一種明膠水凝膠心肌仿生支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域，具體涉及一種可促進心肌細胞生長和心肌片層形成的 明膠水凝膠心肌仿生支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 全球疾病負擔(dān)調(diào)查報告表明，心血管疾病在全球疾病致死率中居于首位，嚴重影 響和危害人類的健康和生活。缺血性心臟病全球致死率逐年增加，1980年有450萬，在1990 年上升到520萬，2000年達到630萬，而在2010年增至700萬。心血管疾病誘發(fā)多種嚴重 的并發(fā)癥，例如心肌梗死，繼而導(dǎo)致心肌壞死和心肌細胞的缺失和死亡。心臟疾病的治療方 法主要有兩種，一是進行心臟移植，二是安裝左心室輔助裝置（LVADs)。心臟移植涉及了復(fù) 雜的法律和醫(yī)學(xué)程序，且捐贈器官有限；而LVADs所需費用昂貴。此外，近些年來一些抗癌 藥物由于產(chǎn)生嚴重的心臟毒性副作用而被召回，給醫(yī)藥公司帶來巨大的經(jīng)濟損失，同時也 讓眾多病患深受其害?；谝陨显颍诮M織工程領(lǐng)域，研發(fā)可改善受損心臟功能的臨床移 植材料或心肌支架，以及在藥物進入臨床應(yīng)用前進行可靠的體外評價和篩選，將讓廣大的 病患大受裨益。近些年心肌組織工程研宄中發(fā)現(xiàn)支架材料的力學(xué)性能對心肌細胞形貌及 功能產(chǎn)生影響，彈性模量能夠影響支架的心臟修復(fù)和血管化功能。心肌組織軟硬度隨個體 的成熟而發(fā)生變化，在新生個體中，心肌組織軟硬度僅在IKPa左右；而在成熟個體中，心臟 舒張期早期的心肌軟硬度為l〇KPa_20KPa，舒張期晚期的心肌軟硬度約在200KPa_300KPa。 因此心肌支架的軟硬度控制在lKPa_300Kpa為佳。研宄表明具有適宜的彈性模量的支架 有利于心臟細胞的形貌和功能，細胞的伸長率最高，興奮閾值更為合理，產(chǎn)生的收縮力度最 強。此外，組織工程研宄中發(fā)現(xiàn)空間結(jié)構(gòu)的調(diào)控可引導(dǎo)細胞分布，促進細胞的成熟和增殖。 最近的研宄顯示：與體內(nèi)心肌層軟硬度相近的水凝膠在體外實驗中可促進心肌細胞的生長 以及干細胞向心肌細胞分化，在體內(nèi)動物心梗模型中可改善心臟功能。合成水凝膠和天然 水凝膠在心肌組織工程中得到廣泛研宄。然而合成水凝膠生物相容性較差且降解速度緩 慢，不利于后期臨床應(yīng)用。天然水凝膠來源廣泛，具有良好的生物相容性和對環(huán)境的敏感 性，且大多具有良好的生物降解性。明膠生物相容性好、無毒、無免疫原性、可生物降解，在 生物材料和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中備受關(guān)注。然而未經(jīng)修飾的明膠穩(wěn)定性和機械性能差，可通過 交聯(lián)的方法進一步改善明膠水凝膠的性能。化學(xué)交聯(lián)目前常使用甲醛、戊二醛、碳二亞胺等 交聯(lián)劑對明膠進行交聯(lián)改性，然而這三種交聯(lián)劑存在生物毒性的問題，影響交聯(lián)后的明膠 的生物相容性。京尼平是梔子果實中的京尼平苷經(jīng)葡萄糖苷酶水解后得到。京尼平 及京尼平苷在中藥中常作為抗炎藥和利膽藥。近年來，也有研宄利用京尼平與明膠交聯(lián)， 改善明膠性能。Lien等人研宄了三種不同的交聯(lián)方式對明膠水凝膠的影響，主要研宄冷 凍干燥的順序?qū)γ髂z水凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響，但是其無法實現(xiàn)對明膠水凝膠軟硬度的調(diào)控 (LienS-M,Liff-T,HuangT-J.Genipin-crosslinkedgelatinscaffoldsforarticular cartilagetissueengineeringwithanovelcrosslinkingmethod[J].Materials ScienceandEngineering:C，2008,28(l):36-43.)。Liang等人研宄了碳二亞胺、京尼 平交聯(lián)的明膠的生物毒性，發(fā)現(xiàn)京尼平交聯(lián)的明膠水凝膠低于碳二亞胺交聯(lián)的明膠水凝 膠，但是其研宄著眼于明膠水凝膠在藥物緩釋中的應(yīng)用，而非心肌支架（LiangHC，Chang WH,LiangHF，etal.Crosslinkingstructuresofgelatinhydrogelscrosslinked withgenipinorawater-solublecarbodiimide[J].JournalofAppliedPolymer Science，2004, 91 (6) :4017-4026.)。張鵬云等人研究了京尼平對靜電紡明膠納米纖維膜改 性的影響，然而靜電紡絲方法獲得的明膠納米纖維軟硬度太大，不適于作為心肌支架的材 料（張鵬云，張建松，徐曉紅等.生物交聯(lián)劑京尼平對靜電紡明膠納米纖維膜改性的影響 [J] ?中國組織工程研宄與臨床康復(fù)，2009, 13 (8) : 1500-1504.)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中交聯(lián)劑生物毒性及交聯(lián)后的彈性模量不適宜心肌細胞生長 的問題，本發(fā)明利用京尼平交聯(lián)明膠水凝膠，確定了京尼平的濃度、交聯(lián)溫度、溶劑等參數(shù)， 得到了與體內(nèi)心肌組織軟硬度一致、利于心肌細胞生長和心肌片層形成的明膠水凝膠支 架。本發(fā)明的另一目的還在于提供一種可促進心肌細胞生長和心肌片層形成的明膠水凝膠 支架的制備方法。
[0004] 為了達到發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：所述仿生支架中的明膠水凝膠是 經(jīng)京尼平交聯(lián)的。
[0005] 所述仿生支架表面具有可引導(dǎo)心肌細胞高度有序排列生長的微結(jié)構(gòu)。
[0006] 所述微結(jié)構(gòu)為平行排列的溝槽結(jié)構(gòu)。
[0007] 所述溝槽結(jié)構(gòu)的溝和嵴的寬度均為5ym~25ym，溝與嵴的高度差為0. 5ym~ IUm〇
[0008] 所述溝槽結(jié)構(gòu)的溝和嵴的寬度優(yōu)選為10ym~20ym。
[0009] 所述微結(jié)構(gòu)的溝和嵴的寬度進一步優(yōu)選為為15ym。
[0010] 所述仿生支架中明膠的質(zhì)量體積比為6 %~20 %。
[0011] 所述的仿生支架的制備方法的具體過程如下：首先將明膠溶于水中，得到質(zhì)量體 積比為6%~20%的明膠溶液；然后吸取所得明膠溶液成膠，即可得到表面無微結(jié)構(gòu)的明 膠水凝膠；最后將京尼平用溶劑溶解，得到質(zhì)量體積比為〇. 1%~1.0%的京尼平溶液，再 將所述無微結(jié)構(gòu)的明膠水凝膠浸泡于所述京尼平溶液中，置于5°C~30°C下中交聯(lián)4小 時~72小時，交聯(lián)完畢后，用超純水清洗支架，最終制備得到所述的仿生支架；所述用于溶 解京尼平的溶劑為水或濃度為IOmM且pH為7. 4的HEPES緩沖液。
[0012] 所述的仿生支架的制備方法中京尼平交聯(lián)的溫度為25°C。
[0013] 所述的表面具有微結(jié)構(gòu)的仿生支架的具體制備過程如下：首先將明膠溶于水中， 得到質(zhì)量體積比為6%~20%的明膠溶液；然后將硅模板上的微結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移至PDMS模板上， 再取所述明膠溶液滴至PDMS模板表面成膠，待明膠水凝膠成膠后，將其從PDMS模板上剝 離，即制備得到表面具有微結(jié)構(gòu)的明膠水凝膠；最后，將京尼平用溶劑溶解，得到質(zhì)量體積 比為0. 1%~1.0%的京尼平溶液，將所述具有微結(jié)構(gòu)的明膠水凝膠浸泡于所述京尼平溶 液中，置于5°C~30°C下交聯(lián)4小時~72小時，交聯(lián)完畢后，用超純水清洗支架，除去殘留 的京尼平，即制備得到所述表面具有微結(jié)構(gòu)的仿生支架；所述用于溶解京尼平的溶劑為水 或濃度為IOmM且pH為7. 4的HEPES緩沖液。
[0014] 所述的表面具有微結(jié)構(gòu)的仿生支架的制備方法中京尼平交聯(lián)的溫度為25°C。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0016] (1)構(gòu)建了一種無生物毒性的經(jīng)京尼平交聯(lián)的明膠水凝膠支架并用于心肌組織工 程技術(shù)領(lǐng)域中，解決了現(xiàn)有技術(shù)中殘留的交聯(lián)劑的生物毒性的問題。
[0017] (2)本發(fā)明的明膠水凝膠支架可以通過改變交聯(lián)條件調(diào)控水凝膠支架的彈性模 量，達到力學(xué)可控的效果，更能模擬體內(nèi)心肌層的力學(xué)性能，能夠更早地實現(xiàn)心肌細胞的整 體同步跳動并帶動基底收縮，從而促進心肌細胞生長和心肌片層形成。
[0018] (3)本發(fā)明的明膠水凝膠支架可以通過調(diào)控水凝膠表面微結(jié)構(gòu)引導(dǎo)心肌細胞沿微 結(jié)構(gòu)方向高度有序地生長，提高細胞的伸長率，使心肌細胞產(chǎn)生的收縮力度增大，進一步地 促進心肌細胞生長和心肌片層的形成。
【附圖說明】
[0019] 圖1 :為實施例2制備得到的明膠水凝膠仿生支架上新生大鼠心肌細胞的搏動情 況，I、II和III為支架上不同位置。
【具體實施方式】：
[0020] 為了加深對本發(fā)明的理解，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳述。
[0021] 實施例1 :
[0022] 步驟1、明膠溶液的制備：稱取0. 6g的明膠溶于IOmL超純水中，室溫溶脹30min 后，置于40°C水浴鍋中溶解，形成質(zhì)量體積比為6%的明膠溶液；
[0023] 步驟2、無微結(jié)構(gòu)的明膠水凝膠支架的制備：吸取400yL步驟1中的明膠溶液注 入內(nèi)徑為IOmm的圓柱體模具中，置于4°C環(huán)境中2小時即可形成無微結(jié)構(gòu)的明膠水凝膠支 架。
[0024] 步驟3、京尼平交聯(lián)水凝膠：稱取一定量的京尼平溶解于超純水中，形成質(zhì)量體積 比為〇. 1%的京尼平溶液。將上述制備得到的水凝膠支架浸泡于京尼平溶液中，置于5°C培 養(yǎng)箱中交聯(lián)4h。交聯(lián)完畢后，超純水清洗支