【具體實(shí)施方式】
[0050] 本發(fā)明，在其一些實(shí)施方案中，涉及預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移、癌癥治療和預(yù)后及鑒定為推定 轉(zhuǎn)移抑制劑的試劑的方法。
[0051] 詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案之前，應(yīng)理解本發(fā)明在其應(yīng)用上不一定限于 以下描述中提出或?qū)嵤├信e例說(shuō)明的詳情。本發(fā)明能夠有其它實(shí)施方案或能夠以各種方 式實(shí)踐或?qū)嵤?br>[0052] 生長(zhǎng)因子驅(qū)使細(xì)胞迀移和轉(zhuǎn)移，但根本機(jī)制未完全了解。
[0053] 本發(fā)明現(xiàn)已鑒定突觸囊泡磷酸酶-2 (SYNJ2)為調(diào)節(jié)體外侵襲偽足和板狀偽足和 體內(nèi)癌轉(zhuǎn)移中的主要模塊。
[0054] 如下文和之后的實(shí)施例部分所述，本發(fā)明人在動(dòng)物和患者樣本中證實(shí)了其在體 外的發(fā)現(xiàn)。具體地，采用經(jīng)EGF刺激的乳腺細(xì)胞，本發(fā)明人將脂質(zhì)磷酸酶突觸囊泡磷酸酶 2 (SYNJ2)與侵襲性表現(xiàn)型聯(lián)系起來(lái)，并且將高SYNJ2于癌癥患者的短期存活率關(guān)聯(lián)起來(lái)。 SYNJ2的敲減穩(wěn)健地削弱了動(dòng)物模型中乳腺腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在體外，SYNJ2缺乏型細(xì)胞表 現(xiàn)出EGFR和整聯(lián)蛋白脫軌運(yùn)輸，導(dǎo)致粘著斑變形、板狀偽足受阻和侵襲偽足消失。不受理 論約束，表明活性EGFR的再循環(huán)局部促進(jìn)SYNJ2介導(dǎo)的特定磷酸肌醇脂質(zhì)脫磷酸，從而促 使侵襲偽足和板狀偽足形成并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展（見(jiàn)圖15)。
[0055] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，條件是所述腫瘤 不是神經(jīng)膠質(zhì)瘤，所述方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的突觸囊泡磷酸酶 2(SYNJ2)抑制劑，從而預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移。
[0056] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"腫瘤轉(zhuǎn)移"指從其首發(fā)位置擴(kuò)散到身體其它部位的惡性腫 瘤，例如轉(zhuǎn)移到肺部的乳腺癌。
[0057] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"癌癥"和"腫瘤"可交換使用。該術(shù)語(yǔ)指異常且不受控制的 細(xì)胞分裂引起的惡性生長(zhǎng)或腫瘤。
[0058] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"預(yù)防"指阻止、中斷、抑制轉(zhuǎn)移過(guò)程或進(jìn)展和后續(xù)轉(zhuǎn)移。
[0059] 根據(jù)另一方面，提供了一種治療癌癥的方法，所述方法包括向有需要的受試者施 用治療有效量的突觸囊泡磷酸酶2 (SYNJ2)抑制劑和與癌癥發(fā)作或進(jìn)展相關(guān)的細(xì)胞表面受 體的抑制劑，從而治療癌癥。
[0060] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"治療"包括消除、大體上抑制、減緩或逆轉(zhuǎn)病狀的進(jìn)展，大體 上改善病狀的臨床或?qū)徝腊Y狀，或大體上預(yù)防病狀的臨床或?qū)徝腊Y狀出現(xiàn)。
[0061] 可根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案治療（或預(yù)后）的癌癥的非限制性實(shí)例包括任何實(shí) 體或非實(shí)體癌和/或癌轉(zhuǎn)移，包括但不限于胃腸道腫瘤（結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)直腸癌瘤、結(jié) 直腸癌、結(jié)直腸腺瘤、1型遺傳性非息肉病、2型遺傳性非息肉病、3型遺傳性非息肉病、6型 遺傳性非息肉病、結(jié)直腸癌、7型遺傳性非息肉病、小腸和/或大腸癌瘤、食道癌、伴有食道 癌的胼胝癥、胃癌、胰腺癌、胰腺內(nèi)分泌腫瘤）、子宮內(nèi)膜癌、隆凸性皮膚纖維肉瘤、膽囊癌、 膽道腫瘤、前列腺癌、前列腺腺癌、腎癌（例如，2型或1型維爾姆斯氏瘤（Wilms' tumor))、 肝癌（例如，肝胚細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌瘤、肝細(xì)胞癌）、膀胱癌、胚胎性橫紋肌肉瘤、胚細(xì)胞瘤、 滋養(yǎng)細(xì)胞瘤、睪丸生殖細(xì)胞瘤、卵巢未成熟畸胎瘤、子宮、卵巢上皮性、骶尾瘤、絨毛膜癌、胎 盤(pán)部位滋養(yǎng)細(xì)胞瘤、成人上皮細(xì)胞瘤、卵巢癌、漿液性卵巢癌、卵巢性索腫瘤、宮頸癌、子宮 頸癌、小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌、鼻咽、乳腺癌（例如，乳腺導(dǎo)管癌、乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、散發(fā) 性乳腺癌、乳腺癌敏感性、4型乳腺癌、乳腺癌-1、乳腺癌-3、乳腺-卵巢癌）、鱗狀細(xì)胞癌 (例如，在頭頸部）、神經(jīng)源性腫瘤、星形細(xì)胞瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、淋巴 瘤（例如，霍奇金病（Hodgkin's disease)、非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma)、 B細(xì)胞瘤、伯基特淋巴瘤（Burkitt)、皮膚T細(xì)胞瘤、組織細(xì)胞瘤、淋巴細(xì)胞瘤、T細(xì)胞瘤、胸 腺腫瘤）、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腺癌、腎上腺瘤、遺傳性腎上腺皮質(zhì)癌、腦部惡性（腫瘤）、各種其它 癌（例如，支氣管原大細(xì)胞癌、導(dǎo)管癌、EhrIich-Lettre腹水、表皮樣癌、大細(xì)胞癌、Lewis肺 癌、髓樣癌、粘膜表皮樣瘤、燕麥細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌、梭形細(xì)胞癌、棘細(xì)胞癌、移行細(xì)胞癌、未 分化癌、癌肉瘤、絨毛膜癌、囊腺癌）、室管膜母細(xì)胞瘤、上皮瘤、紅白血病（例如，弗蘭德紅 白血?。‵riend)、淋巴母細(xì)胞紅白血?。?、纖維肉瘤、巨細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤（例 如，多形性、星形細(xì)胞瘤）、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞瘤、異種雜交瘤、雜交骨髓瘤、組織細(xì)胞瘤、雜 交瘤（例如，B細(xì)胞）、腎上腺樣瘤、胰島瘤、島細(xì)胞瘤、角質(zhì)瘤、成平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、白 血?。ɡ?，急性淋巴細(xì)胞白血病、急性淋巴母細(xì)胞白血病、急性淋巴母細(xì)胞性前B細(xì)胞白 血病、急性淋巴母細(xì)胞性T細(xì)胞白血病、急性成巨核細(xì)胞白血病、單核細(xì)胞白血病、急性髓 細(xì)胞白血病、急性髓性白血病、伴有嗜酸粒細(xì)胞增多的急性髓性白血病、B細(xì)胞性白血病、 嗜堿細(xì)胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性白血病、B細(xì)胞性白血病、嗜酸細(xì)胞性白血病、弗 蘭德白血?。‵riend)、粒細(xì)胞或髓細(xì)胞性白血病、毛細(xì)胞白血病、淋巴細(xì)胞性白血病、巨核 細(xì)胞白血病、單核細(xì)胞白血病、單核-巨噬細(xì)胞白血病、成髓細(xì)胞性白血病、骨髓性白血病、 慢性骨髓單核細(xì)胞性白血病、漿細(xì)胞白血病、前B細(xì)胞白血病、前髓細(xì)胞性白血病、亞急性、 T細(xì)胞、淋巴腫瘤、髓系惡性腫瘤素因、急性非淋巴細(xì)胞性白血?。⒘馨腿饬?、黑素瘤、乳腺 腫瘤、肥大細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、間皮瘤、轉(zhuǎn)移瘤、單核細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓發(fā)育 異常綜合征、骨髓瘤、腎母細(xì)胞瘤、神經(jīng)組織膠質(zhì)瘤、神經(jīng)組織神經(jīng)元腫瘤、神經(jīng)鞘瘤、成神 經(jīng)細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、骨軟骨瘤、骨骨髓瘤、骨肉瘤（例如，尤文氏肉瘤（Ewing's))、 乳頭狀瘤、移行細(xì)胞瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體瘤（侵襲型）、漿細(xì)胞瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、橫紋 肌肉瘤、肉瘤（例如，尤文氏肉瘤、組織細(xì)胞肉瘤、延森氏肉瘤（Jense)、骨原性肉瘤、網(wǎng)狀 細(xì)胞肉瘤）、神經(jīng)鞘瘤、皮下瘤、畸胎癌（例如，多能畸胎癌）、畸胎瘤、睪丸瘤、胸腺瘤和 毛發(fā)上皮瘤、胃癌、纖維肉瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤；多發(fā)性血管球瘤、李-佛美尼綜合征 (Li-Fraumeni syndrome)、脂肪肉瘤、Lynch癌家族綜合征II、男性生殖細(xì)胞腫瘤、肥大細(xì) 胞白血病、甲狀腺髓樣癌、多發(fā)性腦膜瘤、內(nèi)分泌瘤病粘液肉瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、家族性非嗜鉻 瘤、毛母質(zhì)瘤、乳頭瘤、家族性和分散性、橫紋肌樣瘤易感綜合征、家族性、橫紋肌樣瘤、軟組 織肉瘤和伴有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的Turcot綜合征。
[0062] 根據(jù)一特定實(shí)施方案，所述癌癥為乳腺癌。
[0063] 根據(jù)一特定實(shí)施方案，所述癌癥（或癌轉(zhuǎn)移）為受EGF調(diào)節(jié)。
[0064] 根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方案，所述癌癥的特征在于ErbB受體分子例如EGFR或HER2過(guò) 表達(dá)或上調(diào)。
[0065] 已經(jīng)將導(dǎo)致EGFR過(guò)表達(dá)（稱(chēng)為上調(diào)）或過(guò)度活性的突變與許多癌癥，包括肺癌、 肛門(mén)癌和多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤相聯(lián)系起來(lái)。在后一種情況下，常常觀(guān)察到EGFR或多或少的 特異性突變，稱(chēng)為EGFRvIII。在所有上皮癌的約30%中牽涉到EGFR或家族成員的突變、擴(kuò) 增或誤調(diào)節(jié)。
[0066] 牽涉EGFR的突變可導(dǎo)致其不斷活化，這樣可導(dǎo)致細(xì)胞分裂不受控制-癌癥素因。 相反，已經(jīng)在幾個(gè)類(lèi)型的癌癥中鑒定出EGFR的突變，并且是一類(lèi)不斷擴(kuò)大的抗癌療法的目 標(biāo)[Zhang 2007 J. Clin. Invest. 117(8) :2051 - 8] 〇
[0067] 在約30%的乳腺癌中出現(xiàn)ERBB2基因擴(kuò)增或過(guò)表達(dá)。與疾病復(fù)發(fā)增加和預(yù)后較差 有極大關(guān)聯(lián)。還了解到在卵巢癌、胃癌和侵蝕形式的子宮癌，例如漿液性子宮內(nèi)膜癌中出現(xiàn) 過(guò)表達(dá)。
[0068] 下面是癌癥列表，其中涉及了受體酪氨酸激酶ErbB家族的成員。
[0069] ErbB-I-腎上腺皮質(zhì)癌、膽管癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、食道癌、膽囊癌、胃癌、成膠質(zhì) 細(xì)胞瘤、頭頸癌、肺癌（非小細(xì)胞、鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞肺癌）、胰腺癌、唾液腺癌、腹 瀉、良性贅生物、浸潤(rùn)性癌、皮膚病、導(dǎo)管原位癌、甲溝炎。
[0070] ErbB-2-膽管癌、膀胱癌、乳腺癌、膽管細(xì)胞癌、食道癌、膽囊癌、胃癌、成膠質(zhì)細(xì)胞 瘤、卵巢癌、胰腺癌、唾液腺癌。根據(jù)一特定實(shí)施方案，所述癌癥為乳腺癌或胃癌。
[0071] ErbB_3_乳腺癌、肺癌和病毒性白血病。
[0072] ErbB-4-乳腺癌、病毒性白血病、髓母細(xì)胞瘤、肺癌和乳腺腫瘤。
[0073] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"受試者"指已經(jīng)診斷患有癌癥的哺乳動(dòng)物（例如，人）。
[0074] 如本文所使用，突觸囊泡磷酸酶-2或SYNJ2指突觸肌醇-1，4, 5-三磷酸5-磷酸 酶2, EC 3. 1.3. 36。突觸囊泡磷酸酶-2為泛表達(dá)磷酸肌醇5-磷酸酶（SEQ ID N0:1和2分 別指多聚核苷酸和編碼的多肽）。
[0075] 如本文所使用，短語(yǔ)"突觸囊泡磷酸酶2 (SYNJ2)抑制劑"指降低或下調(diào)SYNJ2的 表達(dá)或活性的分子。
[0076] 下調(diào)可超過(guò) 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或完全抑制（通 過(guò)給定測(cè)定法，例如下文所述測(cè)定法測(cè)定活性或表達(dá)100%損失）。
[0077] 下調(diào)SYNJ2的表達(dá)可如下文所述在DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平上實(shí)現(xiàn)。SYNJ2活性指 其催化活性[作為磷酸酶，將PI (3, 4, 5)P3轉(zhuǎn)化為PI (3, 4)P 2]、其信號(hào)活性（與發(fā)動(dòng)蛋白、 皮動(dòng)蛋白相互作用，見(jiàn)圖5E-H)或細(xì)胞定位。在后一種情況下，SYNJ2抑制劑將改變蛋白質(zhì) 的細(xì)胞定位。
[0078] 因此，可在基因組和/或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平上使用敲入所述基因或干擾其轉(zhuǎn)錄和/或 翻譯的各種分子[例如，核酸沉默劑例如核酸（RNA)沉默劑（例如反義、siRNA、shRNA、微 RNA、核酶和DNA酶）]，或在蛋白質(zhì)水平上使用例如拮抗劑、裂解多肽的酶等實(shí)現(xiàn)SYNJ2的下 調(diào)。
[0079] 以下是一系列能夠下調(diào)SYNJ2的表達(dá)水平和/或活性的試劑。
[0080] 能夠下調(diào)SYNJ2的試劑的一個(gè)實(shí)例為能夠特異性結(jié)合SYNJ2的抗體或抗體片段。 優(yōu)選地，所述抗體特異性結(jié)合SYNJ2的至少一個(gè)表位。當(dāng)SYNJ2為細(xì)胞蛋白時(shí)，采取措施將 抗體引入細(xì)胞內(nèi)。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"表位"指抗體結(jié)合部位在抗原上結(jié)合的任何抗原決 定簇。
[0081] 表位決定簇通常由分子化學(xué)活性表面分組，例如氨基酸或碳水化合物側(cè)鏈組成并 且通常具有特定三維結(jié)構(gòu)特征以及特定電荷特征。
[0082] 如本發(fā)明中所使用，術(shù)語(yǔ)"抗體"包括完整分子及其能夠與巨噬細(xì)胞結(jié)合的功能片 段，例如Fab、F(ab'）2和Fv。這些功能性抗體片段定義如下：（l)Fab，可通過(guò)用木瓜蛋白酶 消化全抗體得到完整輕鏈和一條重鏈的一部分生成的含抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段的 片段；（2) Fab'，可通過(guò)用胃蛋白酶處理全抗體，接著還原得到完整輕鏈和重鏈的一部分獲 得的抗體分子片段；每個(gè)抗體分子獲得兩個(gè)Fab'片段；（3) (Fab'）2,可通過(guò)用胃蛋白酶處 理全抗體，無(wú)需后續(xù)還原得到的抗體片段；F (ab'）2是通過(guò)兩個(gè)二硫鍵結(jié)合在一起的兩個(gè) Fab'片段的二聚體；（4)Fv，定義為含表示成兩條鏈的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的基因工 程化片段；和（5)單鏈抗體（"SCA")，含有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，通過(guò)適合多肽接頭連 接成基因融合單鏈分子的基因工程化分子。
[0083] 生產(chǎn)多克隆和單克隆抗體及其片段的方法在本領(lǐng)域眾所周知（見(jiàn)例如，Harlow 和 Lane，Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988,其以引用的方式并入本文）。
[0084] 根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案所述的抗體片段可通過(guò)抗體的蛋白水解或通過(guò)在大腸 桿菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞（例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)物或其它蛋白表達(dá)系統(tǒng)）中表達(dá)編碼 所述片段的DNA制備?？捎脗鹘y(tǒng)方法通過(guò)胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全抗體獲得抗體片 段。例如，可通過(guò)用胃蛋白酶酶促裂解抗體生成抗體片段以提供5S片段表示的F(ab'）2。 可使用硫醇還原劑，和任選地由二硫鍵裂解產(chǎn)生的巰基的封端基團(tuán)進(jìn)一步裂解該片段，以 生成3.5S Fab'單價(jià)片段?？蛇x地，使用胃蛋白酶酶促裂解直接生成兩個(gè)單價(jià)Fab'片段 和一個(gè)Fc片段。例如，Goldenberg，美國(guó)專(zhuān)利第4, 036, 945號(hào)和第4, 331，647號(hào)及其中所 含參考文獻(xiàn)中描述了這些方法，所述專(zhuān)利特此以引用的方式整體并入。同樣見(jiàn)Porter，R. R. [Biochem. J. 73:119-126(1959)]。也可使用其它裂解抗體的方法，例如分離重鏈形成單 價(jià)輕鏈-重鏈片段，進(jìn)一步裂解片段或其它酶促、化學(xué)或基因技術(shù)，只要所述片段與完整抗 體所識(shí)別的抗原結(jié)合。
[0085] Fv片段包含VH和VL鏈的締合。這種締合可為非共價(jià)，如Inbar等[Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 69:2659-62(19720]所述?？蛇x地，可變鏈可通過(guò)分子間二硫鍵連接或通過(guò) 化學(xué)物質(zhì)例如戊二醛交聯(lián)。優(yōu)選地，F(xiàn)v片段包含通過(guò)肽接頭連接的VH和VL鏈。通過(guò)構(gòu)建 包含通過(guò)寡聚核苷酸連接的編碼VH和VL結(jié)構(gòu)域的DNA序列的結(jié)構(gòu)基因制備這些單鏈抗 原結(jié)合蛋白（sFv)。將結(jié)構(gòu)基因插入表達(dá)載體中，隨后將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞例如大腸 桿菌。重組宿主細(xì)胞合成帶有橋接兩個(gè)V結(jié)構(gòu)域的接頭肽的多肽鏈。例如，[Whitlow和 Filpula，Methods 2:97-105(1991) ;Bird 等，Science 242:423-426(1988) ;Pack 等，Bio/ Technology 11:1271-77(1993);和美國(guó)專(zhuān)利第4, 946, 778號(hào)描述了生成sFv的方法，其特 此以引用的方式整體并入。
[0086] 抗體的另一種形式是編碼單個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)的肽。可通過(guò)構(gòu)建編碼 目標(biāo)抗體的CDR的基因獲得CDR肽（"最小識(shí)別單位"）。例如，通過(guò)使用聚合酶鏈 式反應(yīng)制備