一種海藻多糖的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種海藻多糖的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展，特別是近年來集約化養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展很快，目前，畜禽疾病防治也面臨很多問題。畜禽傳染病根據(jù)其病原特性大體可分為病毒性疾病、細(xì)菌性疾病、真菌性疾病、支原體病等。而病毒性疾病是目前尚無特效藥物和治療方法的“疑難”。而目前針對病毒性傳染疾病主要采取的措施是注射疫苗、運用抗病毒藥物等治療方法。這兩種方法都存在一定的缺陷，疫苗注射只是針對于某一種病毒有效，不具有廣譜性，而運用抗病毒藥物進(jìn)行治療也具有一定的局限性，它們可以抑制普通的病毒，但對有些病毒的抗性卻不夠理想，而且長期使用會產(chǎn)生耐藥性。
[0003]研宄報道，多糖作為免疫增強(qiáng)劑可以提高傳染性法氏囊炎病毒疫苗、新城疫疫苗的效果。海藻多糖已被發(fā)現(xiàn)具有多種生物學(xué)活性，目前已經(jīng)公開報道的活性包括海藻多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗凝血等活性，但對于海藻多糖作為免疫增強(qiáng)劑，尤其是其在預(yù)防和治療禽流感病毒方面的用途還未見報道。相對于油乳劑全病毒滅活疫苗而言，海藻多糖具有原料來源豐富，生產(chǎn)成本低，制備工藝簡單等若干優(yōu)勢，且其對動物體沒有傷害，并同時具有提高動物免疫力、抗病毒、抗氧化、抗菌等功效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種海藻多糖的應(yīng)用。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]一種海藻多糖的應(yīng)用，海藻多糖作為制備抗病毒或免疫的制劑。
[0007]所述海藻多糖作為制備抗畜禽養(yǎng)殖動物的病毒或其免疫的制劑。
[0008]所述海藻多糖作為制備抗禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊炎病毒、傳染性支氣管炎病毒或輪狀病毒的制劑。
[0009]所述海藻多糖作為制備增強(qiáng)T細(xì)胞或脾淋巴細(xì)胞增殖及活性的增強(qiáng)制劑。
[0010]所述海藻多糖是從海帶、馬尾藻、裙帶菜、泡葉藻、墨角藻、蜈蚣藻、麒麟菜、龍須菜、江蘺、石花菜、瓊脂、萱藻、滸苔和孔石莼中的一種或幾種大型海藻中提取的粗多糖；
[0011]或，將從海帶、馬尾藻、裙帶菜、泡葉藻、墨角藻、蜈蚣藻、麒麟菜、龍須菜、江蘺、石花菜、瓊脂、萱藻、滸苔和孔石莼中的一種或幾種大型海藻中提取的粗多糖通過降解的方式獲得的低分子量多糖或寡糖。
[0012]上述獲得海藻多糖由單糖組成，主要為鼠李糖、甘露糖、半乳糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)、K、Na、Ca和Mg，硫酸根含量在2% -40%之間，其中，粗糖分子量為400KDa-1000KDa，經(jīng)降解后平均分子量在lKDa_400KDa范圍內(nèi)。
[0013]本發(fā)明具有的優(yōu)點:
[0014]本發(fā)明中的海藻多糖均來源于大型經(jīng)濟(jì)海藻，原料來源豐富，生產(chǎn)成本低，并且海藻多糖屬于綠色環(huán)保產(chǎn)品，長期使用不存在對養(yǎng)殖動物的傷害作用；通過細(xì)胞模型和體內(nèi)動物實驗表明，所得到的的海藻多糖具有明顯的抗病毒作用和免疫增強(qiáng)作用，可以對多種病毒具有治療效果，因此具有廣譜性。
[0015]利用本發(fā)明中的海藻多糖直接作用于被病毒侵染的細(xì)胞、雞胚，即可反映證明該海藻多糖具有抗病毒作用。按多糖濃度lmg/ml或0.2mg/ml使用，直接作用于細(xì)胞或雞胚。海藻多糖可以顯著抑制H9N2流感病毒及傳染性法式囊炎B87病毒的活性，如血凝效價降低，病毒拷貝數(shù)降低，細(xì)胞因子表達(dá)升高等。
[0016]本發(fā)明海藻多糖調(diào)節(jié)動物體液免疫力(見實施例2)。以腹腔注射為方法，利用上述海藻多糖為原料，可驗證該多糖對抗體反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用。按動物(小型動物)體重比10mg/kg或50mg/kg使用。海藻多糖與禽流感病毒(AIV)滅活病毒混勻后，按正常免疫劑量，腹腔注射免疫動物。其特征在于:與疫苗相比，海藻多糖效果更好，如抗體水平提升顯著，同時免疫調(diào)節(jié)作用明顯。
[0017]同時海藻多糖也能夠增強(qiáng)動物細(xì)胞免疫力的調(diào)節(jié)作用(見實施例3)。利用本發(fā)明中的海藻多糖與疫苗聯(lián)合作用，即可證明該海藻多糖具有調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的作用。按動物(小型動物)體重比10mg/kg或50mg/kg使用。海藻多糖與AIV滅活病毒混勻后，按正常免疫劑量，腹腔注射免疫動物。其特征在于:與疫苗相比，海藻多糖效果更好，如細(xì)胞因子產(chǎn)生水平提高，T淋巴細(xì)胞的分型提高，促進(jìn)脾臟細(xì)胞生長活性等。
【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明實施例提供的多糖體外抗H9N2病毒血凝效價圖，其中，星號表示和對照之間存在顯著差異(以下同)。
[0019]圖2為本發(fā)明實施例提供的多糖體外抗H9N2病毒H9N2相對表達(dá)量圖。
[0020]圖3為本發(fā)明實施例提供的多糖對病毒阻斷作用相對細(xì)胞活性圖。
[0021]圖4為本發(fā)明實施例提供的多糖對病毒抑制作用相對細(xì)胞活性圖。
[0022]圖5為本發(fā)明實施例提供的多糖對病毒直接殺滅作用細(xì)胞活性圖。
[0023]圖6為本發(fā)明實施例提供的雞胚抗病毒實驗存活率圖。
[0024]圖7為本發(fā)明實施例提供的雞胚抗病毒實驗血凝效價圖。
[0025]圖8為本發(fā)明實施例提供的雞胚抗病毒實驗細(xì)胞因子IL-4表達(dá)水平圖。
[0026]圖9為本發(fā)明實施例提供的雞胚抗病毒實驗細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)水平圖。
[0027]圖10為本發(fā)明實施例提供的兩次免疫后小鼠體內(nèi)AIV特異性抗體含量圖。
[0028]圖11為本發(fā)明實施例提供的細(xì)胞因子IFN-Y含量圖。
[0029]圖12為本發(fā)明實施例提供的細(xì)胞因子IL-4含量圖。
[0030]圖13為本發(fā)明實施例提供的T淋巴細(xì)胞分型⑶3+⑶4+含量圖。
[0031]圖14為本發(fā)明實施例提供的T淋巴細(xì)胞分型⑶3+⑶8+含量圖。
[0032]圖15為本發(fā)明實施例提供的不同濃度海藻粗多糖對淋巴細(xì)胞增殖的影響圖。
【具體實施方式】
[0033]實施例1
[0034]分別以蜈蚣藻、孔石莼和馬尾藻為例提取海藻多糖的:
[0035]取破碎后的蜈蟻藻(Grateloupia filicina) 100g，加入5000g蒸飽水，于100°C水浴中浸提2小時；分別用100 0,200目和300目篩絹將濾渣濾出，濾液透析除鹽后用減壓濃縮設(shè)備進(jìn)行濃縮為原體積的1/10，用4倍體積的95%的乙醇醇沉24小時，離心，沉淀凍干，即得蜈蚣藻多糖，待用。
[0036]破碎后的孔石莼(Ulva Pertusa)加40倍的蒸餾水，于125°C水浴中浸提4小時；分別用100 0,200目和300目篩絹將濾渣濾出，濾液透析除鹽后用減壓濃縮設(shè)備進(jìn)行濃縮為原體積的1/10，用4倍體積的95%的乙醇醇沉24小時，離心，沉淀凍干，即得孔石莼多糖，待用。
[0037]馬尾藻(Sargassumqingdaoense) 10g 加入 3000g 蒸飽水，于 91°C水浴中浸提 4小時。分別用100 0,200目和300目篩絹將濾渣濾出，濾液透析除鹽后用減壓濃縮設(shè)備進(jìn)行濃縮為原體積的1/10，用4倍體積的95%的乙醇醇沉24小時，離心，沉淀凍干，即得馬尾藻多糖，待用。
[0038]分別以蜈蚣藻、孔石莼和馬尾藻提取海藻多糖為例進(jìn)一步獲得低分子量的多糖或寡糖:
[0039]將上述分別獲得不同藻的多糖(粗糖)用水分別配制0.1 %-4%水溶液，向其中依次加入鹽酸終濃度為0-2mol/L和雙氧水終濃度為1-10%，然后在功率為50-1000W的微波輔助下，以50-90°C降解5-60min，反應(yīng)后溶液用堿液中和至中性，透析、濃縮、醇沉、離心收集沉淀，冷凍干燥即得平均分子量在lKDa-400KDa范圍內(nèi)各大型海藻中低分子量的海藻多糖或寡糖。
[0040]上述所得海藻多糖的單糖組成，主要為鼠李糖、甘露糖、半乳糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)、K、Na、Ca和Mg，硫酸根含量在2% -40%之間。
[0041]實施例2
[0042]體外抗病毒實驗
[0043]I)抗H9N2禽流感病毒
[0044]Madin-Darby canine kidney (MDCK)細(xì)胞于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中長成單層后，棄掉培養(yǎng)液，用PBS沖洗兩遍后接種H9N2病毒，吸附一小時后棄掉病毒，PBS沖洗兩遍后加含有100ug/ml或20ug/ml的上述實施例獲得海藻多糖及I %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，陰性對照組不加多糖。37°C ,5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)液測定血凝效價(Hemagglutinat1n test, HA)，沖洗兩遍后提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄之后通過熒光定量PCR檢測H9N2表達(dá)量。實驗表明，加入上述實施例獲得海藻多糖后，H9N2的血凝效價有了一定的降低，而H9N2的表達(dá)量有顯著降低。其中0.2mg/ml孔石藥多糖及l(fā)mg/ml馬尾藻多糖處理組的血凝效價均有顯著降低，其余處理組也有一定降低，見附圖1。在熒光定量PCR中，lmg/ml蜈蚣藻處理組的H9N2表達(dá)量為陰性對照組的0.26倍，0.2mg/ml的蜈蚣藻處理組的H9N2表達(dá)量為陰性對照組的0.20倍，說明蜈蚣藻多糖對H9N2病毒有非常明顯的抑制作用孔石莼處理組的H9N2表達(dá)量為陰性對照組的0.40倍，0.2mg/ml的孔石莼處理組的H9N2表