一種肉桂提取物的制備方法及對(duì)白血病k562細(xì)胞的作用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種肉桂提取物的制備方法及對(duì)白血病K562細(xì) 胞的作用。
【背景技術(shù)】
[0002] 三陽(yáng)血傣因治療腫瘤具有良效和埃及衛(wèi)生部有國(guó)際合作研宄[1]，其中所用到的 肉桂是屬于樟科家族的常綠喬木的外皮，含有多種活性成分如精油（肉桂醛，肉桂醛），鞣 質(zhì)，粘液和碳水化合物。近年來(lái)，全世界對(duì)肉桂的藥用功效已有很多研宄，肉桂的另一種水 溶性成分，MHCP(甲基羥查耳酮聚合物），最近被認(rèn)為對(duì)胰島素模擬物的性能有影響[2]。美 國(guó)農(nóng)業(yè)部的研宄人員使用肉桂作用于淋巴瘤，驚人的是在24小時(shí)內(nèi)肉桂通過(guò)中斷細(xì)胞的 G2/M期來(lái)使細(xì)胞停止增殖，這意味著有絲分裂（細(xì)胞分裂）被終止，盡管在細(xì)胞周期的合 成期（S)不是這樣。但是肉桂可能是通過(guò)抑制細(xì)胞的某些可促進(jìn)有絲分裂的磷酸酶[3]， 因此，研宄這些致病因素，針對(duì)可能有助于預(yù)防白血病的關(guān)鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)。在以前的報(bào)告中有報(bào) 道，肉桂提取物具有抗腫瘤作用，也具有通過(guò)抑制NFkappaB的APl和小鼠黑色素瘤模型聯(lián) 系起來(lái)來(lái)增強(qiáng)促凋亡活性[4]。
[0003] 近年來(lái)，利用人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞Caco-2模型在藥物研宄方面因其特殊的結(jié)構(gòu)和 生理生化作用取得了令人鼓舞的進(jìn)展。該細(xì)胞單層模型和人體小腸上皮細(xì)胞相類似。采用 中藥經(jīng)transwell轉(zhuǎn)運(yùn)池 Caco-2細(xì)胞模型吸收轉(zhuǎn)運(yùn)后的過(guò)濾液作用于研宄的白血病細(xì)胞， 可替代中藥血清學(xué)方法，更能體現(xiàn)中藥在體內(nèi)的真正作用情形。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明揭示肉桂提取物對(duì)白血病K562細(xì)胞的作用。
[0005] 肉桂提取物的制備方法按照以下步驟：
[0006] 步驟1 :肉桂的干燥粉末，用乙醇：水為80:20作為溶劑，萃取三次；
[0007] 步驟2 :減壓回流除去溶劑后，得到殘余物；
[0008] 步驟3 :將殘余物溶解在丙酮中，過(guò)濾，將丙酮溶液在真空中蒸發(fā)得到的丙酮可 溶提取物，將其懸浮在水中；
[0009] 步驟4 :然后用石油醚和EtOAc利用沸點(diǎn)不同進(jìn)行分離，得到水溶性提取物；
[0010] 步驟5 :水溶性提取物經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿：甲醇：水為80:20:2. 5得到肉桂提 取物。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖 lA(-)-(7，S，8S，8，R)-4,4，-dihydroxy-3,3，，5,5，
[0012] -tetramethoxy-7' ，9-epoxylignan_9' -〇l_7-〇ne ;
[0013] 圖 IB(_)-Iyoniresinol 3 a-〇-β-d
[0014] -glucopyranoside ；
[0015] 圖 1C3, 4, 5-trimethoxyphenolβ _d - apiofuranosyl(I - 6)-β _d
[0016] -glucopyranoside ；
[0017] 圖2Α掃描電子顯微鏡15000 X ;
[0018] 圖2B掃描電子顯微鏡3000 X ;
[0019] 圖2C透射電子顯微鏡20000 X ;
[0020] 圖3A普萘洛爾標(biāo)準(zhǔn)品；
[0021] 圖3B普萘洛爾經(jīng)transwell吸收；
[0022] 圖3C阿替洛爾標(biāo)準(zhǔn)品；
[0023] 圖3D阿替洛爾經(jīng)transwell吸收；
[0024] 圖4A:肉桂提取物A標(biāo)準(zhǔn)品；
[0025] 圖4B:經(jīng)transwell吸收的附子提取物肉桂提取物A ;
[0026] 圖4C:肉桂提取物B標(biāo)準(zhǔn)品；
[0027] 圖4D :經(jīng)transwell吸收的附子提取物肉桂提取物B ;
[0028] 圖4E:肉桂提取物C標(biāo)準(zhǔn)品；
[0029] 圖4F:經(jīng)transwell吸收的附子提取物肉桂提取物C ;
[0030] 圖5A:肉桂提取物A;
[0031] 圖5B:肉桂提取物B;
[0032] 圖5C:肉桂提取物C;
[0033] 圖6A陰性對(duì)照組的K562細(xì)胞；
[0034] 圖6B50 μ M肉桂提取物A作用K562細(xì)胞72h ;
[0035] 圖6C50 μ M肉桂提取物B作用K562細(xì)胞72h ;
[0036] 圖6D50 μ M肉桂提取物C作用K562細(xì)胞72h ;
[0037] 圖7K562細(xì)胞系各階段細(xì)胞周期分布和DNA含量分析；
[0038] 圖850 μ M和75 μ M肉桂提取物A, B，C作用K562細(xì)胞72h對(duì)細(xì)胞周期的影響；
[0039] 圖9A肉桂提取物作用K562細(xì)胞72h對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，陰性組；
[0040] 圖9B肉桂提取物作用K562細(xì)胞72h對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，50 μ M肉桂提取物；
[0041] 圖9C肉桂提取物作用Κ562細(xì)胞72h對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，75 μ M肉桂提取物；
[0042] 圖10Α:Κ562細(xì)胞分化抗原圖，PE-CD36 ;
[0043] 圖 10Β:Κ562 細(xì)胞分化抗原圖，F(xiàn)ITC-CD13 ;
[0044] 圖 10C:K562 細(xì)胞分化抗原圖，F(xiàn)ITC-CD33 ;
[0045] 圖 10D:K562 細(xì)胞分化抗原圖，PE-CD235a ;
[0046] 圖 10E:K562 細(xì)胞分化抗原圖，F(xiàn)ITC-CD61 ;
[0047] 圖10F:K562細(xì)胞分化抗原圖，PE-CD41 ;
[0048] 圖10G:K562細(xì)胞分化抗原圖，PE-CD34 ;
[0049] 圖 10H:K562 細(xì)胞分化抗原圖，F(xiàn)ITC-CD38。
【具體實(shí)施方式】
[0050] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0051] 本發(fā)明肉桂提取物的制備方法為：
[0052] 肉桂（50公斤）的干燥粉末，用乙醇-水（80:20) (3X 90升）萃取三次，減壓回流 除去溶劑后，得到殘余物（7.5千克）。將殘余物溶解在丙酮中，過(guò)濾，將丙酮溶液在真空中 蒸發(fā)得到的丙酮可溶提取物（5. 0千克），將其懸浮在水中，然后用石油醚和EtOAc利用沸點(diǎn) 不同進(jìn)行分離。水溶性提取物（1.5千克）經(jīng)硅膠柱層析（CC) (20X120厘米，7.5公斤）， 用氯仿：甲醇：水（80:20:2. 5,25L，V/V(體積比））得到三個(gè)組分，A-C。
[0053] 餾分八(3.1克）適用于1^-180：(3.0\3.0厘米的806)洗脫梯度，用甲醇水溶液 (10:90, 30:70, 50:50, 70:30,90:10,1L，每次，V/V (體積比）），得到兩種餾分，Al 和 A2。組分 A2 (1 克）進(jìn)行MCI 凝膠 CHP20P CC (2. 0 X 50 厘米，100 克）純化，用 Me0H/H20 (30:70,40:60， 50:50,60:40, 70:30,80:20, 700 毫升，每次，V/V)，得到 3 餾分，A2A-A2C。組分 A2C (300 毫 克）通過(guò)制備！1(：純化，用01(：13/^6〇!1(11:1，100毫升，￥/￥)，得到化合物4(19.7毫克） 純化。
[0054] 餾分B (155克）進(jìn)行交聯(lián)葡聚糖LH-20CC (6. OX 125厘米，500克）（MeOH)純化，得 到兩部分，Bl和B2。餾分Bl (5.2克），用RP-18CC (3. OX 50厘米，200克）純化，用MeOH/ !120(10:90,30:70,50:50,70:30,90:10，1升，體積/體積），提供了三個(gè)組分，組分813-81(：。 組分Blb的（462毫克）通過(guò)制備TLC純化，用CHC13/Me0H/H20 (3:1:0. 05, 200毫升，體積/ 體積/體積），得到B (3. 9毫克）洗脫。組分BlC (240毫克）通過(guò)制備TLC純化，用CHC13/ Me0H/H20 (6:1:0. 05,150毫升，體積/體積/體積），得到化合物C (42. 8毫克）洗脫。
[0055] 圖1中的A、B、C表達(dá)了三種肉桂提取物的結(jié)構(gòu)。其中，
[0056] A:已知的成分鑒定如下（-)-(7' S, 8S, 8' R)_4, 4' -dihydroxy-3, 3'，5, 5'
[0057] -tetramethoxy-7' ，9-epoxylignan_9' -〇l_7-〇ne[5]〇
[0058] B: (_)-Iyoniresinol 3 a-〇-β-d
[0059] -glucopyranoside[6]〇
[0060] C:3, 4, 5-trimethoxyphenolβ _d - apiofuranosyl(I - 6)-β _d
[0061] -glucopyranoside[7]〇
[0062] 本發(fā)明肉桂提取物對(duì)于白血病K562細(xì)胞的作用：
[0063] 細(xì)胞培養(yǎng)
[0064] 將白血病Κ562細(xì)胞株接種到含10 %胎牛血清（Fetal calf serum，F(xiàn)BS)中，添加 100U/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素到RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37°C含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi) 將細(xì)胞培養(yǎng)傳代。每2-3天換液1次，所有實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期內(nèi)進(jìn)行。
[0065] Transwell轉(zhuǎn)運(yùn)池細(xì)胞培養(yǎng)法的建立
[0066] 將0&(3〇-2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、10(^/1111青霉素和100^8/1111鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)液中，在37°C含5% 0)2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。如果細(xì)胞已長(zhǎng)滿（匯合達(dá)80-90% )， 即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)Caco-2細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)，將細(xì)胞消化記數(shù)，用DMEM-10稀釋至 1.0 X 105-2· 5X 105/ml。將I. 5ml的已充分混合的細(xì)胞懸浮液加入transwell的頂端絨毛 面，將2. 6ml的DMEM-10完全培養(yǎng)基加入底端基底面。而后將transwell放入37°C含5% 〇)2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔一天換液一次，直至第21天，測(cè)定培養(yǎng)21天的Caco-2細(xì)胞單 層的電阻值，每孔均大于500 Ω/cm2,表明其具有足夠的緊密連接和完整性?？捎脕?lái)進(jìn)行藥 物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的試驗(yàn)研宄。
[0067] 肉桂提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性
[0068] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Caco-2細(xì)胞，0. 25%胰酶消化，制成4X IO4Ail的單細(xì)胞懸液，接種 于96孔培養(yǎng)板，200 μ 1/孔，培養(yǎng)24h，吸凈培養(yǎng)液，分別加入8個(gè)濃度梯度的肉桂提取物， 經(jīng)0.22 μ m濾膜過(guò)濾除菌，溶解到Hanks平衡鹽溶液（Hank's Balanced Salt Solution， HBSS)中（0、50、100、200、400、600、800、1000 μ g/ml)，并設(shè)空白對(duì)照為細(xì)胞加入到 HBSS 中。 孵育2h后加入MTT (5mg/ml)，20 μ 1/孔。培養(yǎng)4h后，去上清液，加入DMS0150 μ 1/孔，搖床 振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)490nm處光密度（Optical density，0D)值 [8]，計(jì)算肉桂提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。
[0069] 選擇細(xì)胞存活率大于80 %的藥物濃度作為無(wú)毒濃度進(jìn)行下一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
[0070] 抑制率=(空白組A值-實(shí)驗(yàn)組A值）/空白組A值X 100%。
[0071] 注：空白組A值=只加 HBSS的Caco-2細(xì)胞懸浮液經(jīng)上述處理后用490nm濾光片 在酶標(biāo)儀上測(cè)定的吸光度。
[0072] 實(shí)驗(yàn)組A值=將藥物溶解在HBSS的Caco-2細(xì)胞懸浮液經(jīng)上述處理后用490nm濾 光片在酶標(biāo)儀上測(cè)定的吸光度。
[0073] 中藥提取物經(jīng)Transwell轉(zhuǎn)運(yùn)池
[0074] 取6孔transwell板將Caco-2細(xì)胞接種在上面，分別在第3d和第14d用HBSS 洗聚碳酯膜上的單層細(xì)胞2次，隨后用4. 9mmol/L的鈣，鎂和含0. 5 % Triton-