一種復(fù)合導(dǎo)電材料的心肌仿生支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)合了氧化石墨烯的明膠水凝膠心肌仿 生支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 心血管疾病誘發(fā)多種嚴(yán)重的并發(fā)癥，例如心肌梗死，從而導(dǎo)致心肌壞死和心肌細(xì) 胞的缺失和死亡，在全球疾病致死率中居于首位，嚴(yán)重影響和危害著人類的健康和生活。目 前心臟疾病的治療方法主要為心臟移植和安裝左心室輔助裝置（LVADs)。但是心臟移植面 臨捐贈器官有限的問題且LVADs所需費(fèi)用昂貴。心肌組織工程的目的是在可模擬體內(nèi)心肌 組織、由細(xì)胞和/或生物材料組成的支架的引導(dǎo)作用下實(shí)現(xiàn)受損心肌的修復(fù)或者在體外進(jìn) 行藥物篩選，排除可能會引起心臟毒性副作用的藥物。心肌組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，心肌層排列緊 密，且構(gòu)成心肌層的心肌細(xì)胞排列高度有序，首尾相連的心肌細(xì)胞與心肌內(nèi)其他細(xì)胞通過 末端的連接盤（包括縫隙連接和其他粘著位點(diǎn)）相互聯(lián)系，傳導(dǎo)分子信號及收縮力的信號。 在體內(nèi)，心肌細(xì)胞能夠順應(yīng)循環(huán)系統(tǒng)中急性或慢性的變化。心肌組織具有豐富且復(fù)雜的電 生理活動，跳動的心肌細(xì)胞產(chǎn)生電信號，傳播至整個(gè)心臟，引起細(xì)胞膜電位的去極化以及心 肌細(xì)胞的收縮程序。因此組織工程化的心肌組織應(yīng)當(dāng)能夠滿足體內(nèi)心肌特異的、高度有序 的空間結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞提供軟硬度適宜的支撐，還應(yīng)當(dāng)具備利于支架上的細(xì)胞傳遞電信號的 性能，在結(jié)構(gòu)和功能上同時(shí)模擬在體心肌組織。近些年來，開始有研宄在仿生支架中復(fù)合導(dǎo) 電材料（如納米金，碳納米纖維等），增強(qiáng)支架的導(dǎo)電性。最近的一些研宄結(jié)果表明復(fù)合導(dǎo) 電材料的混合支架上的心肌細(xì)胞的代謝活動比單獨(dú)的支架上的更為活躍，導(dǎo)電材料可能增 強(qiáng)細(xì)胞間的電信號傳導(dǎo)，促進(jìn)與收縮和電耦合的心肌特異基因的表達(dá)上調(diào)，改善心肌支架 的性能。氧化石墨烯由石墨經(jīng)強(qiáng)酸氧化而成，是一種性能優(yōu)異的新型碳材料，具有較高的比 表面積和表面豐富的官能團(tuán)，具有一定的導(dǎo)電性。Shin等人在明膠-甲基丙烯酸甲酯接枝 共聚物中摻入氧化石墨烯并利用3T3細(xì)胞研宄其細(xì)胞相容性，但3T3細(xì)胞為成纖維細(xì)胞系， 增殖能力強(qiáng)并可持續(xù)傳代，而心肌細(xì)胞為原代細(xì)胞，無法增殖，其特性與3T3細(xì)胞相差很 大。(Shin S R, Aghaei-Ghareh-Bolagh B,Dang T T, et al. Cell-laden Microengineered and Mechanically Tunable Hybrid Hydrogels of Gelatin and Graphene Oxide[J]. Advanced Materials, 2013, 25(44):6385-6391.)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的在于提供一種復(fù)合導(dǎo)電材料氧化石墨烯的、導(dǎo)電性能增強(qiáng)的、可促進(jìn) 心肌細(xì)胞生長和改善心肌細(xì)胞功能的仿生支架。本發(fā)明的另一目的還在于提供一種復(fù)合導(dǎo) 電材料氧化石墨烯的、導(dǎo)電性能增強(qiáng)的、可促進(jìn)心肌細(xì)胞生長和改善心肌細(xì)胞功能的仿生 支架的制備方法。
[0004] 為了達(dá)到發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0005] 所述復(fù)合導(dǎo)電材料的心肌仿生支架，采用氧化石墨烯與明膠在水中進(jìn)行復(fù)合，復(fù) 合所得到的氧化石墨烯-明膠水凝膠再用京尼平進(jìn)行交聯(lián)。
[0006] 所述的仿生支架中氧化石墨稀的濃度為0. 3mg/mL~1.0 mg/mL。明膠溶解于氧化 石墨烯水溶液后，溶液體積不變，因此氧化石墨烯水溶液濃度不變。
[0007] 所述的仿生支架中明膠的質(zhì)量體積比為6%~20%。
[0008] 所述的仿生支架表面具有可引導(dǎo)心肌細(xì)胞高度有序生長排列的微結(jié)構(gòu)。
[0009] 所述微結(jié)構(gòu)為平行排列的溝槽結(jié)構(gòu)。
[0010] 所述溝槽結(jié)構(gòu)的溝和嵴的寬度均為5 μL?~25 μL?，溝與嵴的高度差為0. 5 μL?~ 1 μ m〇
[0011] 更優(yōu)選地，所述溝槽結(jié)構(gòu)的溝和嵴的寬度均為10~20 μ m。
[0012] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述溝槽結(jié)構(gòu)的溝和嵴的寬度均為15 μ m。
[0013] 所述仿生支架的制備方法的具體過程如下，首先將明膠溶于0. 3mg/mL~1.0 mg/ HiL的氧化石墨烯水溶液中，得到明膠的質(zhì)量體積比為6 %~20 %的氧化石墨烯-明膠溶液； 然后吸取所得氧化石墨烯-明膠溶液成膠，即可得到表面無微結(jié)構(gòu)的氧化石墨烯-明膠水 凝膠；最后稱取京尼平，用溶劑溶解，得到質(zhì)量體積比為〇. 1%~1. 〇%的京尼平溶液，再將 所述無微結(jié)構(gòu)的氧化石墨烯-明膠水凝膠浸泡于所述京尼平溶液中，置于5°C~30°C下中 交聯(lián)4小時(shí)~72小時(shí)，交聯(lián)完畢后，用超純水清洗支架，最終制備得到所述的仿生支架；所 述用于溶解京尼平的溶劑為水或濃度為IOmM且pH為7. 4的HEPES緩沖液。
[0014] 所述的表面具有微結(jié)構(gòu)的仿生支架的制備方法具體過程如下：首先將明膠溶于 0. 3mg/mL~1.0 mg/mL的氧化石墨稀水溶液中，得到明膠的質(zhì)量體積比為6%~20%的氧 化石墨烯-明膠溶液；然后將硅模板上的微結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移至PDMS模板上，再取所述氧化石墨 烯-明膠溶液滴至PDMS模板表面成膠，待氧化石墨烯-明膠水凝膠成膠后，將其從PDMS模 板上剝離，即制備得到表面具有微結(jié)構(gòu)氧化石墨烯-明膠水凝膠；最后，稱取京尼平溶解， 用溶劑溶解，得到質(zhì)量體積比為〇. 1%~1.0%的京尼平溶液，將所述具有微結(jié)構(gòu)的氧化石 墨烯-明膠水凝膠浸泡于所述京尼平溶液中，置于5°C~30°C下交聯(lián)4小時(shí)~72小時(shí)，交 聯(lián)完畢后，用超純水清洗支架，即制備得到所述表面具有微結(jié)構(gòu)的仿生支架；所述用于溶解 京尼平的溶劑為水或濃度為IOmM且pH為7. 4的HEPES緩沖液。
[0015] 所述的仿生支架的制備方法中京尼平交聯(lián)的溫度為25°C。
[0016] 所述的表面具有微結(jié)構(gòu)的仿生支架的制備方法中京尼平交聯(lián)的溫度為25°C。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0018] (1)構(gòu)建了一種復(fù)合氧化石墨烯的、導(dǎo)電性能增強(qiáng)的、基于明膠的水凝膠仿生支架 并用于心肌組織工程技術(shù)領(lǐng)域中，解決了現(xiàn)有技術(shù)中心肌仿生支架無導(dǎo)電性或?qū)щ娦阅懿?的問題。
[0019] (2)本發(fā)明的氧化石墨烯明膠水凝膠支架可以通過改變京尼平交聯(lián)條件調(diào)控水凝 膠支架的彈性模量，達(dá)到力學(xué)可控的效果，更能模擬體內(nèi)心肌層的力學(xué)性能，能夠更早地實(shí) 現(xiàn)心肌細(xì)胞的整體同步跳動并帶動基底收縮，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞生長和心肌片層形成。
[0020] (3)本發(fā)明的氧化石墨烯明膠水凝膠支架可以通過調(diào)控水凝膠表面微結(jié)構(gòu)引導(dǎo)心 肌細(xì)胞沿微結(jié)構(gòu)方向高度有序地生長，提高細(xì)胞的伸長率，使心肌細(xì)胞產(chǎn)生的收縮力度增 大，進(jìn)一步地促進(jìn)心肌細(xì)胞生長和心肌片層的形成。
【附圖說明】：
[0021] 圖1-圖3為不同時(shí)間點(diǎn)支架的收縮力度圖。其中圖1為實(shí)施例11制備得到的無 微結(jié)構(gòu)的明膠水凝膠，產(chǎn)生的最大收縮力度為〇. 45 μ N。圖2為實(shí)施例2制備得到的無微結(jié) 構(gòu)的氧化石墨烯-明膠水凝膠，產(chǎn)生的最大收縮力度為〇. 75 μ Ν。圖3為實(shí)施例7制備得到 的表面具備微結(jié)構(gòu)的氧化石墨烯-明膠水凝膠產(chǎn)生的最大收縮力度為13 μ Ν。
【具體實(shí)施方式】：
[0022] 為了加深對本發(fā)明的理解，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。
[0023] 實(shí)施例1 :
[0024] 步驟1、氧化石墨稀-明膠溶液的制備：稱取0. 6g的明膠溶于IOmL的0. 3mg/mL的 氧化石墨烯溶液中，室溫溶脹30min后，置于40°C水浴鍋中溶解，形成明膠的質(zhì)量體積比為 6%的氧化石墨烯-明膠溶液；
[0025] 步驟2、無微結(jié)構(gòu)的氧化石墨烯-明膠水凝膠支架的制備：吸取400 μ L步驟1中 的氧化石墨烯-明膠溶液注入內(nèi)徑為IOmm的圓柱體模具中，置于4°C環(huán)境中2小時(shí)即可形 成無微結(jié)構(gòu)的氧化石墨烯-明膠水凝膠支架。
[0026] 步驟3、京尼平交聯(lián)水凝膠：稱取一定量的京尼平溶解于超純水中，形成質(zhì)量體積 比為〇. 1 %的京尼平溶液。將上述制備得到的氧化石墨烯-明膠水凝膠支架浸泡于京尼平 溶液中，置于5°C培養(yǎng)箱中交聯(lián)4h。交聯(lián)完畢后，超純水清洗支架三遍，除去殘留的京尼平， 即制備得到所述心肌支架。
[0027] 實(shí)施例2 :
[0028] 步驟1、氧化石墨稀-明膠溶液的制備：稱取0. 6g的明膠溶于IOmL的0. 6mg/mL的 氧化石墨烯溶液中，室溫溶脹30min后，置于60°C水浴鍋中溶解，形成明膠的質(zhì)量體積比為 6%的氧化石墨烯-明膠溶液；
[0029] 步驟2、無微結(jié)構(gòu)的氧化石墨烯-明膠水凝膠支架的制備：吸取400 μ L步驟1中 的氧化石墨烯-明膠溶液注入內(nèi)徑為IOmm的圓柱體模具中，置于l〇°C環(huán)境中2小時(shí)即可形 成無微結(jié)構(gòu)的氧化石墨烯-明膠水凝膠支架。
[0030] 步驟3、京尼平交聯(lián)水凝膠：稱取一定量的京尼平溶解于HEPES緩沖液（10mM，pH 7.4) 中，形成質(zhì)量體積比為0.2%的京尼平溶液。將上述制備得到的水凝膠支架浸泡于京 尼平溶液中，置于25°C培養(yǎng)箱中交聯(lián)24h。交聯(lián)完畢后，超純水清洗支架三遍，除去殘留的 京尼平，即制備得到所述心肌支架。
[0031] 實(shí)施例3:
[0032]