, A61P13-12, A61K31-5377, A61P43-00
【公開號】CN104800849
【申請?zhí)枴緾N201510171337
【發(fā)明人】曹瑩, 王宏, 許紋衍
【申請人】同濟(jì)大學(xué)
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年4月13日