驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位的制備方法及抗炎用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位制備方法，以及抗炎的藥物或保健品中的用 途，屬于民族醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊，Vernonia anthelmintica (L. )Willd，別名印度山茴香，是菊科 (Asteraceae)斑鳩菊屬（Vernonia) -年生高大草本，藥用部位為成熟的果實(shí)，秋季采收、 晾干。其性三級(jí)干熱，功效主要是清除異常粘液質(zhì)、驅(qū)蟲(chóng)、消腫、散寒止痛，是歷代傳統(tǒng)維吾 爾醫(yī)治療白癜風(fēng)的主要經(jīng)典藥物。
[0003] 驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊果實(shí)中含有倍半萜內(nèi)酯類(lèi)、黃酮類(lèi)、括環(huán)氧十八碳烯酸及其甘油酯類(lèi)、 三萜類(lèi)和留醇類(lèi)和咖啡?；鼘幩犷?lèi)等多種化合物。已有報(bào)道驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊總提取物能夠抑 制免疫反應(yīng)，但是驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊具有抗炎活性的部位未見(jiàn)報(bào)道。
[0004] 驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊在民間用藥歷史悠久，有著長(zhǎng)期穩(wěn)定的臨床應(yīng)用，因此其開(kāi)發(fā)應(yīng)用前 景廣闊。維吾爾醫(yī)藥理論中，驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊性三級(jí)干熱，功效主要是清除異常粘液質(zhì)、驅(qū)蟲(chóng)、消 月中、散寒止痛。驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊種子為主藥的上市藥品和制劑有驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊注射液、卡力孜然蜜 膏、復(fù)方驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊丸、復(fù)方卡力孜然酊、復(fù)方卡力孜然片、驅(qū)白巴布斯片等。
[0005] 脂多糖（LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的組成成分，是常見(jiàn)的生物性致炎因子，可 引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克及播散性血管內(nèi)凝血等。在LPS刺激下，巨噬細(xì)胞通過(guò) NF κ B信號(hào)通路被激活，并釋放炎癥介質(zhì)NO (-氧化氮）和PGs (前列腺素），分泌IL-1、 IL-6、TNF-a等淋巴因子以及趨化因子。環(huán)氧合酶-2(C0X-2)是前列腺素合成步驟中的關(guān) 鍵限速酶，與炎癥反應(yīng)有密切關(guān)系。NO是體內(nèi)重要的免疫炎性介質(zhì)。NO主要由一氧化氮 合酶（NOS)催化生成。NOS主要有三個(gè)亞型：神經(jīng)型NOS (nNOS)、內(nèi)皮型NOS (eNOS)、誘導(dǎo)型 NOS (iNOS)。其中nNOS和eNOS又稱(chēng)為結(jié)構(gòu)型NOS (cNOS)，而iNOS則在損傷或刺激后誘導(dǎo)表 達(dá)。
[0006] 通過(guò)對(duì)細(xì)菌脂多糖（LPS)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264. 7炎癥反應(yīng)的抑制試驗(yàn)，觀察 到驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位具有抑制炎癥因子IL-6、TNF-a、IL-I和炎癥介質(zhì)NO產(chǎn)生的作用； 并降低炎癥信號(hào)通路中的關(guān)鍵酶C0X-2的表達(dá)水平，以及NF κ B信號(hào)通路中NF κ B的磷酸 化水平，可見(jiàn)驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位具有良好的抗炎活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的在于，提供一種驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位的制備方法及抗炎用途，該方法 是將干燥的驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊果實(shí)粉碎，采用有機(jī)溶劑提取，樹(shù)脂分離純化獲得驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊提取 物，主要成分為咖啡?；鼘幩?、二咖啡酰基奎寧酸等酚酸類(lèi)化合物。測(cè)定酚酸含量的質(zhì)量 百分比20% -99%。驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位中主要活性成分3, 4-二咖啡?；鼘幩?、3, 5-二 咖啡?；鼘幩?、4, 5-二咖啡酰基奎寧酸的含量分別為3-26%、5-34%、5-40%。經(jīng)初步實(shí) 驗(yàn)證明：通過(guò)本發(fā)明所述的方法獲得的驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位可通過(guò)抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合 酶（iNOS)的蛋白表達(dá)，降低一氧化氮合酶（NOS)活性，從而減少炎性介質(zhì)NO的釋放。此 外，驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位還具有抑制炎癥因子IL-6、TNF-a、IL-I合成釋放的作用，同時(shí)可 以抑制環(huán)氧酶2 (C0X-2)的過(guò)量表達(dá)，以及NFk Β(核因子κΒ)的磷酸化。驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸 部位具有具有良好的抗炎活性，可作為抗炎藥物先導(dǎo)化合物用于預(yù)防或治療由N0、TNF_a、 IL-6或IL-I過(guò)量而導(dǎo)致的炎癥。
[0008] 本發(fā)明所述的一種驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位的制備方法，按下列步驟進(jìn)行：
[0009] a.將干燥的驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊果實(shí)粉碎后，用濃度為0-95%甲醇、乙醇或水溶液，室 溫-95°C提取1-5次，提取時(shí)間0. 5-3小時(shí)，冷卻至室溫，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇 味，得到醇提物，驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊果實(shí)與甲醇或乙醇水溶液的固液比為1:3-30 ;
[0010] b.將步驟a得到的提取物用濃度為0-15%甲醇、乙醇或水溶液溶解分散后，過(guò)濾， 再用樹(shù)脂分離，先用水洗去雜質(zhì)，再用濃度為10-95%甲醇或乙醇洗脫，收集甲醇或乙醇洗 脫液，減壓濃縮除盡溶劑，干燥，即得到含有3, 5-二咖啡?；鼘幩帷?, 5-二咖啡?；鼘?酸和3, 4-二咖啡酰基奎寧酸的驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位。
[0011] 步驟 b 中所述的樹(shù)脂為 DM-130、AB-8、HPD-450、NKA-9、HPD-100、D101、HPD-400、 HPD-500、HPD-600、HPD-300、HPD-417、聚酰胺或十八烷基硅烷鍵合硅膠。
[0012] 所述方法獲得的驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位中含有酚酸類(lèi)化合物為質(zhì)量百分比 20% -99%。
[0013] 所述方法獲得的驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位中主要活性成分3, 4-二咖啡?；鼘幩帷?3, 5-二咖啡?；鼘幩岷?, 5-二咖啡?；鼘幩岬暮糠謩e為3-26%、5-34 %和5-40%。
[0014] 所述方法獲得的驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位作為原料或輔助劑在制備治療抗炎藥物中 的用途。
[0015] 所述抗炎是由于巨噬細(xì)胞釋放過(guò)量炎癥細(xì)胞因子包括白介素 6、白介素 1和腫瘤 壞死因子α或炎癥介質(zhì)為巨噬細(xì)胞釋放的一氧化碳而導(dǎo)致的炎癥。
[0016] 所述方法獲得的驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位在制備抗炎保健品中的用途。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為本發(fā)明驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位抑制LPS刺激RAW264. 7巨噬細(xì)胞表達(dá)iNOS ;
[0018] 圖2為本發(fā)明驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位抑制LPS刺激RAW264. 7巨噬細(xì)胞表達(dá)C0X-2 ;
[0019] 圖3為本發(fā)明驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位抑制LPS刺激RAW264. 7巨噬細(xì)胞NF κ B的磷 酸化。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例1 :驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位的制備：
[0021] 將干燥的驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊果實(shí)藥材IOkg粉碎，加入30倍體積的水溶液，加熱回流提取 3次，溫度95°C，時(shí)間3小時(shí)，冷卻至室溫，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，得到醇提 物；
[0022] 將得到的醇提物用濃度為5%乙醇分散至含生藥100g/L，過(guò)濾，再用AB-8型大孔 吸附樹(shù)脂柱，先用1倍柱體積水洗脫，再用8倍柱體積濃度為40%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫 液，減壓濃縮，真空干燥成干粉，即得含有3, 5-二咖啡?；鼘幩帷?, 5-二咖啡?；鼘幩?和3, 4-二咖啡?；鼘幩岬尿?qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位390g。
[0023] 實(shí)施例2 :驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位的制備：
[0024] 將干燥的驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊果實(shí)藥材IOkg粉碎，加入3倍體積濃度為95%乙醇，加熱回 流提取5次，室溫，時(shí)間3小時(shí)，冷卻至室溫，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，得到醇 提物；
[0025] 將得到的醇提物用濃度為5%乙醇分散至含生藥50g/L，離心（4000轉(zhuǎn)/分鐘）， DM-130型大孔吸附樹(shù)脂柱，先用3倍柱體積水洗脫，再用1倍柱體積濃度為95%乙醇洗脫， 收集乙醇洗脫液，減壓濃縮，真空干燥成干粉，即得含有3, 5-二咖啡酰基奎寧酸、4, 5-二咖 啡?；鼘幩岷?, 4-二咖啡?；鼘幩岬尿?qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位420g。
[0026] 實(shí)施例3 :驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位的制備：
[0027] 將干燥的驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊果實(shí)藥材IOkg粉碎，加入15倍體積濃度為30%乙醇，加熱回 流提取3次，溫度75°C，時(shí)間2小時(shí)，冷卻至室溫，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，得到醇提 物；
[0028] 將得到的提取物用濃度為10 %甲醇分散至含生藥80g/L，離心（4000轉(zhuǎn)/分 鐘），HPD-100型大孔吸附樹(shù)脂柱，先用4倍柱體積水洗脫，再用6倍柱體積濃度為50 %乙 醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮，真空干燥成干粉，即得含有3, 5-二咖啡?；鼘幩?、 4, 5-二咖啡?；鼘幩岷?, 4-二咖啡?；鼘幩岬尿?qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位440g。
[0029] 實(shí)施例4 :驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位的制備：
[0030] 將干燥的驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊果實(shí)藥材IOkg粉碎，加入18倍體積的濃度為60%甲醇，加熱 回流提取2次，溫度50°C，時(shí)間0. 5小時(shí)，冷卻至室溫，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，得到 醇提物；
[0031] 將得到的提取物用濃度為15%甲醇分散至含生藥100g/L，離心（4000轉(zhuǎn)/分鐘）， NKA-9型大孔吸附樹(shù)脂柱，先用5倍柱體積水洗脫，再用5倍柱體積濃度為60%甲醇洗脫， 收集甲醇洗脫液，減壓濃縮，真空干燥成干粉，即得含有3, 5-二咖啡?；鼘幩?、4, 5-二咖 啡?；鼘幩岷?, 4-二咖啡酰基奎寧酸的驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位460g。
[0032] 實(shí)施例5 :驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位的制備：
[0033] 將干燥的驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊果實(shí)藥材IOkg粉碎，加入12倍體積濃度為10%乙醇加熱回 流提取2次，溫度80°C，時(shí)間2小時(shí)，冷卻至室溫，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，得到醇提 物；
[0034] 將得到的提取物用濃度為10 %乙醇分散至含生藥30g/L，過(guò)濾，再用DlOl型大孔 吸附樹(shù)脂柱，先用8倍柱體積水洗脫，再用6倍柱體積濃度為80%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫 液，減壓濃縮，真空干燥成干粉，即得含有3, 5-二咖啡酰基奎寧酸、4, 5-二咖啡?；鼘幩?和3, 4-二咖啡酰基奎寧酸的驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位564g。
[0035] 實(shí)施例6 :驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位的制備：
[0036] 將干燥的驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊果實(shí)藥材IOkg粉碎，加入18倍體積濃度為95 %乙醇，加熱回 流提取2次，溫度60°C，時(shí)間1小時(shí)，冷卻至室溫，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，得到醇提 物；
[0037] 將得到的提取物用水分散至含生藥50g/mL，離心（4000轉(zhuǎn)/分鐘），用HPD400型 大孔吸附樹(shù)脂柱，先用6倍柱體積水洗脫，再用6倍柱體積濃度為65%甲醇洗脫，收集甲醇 洗脫液，減壓濃縮，真空干燥成干粉，即得含有3, 5-二咖啡酰基奎寧酸、4, 5-二咖啡酰基奎 寧酸和3, 4-二咖啡?；鼘幩岬尿?qū)蟲(chóng)斑鳩菊酚酸部位490g。
[0038] 實(shí)施例7